Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах"

Носков Андрей Анатольевич

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ 4,6 ЗАМЕЩЕННЫХ 2-ДЕЗОКСИСТРЕПТАМИНОВ ИЗ ВОДНЫХ СРЕД И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ В ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково - 2004

Носков Андрей Анатольевич

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ 4,6 ЗАМЕЩЕННЫХ 2-ДЕЗОКСИСТРЕПТАМИНОВ ИЗ ВОДНЫХ СРЕД И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ В ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково - 2004

Работа выполнена в Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ

Научный руководитель- доктор технических наук

Михайлов Виктор Александрович.

Научный консультант доктор биологических наук

Албулов Алексей Иванович

Официальные оппоненты:: доктор технических наук, профессор

Римарева Любовь Вячеславовна

кандидат биологических наук Широкова Елена Павловна

Ведущее учреждение: - Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится "16" декабря 2004 г., в 10.00 ч на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г. Щелково, Московская область, п. Бнокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "15" ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

РОС. НАЦИО..,!...

БИБЛИОТЕКА

СПекрСмг С о» тЧлгг'

1иоим |

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди многочисленных лекарственных средств, применяемых в медицинской и ветеринарной практике, большое значение приобрели препараты, получаемые в результате микробиологического синтеза. К ним в первую очередь относятся антибиотики.

В ряду антибиотиков широкого спектра действия важное место занимают аминогликозидные препараты и, в частности, 4,6 замещенные 2-дезоксистрептамины (АМГ) - гентамицин, тобрамицин и апрамицин. Следует отметить, что до настоящего времени производство тобрамицина и апрамицина в нашей стране отсутствует.

Аминогликозиды проявляют бактерицидное действие в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. В терапевтических концентрациях они активны против Е. coli, Salmonella, Shigella, Brucella, Proteus, Staphylococcus и ряда других микроорганизмов. Большое значение имеет активность аминогликозидов, и в частности, тобрамицина, в отношении синегнойной палочки. Апрамицин, хорошо зарекомендовал себя в ветеринарии. Препарат весьма эффективен при сальмонеллезах, колибактериозах, стафилококковых и стрептококковых инфекциях.

В настоящее время зависимый от импорта выпуск антибиотиков не может способствовать развитию России как полноценного самостоятельного государства, которое преследует свои национальные интересы, поскольку зависимость от импортных поставок влияет на экономическую безопасность страны.

Выпуск качественных препаратов АМГ вызывает в свою очередь необходимость наличия высокоэффективных и экспрессных методов выделения и очистки антибиотиков, позволяющих снизить материальные и временные затраты без снижения качества получаемых продуктов. Увеличение объема производства требует использования простых в технологическом исполнении и недорогих методов, позволяющих осуществлять эффективный контроль производства выпускаемой продукции. При этом своевременность и адекватность анализа препарата на различных технологических стадиях позволяет оперативно влиять на процесс производства.

Как и в технологии получения, так и в физико-химических методах, используемых для контроля содержания АМГ в технологических растворах, их выделение и разделение осуществляется преимущественно сорбционными методами. Если на стадии выделения основной задачей является максимальное извлечение антибиотика из КЖ, то при контроле содержания их немаловажную роль играет достоверность и оперативность проведения анализа.

Как метод выделения, ионообменная сорбция обеспечивает получение антибиотиков высокого качества без использования дорогостоящих пожаровзрывоопас-ных растворителей и дает возможность получать антибиотик из культуральной жидкости или из грубоотфильтрованных растворов. Наряду с несомненными достоинствами ионообменная сорбция обладает и рядом недостатков, например, использование громоздкого оборудования, занимающего большие производственные площади; значительные затраты физического труда при обслуживании оборудования; длительность и многооперационность процесса выделения и очистки; большие потери и значительный расход реагентов (воды, минеральных кислот и щелочей).

Одним из направлений интенсификации процесса выделения является использование экстракционных методов, которые просты в исполнении, не требуют сложного и дорогостоящего оборудования и позволяют осуществлять процесс за короткие промежутки времени.

В связи с этим, актуальность работы обусловлена необходимостью разработки эффективных и экспрессных способов выделения АМГ из водных сред, к которым относятся экстракционные методы, например экстракция с "переносчиком".

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Провести теоретическое и экспериментальное изучение процесса взаимодействия АМГ с "переносчиками".

2. Разработать оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред с растворимым в органической фазе "переносчиком".

3. Оценить возможность выделения гентамицина и тобрамицина из нативного раствора.

4. Разработать оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред с растворимым в водной фазе "переносчиком";

5. Разработать методику определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом;

6. Оценить воспроизводимость разработанного метода экстракционного выделения и методики определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом и произвести сравнительную их оценку с существующими методами.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование процесса взаимодействия АМГ с рядом органических реагентов и на основе проведенных исследований выбраны оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред и экстракционно-фотометрического определения их концентрации технологических растворах.

Впервые разработан метод экстракционного выделения гентамицина, тобра-мицина и апрамицина с растворимым в органической фазе "переносчиком".

Впервые разработана универсальная методика определения концентрации АМГ в технологических растворах, основанная на определении разности концентраций красителя, связанного в ассоциат с АМГ, и свободного красителя.

Практическая значимость работы. Разработанный метод выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" позволяет сократить время проведения процесса выделения гентамицина в 10 раз, тобрамицина в 18,5 раз при сохранении количественного выхода полупродуктов.

Разработанная методика определения концентрации АМГ экстракционно-фотометрическим методом позволяет сократить время проведения анализа с 20-24 до 2 часов, что дает возможность оперативно корректировать процесс производства.

Апробация работы. Основные положения работы обсуждались на итоговых научных конференциях Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ (г. Екатеринбург, 1996-2002 гг.), на юбилейной научной конференции НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на юбилейной научной конференции Центра ВТП БЗ (г. Екатеринбург, 1999 г.). на V молодежной школе - конференции по органической химии (УрО РАН г. Екатеринбург, 2002 г.).

Структура и объем диссертации. Работа включает в себя введение, 6 глав, в том числе литературный обзор (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), материалы и методы (глава 6) и основные выводы о проделанной работе. Материал диссертации изложен на 139 стр., иллюстрирован 33 рисунками 34 таблицами. Список использованной литературы включает 88 источников, из них - зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа была выполнена на базе Центра военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии Министерства Обороны Российской Федерации (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ) и кафедры биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (МГАВМБ).

В исследованиях использовали культуральные жидкости (КЖ) , полученные при ферментации актиномицетов Streptomyces cremeus subsp. tobramycini (тобрами-цин и апрамицин) и Micromonospora purpurea var. violacea (гентамицин) их нативные растворы (HP). Содержание антибиотика в HP составляло не менее 500 мкг/мл.

В качестве "переносчиков" и растворителей в работе использовали доступные органические вещества прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

Раствор "переносчика" получали путем растворения концентрата органического вещества в неполярном алифатическом растворителе.

