Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с артериальной гипертонией, на модели крыс линии НИСАГ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривенко, Анжелика Анатольевна, Новосибирск

л"? 6

Институт цитологии и генетики СО РАН

КРИВЕНКО АНЖЕЛИКА АНАТОЛЬЕВНА

ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ, НА МОДЕЛИ КРЫС ЛИНИИ НИСАГ.

03.00.15 - генетика Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: д.б.н. проф. Дымшиц Г.М. д.б.н. проф. Маркель А.Л.

Новосибирск - 1999 г.

Список сокращений. 4

Введение. 5 Глава I. Обзор литературы

1.1. Генетические аспекты изучения артериальной гипертонии человека 8

1.2. Стресс и гипертония 13

1.3. Белки теплового шока и артериальная гипертония 15

1.4. Экспериментальные модели артериальной гипертонии 20

1.5. Молекулярно-генетические подходы к изучению экспериментальной гипертонии. 25

1.5.1. Метод генов-кандидатов. 26

1.5.2. Скрининг генома 34

Глава II. Материалы и методы

11.1. Экспериментальные животные 40 II. 1.1. Объект исследования - крысы линии НИСАГ 40

11.2. Измерение артериального давления 43

11.3. Выделение ДНК из печени крыс 44

11.4. Выделение тотальной РНК из тканей крыс 44

11.5.1. Саузерн блот-гибридизация 45

11.5.2.Нозерн блот-гибридизация 46 II.6. Полимеразная цепная реакция с произвольными

(AP-PCR) праймерами на геномной ДНК крыс 47

И.7. Дифференциальный дисплей суммарной мРНК 48

11.8. Элюция из высушенного ПААГ 49

11.9. Элюция из агарозного геля 49 II. 10. Реакция лигирования продуктов ПЦР в

pT7Blue Т- Vector (Noyagen, США) 50

II. 11. Трансформация компетентных клеток E.coli

NovaBlue (Novagen, США) 50

11.12. Отбор рекомбинантов 51

11.13. Выделение плазмидной ДНК 51

11.14. Определение нуклеотидной последовательности клонированного вpT7Blue Т-Vector фрагмента кДНК 52

11.15. Компьютерный анализ 53

Глава III. Результаты и обсуждение

III. 1. Анализ генома крыс нормо- и г'ипертензивных линий

методом геномного фингерпринтинга 54

111.2. Анализ косегрегации молекулярно-генетических маркёров с величиной АД у крыс гипертензивной

линии НИСАГ 61

111.2.1.Результаты анализа гибридной популяции В1 с использованием микросателлитного зонда (CA С)5 62

111.2.2.Изучение полиморфизма с помощью полимеразной

цепной реакции со случайными праймерами (AP-PCR) 65

111.3. Полиморфизм гена белка теплового шока HSP70 73

111.4. Дифференциальный дисплей мРНК 81

Заключение Выводы

Список литературы

90 94 96

Список сокращений

АГ - артериальная гипертония АД - артериальное давление н. - нуклеотиды

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

УФ - ультрафиолет

AP-PCR - arbitrarily primed PCR (ПЦР со случайными праймерами) АР RT-PCR - arbitrarily primed reverse transcription-coupled PCR

(ПЦР со случайными праймерами при обратной транскрипции) AT - angiotensin type lb (ангиотензин типа IB) ВС - backcrosses (беккроссы) BP - blood pressure (кровяное давление) Chr - chromosome (хромосома) dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат GCA - guanylyl cyclase А (гуанил циклаза A) HSP - heat shock protein (белок теплового шока) LOD - десятичный логарифм отношений вероятности LTR - long terminal repeat (длинный концевой повтор) NOS - NO-синтетаза

ORR - origin region repeat (повторённый район ori)

QTL - quantitative trait locus (локус количественного признака)

RI - recombinant inbred (инбредные рекомбинанты)

RT1 - главный комплекс гистосовместимости

SHR - spontaneously hypertensive rat (спонтанно-гипертензивная крыса) WAG - Wistar Albino Glaxo (крысы инбредной линии Вистар) WKY - Wistar-Kyoto (крысы линии Вистар-Киото)

Введение

Многие широко распространенные заболевания человека, к числу которых относится гипертоническая болезнь, представляют собой патологические состояния со сложным типом наследования. Диагноз - "гипертоническая болезнь" по сути дела объединяет разные клинико-генетические варианты патологии. Кроме того, проявление заболевания зависит не только от генетических, но и от средовых факторов. Поэтому для установления природы гипертонической болезни важно правильно оценить вклад каждого компонента.

