Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Актиномицеты-антагонисты и их действие на возбудителя вертициллезного вилта и хлопчатник

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Актиномицеты-антагонисты и их действие на возбудителя вертициллезного вилта и хлопчатник"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТф^ ^ ^

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ „

<■ \-.ii ¿А]

На правах рукописи УДК 576.852.615.33.582.796.632.4

МАМЕДОВА СУДАБЭ РУСТАМ гызы

АКТИН ОМШДЕТЫ-АНТАГОНИСТЫ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА ВОЗБУДИТЕЛЯ В ЕРТМЦИЛЛЕЗН ОГО ВИЛТА И ХЛОПЧАТНИК

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 2000

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Института микробиологии АН РУз

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук С.М.ХОДЖИБАЕВА

доктор биологических наук, профессор Ж.С. САФИЯЗОВ

кандидат биологических наук, В.Е.ХОХЛАЧЕВА

Кафедра низших растений и микробиологии биолого-почвенного факультета ТашГУ

у* СО

Защита состоится " р " октября 2000. г. в ■{■^ часов на заседании Специализированного Совета Д.015.02.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу:700128, Ташкент-128, ул. А. Кадыри, 76.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз

Автореферат разослан "^Г " сентября 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук С.М. ХОДЖИБАЕВА

'дгьёс. ¿¿¿/¿/-См-.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Хлопководство составляет основу экономики Узбекистана. Важная роль в повышении продуктивности хлопководства принадлежит разработке и внедрению эффективных мер по борьбе с вредителями и болезнями хлопчатника. Известно, что вертициллёзному вилту подвержено более 450 видов растений, в том числе, и хлопчатник.

На отдельных полях в годы сильного вертициллёзного увядания бывает поражено до 80-90% растений, а потери урожая на таких участках, при относительно раннем проявлении болезни, могут достигать 50-60%.

Борьба с вертициллёзным вилтом хлопчатника - одна из актуальных проблем, требующих быстрейшего' разрешения. В последние годы все большее внимание исследователей привлекают экологически чистые микробиологические методы защиты растений. Биопрепараты, в отличие от химических, обладают избирательностью действия и дают возможность отбора препаратов, не угнетающих развитие полезных форм микроорганизмов.

Особую значимость приобретают исследования по индуцированию защитных свойств самих растений. Установлено, что некоторые биологически активные вещества, проникая в растение, способны вызывать образование фитотоксических соединений, тем самым существенно повышать иммунитет последних. Это направление при разработке способов борьбы с вилтом, на наш взгляд, наиболее перспективно. При этом отпадает необходимость использования сильнодействующих химических фунгицидов, загрязняющих окружающую среду, токсических для теплокровных и нарушающих экологическое равновесие в биосфере (Аскарова,1976; Филатова и др., 1989; Ходжибаева, 1992).

На основании этих данных в ряде широко известных научных центров уже разрабатываются защитные мероприятия, позволяющие снизить потери от вилта и других широко распространенных заболеваний, и, соответственно, увеличить урожайность растений. Вопросы изучения и применения препаратов микробного происхождения стоят в центре внимания исследователей. Актуальность этой проблемы вполне объяснима, поскольку такого рода исследования имеют не только теоретическое, но и практическое значение.

Способность к синтезу и накоплению физиологически активных веществ свойственна многим микроорганизмам. Открытие антибиотиков положило начало развитию нового, прогрессивного направлений в химиотерапии растений, как эффективного средства повышения устойчивости растений, к инфекционным заболеваниям. Среди этих препаратов наибольшее применение находят антибиотики, образуемые актиномицетами. В отличие от химических препаратов, они используются в незначительных дозах и не накапливаются в природе. Помимо прямого ингибирующего действия на рост и развитие фитопатогенов, антибиотики повышают устойчивость растений к болезням путем индуцирования синтеза защитных веществ.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в отборе среди "актиномицетов продуцента антибиотика с резко выраженной активностью к грибам, подборе оптимальных условий для биосинтеза антибиотика в динамике роста и развития культуры, в выделении препарата и его биологической и физико-химической характеристике.

Исходя из поставленной цели определены следующие задачи исследований:

- поиск, выделение и идентификация активного продуцента противогрибкового антибиотика среди актиномицетов;

- разработка оптимальных условий для роста и развития продуцента и биосинтеза антибиотика;

- выделение антибиотика, его физико-химическая и биологическая характеристика;

- установление действия имбрицина на некоторые стороны метаболизма возбудителя вилта и хлопчатник;

- выявление возможности использования имбрицина для защиты хлопчатника от болезней.

