Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика секретируемой щелочной фосфатазы Bacillus intermedius

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика секретируемой щелочной фосфатазы Bacillus intermedius"

РГБ Ом

2 5 НОЯ №

На правах рукописи

НЕХОТЯЕВА Наталья Валерьяновна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ВасЩш ШегтейШ

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1996

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоиюкенерии ферментов Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина

Научные руководители:

академик АН РТ,

доктор биологических наук, профессор И.Б. Лещинская

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.Р. Шарипова

доктор медицинских наук, профессор Д.М. Зубаиров (Казанский медицинский университет)

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.Н. Давыдова (Казанский институг биологии

Официальные оппоненты:

академик АН РТ,

КНЦ РАН)

Ведущая организация:

Казанский технологический

университет

диссертационного Сове'____ _. ... , .... ом университете

им. В.И. Ул I,ям о на - Л с 11 ин а, 420008 г.Казань, ул. Ленина, 18.

Защита диссертации

на заседании

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного

университета

Ученый секретарь диссертационногг------

кандидат биологических наук

А.Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последний годы с развитием биотехнологии повысился интерес к микроорганизмам - продуцентам внеклеточных ферментов. Внеклеточные бактериальные ферменты, благодаря раду своих свойств - выделению в среду и связанной с этим относительной легкостью очистки и тестирования, стабильности и низкой молекулярной массе, являются хорошей моделью для решения фундаментальных и прикладных проблем белковой химии и энзимолоши.

Среди прокариот наиболее удобными объектами для изучения и промышленного использования являются представители рода Bacillus, поскольку они не патогенны и легко культивируются.

Наибольшее внимание привлекают ферменты, щцролизующие различные питательные вещества в среде. Большинство субстратов этих ферментов не потребляются клеткой, тогда как продукты их гидролиза являются для нее источником углерода, азота, фосфора. Среди гидролитических ферментов необходимо назвать нуклеазы, протеазы, фосфогидролазы, среди которых в настоящее время особый интерес вызывают фосфатазы. Они интересны как для сравнительного анализа свойств секретируемых гидролаз бактерий, так и для изучения общих закономерностей биогенеза, включая общие пути регуляции синтеза всего спектра этих ферментов.

Цель и задачи исследования. Данная работа проведена с целью создания эффективного метода выделения и очистки нового фермента - внеклеточной щелочной фосфатазы B.intermedius и изучения свойств этого фермента.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Поиск активных продуцентов щелочной фосфатазы среди антибиотикоустойчивых штаммов B.intermedius.

2. Разработка лабораторного метода выделения и очистки фосфатазы из культуралъной среды бактерий и получение гомогенного препарата фермента.

3. Изучение основных физико-химических и каталитических свойств бациллярной фосфатазы.

Научная новизна работы. Впервые обнаружен, ранее не изученный фермент - внеклеточная щелочная фосфатаза B.intermedius. Отобран

стрептомшщнуетойчивый штамм B.intermedius S3-19, обладающий высокой продукцией фермента. Разработан эффективный лабораторный метод препаративного получения гомогенного препарата бациллярной щелочной фосфатазы из фильтратов культуралъных сред микроорганизмов. Проведено изучение физико-химических и каталитических свойств фосфатазы B.intermedius S3-19, которые дополняют сведения по биохимическим свойствам этой группы бациллярных ферментов. Сравнительная характеристика биохимических свойств выделенного нами фермента с описанными в литературе фосфатазами бацилл указывает на наибольшее сходство с АРаае ГУ B.subtilis (Huiett et. al., 1990). Это вызывает особый интерес, в связи с тем, что B.subtilis используется для продукции чужеродных белков. Однако, при клонировании часто возникают проблемы связанные с ограниченными возможностями секреции у этого вида бацилл. Поэтому другой вид с подобным ферментом может оказаться более перспективным в этом отношении. Изучение биохимических и каталитических свойств является первым этапом в исследовании фермента, что позволит также в дальнейшем использовать B.intermedius в качестве модели для установления молекулярных механизмов биосинтеза и секреции внеклеточных белков.