Аммиачную форму "переносчика" в органическом растворителе получали двух-, трехкратной обработкой его 12 % раствором аммиака при объемном соотношении "переносчик"-раствор аммиака равном 1:2 в делительной воронке при перемешивании.

Экстракцию АМГ раствором "переносчика"и реэкстракцию их растворами аммиака и натрия гидроксида осуществляли в делительной воронке вместимостью 50 см3. Содержание АМГ в водных растворах осуществляли методом ВЭЖХ.

Исследование экстракции ассоциатов АМГ с различными сульфофталеиновы -ми красителями проводили на спектрофотометре фирмы Shimadzu модель 1202, а остальные фотометрические измерения - на фотометре фотоэлектрическом КФК-3.

Обработку полученных данных методом регрессионного анализа осуществля -ли с использованием пакета анализа программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор "переносчиков" для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

При выборе "переносчика" для экстракционного выделения АМГ провели сравнительную оценку способности извлекать АМГ из водной фазы в ионный ассо -циат представителей ряда карбоновых кислот (олеиновая кислота (ОК), стеариновая кислота (СТК), ундециленовая кислота (УК)) и сульфокислот (полинонилнафталин-сульфокислота (ПНСК), децилбензолсульфонат натрия (ДБСН), додецилсульфат натрия (ДДБСН), сульфатам (СФН)).

Результаты сравнительной оценки экстрагирующей способности "переносчиков", представленные на рисунке 1, показывают, что гентамицин из водных растворов извлекается на (96+3) %, наибольшая степень извлечения наблюдалась при использовании в качестве "переносчиков" растворов ПНСК, ДБСН и СФН.

Растворы карбоновых кислот извлекают из водных растворов гентамицин на (55+5) %, однако разделение органической и водной фаз происходит только при длительном отстаивании системы (16-18 ч) или при центрифугировании.

Рисунок 1 - Степень экстракции гентамицина растворами "переносчиков"

При извлечении антибиотика из органической фазы 20 %раствором серной кислоты (рисунок 2) разделение фаз практически не происходит даже при длительном отстаивании и центрифугировании раствора в течение 30-40 мин при числе оборотов вращения центрифуги, равном 50 с-1.

Рисунок 2 - Степень реэкстракции гентамицина из ионных ассоциатов с

"переносчиками"

Это объясняется, видимо тем, что в результате взаимодействия карбоновых кислот и раствора экстрагента образуются мыла, обладающие большой поверхностной активностью, образующаяся стойкая пена не позволяет разделить водный и органический слои и выделить антибиотик. В виду невысокой степени извлечения АМГ из водных растворов и сложности разделения фаз, изучение применения карбо-новых кислот в дальнейших исследованиях не представляется целесообразным.

Растворы ПНСК, ДБСН и СФН практически одинаково извлекают из водных растворов гентамицин (рисунок 1). При реэкстракции из ионных ассоциатов раство-

рами NaOH извлекается (98±1) % гентамицина (рисунок 2) от содержания их в ионном ассоциате. Разделение водной и органической фаз происходит при отстаивании в течение 5 мин.

Аналогичные результаты получены при экстракции тобрамицина и апрамици-

на.

В дальнейших исследованиях использовали в качестве "переносчиков" для выделения AMГ из водных сред ПНСК, ДБСН и СФН.

Разработка оптимальных условий экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных растворов

Сульфокислоты (ПНСК, ДБСН и СФН) являются сильными кислотами, и они ионизированы в широком интервале значений рН. Поэтому полнота связывания АМГ в ионный ассоциат определяется степенью протонизации аминогрупп антибиотика.

При извлечении АМГ растворами сульфокислот наибольшая степень извлечения происходит при значениях рН, равных 1,0-6,5 (рисунок 3). Растворами ПНСК, ДБСН и СФН из водной фазы извлекается (98,0±1,5) % гентамицина, (97,1±1,2) % тобрамицина и (98,1± 1,2)% апрамицина.

Выбранные "переносчики" в диссоциированном виде имеют заряд, равный единице. Для более полного извлечения антибиотика из водной фазы необходимо, чтобы "переносчик" прореагировал как можно с большим числом аминогрупп ЛМГ (максимальное число аминогрупп в молекуле АМГ равняется 5). Поэтому предположительно, для наиболее полного экстракционного извлечения из водных растворов АМГ, необходим 5-кратный мольный избыток "переносчика". Данные литературы по экстракции алифатических аминов свидетельствуют о том, что необходимый избыток экстрагента зачастую удается подобрать только экспериментальным путем.

Результаты, полученные при изучении влияния количества "переносчика" на степень извлечения АМГ из водных растворов показывают, что проведение экстракции АМГ при 5-кратном мольном избытке "переносчиков" не позволяет полностью извлекать антибиотик из раствора. Это объясняется, по-видимому, тем, что при та-

ком соотношении не удается добиться максимально возможной гидрофобности ас-социатов, которая достигается при связывании всех аминогрупп в молекуле АМГ.

Экстракция тобрамицина 15-кратным мольным избытком экстрагента позволяет практически полностью связывать антибиотик в ассоциат. Дальнейшее увеличения количества экстрагента не приводит к увеличению степени экстракции АМГ, так как 15-кратный мольный избыток раствора выбранных "переносчиков" позволяет извлекать из водных растворов (97,7±2,2) % антибиотика.

На заключительном этапе исследований по выбору оптимальных условий экстракции АМГ из водных растворов нами был проведен комплекс исследований по реэкстракции антибиотиков из ионных ассоциатов.

При извлечении АМГ из ассоциатов с сульфокислотами максимальная степень реэкстракции достигается в диапазоне значений рН равном 9,0 и более . При этом в водную фазу экстрагируется (97±2) % антибиотика.

В результате исследований по выбору условий проведения экстракционного выделения АМГ растворами "переносчиков" из водных растворов определены оптимальные параметры процесса:

значение рН раствора - 1,0-7,0 ед. рН;

экстракция 15-кратным мольным избытком раствора "переносчика"; реэкстракция - обработка ионного ассоциата с сульфокислотой 5 % раствором аммиака при рН 9.

При выбранных условия проведения экстракции изучили возможности выделения АМГ из технологических (нативных) растворов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при выбранных условиях возможно выделение АМГ из технологических растворов при использовании в качестве "переносчиков" предложенных нами органических веществ (рисунок 3).

Растворы ПНСК, СФН и ДБСН экстрагируют АМГ приблизительно одинаково. Реэкстракция растворами аммиака позволяет перевести в водную фазу из ионных ассоциатов с "переносчиком" практически весь антибиотик (рисунок 4).

Гешамицин Тобрамицин

Рисунок 3- Степень экстракция АМГ из нативного раствора

Генгамицин Гобрамицин

Рисунок 4- Степень реэкстракции АМГ из ионных ассоциатов

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность выделения AMГ из технологических растворов. Выбранные "переносчики" и условия проведения процесса позволяют экстрагировать (97±2) % антибиотика.