Научная новизна. Выделен, изучен и идентифицирован Б1гер1отусез шЪпсаШз, штамм 1 - эффективный продуцент противогрибкового антибиотика. Оптимизированы условия культивирования для роста, развития и антибиотикообразования культуры. Разработана схема выделения антибиотика в лабораторных условиях, дана его физико-химическая и биологическая характеристика,позволившие установить идентичность с имбрицином.

Впервые установлено, что имбрицин индуцирует синтез защитных веществ в растениях хлопчатника, тем самым повышая

устойчивость к болезням. Показано, что имбрицин ускоряет метаболические процессы при прорастании семян хлопчатника, так содержание низкомолекулярных пептидов повышается за счет снижения высокомолекулярных.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований являются научной основой для использования антибиотического препарата имбрицина в борьбе с вилтом хлопчатника. Проникновение антибиотика через корни и листовую поверхность хлопчатника, длительное сохранение активности в тканях растений, индукция защитных свойств значительно повышают интерес к препарату. • Показана возможность использования имбрицина в хлопководстве в качестве как самостоятельного препарата, так и в комплексе "Биополан".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Республиканской конференции, посвященной 5-летию независимости Республики Узбекистан и 660-летнему юбилею Амира Темура (Ташкент, 1996), на 1-Съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 1997), научной конференции "Проблемы современной микробиологии и биотехнологии (Ташкент, 1999), Международный симпозиум "Биокатализ-2000" (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 2 статьи и 5 тезиса, имеется 1 авторское свидетельство.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы, приложения. Материалы изложены на 105 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 21 таблицами. Библиография состоит из 250 работ, из них опубликованых в зарубежных изданиях 67.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам Всеросийского НИИ антибиотиков и ферментов к.б.н. Башковичу А.П., к.б.н. Минбаеву P.M., руководству и сотрудникам лаборатории физиологии микроорганизмов Института микробиологии АН РУз за содействие при выполнении диссертационной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служил наиболее активный актиномицет Strepiomyces imbricatus, штамм I*, отобранный в результате проведенного скрининга 18 штаммов актиномицетов (музейных и выделенных из сероземных почв Узбекистана). Состав питательной среды: глюкоза -20 г, пептон -10 г, MgS04 х Н20 -0,5 r,NaCI-0,5r, КЬ^РО^О.б г агар-20 г, вода-1 л. В дальнейшем культуру Str. imbricatus, ium.1 выращивали при t =28 °С в течение 7-10 суток на среде Чапека с крахмалом следующего состава: крахмал - 20 г, К2НР04 -1 г, NaN03 - 3 г, KCl - 0,5 г, MgS04 - 0,5 г, FeS04 - 0,015 г, агар - 20 г, вода -1 л.

Антигрибковую активность проверяли на агаризованной среде Чапека с сахарозой: NaNOs - 2 г, КН2РО 4 - 1 г, KCl - 0,5 г, MgS04 - 0,5 г, FeS04- 0,01 г, сахароза - 20 г, агар - 20 г, вода - 1 л. методом наложения блоков на газон тест-культуры, а на жидкой среде - методом серийных разведений (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований, 1980). Тест-культурой служили различные по вирулентности штаммы гриба Verticillium dahliae Kleb.

Посевной материал для проведения ферментации и выделения антибиотика выращивали в течении 48 часов на качалке при t=28 °С и вносили в ферментационную среду в количестве 15%. Ферментация проходила в течении 4-5 суток. Для извлечения антибиотика из биомассы предварительно изучали его растворимость в различных экстрагентах -спиртах и ацетоне различной степени водности.

Изучены физико-химические свойства и антимикробный спектр выделенного антибиотика. Для выделения фитотоксического комплекса из растений хлопчатника использовали смесь хлороформ-этанол (2:1), после чего обрабатывали диметил-формамидом. Обе фракции проверялись на активность к V.dahliae разного возраста.

Выделение и определение белков из проростков хлопчатника проводили по методу Lowry (1951). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Аналитический электрофорез хлопчатника проводили по методу Laemmli (1970). Для количественного определения относительного содержания

* в последующем Str. imbricatus, шт. 1.

белков, гели денситометрировали на лазерном денситометре LKB, Vetrasonic (Швеция).

Выявление эффективности имбрицина в полевых условиях проводили в хлопкосеющих хозяйствах Ташкентской области в сравнении с другими рекомендуемыми ' препаратами, различающимися по химической природе и характеру действия на растения. Акты испытаний прилагаются в приложении к диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1.Бнологнческие особенности Streptomyces imbricatns, штамм 1.

