Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2a и альфа-2b

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2a и альфа-2b"

На правах рукописи

ШАМОНОВ Николай Алексеевич

Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 MAP 2015

005560315

Москва-2015

005560315

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ФГУП ГосПИИгенетика»)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хамитов Равиль Авгатович

Официальные оппоненты:

Костров Сергей Викторович - доктор фармацевтических наук, профессор, член-корр. РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт молекулярной генетики Российской академии наук», директор, +7(916) 65163-55, kostrov@img.ras.ru.

Чистяков Виктор Владимирович - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», центр доклинических и клинических исследований, директор, +7(916) 335-1192, chistvic@gmail.com.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова», +7(495) 434-71-55, mitht@mitht.ru.

Защита состоится «¿2.» (Хм £ 2015 г. в "Г?""^ часов на заседании

диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. 8(495)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23) и на сайте http://mgavm.ru.

Автореферат разослан « С

2015 г. и размещен на сайте

/ /

http://www.vak.ed.gov.ru ' /

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На сегодняшний день мир сталкивается все с новыми вызовами, связанными с распространением тяжелых вирусных заболеваний. Только от хронического гепатита С в мире ежегодно умирают около 500 тыс. человек. В РФ по официальной статистике число больных хроническим гепатитом В и С составляет около 5,35 млн. человек, общее число носителей около 9 млн. (Онищенко Г.Г., 2001).

Значительную проблему представляет и распространение вирусных заболеваний у различных видов животных. К примеру, в случае молодняка крупного рогатого скота значительную опасность представляет вирусная диарея, падеж от которой составляет 30 - 50 % (Dcregt D., 1995). Не меньшую опасность представляют и другие вирусные заболевания: ящур, везикулярный стоматит, герпес, гепатит и т.д.

Классическим подходом к терапии вирусных заболеваний считается терапия интерфероном альфа. Интерферон альфа — это цитокин, синтезируемый в основном лейкоцитами и моноцитами в ответ на проникновение инфекции (Bckisz J., 2004).

Однако, терапия гепатита нативным интерфероном не в полной мере эффективна и безопасна из-за недостатков, присущих всем препаратам на основе нативных белковых молекул: малое время полужизни в крови пациента, высокая иммуногенность, большой объем распределения препарата в организме пациента и т.д (Hoofiiagle J., 1986). Обозначенные недостатки были нивелированы за счет создания пролонгированных форм интерферона - пегилированного интерферона альфа-2Ь (препарат Пе-гинтрон, 2000 г) (Wang Y., 2002) и пегилированного интерферона апьфа-2а (препарат Иегасис, 2001 г) (Bailón Р., 2001). Важно отметить, что обозначенные препараты созданы на основе интерферона альфа без N - концевого метионина, что так же повышает их эффективность. Препараты пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь получили широкое распространение при терапии больных с вирусом гепатита С.

Пегинтрон и Пегасис входят в список жизненно важных лекарственных средств и востребованы в больших объемах. При этом в Российской Федерации не производятся. По этой причине разработка отечественной технологии промышленного производства субстанций интерферона альфа-2Ь и альфа-2а без N - концевого метиоии-

j

на и дальнейшего получения на их основе пегилированных форм путем ковалентной сшивки с молекулами ПЭГ является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью дашюго исследования являлась разработка промышленной технологии производства субстанции нагивных (без N - концевого метионина) и пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести оптимизацию процесса ренатурации интерферона альфа-2.

2. Разработать технологическую схему хроматографической очистки интерферона альфа-2.

3. Определить оптимальные параметры процесса пегилирования интерферона альфа-2.

4. Разработать схему выделения целевой монопегилированной формы интерферона альфа-2.

5. Провести масштабирование разработанных процессов на производственной площадке ООО «Фармапарк» и их последующую валидацию.

6. Рассчитать экономическую эффективность разрабатываемой технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2.

Научная новизна. Впервые в России проведена работа по установлению критических параметров проведения процесса ренатурации интерферона альфа-2 (концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила раствора; концентрация хаотропных агентов; температура проведения процесса; продолжительность процесса; нагрузка телец включений) и определению их оптимальных значений. Впервые в мире проведена оптимизация процесса пегилирования интерферона альфа-2 и определены критические параметры данного процесса (соотношение белок / ПЭГ; исходная концентрация белка; температура и продолжительность процесса; влияние структуры растворителя). На основании разработанных технологий впервые в России получены субстанции пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

По результатам проведенной работы подана заявка на патент России №

2014114369 от 11.04.2014 на изобретение «Способ получения отдельных изоформ

пегилированного интерферона альфа-2Ь и их смеси».