Разработка экстракционно-фотометрического метода определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в технологических растворах

Важным условием для экстракционно-фотометрического определения веществ является наличие у экстрактов в органическом растворителе характерного поглощения в видимой области спектра. Такого поглощения АМГ (прозрачны в УФ и видимой областях спектра). Поэтому для экстракционно-фотометрического определения AMГ в необходимы peaгенты с хромофорными группами, придающими окраску экстрактам ионных ассоциатов реагента с антибиотиком.

Изученные нами растворимые в водной фазе "переносчики"- ДБСН и СФН позволяют связывать АМГ в гидрофобные ионные ассоциаты, однако их растворы обладают низким коэффициентом молярного поглощения, что обусловлено отсутствием в их строении хромофорных групп. Поэтому данные переносчики непригодны для фотометрического анализа АМГ.

Па основании критерия гидрофобности, в качестве реагента с хромофорными группами для фотометрического определения АМГ, нами исследованы сульфофта-леиновые красители - бромтимоловый синий (БТС), бромкрезоловый пурпурный (БКН), бромкрезоловый зеленый (БКЗ), тимоловый синий (ТС) и в качестве наиболее оптимального хромофорного реагента для фотометрического определения АМГ был выбран БТС.

Из изученных органических растворителей в качестве экстрагента выбран хлороформ. Определено оптимальное значение рН для определения аминогликози-дов гентамицинового комплекса - 7,0, а для определения антибиотиков небрамици-нового комплекса -6,5.

Большинство изученных органических растворителей, наряду с ассоциатом БГС-антибиотик извлекают из водных растворов свободный краситель. Это может вносить значительные искажения в результаты анализа, осуществляемого по оптической плотности хлороформных экстрактов. Кроме того, оценка извлечения антибиотика из водных растворов только по оптической плотности хлороформных экстрактов не дает возможность определить состав ассоциата и влияние на него усло-пий анализа. Поэтому для определения количества антибиотика, извлеченного в виде ассоциата с красителем, была разработана методика, основанная на оценке разности концентраций красителя в водном растворе до и после экстракции хлороформом.

Проведение параллельно с анализом исследуемых растворов холостых опытов, то есть опытов с растворами, не содержащими антибиотик, но имеющими такой же состав по остальным компонентам, как и исследуемые, позволило определить количество свободного красителя, поглощаемого хлороформом.

На следующем этапе нами была разработана методика определения концентрации АМГ эксгракционно-фотометрическим методом. В качестве параметра, используемого для определении концентрации AMГ в растворе, вместо оптической плотности хлороформных экстрактов было выбрано количество красителя, связанного в ионный ассоциат с антибиотиком.

При выполнения данных исследований определялась концентрация БТС в вводных растворах с использованием полосы поглощения красителя при длине вол -ны 616 нм.

Регрессионный анализ полученных данных показал, что наблюдается достаточно хорошая линейная зависимость между общим количеством красителя, извлеченного в хлороформ и концентрацией АМГ - коэффициент корреляции 0,99.

При проведении статистической обработки экспериментальных данных получены уравнения для расчета концентрации АМГ:

Было определено, что относительная погрешность данного варианта методики составляет - 12,25 0,15 % при единичном измерении и 8,5 ± 0,1 % при анализе в двух параллельных измерениях.

Оценка воспроизводимости полученныхрезультатов исследований

Сравнительную оценку разработанного метода выделения AMГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" осуществляли с существующей лабораторной технологией выделения методом бесфильтрационной сорбции но показателям: выходу полупродуктов и продолжительности процесса выделения. Остальные технологические стадии очистки и сушки идентичны (рисунок 5).

Представленные в таблицах 1 и 2 результаты свидетельствуют о том, что обоснованные нами условия выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" позволяют с высокой степенью вероятности в 95 % получать полупродукты гентамицина и НБК.

Рисунок 8 - Блок - схема выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" и последующей их очисткой по существующей технологии

Таблица 1 - Выделение гентамицина из НР методом экстракции при ис-

пользовании в качестве "переносчика" раствора ПНСК

Исходная КЖ Выделение антибиотиков НБК из НР ПНСК

№ партии Объем, дм3 Активность, -3 мкг.см Объем "пере- 3 носчика , дм АКТИВНОСТЬ отработанной КЖ, -3 мкг.см Выход, %

1 3,0 1490 1,1 22,0 98,5

2 3,0 1510 1.1 12,2 99,2

3 3,0 1450 1.1 21,7 98,5

4 3,0 1500 1,1 12,8 99,1

5 3,0 1520 1,1 20,0 98,7

6 3,0 1480 1,1 21,4 98,5

7 3,0 1490 1,1 20,7 98,6

Х+Ум, - - - - 98,7±0,4

Таблица 2 - Выделение НБК из НР методом экстракции при использовании в качестве "переносчика" раствора полинонилнафталинсульфокислоты

№ партии Исходная КЖ Выделение антибиотиков НБК из НР ПНСК

Объем, дм3 Активность, -3 мкг см Объем "переносчика", дм Активность отработанной КЖ, мкг.см-3 Выход, %

1 3,0 620 1,1 8,0 98,7

2 3,0 680 1,1 10,5 98,5

3 3,0 710 1,1 5,3 99,2

4 3,0 650 1,1 8,6 98,7

5 3,0 700 1,1 4,2 99,4

6 3,0 645 1,1 6,5 98,9

7 3,0 680 1,1 8,-1 98,8

Х+Уо,95 - - 98,8+0,5

Сравнительную оценку разработанного метода выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" осуществляли с существующей лабораторной технологией выделения методом бесфильтрационной сорбции по показателям: выходу полупродуктов и продолжительности процесса выделения. Остальные технологические стадии очистки и сушки полупродуктов АМГ идентичны (рисунок 5). Результаты сравнительной оценки представлены в таблицах 3 и 4.

Сравнительная оценка выделения АМГ из технологических растворов методом экстракции с растворимым в органической фазе "переносчиком" и существующей технологией выделения методом бесфильтрационной сорбции показала, что разработанный метод позволяет сократить продолжительность процесса выделения тобрамицина в 18, 5 раз (таблица 3), гентамицина - в 10 раз (таблица 4) без снижения выхода полупродуктов на данной стадии.

Полученные результаты доказывают перспективность внедрения экстракционных методов в технологию получения АМГ.

Данная схема выделения АМГ (рисунок 5) предусматривает введение новой единицы оборудования - экстрактора и нового реагента - раствора "переносчика". Остальное оборудование и реагенты применяются в технологии выделения АМГ сорбционным методом.