Морфолого-культуральные признаки. Культура Str. imbricatus, ium.1 интенсивно растет на различных питательных средах - органических и синтетических. Колонии средней величины, серовато-белого цвета, бугристые, выпукло-складчатые. Спороносцы спиральные, собранные в метелки. Спирали растянутые, с 4-6 витками. Споры шаровидные и овальные, поверхность оболочки спор гладкая. Споры формируются на ветках воздушного мицелия серовато-белого или серого цвета. Диффундирующий пигмент не обнаружен. Колонии матовые или сероватые.

Агар Чапека с глюкозой. Ростхороший, воздушный мицелий отсутствует или слабо развит, сероватый. Колонии средней величины, матовые или сероватые, с зазубренными или зубчатыми краями. Среда не окрашивается.

Крахмало-аммиачная среда. Рост хороший, колонии круглые, серые, местами слабый беловатый налет воздушного мицелия. Среда не окрашивается.

Глюкозо-аспарагиновая среда. Рост хороший, колонии серовато-белые, круглые, выпуклые, воздушный мицелий в виде слабого налета, среда не окрашивается.

Среда Гаузе 1. Рост обильный, воздушный мицелий белоснежный, колонии складчатые, бугристые, темно-песочные. Субстратный мицелий зеленовато-серый или глинисто-желтый. Среда не окрашивается.

Среда Гаузе 2. Ростхороший, воздушный мицелий кремовый с розовым оттенком или палевый. Колонии серовато-желтые, складчатые, бугристые, в виде бородавок. Субстратный мицелий желтовато-бурый. Среда не окрашивается.

Мясо-пептонный агар. Рост слабый, колонии сморчковидные, выпуклые, бесцветные и сероватые, воздушный мицелий отсутствует. Среда не окрашивается.

Картофельная среда. Рост хороший, колонии бородавчатые, светло-серые, воздушный мицелий отсутствует, среда окрашивается в светло-бурый цвет.

Культура Str. imbricatus, шт. 1 по своим признакам ближе всего относится к группе серых актиномицетов Str.griseus. Для сравнительного изучения были использованы различные штаммы Str.griseus. (табл.1), которые были получены нами из лаборатории изысканий новых антибиотиков (г.Санкт-Петербург). Из таблицы видно, что в сравнении с изученными различными штаммами Str.griseus, культура Str.imbricatus, шт.1 по морфолого-культуральным признакам наиболее близка к Str.griseus 12646.

Однако, в результате сравнения физиологических свойств этих штаммов было обнаружено различие по способности усваивать некоторые источники углерода. В результате между изучаемыми культурами был обнаружен отчетливо выраженный взаимный антагонизм, что еще раз свидетельствует о различии сравниваемых культур.

2. Антимикробные свойства Str.imbricatus, шт.1

Изучаемая нами культура активно подавляет рост грам-положительных бактерий-стафилакокков, сарцин, микобактерий, спороностных бактерий. Она действует на грамотрицательные бактерии - E.coli, Pseudomonas sp.H др. Значительная активность проявляется у штамма по отношению к гифальным.грибам, слабо действует против дрожжей и дрожжеподобных грибов. Str.imbricatus,шт.1 активно подавляет некоторые виды актиномицетов.Из испытанных нами видов наиболее чувствительны Str.albus, Str.levoris, Str.griseus.

Для изучения образования антибиотических веществ при глубинном культивировании было проверено несколько ферментационных питательных сред. Данные по проверке активности актиномицета в зависимости от питательных сред представленны в таблице 2.

Установлено, что активность экстракта из мицелия при выращивании Str.imbricatus,шт. 1 на различных питательных средах колеблется в пределах от 1:40 до 1:1280 ед/разведения.

При глубинном культивировании Str. imbricatus, шт. 1 рост хороший, мицелий крупинчатый, серого цвета, быстро оседающий на дно колбы при стоянии, культуральная жидкость прозрачная, светло-коричневого цвета.

Лучшими питательными средами для биосинтеза антибиотика являются органическая среда N2 и кукурузная- 21/12 и 22. В условиях глубинной ферментации активность на таких средах по отношению к Candida albicans и V.dahliae колеблется от 1:640 до 1: 1280 ед/разведения.

Таблица 1

Морфолого-культуральные признаки Streptomyces imbricatus, шт 1 и близких к нему видов

Куль-' Споро- Среда

тура носцы Чапека с глюкозой Чапека с крахмалом Органическая №2 Глюкозо-аспарагиновая

воздушный мицелий пигмент воздушный мицелий пигмент воздушный мицелий пигмент воздушный мицелий пигмент

Str. imbricatus, штамм 1 спиральные белесовато-серый (3-4) нет отсутствует нет отсутствует нет сероватый нет

Str. griseus 11 спиральные грязно- бз<раваго- фиолего- вый (М-3) нет тёмно-дымчатый (М-1) нет Беловатый (Д-1) нет бледный (Д-1) нет

Str. griseus 1769 спиральные беловато -серый (3-4) нет пепельно- серый (К-2) нет беловатый (Д-1) нет отсутствует нет

Str. ' griseus 6282 спиральные мышино -серый (3-4) нет пепельно-серый (К-2) нет дымчатый (А-1) нет бледно-пепельный нет

Str. griseus 12646 спиральные белесовато-серый (3-4) нет отсутствует нет отсутствует нет сероватый нет

* Определение цвета проводили по таблице цветов А.С.Бондарцева ( 1954).