Практическая ценность работы. Возможность получения в гомогенном состоянии внеклеточной щелочной фосфатазы B.intermedius S3-19 и ее характеристика позволят получить новые данные о структуре фермента, его взаимосвязи с другими фосфогидролазами, а также подойти к изучению вопросов регуляции биосинтеза и молекулярных механизмов секреции.

Изучение процесса секреции у B.intermedius представляет интерес с позиции использования штамма в качестве продуцента гомологичных и гетерологичных белков. В настоящее время бациллы часто используют для продукции чужеродных белков. Из всех представителей рода Bacillus достаточно изучены только B.subtilis и B.licheniformis, но они не удовлетворяют потребности этого направления. Поэтому встает необходимость в изучении других представителей рода.

В результате проведенной работы выделена и очищена до гомогенного состояния неспецифическая фосфатаза, которая может быть применена в

практике научных исследований в биотехнологии, генетике и молекулярной биологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Конференции Российской Федерации "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на IV Международной конференции по биотехнологии (Мельбурн, 1995), на Итоговой научной конференции КГУ (Казань, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовалась антибиотикоустойчивые штаммы В.ШегтеШиз из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета: стрептомицинустойчивые - 82, 83, 84, 85, Б6, ,?7, 88, 811, Б12, 813, 814, 815, 816, 83-19; эритромицинустойчивые - Е4, Е6, Е7, Е», рифампищшустойчивые - К2, КЗ, К4, К5, Кб, К8, К9. В качестве контроля использовали штамм ВЛМегте<йш 7Р, не обладающий повышенной устойчивостью к антибиотикам, который был исходным при селекции выше перечисленных штаммов.

Культивирование проводили в 1000мл колбах при соотношении объема среды к объему колбы 1:7 на качалках (200 об/мин) при 30° в течении 12 часов, на среде описанной Знаменской с соавт. (1982). Антибиотики вносили стерильно перед посевом в следующих количествах (мкг/мл): для стретомицинустойчивых бактерий В.ШегтесНиз 82 - 100, В.Шегте&ш 83, 8319, 84, 85, 87, 88 -500, В.МегтсШш БИ, 812, 813, 814, 815, 816 - 1000; для рифампицинустойчивых штаммов В.ШегтесНиз Е2, КЗ, К5 - 1, В.Мегтесйш К4 - 4, ВЛгйегтейшз К8, Я9 - 10; для эритромицинустойчивых штаммов В.ШеппесНиз Е4, Е7, Е8 - 4000, В.ШегтеНиз Е6 - 400.

Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменения оптической плотности культуры. Прирост биомассы измеряли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9, за единицу биомассы принимали поглощение в 1см кювете, равное единице.

Удельную скорость роста ц и удельную скорость накопления фосфатазы в культуральной жидкости е рассчитывали, как описано у Перта (Ри1, 1975).

Продуктивность культуры в отношении синтеза фосфатазы определяли как отношение величины фосфатазной активности в культуралыюй жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах.

Фосфомоноэстсразную и фосфодиэстеразаую активности определяли по действию фермента на модельный субстрат паранитрофенилфосфат и бис-паранитрофенилфостат (Serva, ФРГ), соответственно. Активность фермента выражали в микромолях расщепленного субстрата, тидролизуемого 1мл ферментного раствора за 1мин (мкМ/мл -мин), используя для пересчета калибровочную кривую зависимости Е^ю от концентрации паранитрофенола и бис-паранитрофенола (Лещинская и др., 1980).

Активность РНКазы определяли модифицированным методом Анфинсена (1954).

ДНКазную активность определяли по продуктам гидролиза, растворимым в 4% НСЮ4 с 0,12% уранилацетатом (Лещинская и др., 1980).

Определение протсазной активности осуществляли по методу Каверзневой (1971).

Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация 1 мг/мл соответствует А280=1 в кювете толщиной 1см. А также по методу Бредфорда (Bradford, 1976), используя для пересчета калибровачную кривую, полученную для бы чего сывороточного альбумина.

