Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармакологическое влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на уровень альдостерона в плазме крови экспериментальных животных при стрессогенных воздействиях

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармакологическое влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на уровень альдостерона в плазме крови экспериментальных животных при стрессогенных воздействиях"

На правах рукописи

005011495 {

ДЕМЕНТЬЕВА Татьяна Юрьевна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОН-СУЛЬФАТА НА УРОВЕНЬ АЛЬДОСТЕРОНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ СТРЕССОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 6 ОЕВ Ж2

Новосибирск - 2012

005011495

Работа выполнена в лаборатории экспериментальных животных Научно-исследовательского института клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Обут Тимофей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Лопатин Сергей Викторович,

Доктор ветеринарных наук, доцент Иванова Анжела Борисовна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита состоится «28» февраля 2012 г. в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ПТУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии

Автореферат диссертации разослан__» января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема повышения резистентности организма животных к действию экстремальных факторов внешней среды и тесно связанные с ней аспекты фармакологической профилактики патологических последствий стресса являются весьма актуальными.

Дегидроэпиандростерон (ДЭА) и дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС) гормоны, секретируемые сетчатой зоной коры надпочечников (H.A. Юдаев и соавт., 1976) и продуцируются в нервной системе (P.D. Кго-both et al., 1999; О.Т. Wolf, С. Kirschbaum, 1999). В настоящее время установлено, что ДЭА и ДЭАС способны оказывать многочисленные терапевтические эффекты в организме: антионкогенный (J.R. Williams, 2000), гипотензивный (Т.А. Обут и соавт., 1999), противовирусный (H.D. Danenberg et al., 1995), иммуномодулирующий (M. Ledochowski et al., 2001), антиате-рогенный (G.B. Gordon et ah, 1988).

В литературе есть единичные свидетельства о возможном антистрес-сорном эффекте ДЭА и ДЭАС, касающемся в основном, их, так называемого, антиглюкокортикоидного действия. Опубликовано несколько работ о возможной функциональной связи ДЭАС и опиоидных систем (D.S. Reddy, S.K. Kulkarni, 1997; M. Inagaki et al., 1999; M. Stomati et al., 1999). На настоящий момент достоверно установлено, что ДЭАС оказывает ряд эффектов через о-рецепторы (F.P. Monnet et al., 1995; S. Bastianetto, R. Quirion, 1997; O.T. Wolf, С. Kirschbaum, 1999; A. Urani et al., 2001), но реализация физиологических эффектов ДЭАС через ц-опиоидные рецепторы ещё не изучена. Ранее проведённые Т.А. Обут и соавторами исследования показали адаптивную значимость надпочечникового андрогена ДЭАС при хронических стрессорных воздействиях, и выявили, что его эффекты могут реализоваться, в частности, через ц-опиоидные рецепторы (Т.А. Обут, 1998, 2004; Т.А. Обут и соавт., 2008,2010).

Известно, что гормон клубочковой зоны коры надпочечников альдосте-рон, характеризуется гипертензивным эффектом в организме (М.Н. Gomez-Sanchez, 1997; Е.М. Freel, J.M.C. Connell, 2004), и его уровень повышается при экстремальных воздействиях (R. Francesconi, M. Mager, 1983), но особенности его изменения при однократных или многократно повторяющихся воздействиях недостаточно изучены, как и влияние на него ДЭАС или причастность к его эффекту ц-опиоидных рецепторов. Возникает предположение, что выявленный Т.А. Обут и соавт. (1997; 1999) гипотензивный эффект ДЭАС может осуществляться посредством его подавляющего действия на уровень гипертензивного гормона альдостерона, но это требует специального исследования.

Поэтому представляет интерес изучение фармакологического влияния ДЭАС на уровень альдостерона, особенностей такого влияния в условиях острых и хронических стрессогекных воздействий, а также возможность участия при этом ц-опиоидных рецепторов.

Цель исследований - изучить фармакологическое влияние дегидроэпи-андростерон-сульфата (ДЭАС) на уровень альдостерона у крыс при стрессо-генных воздействиях.

Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи:

1. Изучить особенности изменения уровня альдостерона в плазме крови крыс без фармакологического воздействия при однократном и многократно повторяющемся холодовом и стрессорном нехолодовом воздействии.

2. Изучить характер и особенности фармакологического влияния ДЭАС на уровень альдостерона у животных в состоянии покоя, в условиях однократного и многократно повторяющегося холодового и стрессорного нехолодового воздействия.

3. Изучить уровень кортикостерона, как маркера стресс-реакции, и особенности влияния ДЭАС на его динамику при однократном и многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии.

4. Оценить возможность участия ц-опиоидных рецепторов в реализации эффекта ДЭАС путем введения антагониста опиоидных рецепторов налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует р-опиоидные рецепторы, на уровень альдостерона и особенности реакции при однократном и многократно повторяющемся холодовом и стрессорном нехолодовом воздействии.

Научная новизна.

Впервые показано, что введение ДЭАС животным при холодовом воздействии блокировало индуцируемое холодом повышение уровня альдр-стерона как при однократном, так и при многократно повторяющемся воздействии.

Впервые показано, что ДЭАС оказывал альдостерон-понижающий эффект при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии, не оказывая такого эффекта при однократном нехолодовом воздействии у животных.

Впервые выявлено, что альдостерон-понижающий эффект ДЭАС осуществляется с участием опиоидной системы, в частности ц-опиоидных рецепторов, свидетельствуя о вовлечении опиоидной регуляторной медиации в данные процессы.

Впервые показано, что повышение уровня альдостерона, вызванное стрессогенным фактором, при многократно повторяющемся воздействии, в сравнении с однократным, выражено слабее, как при холодовом, так и при нехолодовом стрессорном воздействии встряхиванием животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о регуляторных механизмах ответа организма на холодовые и нехолодовые стрессорные воздействия и о возможном взаимодействии между ДЭАС и гипертензивным гормоном альдостероном (межгормональном взаимодействии) при многократно повторяющихся стрессорных воздействиях. Принципиальную теоретическую значимость имеет установление участия ц-

опиоидных рецепторов в механизме реализации выявленного нами эффекта ДЭАС на уровень альдостерона при холодовом и нехолодовом стрессорном воздействии. Полученные в работе результаты должны учитываться при проведении дальнейших научных исследований. В ветеринарной практике ДЭАС может быть рекомендован для использования в качестве блокатора индуцируемого стрессогенными воздействиями повышения уровня альдостерона, по крайней мере, при многократно повторяющихся воздействиях. ДЭАС можно рекомендовать в качестве препарата для разработки способов профилактики и лечения при различных стрессорных ситуациях (транспортировке животных, во время проведения каких - либо технологических или ветеринарных мероприятий, в холодных условиях содержания). Результаты исследования используются в учебном процессе в НГПУ, НГАУ (Новосибирск), в ТывГУ (Кызыл).

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены: на III и V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007 и 2011); на XX (Москва, 2007) и XXI (Калуга, 2010) съездах физиологического общества им. И.П. Павлова; на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); на Международной конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований 2009» (Одесса, Украина, 2009); на научной телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение» (Томск, 2010); на официальной апробации в НИИ клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе, 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ («Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Вестник Томского гос. университета», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки») и 1 статья в зарубежном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 264 источника, из них 162 зарубежных авторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологический альдостерон-понижающий эффект ДЭАС проявляется как при однократном, так и при многократно повторяющемся холодовом воздействии и лишь прн многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии, но не в поксе, т.е. зависит от физиологического состояния организма.