Таблица 2

Образование антибиотического вещества Streptomyces imbricatus, luml на различных средах

Тест-микроб Среда

№2 ■N¡>21/12 №22 №5 №54

Культуральная жидкость (зона подавления в мм/г)

Staph, aureus 8 5 6 5 2

Candida albicans 7 6 5 4 2

Sacch. cerevisiae 2 1 2 .0 0

Vert, dahliae 7 5 5 5 5

Ацетоновый эксграт (зона подавления в мм/г)

Staph, aureus 6 7 7 5' 3

Candida albicans 8 8 8 6 4

Sacch. cerevisiae 2 1 1 0 0

Vert, dahliae 8 9 8 6 2

Ацетоновый экстрат (ед/разведения)

Candida albicans 1:640 1:640 1:640 1:40 1:40

Vert, dahliae 1:640 1:640 1:1280 1:80 1:40

3. Динамика роста и антибиотикообразования 81глтЬг'1са1и$,штЛ

При засеве питательной среды спорами логарифмическая фаза в динамике роста 8(ктЬггса1из,шт.1 характеризуется проростанием спор и началом роста культуры. При этом отчетливо выражена задержка начального роста. Массовое проростание спор наблюдалось через 10-12 часов после засева среды. Цитоплазма ростовой трубки интенсивно окрашивалась мётиленовым синим, что свидетельствует о высоком содержании в ней РНК. Рост первичной гифы и ее боковых побегов у актиномицета наблюдается через 12-14 часов, при этом споры уже не обнаруживались. При использовании в качестве посевного материала вегетативного мицелия к 12-14 часам после засева среды прорастающие обрывки посевного мицелия образуют многочисленные мелкие, интенсивно растущие микроколонии.

Экспоненциальная фаза характеризуется интенсивным ростом культуры. Через 14 часов ферментации в культуральной

жидкости содержались многочисленные, длинные, утолщенные, слабо ветвящиеся гифы. Культура входит в период, интенсивного роста и энергично потребляет питательные вещества.

В течении лаг- и экспоненциальной фаз развития культуры 81гЛтЬг1са1и$,штЛ (физиологические фазы) антибиотическое вещество практически не образуется или образуется.в незначительных количествах (анализ продуктивности мицелия производится расчетом прироста антибиотического вещества на 1 мг сухого мицелия за 1 час) (рис. I).

3

4

о о.

о е; 2 о

о

и И

Н о

Ю X

н <

Рис. 1. Накопление биомассы (-) и антибиотика (---) в динамике

роста Sir.imbricatus, тт. 1 на среда с мальтозой, накопление биомассы (♦—♦ ) и антибиотика (•—в) а динамике роста Sir.imbricatus, шт. 1 на среде с сахарозой.

Стационарная фаза характеризуется замедлением роста культуры Str.imbricatus, turtt.l, измеряемый приростом биомассы в единицу времени. В связи с этим в этой фазе развития значительно медленно используются питательные вещества. И на 4-5 сутки вес мицелия достигал максимального значения, а питательные компоненты в основном использованы. Вступление Str. imbricatus.uim.l в эту- фазу развития сопровождалось резким повышением содержания антибиотического вещества. Масса мицелия в начале этой фазы обладала наиболее высокой способностью к образованию антибиотика. Максимальное количество антибиотического вещества в культуральной жидкости накапливалось к концу стационарной фазы.

Фаза отмирания. После 5 суток культура Str. imbricatus, шт. 1 стареет. Идет спорообразование и автолиз клеток.

При изучении динамики накопления активного вещества установлено, что активность культуральной жидкости достигает максимальной величины на пятые сутки роста культуры. На основании сумарной активности можно считать, что для получения высокоактивного вещества необходимо 5-ти суточное культивирование продуцента.

4.Выделение и физико-химические свойства имбрицина

С целью выделения и идентификации были изучены следующие свойства антибиотика: растворимость в воде и различных органических растворителях; подвижность при хроматографии в различных системах растворителей, а также спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях. Хроматографирование антибиотика проводили в 12-ти системах растворителей. На основании анализа полученных хроматограмм построен стандартный график значения Rf для имбрицина.