Таблица 3 - Сравнительная оценка выхода антибиотиков НБК и продолжительности ведения процесса выделения по существующей лабораторной технологии выделения и методом экстракции с "переносчиком"

Существующая технология выделения Выделение методом экстракции с

методом бесфильтрационной сорбции "переносчиком"

Стадия технологи- Выход, Время, Стадия технологиче- Выход, Время, ч

ческого процесса % ч ского процесса %

Предварительная Предварительная под-

подготовка КЖ 99,0 2,0 готовка КЖ 99,0 2,0

Получение HP мето-

дом сепарирования 89,7 3,0

Выделение антибио- Экстракция антибио-

тиков НБК из КЖ тиков НБК из КЖ

98,7 43,0 98,7 1,0

Хроматографиче- Реэкстракция - разде-

ское разделение ап- ление компонентов

рамицина и КТ 87,5 58,0 НБК 92,3 1,1

Peгенерация катио- - 28,0 Регенерация "пере- - 0

нита КБ-2 носчика"

Итого 1СР=95, 0 51=131 Итого £ср=95, 0 1=7,1

Примечание - продолжительность ведения процесса рассчитана с учетом временных затрат на проведение вспомогательных операций

Таблица 4 - Сравнительная оценка выхода гентамицина и продолжи тельности ведения процесса выделения по существующей лабораторной техно логии выделения и методом экстракции с "переносчиком"_

Существующая технология выделения и очистки

Выделение методом экстракции с "переносчиком"

С гадия технологи- Выход, % Время, Стадия технологиче- Выход, Время, ч

ческого процесса ч ского процесса %

Предварительная Предварительная под-

подготовка КЖ 99,0 2,0 готовка КЖ 99,0 2,0

Получение ОТ мето-

дом сепарирования 90,2 3,0

Выделение гента- Экстракция гентами-

мицина из КЖ 92,5 32,0 цина из КЖ 97,9 1,0

Регенерация ка-гионита КБ-2 - 28,0 Регенерация "переносчика" - 0

£<¿=95,7 1=64,0 £ср=95, 2=6,0

7

Примечание - продолжительность ведения процесса рассчитана с учетом временных затрат на проведение вспомогательных операций

Полинонилнафталинсульфокислота относится к классу жидких сульфокатиони-тов. Нетоксична. Использование ПНСК в технологии выделения не требует введения дополнительных средств на защиту работающего персонала и повышения коррозийной устойчивости оборудования. Она пожаровзрывобезопасна. Однако использование растворителей - бутилацетата и изобутилового спирта предусматривает повышение класса опасности производственных помещений. На утилизацию отработанного "переносчика", по сравнению с ионообменными смолами, не требуется дополнительных затрат.

Ввиду отсутствия необходимости дополнительной регенерации "переносчика", значительно снижается расход реагентов (кислот и щелочей) и воды, применяемой для ведения технологического процесса, и, следовательно, сокращается объем сточных вод, на утилизацию которых затрачивается большое количество средств и времени.

Учитывая то обстоятельство, что в настоящее время преимущество отдается использованию полифункциональных АТЛ, способных в короткие сроки перейти на выпуск других, пользующихся спросом препаратов, и то, что технология получения большинства препаратов антибиотиков основана на экстракционных методах, существенных затрат внедрение данного способа в технологию получения АМГ не предусматривает.

На заключительном этапе была выполнена оценка воспроизводимости разработанного экстракционно-фотометрического метода определения концентрации АМГ в технологических растворах и произведена сравнительная оценка разработанного метода с микробиологическим (таблицы 5,6).

Представленные в таблице 5 и 6 данные свидетельствует о том, что результаты определения концентрации АМГ в культуральной жидкости разработанным экс-тракционно-фотометрическим методом и микробиологическим методом сопоставимы (Б>> Е1абл). В связи с этим можно сделать заключение о том, что применение ЭФМ позволяет с высокой степенью надежности получать достоверные сведения о концентрации АМГ в технологических растворах. Однако использование ЭФМ определения концентрации АМГ в технологических растворах позволяет сократить в

10-12 раз временные и более чем в 3 раза материальные затраты на проведение ана-

лиза.

Таблица 5 - Результаты определения концентрации АМГ в культуральной жидкости экстракционно-фотометрическим и микробиологическим методом

Концентрация препарата в пробе, мкг.см-3 , при определении

микробиологическим методом экстракционно-фотометрическим методом

КЖ тобрамицина

1344+103 1398+88

1334± 103 1355+76

1334± 103 1274+86

1300±132 1288+103

1400+110 1390+78

КЖ гентамицина

670+41 645+31

586+65 560+50

586+65 546+49

621+35 607+28

650+72 667+60

Таблица 6 - Сравнительная оценка эффективности использования ЭФМ определения концентрации АМГ при разработанных условиях экстракционного выделения 4,6-замещенных 2-дезоксистрептаминов_

Показатель Метод определения

микробиологический метод экстракционно- фотометрический метод

Продолжительность определения концентрации антибиотика, ч 22,0-24,0 1,5-2,0

Ошибка метода, % 20+5 9+2

Стоимость одного определения, руб 88,5 27,4

Сопоставимость результатов определения (критерий Фишера) Р^^Г,) = 53,8

Р(Р,^2)таб=2,94

Выводы:

1. Впервые теоретически и экспериментально проведено систематическое изучение процесса взаимодействия АМГ с представителями карбоновых (олеиновой, стеариновой, ундециленовой) кислот, сульфоновых (додецилсульфоновой и тетра-децилсульфоновой) кислот, сульфокислот (полинонилнафталинсульфокислотой, до-децибензолсульфокислотой и сульфанолом) и с рядом сульфофталеиновых красителей и органических растворителей.

2. Экспериментально показана возможность выделения гентамицина, апрами-цина и тобрамицина из технологических растворов и определены оптимальные параметры экстракционного выделения АМГ из водных сред растворимыми в органической фазе "переносчиками"- полинонилнафталинсульфокислотой, додецилбен-золсульфо-натом натрия и сульфонолом:

значение рН раствора - 1,0-7,0 ед. рН;

экстракция 15-кратным мольным избытком раствора "переносчика";

продолжительность проведения экстракции - 10-15 мин при интенсивности перемешивания 5,0-6,6 с-1;

реэкстракция - обработка ионного ассоциата с сульфокислотой раствором аммиака до значений рН>9. Степень экстракции составляет (97±2) % от содержания антибиотика в нативном растворе.

3. Разработанный метод экстракционного выделения АМГ с растворимым в органической фазе "переносчиком" позволяет сократить продолжительность процесса выделения тобрамицина в 18, 5 раз, гентамицина - в 10 раз без снижения выхода полупродуктов на стадии выделения.

4. Определены оптимальные условия экстракции АМГ из водных сред с растворимыми в водной фазе "переносчиками":

значение рН раствора гентамицина - 7,0 ед. рН, апрамицина и тобрамицина -6,5 ед.рН;

хромофорный реагент - бромтимоловый синий;

экстрагента - хлороформ.