Для получения фосфатазы использовали следующую схему очистки. Фосфатаза была сконцентрирована из культуральнон жидкости на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной 10мМ трис-ацетатным буфером, рН7,9 с 0,5мМ MgCl2 и ОДмМ C0Q2 (буфер 1). ДЕАЕ-целлюлозу помещали в колонку (5X2 см) и белок элюировали буфером 1 с 1М MgClî, рН7,0. Активные фракции разводили дистиллированной водой в 10 раз и пропускали через SP-колонку (LKB-Produkter АВ, Швеция), уравновешенную буфером 1, рН7,0. Фосфатазу элюировали буфером 1, содержащим 0,5М MgCli, рН7,8. Фракции с активностью были разведены до содержания MgClî 0,15М и пропущены через мембранный фильтр с диаметром nop 0,22mm. Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на колонке Mono S HR 5/5 с использованием FPLC System для быстрой хроматографии белков (Pharmacia, Швеция). После сорбции фермента колонку промывали буфером 1,

содержащим 0,15М МёС1г. Элюцию проводили в линейном градиенте М§С12 от 0,15 до 0,45М в буфере 1 со скоростью 1 мл/мин.

Электрофорез проводили по методу Лаэммли (ЬаеттН,1970). Нативный электрофорез проводили в буферной системе Лаэммли, но в отсутствии додецилсульфата натрия и Д-мекралтоэтанола при концентрации акриламида в геле равной 15%. По окончанию электрофореза проводили субстратный блоттннг, поэтому гель покрывали 1% агарозной пластинкой, содержащей 5мг/мл р-ИРР в 0,2М трис-НС1 буфере, рН9,5 и инкубировали в течении 1часа при 50°.

При определении рН-оитимума и рН-стабнльноспг фосфатазы использовали 0,1М натрий-ацетатный буфер, рН5,0-7,5; 0,1М трис-ацетатный буфер, рН7,0-8,3; 0,1М трис-НС1 буфер, рН7,5-9,5; 0,1М натрий-глициновый буфер, рН9,0-11,0.

Для определения термостабюнности фосфатазы ее преинкубировали при температурах 37°, 45°, 50°, 55°, 60°, 70° и 80°в течении 5, 15, 30, 60 и 120 минут, а затем определяли остаточную активность. За 100% принимали активность без предварительного прогрева.

Изучение субстратной специфичности фосфатазы проводили по методу Ьомму-Ьорег (Ьо\>/гу, 1946), при использовании следующих субстратов: р-ОТР, 5'АМР, З'АМР, 5'СМР, З'вМР, 5'иМР, З'иМР, 5'СМР, АБР, ОБР, 1ГОР, фруктозо-1,6-дифосфат, глюкозо-1-фосфат, ОТР, АТР. За 100% принимали содержание каждого субстрата в мкМ в реакционной смеси.

Для определения кинетических констант Км и К^ использовали синтетический субстрат паранитрофенилфосфат {р-ЫРР) в концентрации 0,1 до 4мМ растворенный в 0,2М трис-НС1 буфере, рН9,5 с 0,05М М§С1г и 0,1мМ СоС12. Начальные скорости гидролиза субстрата р-НРР фосфатазой В.ШегтесИш определяли на спектрофотометре при длине волны 410нм и 20 "во времени (через 1 минуту), считая Е для р^РР равной ШООМ^-см"1 (Досон, 1991). Км определяли из зависимости 1/[у] от 1/[б], Кют вычисляли по формуле Утах/[Е] (Ленинджер, 1976).

При изучении влияния вонов двухвалентных металлов на каталитическую активность гомогенного препарата, фермент предварительно обессоливали на колонке с сефадексом С25 (0,4X15см) уравновешенной 20мМ трис-НС1

буфером, рН8,5 со скоростью 10мл/час. Отсутствие содержания ионов Mg2+ определяли аналитическим методом. Далее в реакционную смесь добавляли растворы мелаллов (Со24, Са2+, Zn2+, Mg24, Cu2+, Fe2+ и Mn2+) в конечной концентрации 0,05, 0,1 и 1 мМ, выдерживали в течении 10 минут при комнатной температуре, а потом определяли фосфатазную активность. За 100% принимали активность фермента без добавления ионов двухвалентных металлов.