С учетом растворимости антибиотика в различных системах растворителей разработана схема лабораторного выделения антибиотика -сырца, который имеет вид желтовато-серого порошка, с максимумом спектра поглощения в области 240270 ммк.

Выход антибиотика-сырца составляет 22 мг на литр глубинной культуры. Препарат негигроскопичен, имеет горький вкус и слабый грибной запах.

В производственных условиях с целью оптимизации стадии извлечения антибиотика из мицелия, снижения его потерь в процессе осаждения, кристализации и промывки проведено изучение растворимости имбрицина в различных экстрагентах -спиртах, ацетоне различной степени водности. Установленно, что наибольшей растворяющей способностью обладает водный 65-70%-ный метанол и 55-60%-ный изопропанол: растворимость в них имбрицина достигает 120-150 мг/мл. В 65-70%-ном водном ацетоне растворяется до 35-40 мг/мл антибиотика, причем, растворимость существенно повышается при нагревании экстрагента до 40-45°С и достигает 130-140 мг/мл. В 98%-ном водном ацетоне растворяется в 8-10 раз меньше имбрицина, чем

в этиловом и метиловом спиртах такой же степени водности, но все же достигает существенной величины- 6-8 мг/мл.

Исходя из полученных данных, для извлечения антибиотика из биомассы отобран более избирательный экстрагент - водный 54-65%-ный спирт или ацетон. Концентрирование экстракта проводится до содержания растворителя - 25%, соответственно воды -75%. При таком процентном соотношении вода-растворитель резко повышается растворимость в концентрате антибиотика и он выпадает в осадок в процессе упарки, а примеси, извлекаемые из клеток мицелиальной массы, остаются в растворенном состоянии.

Такой способ выделения и химической очистки имбрицина позволяет получить продукт с активностью 800-950 мкг/мг и выходом не менее 50%. Значительно сокращаются операции очистки антибиотика, экономятся растворители, упрощается аппаратурно-технологическая схема процесса.

Схема выделения имбрицина-сырца из мицелия Streptomyces imbricatus, шт1.

Культуральная жидкость .

I-П

Фильтрат Мицелий

Экстракция Н-бутанолом

I

Вакуум^упарка досуха

I

Промывка петролейным эфиром

I

Вакуум- сушка I

Порошок сухой (препарат сырец)

Активность выделенного антибиотика составляла от 12,5-0,39 мкг/мл. к St. aureus и Candida albicans

Выделенный антибиотик проявил высокую противогрибковую активность, включая некоторые фитопатогенные грибы (табл.3).

При этом, в зависимости от концентрации, имбрицин обладает как фунгистатической, так и фунгицидной активностями.

Таблица 3

Противогрибковый спектр имбрицина

Тест-микроб Минимальная доза задержки роста, мкг/мл

Alternaria radicini 3,12

Alternaria solani 1,56

Alternaria humicola 0,78

Ascochyta pisi 12,50

Ascochyta trifolii 3,12

Aspergillus niger 1,56

Botrytis cinerea 6,25

Cladosporium herbarum 3,12

Cladosporium falvum 3,12

Colletotrichum digitalis 6,25

Colletotrichum lagenarrium 1,56

Fusarium avenaceum 1,56

Fusarium nivale 3,12

Fusarium solani 6,25

Fusarium culmorum 1,56

Fusarium oxysporum 6,25 .

Fusarium vasinfectum 3,12

Pénicillium digitatum 3,12

Rhizoctonia solani 1,56

Rhizoctonia violacés 3,12

Rhizoctonia sp. 1,56

Verticillium dahliae 1,56

5. Действие имбрицина на некоторые метаболические процессы хлопчатника

Направленное действие различных регуляторов, в том числе антибиотиков, на рост растений определяется ответной реакцией системы синтеза белка. Изучение влияния имбрицина на содержание растворимых белков хлопчатника проводилось совместно и на базе лаборатории биохимии белка (Институт

биохимии АН РУз). Для сравнения использовали стимулятор Т, являющийся объектом исследования данной лаборатории. Сравнительный анализ денсимограмм гелей показал, что через 24 часа после обработки имбрицином происходит накопление в первичных корешках низкомолекулярных полипептидов с молекулярной массой 12-25 кД и соответственно, высокомолекулярных полипептидов с молекулярной массой 45-67 кД. У двухдневных проростков изменения в профиле фракционного состава выражены более заметно в высокомолекулярной зоне. В спектре белка отмечается убыль полипептидов с молекулярной массой 45-55 кД (рис.2).

'С" ХТ ■ ОУА А

1

■ и .