5. Разработаная методика определения концентрации гентамицинового и не-брамицинового комплексов в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом позволяет сократить время проведения анализа с 20 до 2 часов. Относительная погрешность разработанного метода составляет (8,5±1,0) %.

6. Оценка воспроизводимости разработанного метода выделения гентамицина и тобрамицина из водных сред и методики определения их концентрации в технологических растворах показала:

использование метода экстракции с "переносчиком" для выделения АМГ позволяет с степенью вероятности в 95 % получать полупродукты гентамицина и НБК;

методика определения концентрации АМГ позволяет с высокой степень вероятности получать достоверную информацию о содержании гентамицина и тобрамицина в технологических жидкостях.

Практическиепредложения

Метод экстракционного выделения рекомендован для использования в технологии получения апрамицина. Методика определения концентрации гентамицино-вого и небрамицинового комплексов в технологических растворах внедрена в практику контроля за технологическим процессом производства гентамицина, тобрами-цина и апрамицина на базе Центра военно-технических проблем биологической защиты. Результаты проведенных исследований реализованы в:

• методика выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов экстракцией растворимыми в органической фазе "переносчиками" (инв № Д-673-ДСП);

• методика определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в технологических растворах, которая включена в

. сборник методик по контролю качества тобрамицина. Инв. № 54/И-М;

• сборник методик по контролю процесса производства и оценке качества субстанции апрамицина сульфата (СТП-ОА-190-98 - СТП-ОА-208-98). Инв. № Д-261-ДСП;

сборник методик по контролю процесса производства и оценки качества субстанции гентамицина сульфата (СТП-ОА-171-98 - СТП-ОА-189-98). Инв. № Д-238-ДСП,

сборник методик по контролю процесса производства и оценке качества раствора гентамицина сульфата 4 % для инъекций (СТП-ОА-229-99 - СТП-ОА-240-99). Инв. № 64/И-М.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ноговицына Л.В., Макарова Ю.А., Носков А.А., Михайлов В.А. Разработка технологии выделения и очистки тобрамицина // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, 30 апреля - 1 июня 1999 г. / Центр ВТП БЗ. -Екатеринбург, 1999.-С. 175-176.

2. Михайлов В.А., Макарова Ю.А., Носков А.А. Выделение антибиотиков аминогликозидного ряда из водных сред растворами высших сульфокислот// Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, 30 ноября - 1 декабря 1998 г. / НИИ микробиологии. - Киров, 1998. - С. 316-317.

3. Макарова Ю.А., Ноговицына Л.В., Носков А.А., Карпов И.В., Михайлов

B.А. Оптимизация процесса хроматографического разделения компонентов небра-мицинового комплекса // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, 30 ноября - 1 декабря 1998 г. / НИИ микробиологии. - Киров, 1998. -

C. 315-316.

4. Носков А.А., Михайлов В.А., Ноговицына Л.В. Применение жидких иони-тов в технологии выделения и очистки антибиотиков аминогликозидного ряда// Материалы V молодежной научной школы - конференции по органической химии / УрО РАН. - Екатеринбург, 2002. - С. 361.

5. Тихонов И.В., Носков А.А., Михайлов В.А., Выдрин А.Ф., Махортов В.Л.. Изучение возможности применения экстракционных методов в технологии выделения и очистки апрамицина // Ветеринарная медицина. - М., 2003, № 1(3). - С. 18-19.

6. Тихонов И.В., Носков А.А., Выдрин А.Ф., Михайлов В.А., Махортов В.Л. Способ выделения апрамицина // Ветеринарная медицина. - М., 2003, № 1(3). - С. 22-23.

«23942

Отпечатано ООО «Мещера» здк. №057 тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Носков, Андрей Анатольевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные свойства 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

1.2. Методы выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред

1.3. Общие сведения об экстракции гидрофильных органических оснований

1.4. "Переносчики" для экстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

1.5. Органические растворители для экстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов ' 33 II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы

1.1. Объекты исследования

1.2. Методы исследования

1.2.1. Методы ведения технологических процессов

1.2.2. Методы контроля ведения технологических процессов

1.2.3. Методы контроля показателей качества препаратов

1.3. Обработка результатов

2. Выбор условий, "переносчиков" и растворителей для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

2.1. Выбор условий экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред

2.2. Выбор системы "растворитель-переносчик" для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных растворов 54 2.2.1. Выбор органического растворителя для экстракционного выделения

4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред растворами переносчиков"

2.2.2. Выбор "переносчиков" для экстракционного выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водныз сред

3. Выбор оптимальных условий экстракционного выделения

4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных растворов

3.1. Изучение влияния значения рН раствора на экстракцию 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

3.2. Изучение влияния мольного соотношения реагентов на экстракцию

4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

3.3. Изучение влияния продолжительности процесса экстракции на полноту извлечения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водного раствора в ионный ассоциат

3.4. Выбор условий реэкстракции 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из системы антибиотик-"переносчик"

4.5. Экстракция 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из нативных растворов

4. Разработка экстракционно-фотометрического метода определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в технологических растворах

4.1. Выбор оптимальных условий проведения экстракционно-фотометрического определения концентрации 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в технологических растворах

4.1.1. Выбор "переносчика" для фотометрического определения

4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов

4.1.2. Выбор органического растворителя для экстракции ассоциата 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов с бромтимоловым синим в органическую фазу

4.1.3. Изучение влияния рН водного раствора на экстракцию ионного ассоциата антибиотик-краситель

4.2. Разработка методики определения концентрации бромтимолового синего в водных растворах

4.3. Исследование зависимости между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и количеством красителя, связанного в ионный ассоциат с антибиотиком

4.3.1. Исследование зависимости между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и оптической плотностью хлороформных экстрактов

4.3.2. Исследование зависимость между концентрацией 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов в водном растворе и разностью концентраций красителя в водном растворе до и после экстракции

5. Оценка воспроизводимости полученных результатов исследований

5.1. Оценка воспроизводимости разработанного метода выделения 4,6 замещенных 2 дезоксистрептаминов экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком"

5.2. Оценка воспроизводимости разработанного экстракционно-фотометрического метода определения концентрации 4,6 замещенных 2 - дезоксистрептаминов

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

IV. ВЫВОДЫ

V. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

VI РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах"

Среди многочисленных лекарственных средств, применяемых в медицинской и ветеринарной практике, большое значение приобрели препараты, получаемые в результате микробиологического синтеза. К ним в первую очередь относятся антибиотики.

В ряду антибиотиков широкого спектра действия важное место занимают аминогликозидные препараты и, в частности, 4,6 замещенные 2-дезоксистрептамины (АМГ) — гентамицин, тобрамицин и апрамицин. Следует отметить, что до настоящего времени производство тобрамицина и апрамицина в нашей стране отсутствует.