2. Введение крысам, совместно с ДЭАС, антагониста опиоидных рецепторов налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует ц-

опиовдные рецепторы, отменяет альдостерон-понижающий эффект ДЭАС при многократно повторяющихся, но не однократных холодовом и стрессор-ном нехолодовом воздействиях, указывая на реализацию альдостерон-подавляющего действия ДЭАС через ц-опиоидные рецепторы, по крайней мере при многократно повторяющихся стрессогенных воздействиях.

3. Фармакологический эффект ДЭАС, реализуемый через ц-опиоидные рецепторы, проявляющийся лишь после многократно повторяющихся, но не однократных стрессогенных воздействий, свидетельствует о необходимости формирования (постепенной индукции) ц-опиоидного механизма действия ДЭАС в организме, более чем однократной стрессорной экспозицией.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2007-2010 гг. в лаборатории экспериментальных животных НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН. Часть исследований выполнена в НИИ физиологии Сибирского отделения РАМН.

Эксперименты проводили на половозрелых самцах крыс линии Wistar, массой 160-240 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария СО РАМН. Общее количество животных составило 1386 голов.

Кровь для определения гормонов собирали после декапитации животных (системная кровь) в гепаринизированные пробирки, плазму отделяли центрифугированием, хранили при температуре -20° С.

Холодовое воздействие оказывали на крыс содержанием их в отдельных клетках в холодильной камере при +4° С, по 1 часу в день однократно или на протяжении 19 дней (многократно повторяющееся холодовое воздействие) (S. Herbute et al., 1984; J.L. Quintanar-Stephano et al., 1991). Для оценки общего действия холодового фактора у крыс измеряли ректальную температуру на глубине 9 мм и температуру ядра тела на глубине 3,5 см цифровым термометром (модель LD-301). После проведения, многократно повторяющегося холодового воздействия, животных взвешивали на весах (модель ПВ-15). Кроме того, после многократно повторяющегося холодового воздействия легкие, печень, сердце, селезенку животных отправляли для проведения бактериологических исследований, на наличие патогенной микрофлоры в Новосибирскую межобластную ветеринарную лабораторию.

В качестве стрессорного нехолодового воздействия применяли встряхивание животных на лабораторном шюпель-аппарате типа АВБ-4п, с частотой 180 возвратно-поступательных движений в минуту по 1 часу в день однократно или на протяжении 19 дней (Т.А. Обут и соавт., 2002; Т.А. Обут, 2004). Подобное воздействие используется другими исследователями (P.Y.S. Fung, Е.Т. Uyeno, 1983; R. Hirasawa et al., 1990). После проведения многократно повторяющегося встряхивания животных взвешивали на весах (модель ПВ-15).

Для оценки развития стресс-реакции при данном воздействии у животных определяли уровень кортикостерона в плазме крови. Уровень альдо-

стерона определяли радиоиммунным методом, применяя стандартизированные наборы (Франция). Уровень кортикостерона определяли методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (О.П. Черкасова, В.И. Федоров, 2001) на приборе «Милихром-1» (МПО «Научприбор», г. Орёл) с хроматографической колонкой из нержавеющей стали с сорбентом Силасорб С. 18. Выражаю искреннюю признательность О.П. Черкасовой за методическую помощь в определении уровня кортикостерона.

ДЭАС (Sigma, USA) вводили крысам подкожно, однократно, в дозе 30 мг/кг (Т.А. Обут, 1998, 2004) за двое суток до забоя животных. При однократных воздействиях ДЭАС вводили сформированным группам крыс за двое суток до начала эксперимента. При хронических воздействиях (19-дневных) ДЭАС вводили на 17 день эксперимента, т.е. также за двое суток до забоя животных и прекращения стрессорного воздействия.

Для оценки эффекта более низких доз, ДЭАС вводили в дозах 1 и 5 мг/кг. Антагонист опиоидных рецепторов налтрексон (Sigma, USA) вводили крысам подкожно в дозе 0,1 мг/кг за 20 мин. до инъекции ДЭАС.

В работе использовали компьютерный пакет статистических программ SPSS 11.5. Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (М±ш). Статистические различия оценивали по t-критерию Стью-дента. Различия считали достоверными при р<0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Фармакологическое влияние введения ДЭАС на уровень альдостерона в плазме крови крыс при холодовом воздействии Влияние введения ДЭАС на уровень альдостерона у контрольных животных. Введение ДЭАС животным не оказывало влияния на содержание альдостерона в плазме крови контрольных крыс: уровни альдостерона у контрольных животных без введения ДЭАС и после его введения достоверно не различались (р>0,05). Данные представлены в таблице 1.

Таблица I - Содержание альдостерона в плазме крыс и влияние введения ДЭАС у контрольных животных

Группа крыс (п =) Уровень альдостерона, пг/мл

I контрольная до введения ДЭАС (8) 131,2 ±24,73

II контрольная после введения ДЭАС (8) 147,2 ±45,48

Примечание: в скобках, здесь и далее - количество животных в группах.

Влияние введения животным ДЭАС на уровень альдостерона при холодовом воздействии. После однократного холодового воздействия наблюдалось значительное увеличение у крыс уровня альдостерона (р<0,001), в сравнении с контрольным показателем на 169,3 ± 24,89 пг/мл. Введение крысам ДЭАС в этих условиях, вызывало достоверное (р<0,01) снижение у них уровня альдостерона на 61,7 ± 4,75 пг/мл (табл. 2).

Таблица 2 - Содержание альдостерона в плазме крыс до и после введения _животным ДЭАС при однократном холодовом воздействии_

Группа крыс (п =) Уровень альдостерона, пг/мл

I контрольная(32) 113,8 ± 12,05

П однократное холодовое воздействие до введения ДЭАС (14) 283,1 ±36,94*

III однократное холодовое воздействие после введения ДЭАС (13) 221,4±41,69#

* - р<0,001 относительно контроля; # - р<0,01 относительно группы крыс с однократным Холодовым воздействием без введения ДЭАС.

После многократно повторяющегося холодового воздействия также происходило статистически значимое повышение уровня альдостерона у крыс (р=0,05) относительно контрольного показателя на 37,6 ± 2,25 пг/мл (табл. 3). Но при многократно повторяющемся воздействии, в сравнении с однократным, это повышение было менее значительным (р<0,001), что связано, видимо, с привыканием животных к повторно применяемому стереотипному фактору.

Таблица 3 - Содержание.алъдостерона в плазме крыс до и после введения ДЭАС при многократно повторяющемся холодовом воздействии

Группа крыс (п =) Уровень альдостерона, пг/мл

I контрольная(32) 113,8 ± 12,05

II многократно повторяющееся холодовое воздействие до введения ДЭАС (37) 151,4 ± 14,30*

III многократно повторяющееся холодовое воздействие после введения ДЭАС (16) 46,6 ± 9,20 *♦#

* - р=0,05; ** - р<0,001 относительно контроля; # - р<0,001 относительно группы крыс с многократным Холодовым воздействием.

Введение крысам ДЭАС на фоне многократно повторяющегося холодового воздействия приводило к статистически значимому подавлению индуцируемого холодом повышения уровня альдостерона на 104,8 ±5,10 пг/мл (р<0,001) по сравнению с таковым в группе животных без введения ДЭАС. Более того, достигаемый после введения ДЭАС уровень альдостерона, равный 46,6 ± 9,20 пг/мл, был ниже контрольного значения на 67,2 ± 2,85 пг/мл (Р<0,001).

Таким образом, оба варианта холодового воздействия, однократное и многократно повторяющееся, вызывали повышение уровня альдостерона по сравнению с контролем на 169,3 ± 24,89 пг/мл (р<0,001), и на 37,6 ± 2,25 пг/мл (р=0,05) соответственно, более значимое после однократного, чем после многократно повторяющегося воздействия.