1,0 08 06 04 0,2 0,0 ОЭП

Рис. 2. Денсигограммы растворимых белков хлопчатника, обработанного имбрицином - 48 часов (корешки) ....... Имбрицин; - Контроль

Выявлено, что по мере проростания семян хлопчатника происходит постепенный распад высокомолекулярных полипептидов. В начальный период проростания обработанных имбрицином растений, спектр белков (24 ч.) характеризуется уменьшением сордержания полипептидов с молекулярной массой

18-60 кД и накоплением низкомолекулярных полипептидов с молекулярной массой 17-19 кД.

По мере проростания в спектре растворимых белков хлопчатника число идентифицированных компонентов остается на уровне контроля, но при этом отмечается уменьшение их абсолютного количества, что можно объяснить высоким уровнем протеазной активности.

Таким образом, на основании полученных данных при исследовании растворимых белков семядолей и корешков семян хлопчатника в раннем онтогенезе, можно сделать заключение, что в исследованные сроки при обработке имбрицином наблюдается перераспределение содержания белковых компонентов в области низкомолекулярных компонентов одновременное интенсивной их утилизацией. Распад запасных белков и их перераспределение несколько выше в опытных вариантах, что указывает на положительный эффект используемого антибиотического препарата. Можно констатировать, что под действием имбрицина в раннем онтогенезе хлопчатника происходит изменение количественного содержия отдельных фракций белков проростков хлопчатника: уменьшение высокомолекулярных и более интенсивное накопление низкомолекулярных, что указывает на интенсификацию метаболических процессов в растениях хлопчатника.

6. Индуцирование фитоалекеннов хлопчатника

Наши многолетние исследования показали, что полиеновые антибиотики индуцируют синтез фитоалексинов у хлопчатника, тем самым повышая устойчивость к заболеваниям. Иммунитет растения, обработанного антибиотиком, определяется с одной стороны специфичностью к патогену, проникшему .в растение, а с другой - интенсивностью образования под его влиянием антифунгального комплекса, обладающего более широким антимикробным спектром действия.

При обработке семян имбрицином (для сравнения с полиеновым антибиотиком нистатином) наибольшая антифунгальная активность обнаруживалась в листьях, а более низкая в стеблях и корнях растений (табл. 4), в опытах с растениями в фазу первых настоящих листьев наибольшая активность для имбрицина была отмечена в стеблях, а для нистатина в листьях. В корнях содержание антифунгальных веществ было незначительным.

Таблица 4

Антифунгальная активность экстрактов из растений хлопчатника, обработанных антибиотиками в начальную фазу развития (замочка семян) и в фазу первых настоящих листьев (Я/мм)

Антибиотики водорастворимые Концентрация % Обработка семян Обработка растений

корень стебель лист корень стебель лист

Имбрицин 0,01 1,0 0,5 5 8 7 7

0,001 0,5 3,0 17 5 15 3

Нистатин 0,1 1,0 1,0 5 1 1 3

0,001 1,2 1,0 2 0,5 1 2

Контроль 1,0 0,2 2 0 0 1

Выделение поступивших в растение антибиотиков проводили путем их экстракции из тканей диметилформамидом и дальнейшей хроматографией. Установленно, что имбрицин и нистатин имеют одинаковую хроматографическую подвижность в системе метоксиэтанол-хлороформ 1:1 Rf-0,65 и Rf-0,66 соответственно. Диметилформамидные экстракты из растений содержали компоненты, дающие цветные реакции на вещества полиенового ряда и имеющие спектральные характеристики и хроматографическую подвижность исходных антибиотиков.

Комплекс биологически активных веществ, образующихся под влиянием индукторов, характеризуется широким антимикробным спектром действия: ингибирует рост и развитие грибов, включая возбудителей вилта, грамположительных (St.aureus) и грамотрицательных (E.coli) бактерии, в том числе возбудителя гоммоза хлопчатника X.malvacearum (табл.5).

Выявление роли сортовых особенностей растений хлопчатника на образование антифунгального комплекса проведено на примере сортов хлопчатника 108-Ф и "Ташкент-6", индуцированных культуральнойжидкостьюStr.imbricatus, шт. 1 и водным раствором имбрицина -0,001%. Показано, что оба сорта в равной степени способны к образованию антифунгальных веществ при воздействии на них индукторов.

7. Использование имбрицина для защиты хлопчатника от болезней

Исследования показали, что имбрицин довольно легко всасывается корневой системой и через ксилему попадает в

надземные органы - стебель и листья. Препарат проникает в растение через листовую поверхность, а также в семена. Недостатком замачивания семян в растворе антибиотика является то, что в результате быстрого' развития растений на первых фазах их роста процент- препарата, приходящегося на каждый грамм ткани, быстро снижается, а соответственно, падает и эффективность защитного действия. В связи с этим, важной задачей является поиск новых рациональных способов введения препарата в растение.