Аминогликозиды проявляют бактерицидное действие в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. В терапевтических концентрациях они активны против Е. coli, Salmonella, Shigella, Brucella, Proteus, Staphylococcus и ряда других микроорганизмов. Большое значение имеет активность аминогликозидов, и в частности, тобрамицина, в отношении синегнойной палочки. Апрамицин, хорошо зарекомендовал себя в ветеринарии. Препарат весьма эффективен при сальмонеллезах, колибактериозах, стафилококковых и стрептококковых инфекциях.

В настоящее время зависимый от импорта выпуск антибиотиков не может способствовать развитию России как полноценного самостоятельного государства, которое преследует свои национальные интересы, поскольку зависимость от импортных поставок влияет на экономическую безопасность страны.

Выпуск качественных препаратов АМГ вызывает в свою очередь необходимость наличия высокоэффективных и экспрессных методов выделения и очистки антибиотиков, позволяющих снизить материальные и временные затраты без снижения качества получаемых продуктов. Увеличение объема производства требует использования простых в технологическом исполнении и недорогих методов, позволяющих осуществлять эффективный контроль производства выпускаемой продукции. При этом своевременность и адекватность анализа препарата на различных технологических стадиях позволяет оперативно влиять на процесс производства.

Как и в технологии получения, так и в физико-химических методах, используемых для контроля содержания АМГ в технологических растворах, их выделение и разделение осуществляется преимущественно сорбционными методами. Если на стадии выделения основной задачей является максимальное извлечение антибиотика из КЖ, то при контроле содержания их немаловажную роль играет достоверность и оперативность проведения анализа.

Как метод выделения, ионообменная сорбция обеспечивает получение антибиотиков высокого качества без использования дорогостоящих пожаровзрывоопасных растворителей и дает возможность получать антибиотик из культуральной жидкости или из грубоотфильтрованных растворов. Наряду с несомненными достоинствами ионообменная сорбция обладает и рядом недостатков, например, использование громоздкого оборудования, занимающего большие производственные площади; значительные затраты физического труда при обслуживании оборудования; длительность и многооперационность процесса выделения и очистки; большие потери и значительный расход реагентов (воды, минеральных кислот и щелочей).

Одним из направлений интенсификации процесса выделения является использование экстракционных методов, которые просты в исполнении, не требуют сложного и дорогостоящего оборудования и позволяют осуществлять процесс за короткие промежутки времени.

В связи с этим, актуальность работы обусловлена необходимостью разработки эффективных и экспрессных способов выделения АМГ из водных сред, к которым относятся экстракционные методы, например экстракция с "переносчиком".

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение возможности применения экстракционных методов для выделения 4,6 замещенных 2-дезоксистрептаминов из водных сред и определения их концентрации в технологических растворах

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Провести теоретическое и экспериментальное изучение процесса взаимодействия АМГ с "переносчиками".

2. Разработать оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред с растворимым в органической фазе "переносчиком".

3. Оценить возможность выделения гентамицина и тобрамицина из нативного раствора.

4. Разработать оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред с растворимым в водной фазе "переносчиком";

5. Разработать методику определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом;

6. Оценить воспроизводимость разработанного метода экстракционного выделения и методики определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим методом и произвести сравнительную их оценку с существующими методами.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование процесса взаимодействия АМГ с рядом органических реагентов и на основе проведенных исследований выбраны оптимальные условия экстракционного выделения АМГ из водных сред и экстракционно-фотометрического определения их концентрации технологических растворах.

Впервые разработан метод экстракционного выделения гентамицина, тобрамицина и апрамицина с растворимым в органической фазе "переносчиком".

Впервые разработана универсальная методика определения концентрации АМГ в технологических растворах, основанная на определении разности концентраций красителя, связанного в ассоциат с АМГ, и свободного красителя.

Практическая значимость работы. Разработанный метод выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком" позволяет сократить время проведения процесса выделения гентамицина в 10 раз, тобрамицина в 18,5 раз при сохранении количественного выхода полупродуктов.

Разработанная методика определения концентрации АМГ экстракционно-фотометрическим методом позволяет сократить время проведения анализа с 20-24 до 2 часов, что дает возможность оперативно корректировать процесс производства.

Публикации и апробация работы.

Основные положения работы обсуждались на итоговых научных конференциях Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ (г. Екатеринбург, 1996-2002 гг.), на юбилейной научной конференции НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на юбилейной научной конференции Центра ВТП БЗ (г. Екатеринбург, 1999), на V молодежной школе - конференции по органической химии (УрО РАН г. Екатеринбург, 2002 г.). Две статьи с результатами исследований опубликованы в журнале "Ветеринарная медицина" ("Изучение возможности применения экстракционных методов в технологии выделения и очистки апрамицина" и "Способ выделения апрамицина" № 1(3), 2003 г.).

Положения выдвигаемые на защиту:

Метод выделения АМГ экстракцией с растворимым в органической фазе "переносчиком"

Методика определения концентрации АМГ экстракционно-фотометрическим методом.

Данные сравнительной оценки выделения АМГ экстракционным и сорбционным методами.

Данные сравнительной оценки определения концентрации АМГ в технологических растворах экстракционно-фотометрическим и микробиологическим методами.

Структура и объем диссертации. Работа включает в себя введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, основные выводы о проделанной работе, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы включающий 88 источников, из них 22 - зарубежных авторов и

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Носков, Андрей Анатольевич

Результаты работы используются в процессе получения и контроля АМГ на базе Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ.

VI РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Разработанный метод экстракционного выделения АМГ из водных сред рекомендован для внедрения в технологию получения апрамицина (Акт апробации и внедрения. № 117/1 от 12.12.02 г., утвержден Начальником Центра ВТП БЗ).

Разработанная методика определения содержания АМГ в технологических растворах ЭФМ внедрена в практику контроля за технологическим процессом производства гентамицина, тобрамицина и апрамицина на базе Центра ВТП БЗ.

Результаты проведенных исследований реализованы в методике выделения АМГ экстракцией с "переносчиком" и стандартах предприятия по контролю качества производства аминогликозидных антибиотиков, утвержденных Начальником Центра.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Носков, Андрей Анатольевич, Щелково

1. Гаузе Г.Ф. Новые аминогликозиды, эффективные в отношении резистентных бактерий// Антибиотики. — 1980. № 9. - С. 710-714.

2. Бережинская В.В., Долгова Г.В., Эйромджанц А.А. и др. Экспериментальные и клинические данные об ототоксических свойствах антибиотиков аминогликозидов (аминоциклитолов)// Антибиотики. - 1983. - № 3. - С. 58-67.

3. Dee Т.Н., Kozin F, Gentamicin and tobramycin penetration into synovial fluid// Antimicrob. Ag. Chemother. 1972. - № 12. - P. 548.

4. Россия теряет собственный рынок лекарств. Официальная хроника// Медицинский курьер. 1997. - № 2 (3). - С. 21.

5. Алазов А. Ситуация на российском рынке лекарств// Медицинский курьер. -1997.- №2(3). -С. 24-25.