При изучении влияния ингибиторов на активность фосфатазы смесь фермента и ингибитора (ЭДТА, ПХМБ, ДТТ, Л^этилмалеимида), инкубировали в течении 30 мин при 4°, а затем определяли активность. При использовании в качестве денатурирующих агентов мочевину и DS-Na, активность фермента определяли после инкубации с ними в течении 30 минут при 4°.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно общепринятым методам (Плохинский,1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

L Продукция внеклеточной щелочной фосфатазы аиткбнотико-устойчивымн штаммами B.intermedius

В процессе поиска продуцентов внеклеточной щелочной фосфатазы для получения высокоочищенного ферментного белка проводили определение фосфатазной активности у 25 штаммов B.intermedius, устойчивых к стрептомицину, рифампицину и эритромицину. В результате у 8-ми из 25 штаммов, а именно, B.intermedius S3-19, S7, S15, S13, Е4, Еб, R5, R8, обнаруживается более высокий уровень фосфатазной активности в культуральной жидкости по сравнению с исходным штаммом B.intermedius 7Р, особенно у стрептомицинустойчивых штаммов: выход фермента у них увеличивается более чем в Зраза, тогда как для рифампицинустойчивых и эритромицинустойчивых штаммов - 1,5-2раза.

У штаммов с более высоким уровнем фосфатазной активности была изучена динамика роста бактерий и накопления внеклеточной щелочной фосфатазы. Полученные данные показывают (рис.1), что для стрептомицинустойчивых и рифампицинустойчивых штаммов характерны 2

Рис.1. Динамика роста(А> и активность внеклеточной щелочной фосфатазы(Б) у

стрептомицинустойчивые штаммы: 1-53-19, 2-£?, 3-513, 4-^15; II -рифампицинустойчивые штаммы: 1-Ц5, 2-^8;)П-эритромицинустойчивые штаммы: 1-Е4, 2-Еб. К-исходный штамм /ля'^^^/у^ 7Р.

пика фосфатазной активности в культуральной жидкости: в фазе замедления роста культуры и в стационарной фазе роста бактерий. У эритромицинустойчивых штаммов проявляется более поздний третий пик в начале стадии спорообразования (25-й час роста). Отмечено, что фосфатазная активность, соответствующая первому пику, в 3-4 раза превышала фосфатазную активность в стационарной фазе (второй пик). Для ряда атибиотикоустойчивых штаммов наблюдалось небольшое смещение во времени максимальных значений фосфатазной активности по сравнению с исходным штаммом. Так, у стрептомицинустойчивых штаммов B.intermedius S3-19 и S7 оба пика совпадали с соответствующими пиками исходного штамма, а у B.intermedius SJ5 лагфаза и появление активного фермента в среде продлены и максимальная активность фосфатазы, соответствующая обоим пикам, наблюдалась на 2 часа позже, чем у B.intermedius 7Р. Наоборот, у B.iniermedius SJ3 первый пик фосфатазной активности наблюдался на 2, а второй на 3 часа раньше, чем у исходного штамма. У рифампицинустойчивого штамма B.intermedius R8 происходило смещение второго пика фосфатазной активности: он наблюдался на 2часа раньше, чем у B.intermedius 7Р и R5. Аналогичная ситуация по отношению к исходному штамму наблюдается для эритромицинустойчивых штаммов: второй пик активности наблюдался раньше на 1-2 часа, чем у B.intermedius 7Р. Неизвестно, являются ли белки, соответствующие разным пикам фосфатазной активности, продуктами одного гена и разница уровней их каталитической активности - результат флуктуации активности фермента или эти белки кодируются разными структурными генами. Ответ на этот вопрос могут дать структурные исследования белка и соответсвукнцего гена. Из полученных данных следует, что секреция фермента в среду достигает максимального уровня в фазе замедления роста, когда активизированы все ферменты, обеспечивающие процессы катаболизма бактерий. У других споровых бактерий, B.subtilis например, Идентифицированы два структурных гена внеклеточной ЩФазы, синтез которых регулируется разными путями (Hulett et al., 1990). Белки кодируемые этими генами, характеризуются высокой (63%) структурной гомологией (Hulett et al., 1991). Один из них - вегетативная щелочная фосфатаза составляет 65% от общей фосфатазной активности в среде в период экспоненциального роста,

проявляет каталитическую активность в состоянии димера и регулируется экзогенным ортофосфатом. Другой белок составляет 35% от общей фосфатазной активности во время вегетативного роста культуры и 100% фосфатазной активности во время споруляции бактерий, активен как мономер и не регулируется экзогенным ортофосфатом в среде (Hulett et al., 1991).