Таблица 5

Антимикробный спектр действия антифунгального комплекса хлопчатника (г/мм)

Индуктор

Тест-культура к.ж. суспензия имбрицин нистатин

V.dahliae N.muscorum 0,001 0,001

V. dahliae 5 3 7 7

Fus. vasinfectum 3 2 6 5

Fus. heterosporium 3 2 4 j

Rhizoctonia solani 0 0 2 0

Pen. chrusogenum 2 1 2 2

X. malvacearum(uiT22) 1-1 8 13 12

X.malvacearum .

(BKM-B-622) 7 4 8 7

St. aureus 5 - 5 4 5

E.coli 4 4 4 4

Turelopsis glutinis 0 0 0 0

Sacch. cerevisiae 2 1 2 2

Candida sp. 0 0 0 0

Str. griseus 6 4 7 7

Proact. ruber 10 10 .8 8

Поэтому в дальнейшем нами изучалась способность антибиотика проникать в растение хлопчатника через листовую поверхность. Показано, что опрыскивание ведет к накоплению антибиотика в тканях растений в количествах, достаточных для его обнаружения не только с помощью биологического теста, но и спектрофотометрически. Во всех этих опытах антифунгальная активность обнаруживалась в тканях растений хлопчатника на протяжении 20-30 суток с максимумом на 15-20 сутки (биологическое тестирование) (рис.3).

10

9-'

81 76' 5-,

41 31 21

Ч

I

10 20 30 40 10 20 30 40 сутки

1 -2 Рис. 3. Антифунгальная активность к У.сЗаИИае экстратов из листьев (1) и корней (2) проростков хлопчатника, обработанных 0,01% раствором

нистатина

иимбрицина]

Анализ хроматогрфических полос антифунгальных веществ, полученных из экстрактов корней и листьев растений, позволяет предпологать, что до 20-ти суток имбрицин, поступивший в растение, сохраняется без заметных изменений.

Под действием имбрицина и нистатина наблюдалось повышение всхожести и энергии прорастания семян, интенсивности роста растений, особенно на первых фазах развития. Прирост длины опытных растений в этот период составляет 6-7 см в сутки, а в контрольных - около 4 см. В частности, на примере сорта 108-Ф показано, что всхожесть семян, обработанных 0,01% раствором нистатина, повышается от 68% в контроле до 90% в опыте, а имбрицином - до 98% (рис.4).

По инициативе Ташкентского научного центра проведены полевые испытания по влиянию разработанных узбекскими учеными 6-ти препаратов, в том числе имбрицина, на всхожесть семян, заболеваемость и урожайность хлопка-сырца в 3-х хозяйствах Ташкентской области. В каждом хозяйстве опыты ставились в 3-х кратной повторности на площади 1 га.

Проведенные испытания показали, что более энергично повышал всхожесть семян имбрицин - 130-140%. Рост-стимулирующая активность остальных препаратов находилась в пределах 109-120 % относительно контроля.

0,5

1,5

0

1

5

10

17

сутки

Рис. 4. Прирост растений хлопчатника (см/сутки) сорта 108-Ф

растворах нистатина Qi

Показано, что в вариантах с имбрицином количество коробочек увеличивается относительно контроля на 125-130%. Также повышается урожайность и достигает 40-41 ц/га (акты испытаний прилагаются).

Результаты, полученные по использованию имбрицина в хлопководстве, 'защищены авторским свидетельством N1506609 и легли в основу созданного В Институте микробиологии АН РУз эффективного биологического комплекса "Биополан", получившего признание хлопкоробов (авт.свид.Ы 428992).

1. Выделен активный продуцент полиенового противогрибкового антибиотика с фунгицидной и фунгистатической активностями. Изучены его морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства, позволившие идентифицировать его как Streptomyces imbricatus, штамм I.

2. Оптимизированы условия культивирования Str. imbricatus, ium.1 для максимального накопления биомассы и антибиотика.

3. Изучена динамика роста, развития культуры и биосинтеза имбрицина.

ВЫВОДЫ

4. Разработаны способы выделения имбрицина в лабораторных и производственных условиях, изучены его физико-химические и биологические свойства.

5. Выявлена индуцирующая способность имбрицина на образование антифунгального комплекса в растениях хлопчатника сортов 108-Ф и "Ташкент-б", повышающего устойчивость к заболеваниям.

6. Установлено, что имбрицин ускоряет метаболические процессы в семенах хлопчатника при их прорастании, в частности, отмечается распад высокомолекулярных полипептидов и интенсивное накопление низкомолекулярных.