ч

Практическая значимость. Разработаны и утверждены руководством ООО «Фармапарк» промышленные регламенты на производство: субстанции интерферона альфа-2Ь (ПР 56882590-22-14 от 04.12.14), субстанции пегнлированного интерферона альфа-2Ь (ПР 56882590-23-15 от 13.01.15); пусковой регламент на производство готовой лекарственной формы пегнлированного интерферона альфа-2Ь (11УР 56882590-21-14 от 02.07.2014). Субстанции интерферона альфа-2Ь и его пегилиро-ванной формы внесены в реестр лекарственных средств под № ФС 000434 (решение Минздрава РФ от 15.11.12) и № ФС 000831 (решение Минздрава РФ от 06.05.14). Готовая лекарственная форма пегнлированного интерферона альфа-2Ь (торговое название ПегЛльтевир) внесена в реестр лекарственных средств под № ЛП 002542 (решение Минздрава РФ от 23.07.14).

Полученная субстанция интерферона альфа-2а использована для производства препарата пегнлированного интерферона альфа-2а, который в настоящее время проходит доклинические исследования на обезьянах

Лнчный вклад соискателя. Автором была проведена работа по оптимизации процесса по оптимизации процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений; разработке технологии очистки интерферона альфа-2; оптимизации процесса пегилирования интерферона альфа-2а и альфа-2Ь и дальнейшей очистки целевой мопопегилированной формы. Автор провел анализ и статистическую обработку полученных данных и на основании этого сделал выводы и скорректировал план дальнейших работ. Совместно с начальником лаборатории биохимии ООО «Фармапарк» Селищевым C.B. автором выполнено масштабирование разработанных процессов и их перенос на производственную площадку, где была проведена их валидация.

Совместно с Гавриловой H.A. и Орловой Н.В. автор разработал нормативную документацию на субстанцию и готовую лекарственную форму пегнлированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорг анизмов и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).

5

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Биофармацевтический журнал).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; описания собственных исследований; материалов и методов исследований; результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; описания практического использования результатов; рекомендаций по использованию научных выводов; списка литературы и приложений. Работа изложена на 163 страницах и включает 68 рисунков, 17 таблиц и 6 страниц приложений. Список цитируемой литературы содержит 140 источников, в том числе 3 на русском языке.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Проведенная оптимизация процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений (по параметрам: концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила раствора; концентрация хаотроп-ных агентов; температура проведения процесса; продолжительность процесса; нагрузка телец включений) позволяет увеличить выход процесса на 90±0,5 %, повысить содержание целевого белка в ренатурате до 81±0,4 %, снизить стоимость процесса ренатурации на 40 % по сравнению с известным аналогом.

2. Разработанная промышленная технология получения интерферона альфа-2 (без N - концевого метионина) обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 11±0,5 г белка с одного производственного цикла в течение 4 суток.

3. Проведенная оптимизация процесса пегилирования (по параметрам: соотношение реагирующих компонентов; концентрация белка в реакционном буфере; значение рН; продолжительность процесса; температура процесса; структура растворителя) позволяет увеличить эффективность пегилирования в 4,2 раза (в случае интерферона альфа-2Ь) и в 3 раза (в случае интерферона альфа-2а).

4. Разработанная промышленная технология получения субстанций пегилиро-ванного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а обеспечивает выпуск продукта с производительностью не менее 450±20 мг белка (в случае пегилированного интерферона альфа-2Ь) и 600±25 мг (в случае интерферона альфа-2а) с одного производственного цикла в течение 4 суток.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Разработка технологии промышленного производства пегалированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ъ проводилась в 2011 - 2014 гг. в отделе медицинской биотехнологии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Используемый штамм - продуцент. Штамм - продуцент Е. Cali BL21 (DE3), содержащий экспрессионную плазмиду РЕТ28, несущую ген целевого белка.

Методы исследований. Процесс ренатурации телец включений интерферона проводили в течение 6 ч при температуре 2 - 8°С в буферном растворе следующего состава: 20 мМ Трис НС1 рН = 8.0; 0,8 М мочевины; 0,1% полисорбат 80; 0,5 мМ цистина; рН = 8,5; нагрузка на ренатурационный буферный раствор: 4,86 г т.в. / л. Процесс очистки интерферона альфа-2 проводили методом хроматографической очистки с использованием системы Purifier (GE, США) под управлением программного обеспечения Unicorn 4.0. В случае стадий катионообменной хроматогарфии использовали сорбенты СМ Sepharose FF (GE, США) и YMC Biopro S30 (YMC, Япония), гель-фильтрационной хроматографии - сорбент Superdex 75 (GE, США). Процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь и альфа-2а осуществляли путем конъюгации интерферона с активированными ПЭГ Sunbright ME 120 TS и Sunbright LY-400NS, соответственно (Nof Corporation, Япония).