При пассировании антибиотикоустойчивых штаммов установлено, что повышенная активность щелочной фосфатазы является устойчивым признаком для стрептомицинустойчивых штаммов и утрачивается через три -четыре генерации у рифамтпщинустойчивых и эритромищшустойчивых штаммов. Возможно, это происходит ввиду того, что стрептомицинустойчивость, как следует из данных литературы (Гейл, 1975), является хромосомным признаком в отличие от признаков устойчивости бактерий к другим антибиотикам, которые, как правило, связываются с внехромосомными элементами.

Таким образом, изучение антибиотикоустойчивых штаммов B.intermedius позволило выделить группу бактерий (B.intermedius S3-19, S15, S13, 57), у которых продукция фермента находится на более высоком уровне.

При изучении влияния условий культивирования бактерий на образование фосфатазы в культуральной жидкости было установлено, что из широкого ряда ионов двухвалентных металлов (Со, Zn, Fe, Co+Zn, Co+Fe) наибольший активирующий эффект проявляют ионы Со2+. Установлено, что оптимальная активирующая концентрация кобальта - ОДмМ. В его присутствии в среде активность внеклеточной щелочной фосфатазы у B.intermedius S3-19 увеличивается в 9 раз по сравнению с исходным штаммом. Дальнейшее повышение содержания кобальта в среде приводит к полной потере активности фермента и ингибированию роста культуры. Наши данные подтверждаются результатами Spencer et al.(1981) для B.licheniformis, у которых синтез внеклеточной щелочной фосфатазы увеличивался более чем в 10 раз при внесении кобальта в опытную среду в концентрации 0,1мМ через 6,5 часов культивирования, в момент запуска этого фермента. Согласно нашим результатам, активность фермента не зависила от времени внесения кобальта в исходную среду в процессе роста бактерий.

Появление внеклеточных ферментов в среде культивирования микроорганизмов в значительной степени определяется ее составом (Безбородов, 1984). Так щелочные фосфатазы, выделенные из клеток B.subtilis, выращенных с использованием разных источников углерода - глюкоза, лахтат, отличались по времени накопления фермента в среде, а также по уровню специфической активности (Ghosh et al, 1977). Проведенная работа по замене источника углеродного питания в среде культивирования показало, что на среде с пируватом в концентрации 0,5% штаммы B.intermedius S3-19 и S7 проявляли наибольшую фосфатазную активность. Видимо, это является ттаммовой особенностью, так как по литературным данным, наиболее часто используют в качестве углеродного питания глюкозу. При изучении влияния 5'-мухлеозидмонофосфататов на синтез щелочной фосфатазы оказалось, что в присутствии AMP в среде культивирования дополнительно увеличивается образование фермента в 1,5-2 раза. Таким образом, после отбора штаммов B.intermedius, отличающихся повышенным синтезом щелочной фосфатазы, были подобраны условия для наиболее эффективного образования этого фермента.

2. Выделение и очистка фосфатазы Bacillus intermedius S3-19

Все описанные выше исследования явились подготовительным этапом для выделения щелочной фосфатазы в гомогенном состоянии. Нами была разработана схема, включающая хроматографию на колонке с DEAE-целлюлозой, SP-колонке, Mono S HR 5/5. В результате проведенной работы (табл. 1) был получен один белковый пик (рис. 2), обладающий фосфатазной активностью. По данным электрофореза в DS-ПААГ препарат фермента являлся гомогенным и не содержал примесей других белков. Молекулярная масса составила 47кДа. Субстратный блотхинг, поставленный после проведения электрофореза препарата фосфатазы в нативных условиях, выявил только одну окрашенную полосу и подтвердил присутствие одной формы фермента. Полученные данные позволяют заключить, что выделена мономерная форма фосфатазы, обладающая каталитической активностью на стадии вегетативного роста бактерий. Из литературы известно, что Hulett et ai. (1990) выделили, с использованием Mono S HR 5/5, две формы фосфатазы из супернатанта культуральной жидкости у мутантов B.subtilis. Одна фосфатаза