6. Рабкина Н. Сравнительный анализ производства и импорта медикаментов в 1996 и 1997 гг.// Фармацевтический вестник. 1997. - № 19 (85). - С. 9.

7. Шемякин М.М., Хохлов А.С., Колосов М.Н. и др. Химия антибиотиков. -М., 1961. Т. 1.- С. 734.

8. Преображенский Н. А., Генкин Э. И. Химия органических лекарственных веществ. М., 1973.

9. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М., 1979.

10. Навашин С. М. Антибиотики. М., 1979.

11. Навашин С.М., Фомина И.П., Сазыкин Ю.О. Антибиотики группы аминогликозидов. М., - 1977.

12. Библикова М.В., Иваницкая Л.П. Род Micromonospora: систематическое положение, антибиотикообразование, методы направленного поиска антибиотиков// Антибиотики. 1986. - № 9. - С. 702-712.

13. Антибиотики: механизмы резистентности и их клиническое значение / Вч 64605. Пнв. №31998 // Сб. ПС №2. - 1994. - С.142-167. - Пер.ст. Antibiotika 1992:

14. Resistenzmechanismen und ihre klinische Relevanz. Ubersicht // Schweiz. med. Wschr. -1992. Jg. 122, - № 8. - S.247- 256.

15. Струнин Б.Н. Химическая трансформация аминогликозидных антибиотиков //Успехи химии. 1977. - Т. 46, вып. 8, С. 1445-1469.

16. Koch K.F., Rhoades J.A. Structure of nebramycin factor.6. A new aminoglicoside antibiotic// Antimicrobial Agents and Chemother. 1971.- V.1970. -P.309-313.

17. Koch K.F. in Drug Action and Drug Resistance in Bacteria. 2.AminogIycoside antibiotics, ed. S. Mitsuhashi//University of Tokyo Press, Tokyo. 1975. - P.l 13.

18. Koch K.F. et al. Structures of some of the minor aminoglycoside factors of the nebramycin fermentation// J.Org.Chem., 1978. - V.43, - № 7. - S. 1430-1434.

19. Weinstein M.J., Luedemann G.M., Oden E.M. Gentamicin, a new antibiotic complex from Micromonospora// J.Med. Chem. 1963. - V.6. - P.463-464.

20. Cooper D.J., Comparative chemistry of some aminoglicoside antibiotics// Pure Appl. Chem. 1971. - V.28. - P.455-464.

21. Guthrie R.D., Williams G.J. 2,6-Diamino-2,3,4,6-tetra-deoxy (D-epi-purpurosamine)// Chem.Commun. 1971. - P.923-924.

22. Иваницкая JI.П. Направленный поиск природных аминогликозидных антибиотиков// Механизмы биосинтеза антибиотиков. М., - 1986. - С. 116-127.

23. Карцева В.Д., Портной Ю.А., Вакуленко С.А. и др. Устойчивость гентамицина и метод его количественного определения //Антибиотики. 1975. - №6. -С. 514-517.

24. Чернышев А.И., Карцева В.Д., Есипов С.Е., Арзамасцев А.П. Определение относительного содержания компонентов Сь С2 и Cia в гентамицине методом ПМР-спектроскопии// Хим.-фарм. журн. 1979. - № 7. - С. 111-115.

25. Busson R., Claes P.J., Vanderhaeghe Н. Determination of composition of gentamicin sulfates by *H and 13C nuclear magnetic spectroscopy// J.Ass.Offic. Analyt.Chem. 1986. - V.69, № 4 - P.601-608.

26. Ганчев К., Фишман B.M., Либинсон Г.С. Потенциометрическое титрование гентамицина// Хим.-фарм. журн. 1974. - № 7. - С. 50-53.

27. Либинсон Г.С. Проблемы стандартизации антибиотиков. Кислотно-основные свойства, растворимость// Антибиотики. 1982. - № 3. -С. 47-61.

28. Чернышев А.И., Карташов А.С., Арзамасцев А.П. Спектроскопия ЯМР в фармацевтическом анализе. VII. Определение компонентного состава гентамицина методом спектроскопии ЯМР 13С// Хим.-фарм. журн. — 1991.- № 8.- С. 81-85.

29. Карташов B.C. Современное состояние и перспективы использования спектроскопии ЯМР в фармацевтическом анализе// Хим.-фарм. журн.- 1996.- № 5. -С. 59-62.

30. Schanck A., Brasseur R., Mingeot-Leclercq М.Р. et al//Magn.Reson. Chem., № 30(1), 1992, P. 11-15.

31. Гольдберг JT.E. Новые аминогликозидные дезоксистрептаминосодержащие антибиотики// Антибиотики. — 1976. № 4. - С. 1033-1050.

32. Англ. Пат. 833851 (1960; С. А., 55, 574 (1961).

33. Карпов В.Л. Определение аминогликозидных антибиотиков в биологических жидкостях// Антибиотики. 1984.- № 9.- С.695-703.

34. Игнатенко С. П. Исследования сорбционных и экстракционных систем с динонилнафталинсульфокислотой: Автореф. дисс. . канд. хим. наук. Минск, 1983.

35. Хансон И. Последние достижения в области жидкостной экстракции // Пер. с англ. под ред. О. А. Синеграбовой и др. М., 1974.

36. А.С.1410530 СССР. 1986, МКМЗ С12Р29/00. Способ выделения тетрациклина / В. С. Солдатов, 3. И. Куваева, А. В. Попов, А. В. Микулич.

37. Беликов В.Г., Карпенко В.А., Степанюк С.Н. Экстракционно-фотометрическое определение тропафена в присутствии продуктов гидролиза// Фармация. 1984. - № 4.- С. 40-43.

38. Шумашкович И.Е., Кошелева Л.И., Саплева В.Т., Савина А. А. Экстракционно-спектрофотометрический метод количественного определения дифезилаЛ Фармация. 1976. - № 2.- С. 26-29.

39. Лукьянчикова Г.И. Экстракционно-фотометрический метод опреде-ления пентамина// Фармация. 1980. - № 5.- С. 26-28.

40. Алещенко Т.О., Книжник А.З. Определение тримекаина экстрак-ционно-фотометрическим методом// Фармация. 1976. - № 1.- С. 38-42.

41. Лукьянчикова Г.И., Лукьянчиков М.С. Экстракционно-фотометри-ческое определение диколина и димеколина// Фармация. 1978. - № 2.- С. 26-29.

42. Беликов В.Г., Степанюк С.Н. Экстракционно-фотометрическое определение меридила// Фармация. 1981. - № 1.- С. 70-71.

43. Багирова В.Л., Суранова А.В., Лутцева А.И. Экстракционно-фотометрическое определение пилокарпина гидрохлорида в лекарственных формах// Фармация. 1982. - № 3.- С. 57-58.

44. Тираспольская С.Г., Компанцева Е.В., Баженова О.О. Экстракционно-фотометрический метод определения содержания эфедрина в лекарственных формах// Фармация. 1982. - № 3.- С. 58-59.