Введение ДЭАС животным блокировало индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона, как при однократном, так и при многократно повторяющемся воздействии. Следовательно, для ДЭАС характерным является эффект лимитирования индуцируемого холодом повышения уровня альдостерона у крыс.

Поскольку альдостерон характеризуется гипертензивным эффектом в организме (М.Н. Gomez-Sanchez, 1997; Е.М. Freel, J.M.C. Cornell, 2004), то

полученное нами уменьшение роста его уровня в ходе многократного повторения холодового воздействия может означать и ослабление при этом гипер-тензивного воздействия альдостерона. Значит, само повторение холодового воздействия в нашем режиме не должно усугублять гипертензивное состояние организма, которое достигается у животных в естественных условиях при различных стрессорных воздействиях для обеспечения способности либо проявления агрессии, либо готовности к бегству. Логично предположить, в связи с этим, что введение ДЭАС животным должно сопровождаться и снижением у них артериального давления, что предполагает возможность разработки способов его применения в ветеринарной практике в соответствующих случаях при холодных условиях содержания животных.

Влияние введения животным налтрексона на альдостерон-пони-жающий эффект ДЭАС при холодовом воздействии. Инъекция животным совместно с ДЭАС налтрексона при однократном холодовом воздействии не приводила к достоверному изменению у них уровня альдостерона (201,6 ±31,05 пг/мл) относительно такового в группе крыс после введения одного ДЭАС (221,4 ±41,69 пг/мл) (рис. 1).

□ контроль ■ без препаратов В ДЭАС □ ншпрексон+ДЭАС О натрексон

*- р<0,01; ** - р<0,001 относительно контроля; # - р<0,01 относительно группы крыс без введения препаратов.

Рисунок I - Содержание альдостерона в плазме крови крыс, влияние введения животным ДЭАС, налтрексона или совместно налтрексона и ДЭАС при однократном холодовом воздействии

Инъекция для дополнительного контроля одного налтрексона крысам в данном эксперименте также не оказывала существенного влияния на уровень у них альдостерона и составила 239,6 ± 36,13 пг/мл.

При многократно повторяющемся (19 дней) холодовом воздействии инъекция животным совместно с ДЭАС налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует р-опиоидные рецепторы (D. Benton, 1985; P.O. Cover, J.С. Buckingham, 1989), приводила к ослаблению (р=0,05) аль-достерон-снижающего эффекта ДЭАС на 28,3 ± 2,52 пг/мл по сравнению с фуппой животных, подвергавшихся такому же воздействию с введением

9

только ДЭАС (рис. 2). Следовательно, в данный блокирующий эффект ДЭАС на индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона вовлечены ц-опиоидные рецепторы. Хотя не полное восстановление при этом уровня альдостерона до такового после многократно повторяющегося воздействия свидетельствует о том, что это снижение связано не только с ц-опиоидными рецепторами, но ещё с чем-то, что требует дальнейшего специального исследования.

Дополнительное контрольное введение одного налтрексона в этом случае снижает индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона у крыс после многократно повторяющегося воздействия на 98,1 ± 1,95 пг/мл. Этот феномен на данном этапе наших знаний интерпретировать трудно.

Таким образом, полученные нами результаты о частичном купировании налтрексоном снижающего действия ДЭАС на индуцированный холодом уровень альдостерона при многократно повторяющемся холодовом воздействии свидетельствуют о том, что данный альдостерон-лимитирующий эффект ДЭАС осуществляется с участием опиоидной системы и, в частности, ц-опиоидных рецепторов. Но при однократном холодовом воздействии ДЭ-АС-зависимое снижение уровня альдостерона реализуется минуя \х-опиоидный механизм, поскольку блокада ц-опиоидных рецепторов налтрексоном в этом случае была неэффективна. Следовательно, при однократном холодовом влиянии на животных проявляется протекторный эффект ДЭАС на индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона, а при многократно повторяющемся - лечебный эффект ДЭАС.

□ контроль ■ без препаратов В ДЭАС С налгрексон+ДЭАС □ налтрексон

* - р=0,05; ** - р<0,001 относительно контроля; ## - р<0,001 относительно группы крыс без введения препаратов; + р=0,05 относительно группы крыс с введением ДЭАС

Рисунок 2 - Содержание альдостерона в плазме крови крыс, влияние введения животным ДЭАС, налтрексона и совместно, налтрексона и ДЭАС при многократно повторяющемся холодовом воздействии

Оценка эффекта введения ДЭАС животным в дозах 1 и 5 мг/кг при многократно повторяющемся холодовом воздействии. Для оценки зависимости выявляемого альдостерон-блокирующего эффекта ДЭАС от дозы применяемого препарата, помимо дозы 30 мг/кг, в приведённых выше ре-10

зультатах, мы применяли дополнительно ещё 1 и 5 мг/кг в условиях многократно повторяющегося воздействия.

Введение животным ДЭАС в дозах 1 и 5 мг/кг выявило те же тенденции: блокаду индуцируемого Холодовым воздействием повышения уровня альдостерона для обеих доз ДЭАС и его снижение на 102,8 ± 13,65 пг/мл и 103,6 ± 15,85 пг/мл, соответственно (рис. 3).

В ДЭАС 1 мг/кг ЕЗ ДЭАС 1 мг/кг = налтрексон

И ДЭАС 5 мг/кг 0 ДЭАС 5 мг/кг + налтрексон

* - р=0,05 относительно контроля; # - р<0,002 относительно группы крыс без введения препаратов; 0 - р<0,002 относительно группы крыс на фоне введения ДЭАС.

Рисунок 3 - Влияние ДЭА С в дозах 1 и 5 мг/кг, меньших 30 мг/кг, на блокаду индуцируемого многократно повторяющимся Холодовым воздействием повышения уровня альдостерона

При этом инъекция животным совместно с ДЭАС налтрексона, в дозе 0,1 мг/кг, приводила к ослаблению (р=0,05) альдостерон-снижающего эффекта ДЭАС на 41,3 ± 22,7 пг/мл и 37,6 ± 18,59 пг/мл, соответственно.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о купировании налтрексоном альдостерон-понижающего действия ДЭАС независимо от его дозы на индуцированное холодом повышение уровня альдостерона при многократно повторяющемся холодовом воздействии.

Оценка действия холодового фактора на животных. Для оценки действия холодового фактора на животных, у них измеряли ректальную температуру и температуру «ядра» тела, массу тела и определяли наличие патогенной микрофлоры. Измерение ректальной температуры, показало достоверное её снижение у животных сразу после холодового воздействия при его однократном воздействии или многократном повторении. Такое снижение ректальной температуры описано и другими исследователями (1.1. Ibidapo, O.A. Sofola, 1989).

Определение температуры «ядра» тела выявило, что у контрольных и у подвергавшихся однократному или многократно повторяющемуся холодо-вому воздействию крыс показатели температуры «ядра» тела статистически не различались (р>0,05). Следовательно, не происходило переохлаждения животных с потерей температуры «ядра» тела от данного холодового воздействия. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Ректальная температура у животных, её изменение после холодового воздействия___

Группа крыс (п=) Ректальная температура, °С Температура ядра тела, "С

I контрольная(31) 36,1 ±0,14 37,9 ±0,12

II однократное холодовое воздействие (14) 34,3 ± 0,25 * 37,7 ±0,10

Ш многократно повторяющееся холодовое воздействие (17) 34,9 ±0,19 * 37,7 ±0,25

* - р<0,001 относительно контроля.

Взвешивание контрольных и подвергавшихся многократно повторяющемуся холодовому воздействию животных показало, что по массе тела они статистически не различались (р>0,05), т.е., данный способ экспериментального воздействия не оказывал влияния на массу и прирост тела у животных (табл. 5).