5 10

Оёыи, iu

Fac.2 Хроматографический профиль элэошш фосфатагы В .intermedins S3-] 9 с колонки Mono S HR 5/5

1 - Активность фосфатазы

2 - белок, опт. ед. (A2so)

3 - Градами MgCI2

Таблшдз 1

Очистка щелочной фосфатазы из культуралыгой жидкости В. intermedins S3-19 ■

Стадии очистки Объем, мл Общий белок, мг Общая активность, мкМ/мин Удельная активность ел/иг Степевь очистки

1. Культуральная жидкость 900 18720 12797 0,7 1

2. колонка с DEAE-цедлголозой 50 2350 4709 2 2,9

З.БР-колонка 16 1,6 1307 817 1167

4. колонка Mono S HR 5/5 2,5 0,125 193 1540 2200

являлась мономером с М.м. 45 кДа и продуцировалась неспорулируюшими клетками. Другая форма, которая была активна как димер с М.м. 80кДа, продуцировалась как во время вегетативного роста, так и в период слоруляции культуры. Их соотношение во время вегетативного роста составляло 65% и 35% для мономерной и димерной формы ЩФазы соответственно.

3. Характеристика фоефатазы

Препарат фоефатазы расщеплял лараншрофенилфосфат и бис-паранитрофенилфосфат, не шдролизовал РНК, ДНК и казеин. Фосфодиэстеразная активность составляла 40% от фосфомоноэстеразной активности. Изучение рН-оптимумов для обеих активностей показало, что они совпадают и максимальная фосфомоноэстеразная и фосфодиэстеразная активности препарата обнаруживаются при рН9,5. Такой же результат был получен при определении оптимума температуры: он одинаков для обеих активностей и проявляется при температуре 55*. Область рН-стабильности для фосфомоноэстеразной и фосфодиэстеразной активностей препарата обнаруживались при рН 8-10. Более 50% этой активности терялось за 2 часа инкубации при рН6,5 и 7,0. Изучение термоинактивации фермента показало, что фосфомоноэстераза стабильна при нагревании до 60' и полностью теряла активность при нагревании в течение часа при 80'. При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на фосфомоноэстеразную и фосфодиэстеразную активности было установлено, что Со2+, Са2+, Мд2+ и Zn2+ активировали обе активности препарата, причем максимальный стимулирующий эффект наблюдался при концентрации металлов 0,1мМ. Повышение концентрации металлов приводило к подавлению ферментативной активности. Си2+, Рс2+, Мп2+ даже в концентрации 0,1мМ оказывали иншбирующие действие на обе активности. Изучение влияния ингибиторов и денатурирующих агентов на фосфодиэстеразную и фосфомоноэстеразную активности фермента показало, что ЭДТА оказывал ингибирующее действие, дитиотритол, п-хлормеркурибензоат, н-этилмалеимид оказывали слабое ингибирующее действие на обе активности. Таким образом, можно сделать вывод, что выделенный нами фермент

Биохимические свойства щелочных фосфатаз бацилл

Таблица 2

Продуцент Локализация Молекулярная масса фермента (кДд) Четвертичная структура Молекулярная масса субъедин иды (кДа) рНопт Т опт Кт,молъ (р-ИРР) ФДЭ-активность (% отФМЭ) Авторы

\-B.lichenformis МС 14 цпм вне клетки 120 110 димер димер 60 60 10,1 10,0 55° 55° -А 2,5 • 10 * - 8с1и0е1,Ни1еи ,1978 Ни1еЦ et.al.1986

2 .ВлиЫЯи 1Н646МБ АРазе III АРте IV вне клетки вне клетки 80 45 димер мономер 46 45 10,0 10,0 * * * 5% Ни1е« et.al.1990

3 .ВяиЫНЬ 168 А Разе I А Разе II ЦПМ цпм 110 95 димер димер 50 47 10,2 10,5 55° 60° -5 5,1 . 10 -4 2,7 • 10 ~ Б^аЬага et.al.1991

А.В.МегтесИш 83-19 вне клетки 47 мономер 47 9,5 55° -3 1,2 • 10 40% собственные данные

* - данные отсутствуют

обладает двумя ферментативными активностями, которые, по-видимому, определяются одним активным центром.