Процесс очистки пегилироваиного интерферона альфа-2 осуществляли с помощью катионообменного сорбента MacroCap SP (GE, США). Перевод пегилироваиного интерферона в буфер хранения осуществляли с помощью гель-фильтрационного сорбента Sephadex G25 (GE, США). Анализ концентрации и чистоты нативного интерферона осуществляли с помощью обращенно-фазовой хроматографии на сорбенте С18 с размером частиц 5 мкм и размером пор 30A (YMC, Япония), на системах Dionex UltiMatc 3000 под управлением программного обеспечения Chromeleon 6.80. Анализ чистоты субстанции нативного и пегалированного интерферона альфа осуществляли электрофорезом по Лемли (ЭФ в ПААГ). Чистоту и концентрацию пегилированных форм оценивали методом гель-фильтрации на сорбенте Superóse 12 (GE, США). Изоформенный состав пегилированных форм оценивали методом катионообменной хроматографии на сорбенте TSKgel SP-5PW с диаметром гранул 10

7

micm (Tosoh, Япония). Оценку биологической активности интерферонсодержащих препаратов проводили с использованием пары клетка - вирус: MDBK (культура клеток почки быка) - VSV (вирус везикулярного стоматита). Активность препарата оценивали по выживаемости клеток после их обработки интерферонсодержащим препаратом в присутствии индикаторного вируса.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерферона альфа.

Разработка технологии производства субстанции пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь включает ряд стандартных этапов: создание штамма - продуцента интерферона альфа-2а и альфа-2Ь, разработку и масштабирование процесса культивирования, создание схемы ренатурации телец включений, разработку схемы хроматографической очистки субстанции иативного интерферона, разработка стадии пегилирования и очистки нативного интерферона.

После проведения процесса культивирования получали тельца включений, содержащие интерферон альфа-2. Данные тельца включений подвергали денатурации с последующим переводом денатурированного белка в растворимую форму с правильной конформацией, т.е. осуществляли т.н. процесс ренатурации.

В качестве исходной точки эксперимента использовали условия, разработанные в 2011 году сотрудниками ООО «Фармапарк»:

состав буферного раствора: 20 мМ Трис НС1 рН = 8,0; 0,8 М мочевины; 35 мМ NaCl; 0,1% Triton Х-114; 3 мМ GSSG; 1 мМ GSH; рН = 8,0; температура: 2 - 8°С; продолжительность: 9 -100 ч; нагрузка на ренатурационный буферный раствор: 2,43 г т.в. / л. Приведенная схема процесса ренатурации позволяет получать 0,14±0,01 мг/мл целевого белка, при его содержании в ренатурационном буфере в количестве 41±0,5 % от общего количества белков в растворе. Недостаток данной схемы состоит в низком выходе целевого белка, его низкой чистоте, высокой мутности получаемого раствора, что осложняет его фильтрацию, а так же невозможности масштабирования данной технологии но причине низкой нагрузки телец включений на ренатурационный буфер. Описанные условия процесса требуют оптимизации.

8

Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих агентов на процесс ренатурации. На первом этапе оптимизации нами было исследовано влияние восстанавливающих и окисляющих агентов на процесс ренатурации. Известно, что два дисульфидных мостика в составе молекулы интерферона оказывают значительное влияние на стабилизацию молекулы интерферона в растворе (Meager А., 2006). Наибольшее влияние на процесс формирования дисульфидных связен оказывают восстанавливающие и окисляющие агенты. В процессе исследования было установлено, что восстанавливающие агенты оказывают негативное влияние на процесс ренатурации интерферона. В частности удаление восстановленного глутатиона из состава ренатурационного раствора позволило увеличить выход процесса на 7±0,1 %. Так же было определено оптимальное содержание другого восстанавливающего агента - дитиотреитола (ДТТ), попадающего в ренатурационный буфер вместе с раствором телец включений — 3 мМ. При меньшем содержании ДТТ не происходило полноценного перевода телец включений в растворимую форму, что приводило к снижению выхода процесса ренатурации.

Далее нами была определена оптимальная концентрация окисляющего агента, в качестве которого рассматривали окисленный глутатион (GSSG) и цистин (Cs). Оптимальная концентрация Cs составила 0,5 мМ (концентрация белка 0,18±0,01 мг/мл); GSSG - 1 мМ (концентрация белка 0,19±0,01 мг/мл). Цистин является предпочтительным окислителем, так как его стоимость более чем в 10 раз ниже стоимости GSSG.

Таким образом, за счет оптимизации концентрации восстановителей и окислителей в ренатурапионном буфере удалось повысить выход процесса на 30 % в сравнении с исходным вариантом.

Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации. Следующим шагом стал выбор детергента. Как уже отмечалось выше, при проведении процесса в исходных условиях наблюдалась высокая мутность ренатурата, что осложняло процесс фильтрации. По этой причине нами был проведен подбор оптимального детергента для проведения процесса. Критериями приемлемости в первую очередь выступала мутность раствора, а так же выход процесса. Зависимость выхода процесса

от типа используемого детергента представлена на рисунке 1.