45. Дрожжина В.В. Экстракционно-фотометрическое определение алкалоидов красавки и атропина сульфата в лекарственных формах// Фармация. 1977. - № 1.-С. 84-85.

46. Башкович А.П. с сотр. Патент 592845. Опубликовано 15.02.78 Бюллетень6.

47. Алыков Н.М. Фотометрическое1 определение аминогликозидных антибиотиков// Антибиотики. 1984.- № 5. - С. 336-338.

48. Тобрамицин / Вч 64605. Инв.№31966 // Сб. ПС № 4. - 1993. - С.53-86. -Пер.ст. Kucers A., Bennett N., Kemp R. из журн. : The use of antibiotics. - London -1988.-P. 675-695.

49. John S. Glasby. Enclyclopaedia of Antibiotics. London, 1979, P.- 467.

50. Никитина Э.П. Применение поляриметрии для предварительной оценки качества лекарственных форм// Фармация. 1991. - № 5.- С. 59-60.

51. Weinstein M.J., Wagman G.H., Oden E.M., Marquez J.A. //J. Bact.-1967.- V.94.- P.789.

52. Weinstein M.J., Ludemann G.M., Wagman G.H. et al.// Пат.3819611 США.

53. Гауптман 3., Грефе Ю., Ремане X. Органическая химия/ Пер с нем. Под ред. В.М. Вдовенко. М. 1979.

54. Николотова З.И., Карташова Н.А. Экстракция нейтральными органическими соединениями/ Справочник по экстракции: под ред. А.М Розена. -М.- 1976-Т. 1.

55. Межов Э.А. Экстракция аминами, солями аминов и четвертичных аммониевых оснований/ Справочник по экстракции. Под ред. А.М Розена. — М. -1977.-Т. 2.

56. Моррисон Д., Фрейзер Г. Экстракция в аналитической химии/ Пер. с англ. под ред. В.М. Вдовенко. Л. - 1960.

57. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. М., 1975.

58. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических соединений. М.1977.

59. Botlle R., Gilbert А/ Analyst, 1972, V. 75, P. 1024.

60. Borel E., Deuel H., Helv. chem. acto, 1973, V. 36, P. 801.

61. Romeike A. Pharm. Zentraih., 1972, Bd. 91. S. 80.

62. Фомин B.B. Химия экстракционных процессов. M. - 1972. - 258 с.

63. Лайтинен Г., Харрис В. Химический анализ/ Пер с англ. под ред. Ю.А. Клячко. М.-1979. с. 624.

64. Коган В.Б., Фридман В.М., Кафаров В.В. Справочник по растворимости. Л.- 1977.-Т. 1.

65. Физико-химические свойства индивидуальных углеводородов/ Справочник: под ред. В.М. Татевского. М. 1960. - с. 428.

66. Абрамзон А.А., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Л. — 1988.

67. Днепровский А.С., Темникова Т.И. Теоретические основы органической химии. Строение, реакционная способность и механизм реакций органических соединений. JI. 1979.

68. Вайсберг А. и др. Органические растворители/ Пер. с англ. Под ред. Я.М. Варшавского. М. 1958.

69. Поверхностно-активные вещества/ Справочник: под ред. А.А. Абрамзона. -Л. 1979.

70. Индикаторы / Под ред. Э.Бишон. М., - 1976. - Т. 1.

71. Ляликов Ю.С. Физико-химические методы анализа. М. 1993.

72. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М. - 1989.

73. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. /Справочник биохимика М.,1991.

74. Реактивы: Каталог/ ООО «УралЭКРОС». Екатеринбург, - 2003.

75. Реактивы: Каталог/ООО «УралЭКОС». Екатеринбург, - 2003.

76. Кобякова С.О., Савостина В.М., Пешкова В.М. Экстракция ферроина с сульфофталеиновыми красителями // Журн. аналит. хим. 1974. - № 2. - С. 300-305.

77. Чалая З.И., Михайлова Л.С. Сравнительное изучение экстракции соединений алифатических низкомолекулярных аминов с сульфофталеинами// Журн. аналит. хим. 1974. -№10,- С.2036-2040.

78. Беликов В.Г., Лукьянчикова Г.И., Дуккардт Л.Н. Сульфофталеиновые красители в качестве экстракционных реагентов на четвертичные аммониевые соединения// Фармация. 1983. - № 1. - С.26-29.

79. Немцева Л.И., Семенов А.Д., Дацко В.Г. Микроопределение летучих с водяным паром аминов в природных водах// Журн. анал. хим. 1964. - № 3. - С. 383-385.

80. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография М. - 1993.

81. Ганчев K.JI. Идентификация и колориметрическое определение антибиотика образуемого Micromonospora purpurea var.violaceus 55-5329// Xilm.-фарм. журн. 1973.- № 7. - С. 49-51.

82. ФС 42-2627-97. Гентамицина сульфат стандартный образец. - Взамен ФС 42-2627-89. Введ.11.03.97. до 31.12.2002.

83. ВФС 42-2013-90. Тобрамицин стандартный образец. Введена впервые. Введ. 25.10.90. до 31.12.93.

84. Государственная фармакопея СССР 11-е изд. М., - 1989. Вып.2. - С.221.

85. Лабораторный регламент на производство субстанции гентамицина сульфата/ Центр ВТП БЗ, 1999. Арх. Центра ВТП БЗ. - Инв. № Д-121 - ДСП.

86. Экспериментально-производственный регламент на получение субстанции гентамицина сульфата (пусковой)/ Центра ВТП БЗ, 1996 Арх. Центр ВТП БЗ. -Инв. № Д-173. - ДСП.

87. Лабораторный регламент на производство субстанции тобрамицина основания/ Центр ВТП БЗ, 2000. Арх. Центра ВТП БЗ. - Инв. № Д-461 - ДСП.

88. Лабораторный регламент на производство субстанции апрамицина сульфата/ Центр ВТП БЗ, 1998. Арх. Центра ВТП БЗ. - Инв. № Д-262 - ДСП.

89. Лабораторный регламент на производство субстанции апрамицина сульфата/ Центр ВТП БЗ, 2001. Арх. Центра ВТП БЗ. - Инв. № Д-520 - ДСП.

90. Михайлов В. А. Разработка технологии выделения и очистки гентамицина из культуральной жидкости: Дисс. . канд. техн. наук. Екатеринбург, 1996.

91. Ноговицына Л.В. Разработка технологии выделения и очистки тобрамицина и апрамицина из культуральной жидкости: Дисс. . канд. техн. наук. -Екатеринбург, 2001.

92. ФС 42-2626-97. Гентамицина сульфат. Взамен ФС 42-2626-89. Введ. 11.03.97. до 31.12.2002.

93. ВФС 42-2012-90. Тобрамицин. Введена впервые. Введ. 25.10.90. до 31.12.93.