В табл. 2 проведено сравнение некоторых биохимических свойств полученных для щелочной фосфатазы B.intermedius S3-19 с биохимическим свойствами щелочных фосфатаз B.ticheniformis и B.subtilis, охарактеризованных в литературе. Как видно из таблицы щелочная фосфатаза B.intermedius по этим характеристикам близка к известным щелочным фосфатазам спорообразующих бактерий.

При изучении субстратной специфичности было показано (табл.3), что наряду с модельными субстратами фермент способен отщеплять фосфорный остаток от широкого ряда природных субстратов: мононуклеотидов, цинуклеотидов, тринуклеотидов и фосфорилированкых тексоз. Таким образом, фермент проявлял свойства типи'шые для неспецифических фосфатаз и обладал широкой субстратной специфичностью. Тем не менее, фосфатаза с большей эффективностью отщепляла фосфорный остаток от нуклеотидов в 5'-

Таблвда 3

Субстратная специфичность B.intermedius S3-19

Субстрат Активность, %

p-NPP 100**

5'-АМР 100**

З'-АМР 72*

5"-GMP 100**

З'-GMP 81*

5'-UMP 100**

З'-UMP 39*

5'-СМР 100**

ADP 56*

GDP 52*

UDP 51*

фруктозо-1,6-днфосфат 60*

глюкозо-1 -фосфат 50*

GTP 30*

АТР 38*

Примечание. *-<j & 10%; ** - CT £ 5%

изложении, отдавая предпочтение нуклеозидмонофосфатам. Сравнительно зысокая активность фосфатазы в отношении нуклеозидмонофосфатов тодчеркивает ее физиологическую роль в утилизации нуклеиновых кислот и гродуктов их распада наряду с секретируемыми нуклеодеполимераэами B.intermedius, известного природного продуцента щелочной рибонуклеазы. Продукты ферментативного расщепления полинуклеотцдов - моно- и элигонуклеотиды могут служить субстратами для фосфатазы. Синтез и ;екреция шелочной фосфатазы осуществляется в условиях голодания бактерий та ортофосфату, который является одним из конечных продуктов в цепи тревращения нуклеиновых кислот. Следовательно, секреция нуклеаз и £осфатаз в среду обеспечивает бактерии в конечном итоге наряду с гуклеотидным материалом еще и ортофосфатом.

Щелочная фосфатаза "B.intermedius S3-19 является металлоферментом. Ионы двухвалентных металлов и тиоловые реагенты оказывали влияние на наивность фосфатазы. Ионы Со2'*", Са2+, Zn2+ и Mg2+ являлись активаторами, рюличивающими активность фермента на 150, 80, 60 и 30%, соответственно. Ферментативная активность снижалась в присутствии ионов Cu2+, Fe2+, Мп2+ (рис. 3). Слабое ингибирующее действие на ферментативную активность щелочной фосфатазы B.intermedius оказывали дитиотршол, п-клормеркурибензоат, н-этилмалеимид (табл. 4). Это свидетельствует о том, что расположенные на поверхности дисулъфидаые и сульфшдрилъные группы не участвуют в каталитическом акте, или же, подобно другим бациллярным фосфатазам, фермент не содержит цистеиновых остатков. Полной инактивации белка можно было добиться при воздействии DS-Na и ЭДТА.

Таким образом, была выделена шелочная фосфатаза B.intermedius S3-19. Она продуцируется вегетативными клетками, ее синтез репрессируется фосфатом. Сравнительная характеристика биохимических свойств фермента с описанными в литературе фосфатазами бацилл указывает на наибольшее сходство с APase IV B.subtilis. Подобно APase ГУ B.subtifís, фосфатаза B.intermedius секретируется в среду. Активные формы обоих ферментов представлены мономерами с одинаковой молекулярной массой. Помимо фосфомоноэстеразной активности, ферменты обладают фосфодиэстеразной активностью (табл. 2). Из всего выше сказанного, можно заключить, что эта