9

Использование детергентов Тритон Х-100; Палаксомер 188 и Чапс не оказывало значительного влияния на процесс ренатурации.

Рис. 1. Зависимость выхода ренатурации от вида детергента

При использовании Полисорба-тов 20 и 80 удалось решить главную задачу — нивелировать мутность раствора ренатурата. При этом при использовании Полисорбата 20 в концентрации 0,1 % выход процесса возрастает на 15 % (до 0,21±0,02 мг/мл целевого белка) по сравнению с Тритон-Х114, используемым в стандартной технологии. Таким образом, в качестве основного детергента был выбран полисор-бат 20 в концентрации 0,1 %.

Далее нами было исследовано влияние ионной силы раствора, концентрации хаотропного агента и значения рН раствора. Из полученных данных можно сделать следующие выводы: оптимальная концентрация хаотропного агента (мочевины) составляет 0,8 M (концентрация целевого белка 0,21 ±0,02 мг/мл); ионная сила раствора не влияет на процесс ренатурации; оптимальное значение рН составляет 8,5 (концентрация целевого белка 0,28±0,02 мг/мл).

Определение оптимальной нагрузки и продолжительности процесса.

Поиск оптимальной нагрузки телец включений на ренатурационный буферный раствор обусловлен необходимостью повышения технологичности процесса ренатурации. В качестве исходной точки выступала нагрузка 2,43 г т.в. / л. Результаты зависимости выхода процесса ренатурации от нагрузки представлены на рисунке 2. Линейная зависимость выхода процесса ренатурации сохраняется до нагрузки 4,86 г/л, после чего кривая выходит на плато. Следовательно, нагрузка 4,86 г/л является оптимальной.

Далее определяли динамику процесса при выбранных условиях. На рисунке 3 представлена динамика процесса ренатурации при комнатной температуре и в диа-

0,21 0,2 0,2

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

■V tP &

л* > о

* ^

0,19

щ —-я Щ

Г шш 1

4_JB й В и

пазоне 2-8°С. Оптимальная продолжительность процесса ренатурации при комнатной температуре составляет 3 часа (концентрация белка 0,51±0,04 мг/мл), при температуре 2 - 8°С - 6 часов (концентрация белка 0,53±0,04 мг/мл). При проведении процесса в условиях комнатной температуры значительно повышалась мутность раствора, по этой причине процесс решено проводить при температуре 2 - 8°С. Содержание интерферона альфа-2 при выбранных условиях проведения процесса составило 81±1 %.

1,215 2,43 3,645 4,86 6,075

0,5х 1х 1,51 2х 2,5х

Нагрузка телец включения, г/л

Рис. 2 Зависимость выхода процесса ренатурации от нагрузки телец включений

-•2-8°С

0,6 |«,4

ю

« 0,3

1 0.2

| 0,1 а

® О

2

0 1 2 3 4 5 6 7 !

Продалжктсльоость реватурацвн. ч

Рис. 3 Динамика процесса ренатурации при его проведении при комнатной температуре и при температуре 2-8°С

По результатам процесса оптимизации стадии ренатурации установлены следующие параметры процесса: состав буферного раствора (20 мМ Трис НС1 рН = 8,0; 0,8 М мочевины; 0,1% полисорбат 20; 0,5 мМ цистина; рН = 8,5); температура (2 -8°С); продолжительность (не менее 6 ч); нагрузка на ренату рационный буферный раствор (4,86 г т.в. / л).

В результате процесса оптимизации удалось повысить выход процесса в 1,9 раза, продолжительность процесса уменьшить в 1,5 раза, уменьшить затраты на данной стадии на 40 % за счет использования более дешевых реактивов, увеличить чистоту целевого белка с 41±0,5 % до 81±1 %.

Разработка технологии очистки интерферона альфа-2. На следующем этапе перед нами стояла задача разработки технологии очистки интерферона альфа-2. Данная задача решена путем разработки четырехстадийной схемы с использованием

катионообменной и гель-фильтрационной хроматографий,

11

На первой и третьей стадии очистки применяли катионообменный сорбент СМ ЗерЬагове РР, на второй стадии катионообменный сорбент УМС Вюрго БЗО. Перевод в буфер хранения осуществляли на гель-фильтрационном сорбенте Эирегёех 75.

Разработанная схема очистки позволяет получать субстанцию высокоочищенно-го интерферона альфа-2 с содержанием целевого белка более 99±1 % и выходом 764:5 мг /1 г т.в., что характеризует ее как эффективную технологию.