Хотя многие физиологические системы, вовлеченные в регуляцию артериального давления, известны, но из-за сложного их взаимодействия как между собой, так и с внешними факторами, трудно определить, какая же из систем претерпела изменения в каждом отдельном случае болезни. Поэтому еще и сегодня артериальную гипертонию во всех клиниках мира в основном лечат эмпирически. Более глубокое понимание природы различных генетико-физиологических механизмов этого заболевания привело бы к специфическому лечению в каждом конкретном случае заболевания.

Создание экспериментальных генетических моделей артериальной гипертонии (линий крыс и мышей) открывает новые возможности для идентификации генов, ответственных за формирование данной патологии и для изучения генетико-физиологических механизмов, лежащих в основе разных ее форм. Одна из таких моделей, которая явилась объектом нашего исследования, - гипертензивная линия крыс НИСАГ (наследственная индуцированная стрессом артериальная гипертония) - была получена в Институте цитологии и генетики СО РАН в результате многолетней селекции по реакции артериального давления в условиях мягкого эмоционального стресса (Маркель, 1985).

Сочетание методов классической генетики с использованием экспериментальных моделей животных и современных молекулярно-генетичес-ких подходов позволяет детально изучать генетические факторы, отвечающие за возникновение и развитие разных форм гипертонической болезни. Использование крыс линии НИСАГ имеет целью исследовать причины и механизмы развития стресс-зависимой или стресс-чувствительной формы артериальной гипертонии. Выявленные морфологические и функциональные изменения сердца, сосудов, и нейро-эндокринной регуляторной системы, возникающие в результате развития артериальной гипертонии у крыс линии НИСАГ, а также особенности генетической селекции данной линии, которая осуществлялась на провокационном фоне, создаваемом эмоциональным стрессом, привлекают особое внимание к механизмам стрессового ответа организма и, в частности, к системе стрессовых белков или белков теплового шока, которым посвящен один из разделов диссертации.

Методом геномной дактилоскопии с использованием мультилокус-ного микросателлитного зонда (САС)5 нами были получены первые результаты, свидетельствующие о высокой степени генетической гомогенности крыс линии НИСАГ, что является одной из основных предпосылок при использовании моделей животных в генетических экспериментах.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы были поиск и идентификация молекулярно-генетических маркеров стресс-зависимых гипертензивных состояний на модели стресс-зависимой артериальной гипертонии - крысах линии НИСАГ.

Были определены следующие конкретные задачи:

1) дать сравнительную характеристику ДНК крыс линий с разным гипертензивным статусом - как нормотензивных WAG и Wistar, так и гипер-

тензивных - SHR и НИСАГ, используя методы геномной дактилоскопии, а именно, гибридизационный тест с молекулярным зондом (САС)5 и полиме-разную цепную реакцию со случайными праймерами (AP-PCR);

2) изучить полиморфизм гена белка теплового шока hsp70 у животных линий НИСАГ и SHR, моделирующих разные варианты возникновения артериальной гипертонии, а также нормотензивных линий WAG и Wistar;

3) провести сравнительный анализ геномной ДНК крыс гипертензив-ной линии НИСАГ, нормотензивной линии Wistar и их гибридов с целью выявления ДНК-маркёров артериальной гипертонии;

4) оценить изменения спектра мРНК при стрессе у крыс линии НИСАГ и нормотензивной линии WAG методом дифференциального дисплея.

Глава I. Обзор литературы

1.1 Генетические аспекты изучения артериальной гипертонии

человека.

Основной целью изучения генетико-физиологических механизмов формирования артериальной гипертонии является, прежде всего, достижение более глубокого понимания процессов регуляции артериального давления (АД) и создание более эффективных способов лечения и предупреждения гипертонической болезни человека.

Термин "артериальная гипертония" определяет группу генетически и, часто, фенотипически различных состояний, имеющих, однако, одну обязательную общую характеристику - наличие повышеного АД. Гипертоническая болезнь, выявляемая по крайней мере у 15 % населения большинства развитых стран, является одной из основных проблем современной медицины.

Все случаи этого заболевания принято разделять на первичную или эссенциальную и вторичную гипертонию.