Таблица S - Масса тела у контрольных и подвергавшихся многократно _повторяющемуся холодовому воздействию крыс_

Группа крыс (п =) Масса тела, г

1 контрольная (10) 190 ±2,95

II многократно повторяющееся холодовое воздействие (10) 195 ±3,91

Результаты бактериологических исследований внутренних органов, проведенных после оказания на крыс многократно повторяющегося холодового воздействия показали, что в исследованных материалах патогенной микрофлоры не выделено. (Справки № 9386-9390, № 3804, № 11235) [Приложение 1,2,3 диссертации]. Последнее свидетельствует о том, что охлаждение в применяемом нами режиме не должно приводить к развитию у животных патологических последствий.

2.2.2. Фармакологическое влияние введения ДЭАС на уровень альдостерона в плазме крови крыс при стрессорном нехолодовом воздействии

После однократного стрессорного нехолодового воздействия уровень альдостерона в плазме крыс достоверно увеличивался на 655,6 ± 20,91 пг/мл по сравнению с контролем (р<0,001) (табл. 7).

Таблица 7 - Влияние введения животным ДЭАС на уровень альдостерона _при однократном стрессорном нехолодовом воздействии_:

Группа крыс (п =) Уровень альдостерона, пг/мл

I контрольная(28) 129,8 ± 12,42

II однократное стрессорное нехолодовое воздействие до введения ДЭАС (13) 785,4 ±33,33*

III однократное стрессорное нехолодовое воздействие после введения ДЭАС (13) 702,4 ±31,22

* _ р<0,001 относительно контроля

Введение животным ДЭАС в дозе 30 мг/кг при данном воздействии не приводило к статистически значимому изменению показателя относительно значения у группы крыс до введения ДЭАС.

Под влиянием многократно повторяющегося стрессорного нехолодо-вого воздействия у крыс также происходило достоверное увеличение (р<0,001) уровня альдостерона относительно контрольного значения на 223,2 ± 34,68 пг/мл (табл. 8).

Таблица 8 — Влияние введения животным ДЭАС на уровень альдостерона при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии

Группа крыс (п =) Уровень альдостерона, пг/мл

I контрольная(28) 129,8 ± 12,42

11 многократно повторяющееся стрессорное нехолодовое воздействие до введения ДЭАС (15) 353,0 ±47,10*

Ш многократно повторяющееся стрессорное нехолодовое воздействие после введения ДЭАС (13) 226,7 ± 39,48 #

*р<0,001 - относительно контроля; #р=0,05 - относительно группы крыс после многократно повторяющегося стрессорного нехолодового воздействия без введения ДЭАС.

Однако уровень альдостерона при многократном воздействии был вдвое ниже (р<0,001), чем при однократном, что связано, видимо, с привыканием к стереотипно повторяющемуся фактору у крыс при многократно повторяющемся воздействии.

После введения животным ДЭАС у них происходило достоверное снижение (р<0,05) уровня альдостерона на 126,3 ± 7,62 пг/мл относительно такового у группы стрессированных крыс без введения ДЭАС.

Итак, при холодовых воздействиях в наших экспериментах альдосте-рон-понижающий эффект ДЭАС проявлялся как при однократной, так и при многократно повторяющейся экспозиции, а при нехолодовых - лишь при многократно повторяющемся воздействии, свидетельствуя о различиях изменений, связанных с характером действующего фактора.

Влияние введения животным налтрексона на альдостерон-пони-жающий эффект ДЭАС при стрессорном нехолодовом воздействии. При однократном стрессорном нехолодовом воздействии введение животным совместно с ДЭАС налтрексона не приводило к достоверному изменению у них уровня альдостерона тю сравнению с таковым в группе крыс после однократного стрессорного воздействия без введения ДЭАС (рис. 4). Инъекция животным для дополнительного контроля одного налтрексона статистически не изменяла у них уровень альдостерона.

Таким образом, введение налтрексона совместно с ДЭАС при однократном стрессорном нехолодовом воздействии было неэффективным. При многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии инъекция животным совместно с ДЭАС налтрексона в дозе 0,1 мг/кг ослабляла эффект лимитирования, посредством ДЭАС, стресс-индуци-руемого повышения уровня альдостерона на 103,3 ± 11,15 пг/мл, хотя данный эффект не приводил к достоверному (р>0,05) различию с таковым в группе крыс после многократного воздействия с введением животным ДЭАС (рис. 5).

□ контроль. Ш без препаратов Н ДЭАС Я налтрексона ДЭАС Ш налтрексон

* - р<0,001 по сравнению с контролем

Рисунок 4 - Содержание альдостерона в плате крыс, влияние введения животным ДЭАС, налтрексона или совместно налтрексона иДЭАС при однократном стрессорном нехолодовом воздействии встряхиванием животных

О контроль ■ без препаратов ПДЭАС В налтрексон+ДЭАС □ налтрексон

** - р<0,001 относительно контроля; # - р=0,05 относительно группы крыс без введения препаратов

Рисунок 5- Содержание альдостерона в плазме крыс, влияние введения животным ДЭА С, налтрексона или совместно налтрексона и ДЭА С при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии встряхиванием животных

Однако этот уровень альдостерона не отличался и от показателя в группе крыс после многократно повторяющегося воздействия без введения животным всех препаратов, т.е. возвращался к исходному значению 353,0 ±47,10 пг/мл (р>0,05). Следовательно, совместное введение препаратов отменяло лимитирующий эффект введения одного ДЭАС, выявленный нами при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии.

Поскольку налтрексон в дозе 0,1 мг/кг селективно блокирует ц-опиоидные рецепторы, следовательно, выявленный нами эффект ДЭАС реализуется через ц-опиоидные рецепторы.

Таким образом, при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии, лимитирующее действие ДЭАС на стресс-индуци-рованное повышение уровня альдостерона происходит через ц-оггаоидные рецепторы, а при однократном стрессорном нехолодовом воздействии данный эффект ДЭАС не выявляется. Это отличает эффект ДЭАС при холодо-вом воздействии, при котором он проявлялся как при однократном, так и при многократно повторяющемся воздействии. 14

Можно предположить, что выявленный блокирующий эффект ДЭАС осуществляется по обратной отрицательной связи (feedback-механизм) стероида ДЭАС на стероид альдостерон. Тогда эта обратная отрицательная связь реализуется через р-опиоидные рецепторы. Но в литературе нет сведений о возможной обратной связи между ДЭАС и альдостероном. Более того, данному предположению противоречат полученные нами и представленные в данной работе результаты, полученные при однократном стрес-сорном воздействии, при котором ДЭАС не оказывал эффекта. А такая обратная отрицательная связь, если бы она функционировала, должна была бы проявляться как при многократно повторяющемся, так и при однократном стрессорном воздействии. У контрольных животных ДЭАС тоже не снижал уровень альдостерона. Значит, данный эффект ДЭАС не объясняется, видимо, феноменом обратной отрицательной связи, а обусловлен наличием и/или формированием de novo определённых регуляторных механизмов, присущих, именно, многократно повторяющемуся стрессорному воздействию, для которого может быть характерна постепенная индукция к изучаемому моменту (19-й день воздействия) опиоидных и, в том числе р-опиоидного, механизмов.

Оценка влияния многократно повторяющегося стрессорного не-холодового воздействия на массу тела животных. Данные по оценке влияния многократно повторяющегося стрессорного нехолодового воздействия на массу тела животных выявили, что у контрольных и у подвергавшихся стрессорному нехолодовому воздействию крыс показатели массы тела статистически не различались (р>0,05), (табл. 6).