Технология ренатурации и очистки была масштабирована и перенесена на производство ООО «Фармапарк». В' рамках валидации было установлено, что разработанный процесс является стабильным и воспроизводимым. Результаты выпуска трех установочных серий представлены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры процесса 3-х валидационных серим получения субстанции интерферона альфа-2 (без N - концевого метионина)

Серия препарата Параметр процесса

Количество белка, мг Содержание целевого белка, % Активность, МЕ/мг

2714 12002 99,11 1,8*10"

3014 11673 99,11 1,7*10"

3214 11024 99,17 1,8*10"

Разработанная масштабированная схема ренатурации и очистки позволяет получать 11±0,5 г кондиционного продукта, соответствующего требованиям качества, заявленным в Европейской фармакопее. Технологическая схема разработанного процесса представлена на рисунке 4. Применяемые буферные растворы: буфер 8: 50 мМ Ас№; рН = 4,5; буфер 9: 50 мМ АсЫа; 500 мМ ЫаС1, рН = 5,5; буфер БЗО: 15 мМ Ш; 65 мМ ЫаС1, рН 5,0; буфер 8Е: 50 мМ АсКа; 0,5 мМ ЕЭТА; рН 5,0.

Рис. 4. Технологическая схема производства субстанции интерферона альфа-2

Предложенная схема включает 8 стадий, продолжительность производственного цикла составляет 4 суток.

Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь. Нами был проведен поиск поставщика активированного ПЭГ. В качестве двух основных критериев приемлемости качества ПЭГ были выбраны: выход целевой монопегилированной формы и стабильность процесса при использовании различных лотов ПЭГ. Наилучшим образом обозначенным критериям соответствует ПЭГ компании Nof Corporation (Япония), произведенный в условиях GMP.

В процессе анализа литературы было обнаружено, что процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь описан только в 1 печатной работе (Wang Y. W., 2000). Условия реакции пегилирования, указанные в данной работе, были использованы в качестве исходной точки эксперимента: состав реакционного буфера: 100 мМ NaP, рН = 6,5; соотношение белок / ПЭГ 1 к 2,6 по массе; продолжительность реакции 70 минут при комнатной температуре; исходная концентрация белка 5 мг/мл.

При проведении реакции в данных условиях содержание монопегилированной формы составляет 40±1 %. Эффективность реакции но ПЭГ около 5 %, по интерферону около 24,5 %, изоформенный состав получаемого продукта (остатки амннокис-

лот, но которым происходит присоединение молекул ПЭГ) не соответствует изо-форменному составу препарата Пегинтрон. По вышеобозначенным причинам потребовалась оптимизация процесса пегилирования.

Первым шагом было исследование влияния рН буферного раствора с целью выравнивания изоформенното состава получаемого препарата и препарата Пегинтрон. Исследование проводили в диапазоне 6,0 - 7,4. Было установлено, что изоформен-ный состав, аналогичный изоформенному составу в Пегинтроне, достигается при значении рН 6,8 ед. Выход реакции пегилирования при увеличении значения рН повышается за счет повышения доступности остатков лизина для пегилирования. При значении рН 6,8 ед. содержание монопегилированной формы составляет 42,3±0,7%.

Далее была определена кинетика процесса пегилирования в двух диапазонах температур: 2-8°С и комнатной температуре. Полученные данные указывают на то, что оптимальная продолжительность пегилирования составляет 120 минут при температуре 2-8°С и 80 минут при комнатной температуре. Процесс целесообразно проводить при комнатной температуре по причине меньшей продолжительности.

Следующим шагом было установление зависимости выхода реакции пегилирования от соотношения реагирующих компонентов. Процесс пегилирования проводили при массовом соотношении белок / ПЭГ: 1 к 0,1; 1 к 0,3; 1 к 0,5; 1 к 0,7; 1 к 1; 1 к 2; 1 к 3. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффективность пегилирования снижается при увеличении соотношения белок / ПЭГ. Оптимальное соотношение составляет 1 к 0,7 (по массе). При данном соотношении на момент окончания реакции содержание монопегилированной формы (МоноПЭГИНФ) составляет 26,5±0,5%.

Далее определили оптимальную концентрацию интерферона в реакционном буфере. Исследование проводили в диапазоне концентраций 2-14 мг/мл. Зависимость выхода процесса от концентрации интерферона представлена на рисунке 5. Как видно из приведенных данных, повышение концентрации белка приводит к значительному росту эффективности пегилирования. При соотношении белок / ПЭГ 1 к 0,7 и концентрации белка 14 мг/мл содержание МоноПЭГИНФ составляет 44,9±1%. Дальнейшее повышение концентрации невозможно осуществить технологически.

55,0

50,0

1 * J0'° |â 35,0

Рис. 5. Зависимость выхода реакции пегм-лирования от концентрации белка (соотношение белок / ПЭГ 1 к 0,7)

20,0

15,0

Таким образом, за

10,0

2 4 6 S 10 12 14

Концентрация интерферона в реакционном буфере, чг/\г.1

счет определения крити-

ческих параметров реак-

ции пегилирования и определения их оптимальных значений удалось повысить эффективность пегилирования по ПЭГ в 4,2 раза до 21±0,5 % (по сравнению с известными аналогами).