Первичная артериальная гипертония (АГ) - это собирательный термин, который используют для обозначения тех форм заболевания, для которых причины, вызывающие повышение АД, не установлены. До 95% случаев относятся именно к этой форме гипертонической болезни.

Диагноз "вторичная гипертония" объединяет синдромы с известными анатомическими и эндокринными нарушениями.

Семейный анализ указывает на то, что от 20 до 40% популяционной изменчивости как систолического, так и диастолического АД генетически обусловлено. Так как в генетической детерминации АД принимает участие не один, а несколько генетических локусов, по которым имеется полиморфизм, принято считать, что наследственная предрасположенность к гипертонии является полигенным признаком. В частности, генетические дефекты

могут приводить к нарушениям почечной экскреции Ка+, мембранного транспорта ионов, изменениям метаболизма и секреции некоторых гормонов, вазо- и кардиоактивных веществ и другим отклонениям, приводящим к повышению АД.

В то же время известно несколько форм артериальной гипертонии, обусловленных дефектом одного гена и, следовательно, имеющих моногенный характер наследования (Табл. 1). Частота встречаемости их в популяции крайне низка и может составлять лишь доли процента.

Принято считать, что две трети случаев повышения уровня АД в человеческой популяции обусловлены влиянием средовых факторов при их взаимодействии с генотипом, определяющим предрасположенность к повышению АД при действии соответствующих факторов среды (Нате!:, 1996). Наиболее существенными для развития заболевания средовыми факторами риска (помимо генетических) являются: особенности диеты, низкая физическая активность, психосоциальный и экологический стрессы. Ниже приведен список основных факторов, способствующих формированию артериальной гипертонии (порядок их перечисления не связан с силой их влияния):

1. Генетическая предрасположенность (в том числе расовые особенности).

2. Старение.

3. Высокосолевая диета.

4. Курение.

5. Ожирение.

6. Употребление большого количества алкоголя.

7. Гиподинамия.

8. Заболевание сахарным диабетом.

9. Психоэмоциональный стресс.

Таблица!. Моногенные формы наследственной гипертонии у человека (Глйоп КР. 1996).

Заболевание Мутация Механизм

Корригируемы й глюкокортикоидами алъдостеронизм Делеция, приводящая к слиянию проксимальной регуляторной части 11-Р гидроксилазы с дистальным участком альдостерон-синтетазы. В результате неравного кроссинговера образуется химерный ген. Реорганизация системы регуляции секреции альдостерона. Повышение уровня альдостерона в плазме происходит под действием адренокортикотропного гормона и приводит к задержке соли и воды в почке, следовательно, к увеличению объёма плазмы крови. Активность ренина при этом низкая.

Синдром мнимого алъдостеронизма Мутация в районе 5-го экзона гена 11-р стероид дегидрогеназы,приводящая к нарушению транскрипции, начиная с 374 ко дона, и делеции 32 аминокислотна С-конце фермента. Снижение активности 11 -Р стероид дегидрогеназы, приводящее к нарушению альдостероновой регуляции водно-солевого баланса в почке. Происходит стимуляция кортизолом минерал---:о-кортикоидных рецепторов и повышение реабсорбции с увеличением объёма плазмы крови.

Синдром Лиддла Мутации в генах для Р- и у-субъединиц №+-эпителиальных каналов, чувствительных к амилориду, приводят либо к делеции цитоплазматических С-концевых фрагментов субъединиц, либо к замене аминокислот в коротком пролин-богатом участке этих фрагментов. Белок-медиатор не может присоединиться и инактивировать активный Ка+-канал. Как и в предыдущих случаях, это приводит к повышенной реабсорбции Ыа+ в почках и увеличению объёма плазмы крови.

Многие из них являются также факторами риска и для возникновения других заболеваний сердечно-сосудистой системы (атеросклероз, ишеми-ческая болезнь сердца).

Принимая во внимание иерархическую и функциональную сложность механизмов, участвующих в регуляции АД, можно понять связанные с этим трудности обнаружения исходной (первичной) причины артериальной гипертонии. Анализ известных мутаций, приводящих к повышению АД, таких, например, как при синдроме Лиддла (Табл. 1), и патогенеза других описанных моногенных форм болезни, указывают на то, что нарушения в регуляции АД, в конечном итоге, приводят к изменениям почечной реабсорбции натрия и задержке соли и воды (Lifton, 1996; Ganten, 1987; Williams, 1988). Большинство исследований сейчас направлено на изучение отдельных генов, влияющих на работу главных регулирующих АД систем, таких как ренин-ангиотензиновая, симпато-адреналовая, адренокортикаль-ная и др. Гены, кодирующие компоненты этих систем - такие белки как ренин, ангиотензиноген, рецептор ангиотензина, ферменты биосинтеза стероидов,, катехоламинов и их рецепторов, являются основными кандидатами при поиске генетических дефектов, ведущих к эссенциальной гипертонии.