Таблица б - Масса тела у контрольных и подвергавшихся многократно повторяющемуся стрессорному нехолодовому воздействию крыс

Группа крыс (п =) Масса тела, г

I контрольная(15) 185 ±5,11

II многократно повторяющееся стрессорное воздействие (15) 195 ±3,41

Таким образом, данный способ экспериментального воздействия не оказывал отрицательного влияния на массу тела животных и прирост тела у них в процессе многократно повторяющегося нехолодового воздействия. Это свидетельствует о хорошей переносимости животными данного воздействия.

2.2.3. Оценка стресс-реакции по уровню кортикостерона после однократного и многократно повторяющегося стрессорного нехолодового воздействия

При оценке влияния введения ДЭАС на уровень кортикостерона в плазме крови контрольных крыс установлено, что показатели до и после инъекции ДЭАС достоверно не отличались (р>0,05).

Однократное и многократно повторяющееся стрессорное воздействие встряхиванием животных, приводило к значительному повышению на 299,3 ± 10,04 нг/мл и 105,2 ± 15,76 нг/мл уровня кортикостерона у стресси-

рованных крыс по сравнению со значениями у контрольных животных, в связи с развитием у животных стресс-реакции, (табл. 9 и 10). Введение крысам ДЭАС при однократном воздействии не приводило к изменению стресс-индуцируемого повышения уровня кортикостерона.

Таблица 9 — Влияние введения животным ДЭАС на уровень кортикостерона _при однократном стрессорном нехолодовом воздействии_

Группа крыс (п=) Уровень кортикостерона, нг/мл

I контрольная(17) 58,2 ±4,68

11 однократное стрессорное воздействие до введения ДЭАС (15) 357,5 ± 14,72 *

III однократное стрессорное воздействие после введения ДЭАС (19) 337,1 ± 19,92 *

* -р<0,001 относительно контроля

Однако при многократно повторяющемся воздействии стресс-инду-цируемый уровень кортикостерона у крыс был ниже на 194,1 ± 5,72 нг/мл (р<0,001), чем при однократном, что свидетельствует о снижении стресс-реакции у животных в ходе многократно повторяющегося воздействия.

Таблица 10 - Содержание кортикостерона в плазме крыс при однократном и многократно повторяющемся стрессорном воздействии

Группа крыс (п=) Уровень кортикостерона, нг/мл

I контрольная(17) 58,2 ±4,68

И однократное стрессорное воздействие (13) 357,5 ± 14,72 **

III многократно повторяющееся стрессорное воздействие (14) 163,4 ± 20,44 *#

* - р<0,01; ** - р<0,001 относительно контроля; # - р<0,001 относительно однократного стрессорного воздействия

Для оценки возможной зависимости влияния ДЭАС на уровень кортикостерона у крыс от вводимой дозы, препарат применяли в дозах 1мг/кг, 5мг/кг, 30 мг/кг и 60 мг/кг (табл. 11).

Таблица 11 - Влияние многократно повторяющегося стрессорного воздействия

• на уровень кортикостерона в плазме крыс при введении различных доз ДЭА С

Группа крыс, (п=) Уровень кортикостерон, нг/мл

I контрольная (7) 30,9 ±2,15

II многократно повторяющееся стрессорное воздействие (7) 181,3 ±15,45 **

III многократно повторяющееся стрессорное воздействие после введения ДЭАС - 1 мг/кг (7) 111,6 ±13,75 *Ч

IV многократно повторяющееся стрессорное воздействие после введения ДЭАС - 5 мг/кг (8) 93,9 ±8,38 **##

V многократно повторяющееся стрессорное воздействие после введения ДЭАС-30 мг/кг (8) 108,6 ± 8,76 **т

VI многократно повторяющееся стрессорное воздействие после введения ДЭАС - 60 мг/кг (7) 168,5 ±11,73 **

**р<0,001 - относительно контроля; #р<0,01; ##р<0,001 - относительно многократно повторяющегося стрессорного воздействия без введения животным ДЭАС.

Инъекция самцам крыс ДЭАС в дозах 1; 5 и 30 мг/кг, на фоне многократно повторяющегося стрессорного воздействия встряхиванием живот-

ных, привела к достоверно (р<0,01) меньшему повышению уровня корти-костерона: (при дозе 1 мг/кг - на 69,7 ± 1,70 нг/мл; при дозе 5 мг/кг - на 87,4 ± 7,07 нг/мл; при дозе 30 мг/кг - на 72,7 ± 6,69 нг/мл) по сравнению с показателями у животных, подвергавшимся такому же воздействию без введения ДЭАС.

Все дозы, кроме 60 мг/кг, оказались эффективными - ДЭАС оказывал равноценное влияние на стресс-реактивность, снижая стресс-индуцируе-мый уровень кортикостерона на 69,7 нг/мл, 87,4 нг/мл и 72,7 нг/мл соответственно, то есть, проявлял стресс-лимитирующий эффект.

Доза 60 мг/кг не снижала стресс-реакгивность. В большинстве своих экспериментов мы использовали дозу 30 мг/кг ДЭАС (Обут Т.А., 1998, 2004).

Влияние совместного введения ДЭАС и налтрексона на уровень кортикостерона при стрессорном воздействии встряхиванием животных. При однократном стрессорном воздействии инъекция животным совместно с ДЭАС антагониста опиоидных рецепторов налтрексона, не приводила к изменению у них стресс-индуцированного уровня кортикостерона (рис. 6). Введение для дополнительного контроля одного налтрексона крысам, подвергавшимся однократному стрессорному воздействию, также не оказывало влияния на стресс-индуцируемый уровень кортикостерона в плазме крыс.

□ контроль ■ без препаратов В ДЭАС Н налтрексон+ДЭАС П наирексон * -р<0,001 относительно контроля

Рисунок 6 - Содержание кортикостерона в плазме крыс, влияние введения животным ДЭАС, налтрексона или совместно налтрексона и ДЭАС при однократном стрессорном воздействии встряхиванием животных

При многократно повторяющемся стрессорном воздействии инъекция животным совместно с ДЭАС налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует ц-опиоидные рецепторы, вызывала отмену лимитирующего стресс-реактивность эффекта ДЭАС (до значения 159,5 ± 21,44 нг/мл у крыс при аналогичном воздействии без введения препаратов, где уровень кортикостерона составил 163,4 ± 20,44 нг/мл) (рис. 7). Следовательно, блокада ц-опиоидных рецепторов налтрексоном полностью предотвра-

щала снижающее действие ДЭАС на стресс-индуцируемый уровень корти-костерона, а значит при многократно повторяющемся воздействии стресс-лимитирующий эффект ДЭАС реализовался через р-опиоидные рецепторы.

□ контроль И без препаратов В ДЭАС 8 налгрексон+ДЭАС П налтрексон

*р<0,001 - относительно контроля; #р<0,05 - относительно группы крыс без введения препаратов; +р<0,05 - относительно группы крыс с введением ДЭАС

Рисунок 7- Содержание кортикостерона в плазме крыс, влияние введения животным ДЭАС, налтрексона или совместно налтрексона и ДЭАС при многократно повторяющемся стрессорном воздействии встряхиванием животных

и о о.

100

Инъекция для дополнительного контроля одного налтрексона крысам, подвергавшимся многократно повторяющемуся стрессорному воздействию, не оказывала влияния на стресс-индуцируемый уровень кортикостерона у животных.

Таким образом, полученные нами результаты о полном купировании снижающего действия ДЭАС на стресс-индуцированный уровень кортикостерона при многократно повторяющемся стрессорном воздействии налтрек-соном в дозе, селективно блокирующей ц-опиоидные рецепторы, свидетельствуют, что лимитирующий стресс-реактивность эффект ДЭАС, при таком воздействии осуществляется с участием ц-опиоидных рецепторов. Но такой эффект не выявляется при однократном стрессорном воздействии.