Разработка процесса пегилирования интерферона альф а-2 а. Аналогичная работа по оптимизации пегилирования была проведена и для процесса пегилирования интерферона альфа-2а. Условия реакции пегилирования, указанные в литературе (Foser S., 2003), были использованы в качестве исходной точки эксперимента:

состав реакционного буфера: 50 мМ NaB, рН = 9,0; соотношение белок / ПЭГ: 1 к 6 по массе; продолжительность реакции: 120 минут при температуре 2 - 8°С; исходная концентрация белка 5 мг/мл. При проведении реакции в данных условиях содержание монопегилированной формы составляет 40±1 %. Эффективность реакции по ПЭГ около 4,5 %, по интерферону около 13 %.

Исследование влияния рН реакционного буфера показало, что выход процесса практически не изменяется при значении рН более 9,0. Интересно отметить, что в результате исследования было установлено: исходная концентрация белка не оказывает существенного влияния на выход процесса.

Далее было исследовано влияния соотношения белок / ПЭГ на выход процесса. Установлено, что оптимальное соотношение белок / ПЭГ составляет 1 к 2 по массе, так как данное соотношение обеспечивает максимальную эффективность процесса.

При соотношении белок / ПЭГ 1 к 2 массе содержание МоноПЭГИНФ на момент окончания реакции составляет 25,2±0,3 %.

Значительного увеличения выхода процесса пегилирования удалось достичь при добавлении в реакционный буферный раствор органического растворителя - диме-тилсульфоксида (ДМСО). Зависимость выхода реакции пегилирования от содержания ДМСО в реакционном буфере (соотношение белок - ПЭГ 1 к 2 по массе) пред-

Рис. 6. Зависимость выхода процесса пегилирования от содержания ДМСО в реакционном буферном растворе

При повышении содержания ДМСО выход монопеги-лированной формы возрастает. Однако, анализ изоформенно-го состава продемонстрировал, что соотношение основных изоформ монопегилированного интерферона сохраняется до содержания ДМСО 30 %, далее соотношение изоформ меняется. При содержании ДМСО 30 % и соотношении белок - ПЭГ 1 к 2 содержание МоноГЮ-ГИНФ составляет 40,5±1 %.

Следующим шагом стало исследование динамики реакции при комнатной температуре и температуре 2 - 8°С. Продолжительность пегилирования в обоих диапазонах температур составила 10 минут. Процесс целесообразно осуществлять при температуре 2 - 8°С, так при данной температуре содержание примесной дипегили-рованной формы (ДиПЭГИНФ) значительно меньше - 9,5 ±0,2 % против 12,0±0,2% при комнатной температуре.

Таким образом, за счет определения критических параметров реакции пегилирования и определения их оптимальных значений удалось повысить эффективность пегилирования по ПЭГ в 3 раза до 13 % (по сравнению с известным аналогом).

Очистка пегилировапного интерферона алъфа-2.

Далее была разработана схема тонкой очистки пегилированного интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте МасгоСар БР с при-

ставлена на рисунке 6.

40

.9

- 35

; О

¡Изо ! т ||25

: о ¡2 20

I

15 10

25,2

10 20 30 40

Содержание ДМСО а реакционном буфере, %

менением следующих буферных растворов:

МСА: 40 мМ ЛсКа; 0,01 % ро1укогЬа1е 80; рН = 4,5;

МСВ: 40 мМ АсК'а; 0,5 М НаС1; 0,01 % ро1уяогЬа1е 80; рН = 4,5;

МСС: 100 мМЫаР; 0,01 % ро1уБогЬа1е 80; рН = 4,5 (пэгинтерферон альфа-2Ь);

МСЭ: 100 мМИаР; 0,01 % ро1уьогЬа1е 80; рН = 7,0 (пэгинтерферон альфа-2Ь);

МСН: 50 мМ АсМа; 30% ОМ8С); 0,01 % ро1узогЬа1е 80; рН 4,50 (пэгинтерферон альфа-2а);

МСй: 50 мМ ЫаВ; 0,01 % Полисорбат 80; рН = 9,0 (пэгинтерферон альфа-2а).

Хроматограмма очистки пегилированного интерферона альфа-2Ь представлена на рисунке 7.

Рис. 7. Хроматограмма тонкой очистки пегилированного интерферона альфа-2Ь

В случае интерферона альфа-2Ь удалось подобрать условиях градиентной элюции, позволяющие селективно удалять не только ДиПЭГИНФ и немодифициро-ванный интерферон, но и впервые выделить в препаративном масштабе отдельные группы изоформ монопегилированного интерферона альфа-2Ь.

Попытка очистки пегилированного интерферона альфа-2а методом градиентной элюции продемонстрировала невозможность удаления ДиПЭГИНФ. По этой причине для очистки пегилированного интерферона альфа-2а была разработана дополнительная стадия промывки сорбента с адсорбированным белком с использованием буферного раствора следующего состава: 50 мМ АсИа; 30 % ДМСО; 0,1 % Полисорбат 80; рН = 4,5. Данная промывка позволяет селективно удалять ДиПЭГИНФ.