Известно, что в регуляции АД и водно-солевого гомеостаза очень важную роль играет ренин-ангиотензиновая-альдостероновая система (РААС) (Liftonl996; Aguilera et al., 1995) (Схема 1). Исследование полиморфизма генов этой системы у человека и животных или полиморфизма участков ДНК, близко к ним расположенных, демонстрируют связь таких мутаций с аномальным уровнем АД (Rapp et al., 1989; Kurtz et al., 1990; Barley et al., 1991; Jeunemaitre et al., 1992; Jacob et al., 1991; Hilbert et al., 1991; Deng and Rapp, 1992; Duru et al., 1994; Bonnardeaux et al., 1994). Так, в работе, проведенной на двух группах сибсов в популяциях Парижа и Солт Лейк Сити,

Ангио х ензиног ен

Ангиотешин П

АТ1 рецептар сосудов

Сжатие сосудов

АТ1 рецептор надпоч ечннк ов

- 1

Минёр алок ор тик опды

I

Активность минер алок ор тик оидных рецепторов

. 1. -

Реабсорбщш №а+

Жа+ СГ к о транспортёр

Эпит е лиальный Иа+ канал

Схема 1. Участие ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) в регуляции артериального давления.

показано, что существуют две формы ангиотензиногена, различающиеся по наличию либо метионина, либо треонина в 235 положении (Теипетакге ег а1., 1992). Эта замена обусловлена точковой мутацией в гене ангиотензиногена, ведущей к замене метионина на треонин, причем аллель М235Т ассоциируется с гипертонией. Белок ангиотензиноген синтезируется в печени и, претерпевая лимитированный протеолиз под действием ренина и ангиотензин-превращающего фермента, образует активный гормон ангио-тензин II, который обуславливает повышение АД. Анализ полиморфизма ДНК, проведенный другой группой исследователей, с использованием

динуклеотидного повтора, фланкирующего ген ангиотензиногена, также выявляет достоверное сцепление с артериальной гипертонией (Caulfield et al., 1995). При этом не было найдено ассоциации с каким-либо из вариантов М235Т или Т174М (замена треонина на метионин в позиции 174). Однако, роль мутации М235Т в развитии артериальной гипертонии была подтверждена другими исследователями, что позволяет сделать вывод о причастности к детерминации АД районов ДНК, расположенных либо вблизи гена ангиотензиногена, либо непосредственно включающих этот ген (Kamitani et al., 1994; Hudecova et al., 1995; Morris et al., 1994; Nishiuma et al., 1995).

1.2 Стресс и гипертония

Особая роль в патогенезе артериальной гипертонии отводится стрессу как неспецифическому ответу на требования, предъявляемые организму (Селье, 1960). Сегодня достаточно хорошо изучены физиологические системы, играющие главную роль в регуляции неспецифических адаптивных реакций организма. В частности, симпато-адреналовая система стимулирует состояние общей повышенной активности при стрессе: 1) стимулируется гликогенолиз в печени; 2) повышается тканевое дыхание; 3) усиливаются и учащаются сокращения сердечной мышцы; 4) повышается кровяное давление; 5) увеличивается возбудимость коры головного мозга; 6) повышается работоспособность скелетных мышц.

По существу, стрессирующим фактором является всякое достаточно сильное (не обязательно экстремальное) воздействие - тепло, холод, болевые раздражения, эмоциональное воздействие и другие. Было показано, что реакция тревоги зачастую является предшественником артериальной гипертонии (Wood et al., 1984). Степень влияния, оказываемого стрессором на уровень АД, зависит от генетической предрасположенности организма, при-

чём для гипертоников характерна повышенная чувствительность к стрессирующим воздействиям (Harnet, 1996). Универсальным ответом организма на широкий спектр стрессорных воздействий служит мобилизация белков теплового шока (heat shock proteins - HSP) (Lindquist et al., 1988; Schlesinger, 1990; Morimoto and Santori, 1998). Накапливаются многочисленные факты, подтверждающие причастность стрессовых белков