Возвращаясь к приведённым выше результатам по определению уровня альдостерона, отметим, что эффекты как ДЭАС, так и совместно введённого ДЭАС с налтрексоном по их влиянию на стресс-индуцируемые уровени кортикостерона и альдостерона совпадают по своему характеру. Именно при многократно повторяющемся, но не однократном, стрессорном воздействии, выявлено снижение индуцируемого стрессом повышения уровня как кортикостерона, так и альдостерона, и отмена этого эффекта ДЭАС при совместном его введении с налтрексоном. Значит, альдостерон-понижающий эффект ДЭАС может быть обусловлен его стресс-лимити-рующим эффектом: лимитирование стресс-реакции как следствие, снимает необходимость повышения уровня альдостерона.

3. выводы

1. После однократного и многократно повторяющегося холодового и стрессорного нехолодового воздействия уровень альдостерона в плазме крови крыс достоверно повышается на 169,3 ± 24,89 и 37,6 ± 2,25 пг/мл, и на 655,6 ± 20,91 и 223,2 ± 34,68 пг/мл, соответственно, но это повышение более выражено после однократного воздействия.

2. Введение ДЭАС контрольным крысам не оказывает влияния на уровень альдостерона в плазме крови. Введение ДЭАС животным при хо-лодовом воздействии блокирует индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона как при однократном, так и при многократно повторяющемся воздействии, снижая уровень альдостерона на 61,7 ± 4,75 пг/мл и на 115,7 ± 8,49 пг/мл, соответственно.

3. При стрессорном нехолодовом воздействии встряхиванием животных, введение им ДЭАС блокирует стресс-индуцируемое повышение уровня альдостерона, снижая его уровень на 126,3 ± 7,62 пг/мл только при многократно повторяющемся, но не однократном стрессорном воздействии.

4. При многократно повторяющихся, но не однократных, как холодо-вом, так и стрессорном нехолодовом воздействиях, эффект ДЭАС, блокирующий стрессогенное повышение уровня альдостерона, реализуется через ц-опиоидные рецепторы (как показало применение антагониста опиоидных рецепторов налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует ц-опиоидные рецепторы).

5. Оценка стресс-рективности по уровню кортикостерона свидетельствует о том, что однократное и многократно повторяющееся стрессорное воздействие встряхиванием животных приводит к увеличению данного гормона у них в плазме крови на 299,3 ± 10,04 нг/мл и 105,2 ± 15,76 нг/мл, соответственно, более выраженному при однократном, чем при многократно повторяющемся воздействии, выявляя различия в степени выраженности стресс-реакции в зависимости от применяемого режима воздействия.

6. Введение ДЭАС животным подавляет стресс-индуцируемое увеличение уровня кортикостерона при многократно повторяющемся, но не однократном стрессорном воздействии встряхиванием животных, с реализацией эффекта ДЭАС через ц- опиоидные рецепторы.

7. Результаты изучения фармакологического влияния ДЭАС выявляют возможность блокады физиологического (стрессогенного) повышения уровня альдостерона в организме животных, во избежание дальнейшего развития патогенного гиперальдостеронизма.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты исследований необходимо учитывать при разработке препаратов, содержащих ДЭАС, и способов их применения в ветеринарной практике.

2. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении курса лекций по фармакологии и физиологии.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обут, Т.А. Дегидроэпиандростерон-сульфат в индивидуальной адаптации / Т.А. Обут, Т.Ю. Дементьева, Е.Т. Обут, Т.А. Григорьева // Вестник Томского гос. университета. - 2006. - № 21. - С. 116-117.

2. Обут, Т.А. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на превращение корти-костерона в 11-дегидрокортикостерон при стрессе: схема регуляции / ТА. Обут, М.В. Овсюкова, Т.Ю. Дементьева, О.П. Черкасова, С.К. Сарыг, Т.Д. Григорьева // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2008. - Т. 94. - № 8. - С. 945-951.

3. Обут, ТА. Тиреоидактивирующий эффект дегидроэпиандростерон-сульфата с участием ц-опиоидных рецепторов при холодовом воздействии / ТА. Обут, O.K. Сарыг, ТА. Григорьева, TJO. Дементьева // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2008. - Т. 94. - № 12. - С. 1420-1425.

4. Обут, ТА. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на уровень альдостерона при холодовом воздействии / ТА. Обут, С.К. Сарыг, М.В. Овсюкова, Т.Ю. Дементьева, Е.Т. Обут, ТА. Эрдыниева // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -2011.-Т. 97.-№2.-С. 214-217.

5. Обут, ТА. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на уровень альдостерона при стрессорных воздействиях: участие ц-опиоидных рецепторов / ТА. Обут, С.К. Сарыг, М.В. Овсюкова, Т.Ю. Дементьева, Е.Т. Обут, ТА. Эрдыниева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152. - № 12. - С. 636-639.

6. Дементьева Т.Ю. Блокада дегидроэпиандросгерон-сульфатом повышения уровня альдостерона при однократном н многократно повторяющемся холодовом воздействии / Т.Ю. Дементьева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2012. -№1.-С. 124-125.

7. Obut, Т.А. Effects of dehydroepiandrosterone sulfate on the conversion of corticosterone into 11-dehydrocorticosterone in stress: a regulatory scheme / T.A. Obut, M.V. Ovsyukova, T.Yu. Dement'eva, O.P. Cherkasova, S.K. Saryg, T.A. Grigor'eva // Neurosci. Behav. Physiol. - 2009. -V. 39.-N. 7.-P. 695-699.

8. Обут, T.A. Адаптивная значимость и возможность терапевтического применения падпочечниковых андрогенов / Т.А. Обут, М.В. Овсюкова, С.К. Сарыг, Е.Т. Обут, Т.А. Эрдыниева, Т.Ю. Дементьева // Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение: сб. науч. тр. 1-оймеждунар. телеконф.-Томск, 2010.-T. 1.-С. 126-130.

9. Обут, Т.А. Биологическая значимость надпочечниковых андрогенов / Т.А. Обут, Т.Ю. Дементьева, Е.Т. Обут // Тез. XX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва, 2007. - С. 358-359.

10. Дементьева Т.Ю. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на уровни альдостерона, кортикостерона и АКТГ при стрессорном воздействии / Т.Ю. Дементьева, Т.А. Григорьева, С.К. Сарыг, Т.А. Обут, М.В. Овсюкова // Тез. докл. VI Сибирского физиологического съезда. - Барнаул, 2008. - Т. 1. - С. 218-219.

11. Обут, Т.А. Дегидроэпиандросгерон-сульфат в регуляции межэндокринных взаимоотношений через мю-опиоидные рецепторы при холодовом и стрессорном нехолодовом воздействии / Т.А. Обут, С.К. Сарыг, Т.А. Григорьева, Т.Ю. Дементьева // Науч. тр. II съезда физиологов СНГ. - Кишинев, 2008. - Т. 2. - С. 151-152.

12. Обут, Т.А. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на индуцированный холодом уровень альдостерона с участием д-опиоидных рецепторов / Т.А. Обут, М.В. Овсюкова, С.К. Сарыг, Т.Ю. Дементьева, Т.А. Эрдыниева, Е.Т. Обут И Тез. докл. XXI съезда физиологического общества им. И.П. Павлова.-Калуга, 2010.-С. 447.

13. Обут, Т.А. Влияние дегидроэпиандростерон-сульфата на артериальное давление: вариант механизма реализации / Т.А. Обут, Е.Т. Обуг, М.В. Овсюкова, Т.А. Эрдыниева, Т.Ю.Дементьева, A.JI. Маркель // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: мат. V Всерос. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2011. - С. 157-158.

Подписано в печать 18.01.2012 г. Формат 60x84 '1,6. _Объем 1п. л. Заказ № 3. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ГНУ СибНСХБ Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Дементьева, Татьяна Юрьевна, Новосибирск

61 12-16Л8

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ

ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

Дементьева Татьяна Юрьевна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОН-СУЛЬФАТА НА УРОВЕНЬ АЛЬДОСТЕРОНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ СТРЕССОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Т.А. Обут

Новосибирск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..............................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................10

1.1. Строение надпочечников и секретируемые ими гормоны....................10

1.2. Биохимия стероидогенеза и регуляция секреции гормонов коры надпочечников..............................................................................13

1.3. Влияние стрессирующих факторов на живой организм.......................16

1.4. Участие опиоидных систем в регуляции стресс-реакции организма.......23

1.5. Современные представления о роли и механизмах действия дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростерон-сульфата..................28

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................42

2.1 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................42

2.1.1. Экспериментальные животные..................................................42

2.1.2. Плазма крови........................................................................42

2.1.3. Экспериментальные воздействия................................................42

2.1.3.1. Холодовое воздействие на животных.........................................42

2.1.3.2. Стрессорное нехолодовое воздействие........................................43

2.1.4. Методы определения гормонов..................................................43

2.1.4.1. Определение альдостерона......................................................43

2.1.4.2. Определение кортикостерона методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии..................................44

2.1.5. Фармакологические тесты........................................................45

2.1.6. Статистическая обработка результатов........................................46

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............................47

2.2.1. Фармакологическое влияние введения ДЭАС на уровень альдостерона в плазме крови крыс при холодовом воздействии..................................47

2.2.2. Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в лимитировании дегидроэпиандростерон-сульфатом индуцируемого холодом------ ------

повышения уровня альдостерона......................................................50

2.2.3. Оценка эффекта введения ДЭАС животным в дозах 1 и 5 мг/кг

при многократно повторяющемся холодовом воздействии......................54

2.2.4. Оценка действия холодового фактора на животных........................56

2.2.5. Влияние введения ДЭАС на уровень альдостерона при стрессорном нехолодовом воздействии...............................................58

2.2.6. Влияние введения животным налтрексона на альдостерон-понижающий эффект ДЭАС при стрессорном нехолодовом

воздействии.................................................................................60

2.2.7. Оценка стресс-реакции по уровню кортикостерона после однократного и многократно повторяющегося стрессорного нехолодового воздействия...................................................................................65

2.2.8. Оценка участия ц-опиоидных рецепторов в лимитировании дегидроэпиандростерон-сульфатом стресс-индуцируемого повышения уровня кортикостерона путем применения антагониста опиоидных рецепторов налтрексона..................................................................70

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................74

4. ВЫВОДЫ.................................................................................89

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................91

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................92

ПРИЛОЖЕНИЕ...........................................................................123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГГАКС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система

ДЭА - дегидроэпиандростерон

ДЭАС - дегидроэпиандростерон-сульфат

СЗКН - сетчатая зона коры надпочечников

КС - кортикостероиды

КРФ - кортикотропин-рилизинг-фактор

НАЛТ - налтрексон

ОАС - общий адаптационный синдром

САС - симпато-адреналовая система

СНС - симпатическая нервная система

СЛС - стресс-лимитирующие системы

СРС - стресс-реализующие системы

ЦНС - центральная нервная система

КМБА - М-метил-Б-аспартат

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема повышения резистентности организма животных к действию экстремальных факторов внешней среды и тесно связанные с ней аспекты фармакологической профилактики патологических последствий стресса являются весьма актуальными.

Дегидроэпиандростерон (ДЭА) и дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС) гормоны, секретируемые сетчатой зоной коры надпочечников (H.A. Юдаев и соавт., 1976) и продуцируются в нервной системе (P.D. Kroboth et al, 1999; О.Т. Wolf, С. Kirschbaum, 1999). В настоящее время установлено, что ДЭА и ДЭАС способны оказывать многочисленные терапевтические эффекты в организме: антионкогенный (J.R Williams, 2000), гипотензивный (Т.А. Обут и соавт, 1999), противовирусный (H.D. Danenberg et al, 1995), иммуномодулирующий (M. Ledochowski et al, 2001), антиатерогенный (G.B. Gordon et al, 1988).

В литературе есть единичные свидетельства о возможном антистрессорном эффекте ДЭА и ДЭАС, касающемся в основном, их, так называемого, антоглюкокортикоидного действия. Опубликовано несколько работ о возможной функциональной связи ДЭАС и опиоидных систем (D.S. Reddy, S.K. Kulkarni, 1997; M. Inagaki et al, 1999; M. Stomati et al, 1999). Ha настоящий момент достоверно установлено, что ДЭАС оказывает ряд эффектов через о-рецепторы (F.P. Monnet et al, 1995; S. Bastianetto, R. Quirion, 1997; O.T. Wolf, С. Kirschbaum, 1999; A Urani. et al, 2001), но реализация физиологических эффектов ДЭАС через u-опиоидные рецепторы ещё не изучена. Ранее проведённые Обут Т.А. и соавторами исследования показали адаптивную значимость надпочечникового андрогена ДЭАС при хронических стрессорных воздействиях, и выявили, что его эффекты могут реализоваться, в частности, через ц-опиоидные рецепторы (Т.А. Обут, 1998, 2004; Т.А. Обут и соавт, 2008, 2010).

Известно, что гормон клубочковой зоны коры надпочечников альдостерон, характеризуется гипертензивным эффектом в организме (М.Н. Gomez-Sanchez, 1997; Е.М. Freel, J.M.C. Connell, 2004), и его уровень повышается при экстремальных воздействиях (R. Francesconi, М Mager., 1983), но особенности его изменения при однократных или многократно повторяющихся воздействиях недостаточно изучены, как и влияние на него ДЭАС или причастность к его эффекту р,-опиоидных рецепторов. Возникает предположение, что выявленный Т. А. Обут и соавт. (1997; 1999) гипотензивный эффект ДЭАС может осуществляться посредством его подавляющего действия на уровень гипертензивного гормона альдостерона, но это требует специального исследования.

Поэтому представляет интерес изучение фармакологического влияния ДЭАС на уровень альдостерона, особенностей такого влияния в условиях острых и хронических стрессогенных воздействий, а также возможность участия при этом ц-опиоидных рецепторов.

Цель исследований - изучить фармакологическое влияние дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС) на уровень альдостерона у крыс при стрессогенных воздействиях.

Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи:

1. Изучить особенности изменения уровня альдостерона в плазме крови крыс без фармакологического воздействия при однократном и многократно повторяющемся холодовом и стрессорном нехолодовом воздействии.

2. Изучить характер и особенности фармакологического влияния ДЭАС на уровень альдостерона у животных в состоянии покоя, в условиях однократного и многократно повторяющегося холодового и стрессорного нехолодового воздействия.

3. Изучить уровень кортикостерона, как маркера стресс-реакции, и особенности влияния ДЭАС на его динамику при однократном и многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии.

4. Оценить возможность участия ц-опиоидных рецепторов в реализации эффекта ДЭАС путем введения антагониста опиоидных рецепторов налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он блокирует ц-опиоидные рецепторы, на уровень альдостерона и особенности реакции при однократном и многократно повторяющемся холодовом и стрессорном нехолодовом воздействии.

Научная новизна.

Впервые показано, что введение ДЭАС животным при холодовом воздействии блокировало индуцируемое холодом повышение уровня альдостерона как при однократном, так и при многократно повторяющемся воздействии.

Впервые показано, что ДЭАС оказывал альдостерон-понижающий эффект при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии, не оказывая такого эффекта при однократном нехолодовом воздействии у животных.

Впервые выявлено, что альдостерон-понижающий эффект ДЭАС осуществляется с участием опиоидной системы, в частности ц-опиоидных рецепторов, свидетельствуя о вовлечении опиоидной регуляторной медиации в данные процессы.

Впервые показано, что повышение уровня альдостерона, вызванное стрессогенным фактором, при многократно повторяющемся воздействии, в сравнении с однократным, выражено слабее, как при холодовом, так и при нехолодовом стрессорном воздействии встряхиванием животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о регуляторных механизмах ответа организма на холодовые и нехолодовые стрессорные воздействия и о возможном взаимодействии между ДЭАС и гипертензивным гормоном альдостероном (межгормональном взаимодействии) при многократно повторяющихся стрессорных воздействиях. Принципиальную теоретическую значимость имеет установление участия (i-опиоидных рецепторов в механизме реализации выявленного нами эффекта ДЭАС на уровень альдостерона при холодовом и нехолодовом стрессорном воздействии. Полученные в работе результаты должны учитываться при проведении дальнейших научных исследований. В ветеринарной практике ДЭАС может быть рекомендован для использования в качестве блокатора индуцируемого стрессогенными воздействиями повышения уровня альдостерона, по крайней мере, при многократно повторяющихся воздействиях. ДЭАС можно рекомендовать для разработки способов профилактики и лечения при различных стрессорных ситуациях (транспортировке животных, во время проведения каких - либо технологических или ветеринарных мероприятий, в холодных условиях содержания). Результаты исследования используются в учебном процессе в НГПУ, НГАУ (Новосибирск), в ТывГУ (Кызыл).

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены: на III и V Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007 и 2011); на XX (Москва, 2007) и XXI (Калуга, 2010) съездах физиологического общества им. И.П. Павлова; на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); на Международной конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований 2009» (Одесса, Украина, 2009); на научной

телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение» (Томск, 2010); на официальной апробации в НИИ клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе, 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в зарубежном журнале.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологический альдостерон-понижаюгций эффект ДЭАС проявляется как при однократном, так и при многократно повторяющемся холодовом воздействии и лишь при многократно повторяющемся стрессорном нехолодовом воздействии, но не в покое, т.е. зависит от физиологического состояния организма.

2. Введение крысам, совместно с ДЭАС, антагониста опиоидных рецепторов налтрексона в дозе 0,1 мг/кг, в которой он селективно блокирует ц-опиоидные рецепторы, отменяет альдостерон-понижающий эффект ДЭАС при многократно повторяющихся, но не однократных холодовом и стрессорном нехолодовом воздействиях, указывая на реализацию альдостерон-подавляющего действия ДЭАС через и-опиоидные рецепторы, по крайней мере при многократно повторяющихся стрессогенных воздействиях.

3. Фармакологический эффект ДЭАС, реализуемый через ц-опиоидные рецепторы, проявляющийся лишь после многократно повторяющихся, но не однократных стрессогенных воздействий, свидетельствует о необходимости формирования (постепенной индукции) ц-опиоидного механизма действия ДЭАС в организме, более чем однократной стрессорной экспозицией.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Строение надпочечников и секретируемые ими гормоны

Надпочечники являются эндокринными железами, а продуцируемые ими гормоны участвуют в регуляции жизненно важных функций организма, как в обычных физиологических условиях, так и в процессе адаптации организма к изменяющимся условиям окружающей среды, в том числе, и при воздействии экстремальных факторов.

Корковое вещество надпочечника делится на клубочковую, пучковую и сетчатую зоны. Клубочковая зона, прилегающая к соеденительнотканной капсуле, состоит из клеток, собранных в клубочки и секретирует преимущественно альдостерон. В пучковой, средней, наиболее широкой зоне группируются железистые клетки, расположенные радиальными колонками, секретирующие, главным образом, глкжокортикоиды - кортикостерон и кортизол, а в сетчатой, внутренней, зоне - группы сетевидно расположенных клеток, секретирующие андрогены - дегидроэпиандростерон (ДЭА) и дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС). Корковое вещество надпочечника богато липидами, окрашивающими его в жёлтый цвет (Б.Н. Розен, 1980).

Гормоны коркового вещества - минералокортикоиды, глкжокортикоиды и андрогены синтезируются в митохондриях секреторных клеток из холестерина. Многообразное влияние этих гормонов на все виды обмена веществ, сосудистый тонус, иммунитет и др. делает корковое вещество надпочечников важнейшим участком жизнеобеспечения в обычных условиях и в условиях адаптации к различным стрессовым воздействиям (П.К. Костюк, Н.П. Бехтерева, 1986; Т. А. Обут, 2004). Альдостерон - основной минералокортикоид, участвующий в регуляции водно-солевого обмена. Впервые в кристаллической форме альдостерон был получен в 1952 году (Н.М. Grundy, S.A. Simpson).

Между глюкокортикоидами и минералокортикоидами существует зона «функционального перекрытия», обусловленная тем, что каждая группа гормонов обладает некоторой активностью противоположной группы (Н.М. Grundy, S.A. Simpson, 1952).

Альдостерон был выделен из коры надпочечников S.A. Simpson et al. в 1953 году. Главным местом метаболизма альдостерона являются печень и частично почки (Е. Fluckiger, F. Verzar, 1954; H.A. Юдаев и соавт, 1976).

Под влиянием альдостерона увеличивается реабсорбция натрия в дистальных отделах канальцев почек. Это ведёт к повышению концентрации ионов натрия в просвете канальцев и индуцирует увеличение отрицательного потенциала в окружающей канальцы жидкости. Полагают, что калий пассивно диффундирует в направлении этого отрицательного потенциала под влиянием минералокортикоидов (В.Н. Forman, P.J. Mulrow, 1975). Такое действие на транспорт ионов альдостерон оказывает также в потовых, слюнных железах, в слизистой кишечника и в обмене между внутриклеточной и внеклеточной жидкостями тела. Соотношение натрий-калий в моче, поте, слюне, кале и внутриклеточной жидкости уменьшается за счёт понижения выделения натрия и в меньшей степени в результате увеличения выделения калия. Экскреция ионов почками под влиянием альдостерона начинается через 1-2 часа и достигает максимума через 45 часов (Н.М. Grundy, S.A. Simpson, 1952).

В результате задержки калия, недостаточность периферического кровообращения и почечная недостаточность неизбежно приводит к смерти (Н.М. Grundy, S.A. Simpson, 1952). Недостаток альдостерона приводит к потере натрия с мочой и задержке калия. Введение альдостерона способствует реабсорбции натрия из клубочкового фильтрата в почечных канальцах и увеличению экскреции калия с мочой (S.L. Alexander et al., 1995; S.R. Holmer et al., 2005).

Помимо этого, альдостерон оказывает прямое воздействие на юкстагломерулярные клетки почек по механизму отрицательной обратной связи (рис. 1). Восстановление артериального давления и объёма крови, а также прямой ингибиторный эффект альдостерона - всё это приводит к эффективному торможению секреции ренина (Ь. ТоЫап, 1959).

Альдостерон усиливает выделение кальция и магния. Этот эффект связан как с увеличением объёма внеклеточной жидкости, так и с торможением реабсорбции кальция и магния в проксимальных канальцах (В. Шее ег а1., 1993).

Избыток альдостерона в организме ведёт к повышению уровня натрия и снижению калия, к алкалозу и к увеличению объёма внеклеточной жидкости. Алкалоз под влиянием альдостерона был отмечен у здоровых людей, которые получали диету с низким содержанием соли и с добавлением бикарбоната (1.Р. Каэз^ег е1 а1., 1971).

АН Г ИОТЕН Э И НО ГЕН

-т—■

АНГИОТЕНЭИН

- АН Г ИОТЕН Э И Н II

РЕНИН