Ионы

Рис.3 Влияние ионов двухвалентных металлов на активность щелочной фосфатазы Bacillus iniermedius S3-19. За 100% принимали активность фосфатазы полученную после обессодивания на колонке с сефадексом G25. * - Р £ 0,05; ** - Р ^ 0,001

Таблица 4

Влияние ингибиторов и денатурирующих агентов иа фосфатазную активность В. iniermedius S 3-19

Конечная концентрация, Остаточная

Препарат мМ активность,

%

ЭДТА 2 48

5 47*

п-ХМБ 2 95

5 98*

дтт 2 98

5 96*

Мочевина 2000 90

4000 94*

N-этилмалеимид 2 98

5 96*

DS-Na 35 0

Примечание. * - а £ 10%

щелочная фосфатаза относится к семейству структурно гомологичных щелочных фосфатаз спорообразующих бактерий.

Изучение биохимических свойств является первым этапом в исследовании фермента, что позволит в дальнейшем использовать B.intermedius в качестве модели для установления молекулярных механизмов биосинтеза и секреции внеклеточных белков. Дальнейшее накопление знаний о функционировании регуляторных систем внесет существенный вклад в понимание механизмов адаптации бактериальных клеток к изменениям окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Выделена группа бактерий (антибиотикоустойчивые штаммы B.intermedius) с повышенной продукцией щелочной фосфатазы.

2. Разработан метод выделения и очистки гомогенного препарата внеклеточной фосфатазы B.intermedius S3-19 из фильтрата культуральной среды бактерий, который включает ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе и SP-колонке, а также высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке Mono S HR 5/5.

3. Молекулярная масса щелочной фосфатазы B.intermedius S3-19, определенная с помощью гель-проникающей хроматографии на Superóse 12 HR 10/30 и ПААГ электрофорезом в денатурирующих условиях, равна 47 кДа.

4. По своим физико-химическим и каталитическим свойствам изучаемая фосфатаза близка щелочным фосфатазам спорообразующих бактерий. Однако, в отличии от щелочной фосфатазы B.licheniformis, выделенный фермент обладает фосфодиэстеразной активностью, более высокой чем у APaselV B.subtilis.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Нехотяева Н.В., Ицкович EJI. Секреция щелочных фосфатазы и протеазы антибиотикоустойчивыми штаммами Bacillus intennedius // Тезисы докладов конференции РФ "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Москва. - 1993. - С. 115.

2. Sharipova M.R., Balaban N.P., Nekhotyaeva N.V., Leshchinskaya I.B. Secretory phosphatase from Bacilli // Proceedings 4 th Pacific Rim Biotechnology Conference, Melbourne, Australia. - 1995. - 320p.

3. Нехотяева H.B., Шарипова M.P., Балабан Н.П. Изучение продукции сехретируемой фосфатазы антибиотикоустойчивыми штаммами бацилл //Деп. В ВИНИТИ, № 2641-В95. - 1995. - 13с.

4. Нехотяева Н.В., Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Ицкович ЕЛ., ШакировЕ.В. Внеклеточные гвдролазы Bacillus intennedius. Выделение и свойства // Деп. в ВИНИТИ, N° 2642-В92. - 1995. - 18с.

5. Шарипова М.Р., Балаьан Н.П., Нехотяева Н.В., Ицкович ЕЛ., Шакиров Е.В., Лещинская И.Б., Руценская Г.Н. Секретируемые гидролазы стрептомицинустойчивых бактерий Bacillus intennedius // Биохимия.-1996.- Т.61, вып.1.- С.] 10-118.

6. Sharipova M.R., Balaban N.P., Nekhotyaeva N.V., Mardanova A.M., Dementiev A .A., Leshchinskaya I.B. A novel Bacillus intennedius extracellular alkaline phosphatase: isolation, physico-chemical and catalytic characteristics // Biochemistry and Molecular Biology international. - 1996. -V.38, Ns 4. - P.753-761.

Откопировано на ризографе в Издательстве Форт Диалог. Заказ № 86. Тираж 80. Бумага ксероксная. г.Казань, ул.Университетская, 17. Тел. (8432) 38-73-51