Разработанная схема очистки позволяет получать высокоочищенные субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь (содержание монопегилированной формы более 97,5±0,5 %) и монопегилированного интерферона альфа-2а (содержание монопегилированной формы более 99±0,5 %). Потери в процессе очистки составляют около 20 %.

Получаемые препараты соответствуют коммерческим препаратам Пегинтрон и Пегасис. Сравнительный анализ препаратов Пегинтрон и полученной субстанции методом ионообменной хроматографии, ЭФ в ПААГ и гель-фильтрации представлены на рисунке 8.

ТОЛГХ 010912

К РЭ0ИУ Р(Е11Й«| 010912

Ось СМ, МЛ

В

Рис. 8. Сравнение субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь и коммерческого препарата Пегинтрон методом ЭФ в ПААГ (А), ионообменной хроматографии (Б) и гель-фильтрации (В)

Представленные данные демонстрируют идентичность полученной субстанции и коммерческого препарата Пегинтрон. Сравнение препарата Пегасис и субстанции пегилированного интерферона альфа-2а методом ионообменной хроматографии и гель-фильтрации представлены на рисунке 9.

Р12А 041014

Объем, »л А

РКА 04101.

"Регазуз

Объем, мл Б

Рис. 9. Сравнение субстанции пегилированного интерферона альфа-2а и коммерческого препарата Пегасис методом ионообменной хроматографии (А) и

гель-фильтрации (Б)

Разработашше технологии были успешно масштабированы и перенесены на производственную площадку ООО «Фармапарк», где была проведена их валидация. В рамках проведенной валидации была продемонстрирована стабильность и воспроизводимость разработанных технологических процессов. Результаты валидации процесса получения пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты валидации технологического процесса получения

субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а

Серия препарата Параметр процесса

Количество белка, 1 Содержание бел-мг 1 ка, % Активность, МЕ/мг

Пегилированный интерферон альфа-2Ь

РЕОШЫ 010912 458 97,58 8,1*10'

РЕС1КЫ 020912 450 97,34 8,0*10'

РЕОТШ 030912 453 97,61 7,6*10'

Пегилированный интерферон альфа-2а

Р12А 041014 604 99,8 1,4*10'

Р12А 061014 610 99,7 1,5*10'

Р12А 081014 611 99,6 1,5*10'

Исследование стабильности полученных препаратов. Далее было проведено исследование стабильности полученных субстанций пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

Полученные данные продемонстрировали, что пегилированный интерферон альфа-2а стабилен при температуре 2 - 8°С, пегилированный интерферон альфа-2Ь при данной температуре не стабилен по причине разрушения основной изоформы -остатку гистидина в позиции 34. В результате разрушения данной изоформы происходит снижение содержания монопегилированной формы. По этой причине хранение субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь необходимо осуществлять при температуре минус 40°С.

Технологическая схема очистки пегилированного интерферона альфа-2Ь и аль-фа-2а представлена на рисунке 10.

Буферы хранения:

5Е1: 50 мМ КаР; 0,01 % ро1узогЬа1е 80; рН = 6,5 (пэгинтерферон альфа-2Ь);

8Е2: 50 мМ МаР; 0,01 % ро1уяогЬа1е 80; рН = 5,5 (пэгинтерферон альфа-2а).

19

Субстанция интерферона

Буфер$Е I Б\фср*ГЛ

Нормирование концентрации в

субстанции пегнлированного интерферона

Формирование серии, фильтрация н фасовка субстанции пегнлироваиного интерферона

Пеги л про ванне | интерферона__[

Вторичное использование немодифичпровлнног о интерферона

Процесс очистки пегнлированного интерферона на сорбенте Масгосар 51*. колонна объемом 200 мл

Гсльфнльтруюшая хроматография пегнлированного интерферона на сорбенте верЬаскх С-25, колонна объемом 500 мл

Буфер Г МСА

Процесс концентрирования пегнлированного интерферона на сорбенте тасгосар колонна объемом 75 мл

Серия субстанцни\ пегнлированного \ \ интерферона I \(выход процесса)/

Буфер 5Е II

ГлфсрМЛ

Буфер Буфер

МСА МСВ

Буфер МСВ

• М( С |

Буфер * МС1> |

Буфер | МСН 1

Буфер

МСС

Рис 10. Технологическая схема производства субстанции пегнлированного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а. Фиолетовый цвет-пегинтерферон альфа-2Ь, зеленый цвет - пегинтерферон альфа-2а

Предложенная схема включает 6 стадий, продолжительность производственного цикла составляет 4 суток.