7. В полевых условиях установлено, что имбрицин повышает всхожесть и энергию прорастания семян хлопчатника, ускоряет фазы развития растений, снижает их заболеваемость, что приводит к повышению урожайности (Авт.свидет.М 1506609).

Антагонист г актниомицетлар ва уларнинг веритицпллга ва гузага таъсири

Табиатан замбуругга кдрши антибиотик синтез киладиган Б^ерЮтусез ¡тЫсай^нинг 1-штамми ажратиб олинди ва унинг усиш хдмда антибиотик >^осил к,илиш шароитлари аник/тнади. Лаборатория шароитида антибиотик ажратиб олиш схемаси (тизими) ишлаб чик;илди. Ажратиб олинган ва тозаланган антибиотикни физик-кимёвий ва биологик хусусияти урганиб чикилиб, унинг имбрицинга ухшаш эканлиги исботланди.

Биринчилардан булиб, имбрицинни рузаусимлигида х;имоя моддалари синтез к,илинищини кучайтириши ва шу туфайли рузани >^ар хил касалликларга чидами ошиши исботланди. Бундан ташкари, имбрицин чигитни усиши даврида метаболик жараёнларни тезлатиши хусусан, юцори молекуляр массага эга булган оксилларни ларчаланишини тезлатиш *исобидан кичик молекуляр массага эга булган пептидлар хосил булиши'кузатилди.

Олинган натижалар имбрицинни гузани вилт касаплигига карши ишлатиш учун илмий асос булиб хизмат килади. Антибиотикни гуза барги ва илдиз тукималаридан бемалол утиши, усимлик тук;ималарида узок; вакт сакланиши ва *имоя воситаларини индукция к;илиши, бу препаратга нисбатан янада куп рок, к,изи1<иш уйготади. Пахтачиликда инбициндан соф холда ёки "Биополан" биопрепарати таркибида ишлатиш мумкинлиги курсатилган.

Actinomycetes - antagonists, theik influence on Verticillium dabliae pathogene and cotton plants

Strain I of Streptomyces imbricatus was found to be an active producer of a number of polyenic and antifungial antibiotics.

Thus one of them called imbricin, being previously isolated and purefied, displayed its high fungicidic and fungistatistic activities. Some (phusical, biochemical, biologicael) properties as well as the way of isolation in the condition of laboratoiy and production have been studied and elaborated.

The antibiotic showed its ability to form antifungial complex that could eucrease resistance of cotton plant to various deseases. Experiments carried out have shown the positive antibiotic influence on methabolic processes in cotton plants.

Some conditions dealing with culture growth and develoment as well as antibiotic synthesis weke optimized.

Список работ опубликованных no теме диссертации

1. Ходжибаева С.М., Бородин Г.И.,Филатова О.Ф., Мамедова С.Р. Сравнительное действие биологически активных веществ на возбудителя вилта хлопчатника. Тез.докл.УП конф. по споровым растениям республик Ср. Азии и Казахстана Алма-Ата, с.97 1984 г.

2. Ходжибаева С.М., Мамедова С.Р., Башкович А.П., Ширай Л.П. Способ предпосевной обработки семян хлопчатника. Авторское свидетельство N1506609 от 8.05.1989 г.

3. Мамедова С.Р., Ходжибаева С.М., Назирова Э.Р. Влияние имбрицина на содержание растворимых белков хлопчатника в раннем онтогенезе. Узб.биол.журн. 1997 г., N4. с. 13-16.

4. Мамедова С.Р., Ходжибаева С.М. Полиеновые антибиотики в повышении устойчивости хлопчатника к вилту.Докл.АН РУз, 1997 г., N9. с. 41-44.

5. Мамедова С.Р.,Ходжибаева С.М. Влияние полиеновых антибиотиков на ферменты хлопчатника. 1 Респ.сьезд микробиологии Узбекистана, Ташкент, 1997 г. с. 137.

6. Мамедова С.Р., Ходжибаева С.М. Действие биологически активных веществ микроорганизмов на образование антифугального комплекса в растениях. 1 Респ. сьезд микробиологии Узбекистана, Ташкент, 1997 г. с. 138.

7. Мамедова С.Р., Ходжибаева С.М. Индуцирование фитоалексинов хлопчатника. Тез. докл. науч. конфер." Проблемы современной микробиологии и биотехнологии" Ташкент, 1999 г. с. 153.

8. Мамедова С.Р., Пулатова Л.Т., Ходжибаева С.М. "Some properties of free and immobilized cells of Streptomyces imbricatus. strain /" Тезисы докладов Международного симпозиума "Биокатапиз - 2000" Москва, июнь - 2000 г.