ВЫВОДЫ

1. Проведен подбор оптимальных условий (отсутствие восстанавливающих агентов; концентрация ДТТ в растворе телец включений - 3 мМ; окислитель — цис-тин в концентрации 0,5 мМ; значение рН 8,5 ед.; детергент: 0,1 % полисорбат 80; хаотропный агент: мочевина в концентрации 0,8 М; продолжительность процесса 6 ч; оптимальная нагрузка т.в.: 4,86 г/л) ренатурации интерферона апьфа-2 (без N -концевого метионина). В результате выход целевого белка повышен в 1,9 раза, продолжительность стадии снижена в 1,5 раза, стоимость стадии снижена на 40 % по сравнению с известным аналогом.

2. Разработана технология хроматографической очистки интерферона альфа-2, позволяющая получать высокоочищенный препарат, соответсгвующий требованиям качества, описанным в Европейской фармакопее. Содержание целевого белка более 99±0,5 %, суммарные потери на всех стадиях менее 30 %.

3. Проведен подбор оптимальных условий процесса пегилирования интерферона альфа-2а (соотношение белок/ПЭГ 1 к 2 по массе; концентрация интерферона 2 мг/мл; температура: 2-8°С; продолжительность 10 мин.; значение рН 9,0 ед.; в состав реакционного буфера входит ДМСО в концентрации 30 %) и альфа-2Ь (соотношение белок/ПЭГ 1 к 0,7 по массе; концентрация интерферона 14 мг/мл; температура: комнатная; продолжительность 80 мин.; значение рН 6,8 ед.), в результате чего эффективность процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь повышена в 4,2 раза, интерферона альфа-2а в 3 раза.

4. Разработана технология хроматографической очистки пегилированных форм интерферона альфа-2Ь и альфа-2а с получением препаратов, соответствующих коммерческим препаратам Пегинтрон и Пегасис по показателям: изоформенный состав, содержание близкородственных и посторонних примесей, биологическая активность, что продемонстрировано в рамках проведенных исследований.

5. Проведено масштабирование разработанных технологических процессов получения субстанции интерферона альфа-2а и альфа-2Ь и их пегилированных форм. Проведена валидация данных технологических процессов, в ходе которой подтверждена их стабильность и воспроизводимость.

6. Разработанные технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь являются экономически рентабельными. Себестоимость одной дозы препарата пегилированного интерферона альфа-2Ь (за дозу 120 мкг) составляет 600 рублей (стоимость коммерческого препарата 7700 рублей), препарата пегилированного интерферона альфа-2а (за дозу 180 мкг) - 1000 рублей (стоимость коммерческого препарата 9900 рублей).

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. На основании полученных результатов разработана и утверждена технологическая документация, описывающая процесс получения субстанций интерферона альфа-2Ь и альфа-2а и их пегилированных форм (промышленный регламент ПР 56882590-22-14 от 04.12.14, промышленный регламент ПР 56882590-23-15 от 13.01.15).

2. Разработанные технологии получения субстанций интерферона альфа-2Ь и его пегилированной формы внедрены в производство ООО «Фармапарк» и используются для выпуска коммерческих серий препаратов интерферона альфа-2Ь (без N -концевого метионина) и ПегАльтевир (пегилированный интерферон альфа-2Ь).

3. Препарат ПегАльтевир зарегистрирован в реестре лекарственных препаратов (ЛП-002542 от 23.07.2014).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Препараты, созданные на основе субстанций пегилированного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, получаемых по разработанной технологии, являются первыми полноценными отечественными препаратами - аналогами коммерческих препаратов Пегинтрон и Пегасис. При этом полученные препараты отличаются меньшей стоимостью и рекомендуются для применения в терапии различных вирусных и онкологических заболеваний человека и животных.

2. Разработанные подходы оптимизации процессов ренатурации, пегилирова-ния и очистки пегилированных форм могут быть рекомендованы в качестве базовых подходов при разработке других пегилированных препаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Технология получения высокоочищснного пегилированного интерферона альфа-2Ь /H.A. Шамонов, C.B. Селищев, Н.В. Орлова и дрУ/Биофармацевтический журнал. - 2013.- № 5. Т. 5.- С. 53-63.

2. Оптимизация процесса пегилирования рекомбинантного интерферона альфа-2а активированным сукцинимидил ПЭГ с разветвленной структурой и молекулярным весом 40 кДа / H.A. Шамонов, Д.А. Зырянов, C.B. Селищев и др. // Биофармацевтический журнал. - 2014,- № 6. Т. 6 - С. 16-21.

3. Разработка технологии получения монопегилированного безметионинового интерферона альфа-2Ь без N - концевой изоформы / H.A. Шамонов, Д.А. Зырянов, C.B. Селищев и дрУ/Биофармацевтический журнал. - 2015,- № 1. Т. 7,- С. 3-12.

Подписано в печать:

12.02.2015

Заказ № 10537 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru