Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ"

На правах рукописи

ФЕДОСЕЕВА ЛАРИСА АБРАМОВНА

ЭКСПРЕССИЯ КЛЮЧЕВЫХ ГЕНОВ РЕНИН-АНГИОТЕЮИНОВОЙ СИСТЕМЫ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС НИСАГ

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАР 2014

Новосибирск 2014

005545896

005545896

Работа выполнена в лаборатории структуры генома и лаборатории эволюционной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Дымшнц Григорий Моисеевич

доктор биологических наук, профессор Маркель Аркадий Львович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Селнтицкая Вера Георгиевна, заведующая лаборатории эндокринологии, зам. директора по научной работе.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН, г.Новосибирск

доктор биологических наук Колесников Николаи Николаевич,

ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН,

г.Новосйбирск

Защита диссертации состоится 22- ¿< 2014 года на заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 позащите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева 10, т/ф (383)363-49-06, Факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.in

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН

Автореферат разослан ф 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

/

Хлебодарова Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов артериальной гипертонии актуально ввиду широкого распространения этого заболевания. Гипертоническая болезнь - одна из ведущих причин нетрудоспособности и смертности. Разработанные в последние десятилетия методы позволили перейти от эмпирического описания к выяснению глубоких генетических и биохимических причин, лежащих в основе гипертонической болезни, а также к пониманию того, что спектр этих причин многообразен. Генетические факторы дают существенный вклад в регуляцию артериального давления (АД). Факторы среды и питания, различный стиль жизни также играют роль в патогенезе первичной гипертонии как важные, но поддающиеся модификации факторы риска Немалую роль в развитии заболевания играет стресс, в том числе эмоциональный, особенно в тех случаях, когда стрессирующее воздействие падает на почву генетической предрасположенности. Адекватная модель такого состояния - линия крыс с наследственной индуцируемой стрессом артериальной гипертонией (НИСАГ) - позволяет исследовать механизмы возникновения и развития стресс чувствительной формы артериальной гипертонии.

За годы, прошедшие с момента создания линии НИСАГ, на этих животных были исследованы физиологические функции таких систем ответа на стресс, как гипоталамо-гипофизарио-адренокортикальная (ГГАС) и симпатоадреналовая (САС), а также транскрипционная активность их ключевых генов. Репин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС) получила меньше внимания исследователей.

Однако авторы обзоров литературы, посвященных гипертонии, сходятся во мнении, что развитие гипертонической болезни, независимо от исходной причины, непременно затрагивает механизмы водно-солевого обмена, а значит, и систему, непосредственно с ним связанную - РАС. Более того, в последние десятилетия усилилось понимание значимости не только системной, но и локальных РАС - в почках, сердце, надпочечниках и едва ли не в первую очередь в мозге, - функции которых могут как влиять на формирование гипертонического статуса, так и меняться под его воздействием. Поэтому анализ активности РАС в органах, связанных с сердечнососудистым гомеостазом, должен быть одним из приоритетных направлений в исследовании природы артериальной гипертонии.

Экспрессию генов РАС у крыс НИСАГ до сих пор изучали в основном на уровне белковых продуктов (например, определения содержания ренина или АСЕ), только в работе Амстиславского (2005) методом «end-point» ПЦР показано снижение уровня мРНК ренина в почке взрослых крыс НИСАГ'. Но транскрипционную активность иных, чем ренин, генов РАС в ночке крыс этой линии, как и в других органах, не исследовали. Более того, не была исследована и экспрессия генов РАС у молодых крыс в период становления гипертонии.

Согласно современным концепциям (Johnson et al., 2008), развитие гипертонической болезни проходит через две фазы. В первой фазе гапертошм соль-резистентна и ренин-зависима, а почки функционируют нормально. Ранняя гипертония ассоциирована с низким объемом крови, повышенным уровнем ренина плазмы и гиперактивной симпатической нервной системой. Известно, что у крыс других линий с низкорениновой формой гипертонии экспрессия ренина в почке повышена в раннем возрасте (Gomez et al., 1988; Sassard et al., 2003), а короткая блокада РАС приводит к долговременному снижению АД и задержке формирования гипертензивного статуса. Показано, что воздействие антигииертензивных средств на

крыс НИСАГ в препубертатном возрасте также смягчает проявления гипертонии в последующем (Филюшина и др., 2007). Исходя из этих данных, кажется необходимым изучать функционирование РАС не только на взрослых животных, но и в критическом возрасте формирования гипертензивного статуса.

Невозможно рассматривать действие РАС изолированно, вне связи с другими физиологическими системами. Так, симпатическая нервная система управляет экспрессией ренина в почке и сама, в свою очередь, зависит от уровня Ang II как в циркуляционном русле, так и в структурах мозга. Ранее было показано, что базальный уровень адреналина в надпочечниках у крыс линии НИСАГ повышен (Маркель и др., 2006; Markel et al., 2007). Это заставляет полагать, что у них присутствуют изменения в цепи биосинтеза катехоламинов.

Высокая симпатическая нервная активность, стимулирующая РАС и ведущая к развитию гипертонии, может иметь причиной особенности формирования симпатической нервной системы. Так, у крыс гипертензивной линии SHR имеется гипериннервация сосудистой стенки, причиной чего может являться изменение восприимчивости симпатических нервов к фактору роста нервов NGF (Nemoto et al., 1994) из-за точечной мутации в нуклеотидной последовательности, соответствующей сигнальному пептиду, гена Ngfr (рецептора NGF низкой аффинности). С локусом этого гена у крыс SHR ассоциировано высокое АД (Hilbert et al., 1991), а у молодых крыс НИСАГ - повышение АД при стрессе (Редина и др., 2003), поэтому можно предположить наличие сходной мутации у животных этих двух линий. Выявить такую мутацию можно методом секвенирования соответствующего участка.

Ранее была показана повышенная активность ГГАС у крыс линии НИСАГ. Реакция ГГАС на стресс и секреция глюкокортикоидов требуют посредников-простагландинов, чей синтез может модулироваться главным эффектором РАС ангиотензином II и его рецепторами. Секреция ренина в почке также регулируется простагландинами - продуктами действия циклооксигеназы (СОХ)-2. Но система биосинтеза простагландинов у крыс НИСАГ до сих пор оставалась вне поля внимания исследователей, за исключением работы Амстиславского и соавт. (Amstislavsky et al., 2005), где иммуногистохимически и методом полуколичественной ПЦР показано снижение уровня мРНК и белка СОХ-2 в почке крыс НИСАГ.

Учитывая все вышесказанное, для изучения были выбраны, помимо генов РАС, ключевые гены систем биосинтеза катехоламинов (ген тирозин-гидроксилазы Th) и простагландинов (ген циклооксигеназы Сох-2).

Цель работы: У генетической модели стресс-индуцируемой гипертонии -крыс НИСАГ определить транскрипционную активность генов ренин-ангиотензиновой системы и связанных с ее функционированием генов тирозин-гидроксилазы и циклооксигеназы-2 в условиях покоя и стресса 17-и часовой водной депривации.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать транскрипционную активность ключевых генов РАС (Ren, Асе, Асе2, Agt, Agirla и Agtr2) в почке, миокарде, отделах мозга (гипоталамус и продолговатый мозг) и надпочечнике у молодых (1,5 мес) и взрослых (4 мес) крыс линии НИСАГ и контрольной нормотензивной линии WAG.

2. Сравнить уровень экспрессии генов РАС (Ren, Асе, Асе2, Agt, Agirla и Agtr2) в почке, миокарде, гипоталамусе и надпочечнике взрослых крыс линий НИСЛГ и WAG в условиях покоя и мягкой (17 часов) водной депривации.

3. В качестве показателя активности катехоламинергической системы изучить транскрипционную активность гена Th, кодирующего тирозин-гидроксилазу, в отделах мозга и надпочечнике у крыс линий НИСАГ и WAG в возрасте 1,5 и 4 мес. Сравнить уровень экспрессии гена Th у взрослых крыс линий НИСАГ и WAG в условиях покоя и водной депривации в гипоталамусе и надпочечнике.

4. Провести у крыс НИСАГ поиск мутации в гене Ngfr, аналогичной влияющей на иннервацию сосудистой стенки у крыс SHR.

5. В качестве показателя активности системы биосинтеза простагландинов изучить транскрипционную активность гена, кодирующего циклооксигеназу-2, в почке, отделах мозга и надпочечнике у крыс линий НИСАГ и WAG в возрасте 1,5 и 4 мес. Сравнить уровень экспрессии гена Сох-2 в почке, гипоталамусе и надпочечнике взрослых крыс линий НИСАГ и WAG в условиях покоя и водной депривации.

Научная новизна работы. В работе впервые:

• проведено комплексное исследование транскрипционной активности генов локальных (тканевых) РАС у молодых (1,5 мес) и взрослых (4 мес) крыс линий НИСАГ и WAG методом ПЦР в реальном времени. Показана повышенная транскрипционная активность гена Ren в почке, а также гена Agt в гипоталамусе и продолговатом мозге у молодых крыс НИСАГ. Показан дисбаланс экспрессии генов апгиотензиновых рецепторов в мозге и надпочечниках. У взрослых крыс НИСАГ показано снижение транскрипционной активности почечной РАС, а также рост экспрессии Асе в миокарде, характерный для сформировавшейся левожелудочковой гипертрофии.

• Показано повышение экспрессии ключевого гена системы биосинтеза катехоламинов - тирозин-гидроксилазы Th у молодых крыс НИСАГ в гипоталамусе и у взрослых - в продолговатом мозге.

• Показало повышенное содержание мРНК Сох-2 в гипоталамусе, продолговатом мозге и надпочечниках молодых крыс НИСАГ.

• При водной депривации обнаружен рост экспрессии гена Th в гипоталамусе, а также рост уровня мРНК Сох-2 в почках и его снижение - в надпочечнике у крыс НИСАГ, тогда как у крыс WAG реакция на этот стресс проявляется в росте экспрессии Agirla в надпочечнике и Ren — в гипоталамусе.

Теоретическая и научно-практическая значимость. Работа расширяет имеющиеся представления о роли и механизмах участия локальных (тканевых) РАС, и прежде всего РАС мозга, в становлении стресс-чувствительной формы артериальной гипертонии. Данные об особенностях экспрессии генов РАС, а также генов Th и Сох-2, у гипертензивных животных могут быть использованы при разработке мер профилактики и лечения гипертонической болезни.

Положения, выносимые на защиту:

1. Транскрипционная активность ключевого гена РАС почки, ренина (Ren), повышена у молодых и снижена у взрослых крыс НИСАГ.

2. В гипоталамусе и продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ повышена транскрипционная активность генов РАС, что ведет к активации симпатической нервной системы и к росту АД. Дисбаланс экспрессии рецепторов

ангиотензина II в гипоталамусе и продолговатом мозге, как и снижение уровня экспрессии Асе2 в гипоталамусе, также связаны с ростом АД.

3. Экспрессия генов РАС в мозговых структурах интактных взрослых крыс НИСАГ не отличается от таковой у крыс WAG, за исключением гена А се 2. Водная депривация снижает уровень экспрессии Ren в гипогаламусе у крыс WAG, но не НИСАГ.

4. В миокарде взрослых крыс НИСАГ повышена экспрессия гена Асе, что характерно для левовентрикулярной гипертрофии, и эта экспрессия снижается при водной депривации.

5. В надпочечниках молодых крыс НИСАГ снижена экспрессия гена Agtr2, что способствует повышению АД. У взрослых интактных крыс различия отсутствуют, но водная депривация снижает экспрессию Agirla только у крыс WAG.

6. У крыс НИСАГ повышено содержание мРНК гена Th в структурах мозга. Водная депривация у взрослых крыс НИСАГ увеличивает уровень экспрессии Th в гипоталамусе.

7. У крыс нормотензивной линии WAG и гипертензивной линии НИСАГ последовательность, кодирующая сигнальный пептид рецептора LNGFR, не содержит мутации, найденной у крыс линии SHR.

8. Система биосинтеза простагландинов активирована в мозговых структурах и надпочечниках у молодых, но не у взрослых, крыс НИСАГ. Это может являться одним из начальных этапов активации ГГАС. У интактных взрослых крыс НИСАГ уровень мРНК Сох-2 понижен в почках, но водная депривация приводит к его росту.

9. Анализ корреляций экспрессии изучаемых генов у молодых крыс НИСАГ и WAG указывает на значительную разницу между линиями животных в связях между транскрипционной активностью генов различных систем и органов.

Апробация результатов. Материалы диссертации обсуждены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008), Сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008), V съезде ВОГИС (г. Москва, 2009), XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Волгоград, 2013), Школе молодых ученых «Геномика и биология клетки» (г. Москва -Звенигород, 2010), конференциях «Фундаментальные науки - медицине» (г. Новосибирск, 2008, 2010, 2012, 2013), «Медицинская геномика и протеомика» (г. Новосибирск, 2009), «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (г. Санкт-Петербург, 2010, 2011), «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (г. Курск 2011).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 8 печатных работ в рецензируемых изданиях, из них 6 - в отечественных, входящих в список ВАК, и 2 -в зарубежных. Кроме того, опубликовано 6 статей в сборниках трудов конференций и 10 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 262 страницах, содержит 48 рисунков и 3 таблицы. Библиографический указатель литературы включает 993 источника, из них 32 отечественных и 961 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальные животные: Эксперименты выполнены на молодых (1,5 мес) и взрослых (4 мес) крысах-самцах двух инбредных линий - гипергензивной линии НИСАГ и нормотензивной линии WAG (Wistar Albino Glaxo), содержавшихся в условиях вивария ИЦиГ СО РАН и получавших воду и сбалансированный корм без ограничения.

Олигонуклеотиды (праймеры) синтезированы ООО «Биосан» (Новосибирск) с очисткой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: для ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green I:

праймеры для генов Th, Ren, Асе, Асе2, Agt, Agirla, Agtr2 и Сох-2 подбирали при помощи программ PrimerQuestSM (Integrated DNA Technologies, Inc, http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest/) и NCBl/Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primcr-blast/). Нуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Праймеры, используемые в ПЦР с применением SYBR Green I.

Ген Нуклеотидная последовательность праймеров Тотж Tper

Th F: 5'- GCA GCC СТА ССА AGA ТСА АА - 3' R: 5'- ААС TTC АСА GAG ААТ GGG CG - 3' 61°C 84°C

Сох-2 F: 5' - GAT GTT CGC ATT CTT TGC CC - 3' R: 5' - ATA CAC CTC ТСС ACC GAT GA - 3' 63°C 84°C

Ren F: 5'— CCT GGG AGT CAA AGA GAA GA - 3' R: 5'- ACA GGT CAT CGT TCC TGA AG - 3' 64°C 84°C

Agí F:_5'- CCT CGC TCT CTG GAC TTA TC - 3' R:_5'- CAG АСА CTG AGG TGC TGT TG - 3' 63°C 87°C

Асе F: 5'- ATG GTA CAG AAG GGC TGG AA - 3' R: 5'- TTG TAG AAG TCC CAC GCA GA - 3' 62°C 88°C

Асе2 F. 5'- TGC CGA CCA AAG CAT TAA AG - 3' R: 5'- TCT CTC ATG GCA TAG GCA AC - 3' 63°C 84°C

Agirla F: 5'- AAA TGA GCA CGC TTT CTT ACC G - 3' R: 5'- TGA GGC AGG GTG AAT GGT CC - 3' 63°C 86°C

Agtr2 F. 5'- CAA TCT GGC TGT GGC TGA CTT - 3' R: 5'~ TGC АСА ТСА CAG GTC CAA AGA - 3' 63°C 83°C

RpBO F: 5'- CAT CTT GGC. GTC TGA TCT TG -3' R: 5'- TCA GAG TCT GTT TGT ACC CC -3' 61 — 64 °C* 84°C

Тот» - температура отжига, Трег - температура регистрации флуоресценции. * - отжиг праймеров для гена сравнения Яр130 проводили при той же температуре, что и отжиг праймеров для целевого гена.

для амплификации н последующего секвенироваиия гена ¿я^/г:

№1 - 5'- ОАСТОАССТАОААСССОАСС - 3' №2 - 5'- ТАСААСАСТССТСССТОСАТ - 3' №3 - 5'- ОАССТТОАССГССТАТТС'ГС - 3' (по №то1о й а1„ 1996) Действие водной депривации изучали на зрелых (4-месячных) животных: декапитацшо производили непосредственно после стресса, вызванного временным удалением из клеток поилок с водой с 19 ч до 12 ч следующего дня. Доступ к пище не ограничивался. Для последующего анализа забирали следующие ткани: почки, печень, миокард, надпочечники и такие отделы мозга как гипоталамус и

продолговатый мозг. Ткани замораживали в жидком азоте и до выделения РЫК хранили при -70°С.

Выделение суммарной РНК из тканей. Суммарную РНК выделяли по методу (Chattopadhyay et а!., 1993) с некоторыми модификациями. Примеси геномной ДНК удаляли обработкой ДНКазой I ("Promega", USA) согласно рекомендациям производителя фермента.

Анализ количества РНК проводили спектрофотометрически по поглощению при 260 нм. Интактпость РНК определяли электрофорезом в 1,2% агарозном геле.

Получение кДНК (обратная транскрипция). Смешивали 3-5 мкг РНК и 0,5 мкг «случайных» (random N9) праймеров-нонамеров в 11 мкл Н20. После денатурации РНК (65°С, 5 мин) и отжига праймеров (37°С, 5 мин) добавляли 19 мкл смеси с обратной транскриптазой. Конечный раствор содержал буфер для обратной транскрипции, 500 мкМ dNTPs и 40 ед. обратной транскриптазы MoMLV. Синтез кДНК проводили при 37°С 1 час, 42°С - 30 мин, 50°С - 10 мин. Фермент инактивировали прогревом смеси при 75°С 5 мин. Для последующей ПЦР использовали 0,25 - 0,5 мкл полученной кДНК.

Определение уровней содержания мРНК. Для определения уровня экспрессии генов определяли относительное количество их мРНК методом ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I на амплификаторах ¡Cycler и iQ5 (Bio-Rad laboratories, США). В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» Rpl30 (ген рибосомного белка L30). Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала стандартный буфер для ПЦР (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск), 0,2 мМ dNTPs, SYBR Green 1(1: 20000), по 150 нМ соответствующих праймеров и 1 ед Taq-полимеразы с антителами. Реакцию проводили в следующих условиях: прогрев при 94°С - 1 мин; затем 40 основных циклов: денатурация при 94СС - 15 сек, отжиг (см. таблицу 1) - 20 сек, элонгация при 72°С - 20 сек, сбор данных по флуоресценции для Rpl30 при 83°С - 10 сек, сбор данных по флуоресценции для целевых генов (см. таблицу 1) - 10 сек. После окончания ПЦР снимали кривые плавления продуктов для контроля специфичности реакции.

По получаемым стандартным калибровочным кривым определяли исходный уровень исследуемых кДНК относительно «стандартной» кДНК (смеси аликвот всех кДНК для данной ткани), и эту величину для целевого гена относили к количеству кДНК гена сравнения, определяя таким образом различия в уровнях экспрессии изучаемых генов между животными разных линий.

Статистическая обработка результатов. Все статистические расчеты производили с помощью программного пакета Statistica 5.5 («Statsoft», США). Использовали дисперсионный анализ (ANOVA/MANOVA), а также непараметрические методы статистики: U-критерий Манна - Уитни, критерий Краскела - Уоллиса (многомерное обобщение U-критерия Манна - Уигни) и медианный тест. Результаты считали статистически значимыми при р < 0,05.

Для обработки данных по экспрессии генов у молодых крыс (1.5 мес) использовали также корреляционный анализ. Определяли коэффициент корреляции Пирсона и непараметрический аналог этого анализа - коэффициент корреляции рангов Спирмена. Результаты также считали статистически значимыми при р < 0,05. Во внимание принимали только те результаты, достоверность которых и по Пирсону, и по Спирмену составляла р < 0,1.

Выделение ДНК из печени крыс. ДНК выделяли с использованием протеиназы К и фенольной экстракции согласно рекомендациям (Sambrook et al.,

1989). Выделенную ДНК растворяли в ТЕ-буфере. Количество ДНК определяли спектрофотомстрически по поглощению при 260 им.

Определение нуклеотидпой последовательности 5'-области гена Lngfr. Реакционная смесь объемом 50 мкл для амплификации интересующего нас участка ДНК содержала буфер для ПЦР, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTPs, по 0,5 мкМ праймеров №1 и №2, 0,4 ед Taq-полимеразы и 0,5 мкг ДНК. Реакцию проводили в следующих условиях: прогрев при 95°С - 3 мин; затем 35 циклов амплификации: 95°С - 30 сек, 69°С- 15 сек, 72°С — 30 сек. Полученные продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1,2% агарозном геле и выявляли окрашиванием бромистым этидием. Участок геля с фрагментом ДНК длиной 345 н.п. вырезали, замораживали на 1 час при -70°С, и после оттаивания центрифугировали 10 мин (Eppendorf Centrifuge 5414, 12000 об/мин, 9000 g) в микроколонках GFX Columns (Amersham Biosciences). Элюаты очищали на колонках Centri-Sep Spin Columns (Applied Biosystems) согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование продуктов ПЦР проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer ("Perkin Elmer", CIIIA) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ("Perkin Elmer", США) как в прямом направлении с праймером №1, так и в обратном — с «вложенным» праймером №3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия генов РАС н С ох-2 в почке. Изучение экспрессии генов РАС в почках молодых (1,5 мес) крыс гипертензивной линии НИСАГ методом полуколичественной PCR в реальном времени выявило у них пониженное содержание мРНК генов Асе (вдвое) и Agirla (на 33%) по сравнению с нормотензивным контролем. Экспрессия гена Agt в почках молодых крыс двух линий не различалась (Рис. 1 а). Снижение уровня мРНК Сох-2 у крыс НИСАГ не достигало уровня достоверности.

Вместе с тем, мы впервые выявили в почках молодых крыс линии НИСАГ почти двукратное превышение содержания мРНК гена фермента ренина {Ren), лимитирующего скорость образования Ang II в почках, но сравнению с нормотензивными крысами линии WAG (Рис. 1а). Этот факт чрезвычайно важен в свете представлений о том, что именно почка является основным источником ренина в циркуляционном русле, и позволяет говорить об активации РАС у молодых крыс НИСАГ.

В почке взрослых (4 мес) крыс линии НИСАГ уровень мРНК генов РАС {Ren, Асе, Agirla) в покое достоверно понижен по сравнению с крысами нормотензивной линии WAG. Исключением, как и у молодых животных, являлся ген Agt, экспрессия которого не отличалась у крыс линий WAG и НИСАГ (Рис. 16). В почках крыс обеих линий 17-часовая водная денривация не приводила к изменениям экспрессии изучаемых генов РАС.

Полученные на взрослых животных результата свидетельствуют об уменьшении активности РАС в почке у крыс линии НИСАГ, что позволяет отнести эту модель к низкорсииновой форме артериальной гипертензии. Низкорениновая гипертония характеризуется, помимо снижения активности ренина, некоторыми специфическими особенностями, такими как повышение чувствительности АД к соли, увеличением объема внеклеточной жидкости, в том числе плазмы крови, и накоплением в организме натрия.

а)

б)

Рис. 1 Уровень мРНК генов РАС и Сох-2 в почках а) молодых и б) взрослых крыс НИСАГ по сравнению с нормотензивным контролем WAG (содержание мРНК у крыс WAG для всех генов принято за 100%). Данные представлены в виде средних значений по группе ± SEM. * - достоверное различие между линиями (р < 0,05).

В литературе описано несколько моделей низкорениновой формы гипертонии. К ним, среди прочих, относятся гипертензивные крысы линий Lyon (LH) и SHR. В раннем возрасте у этих крыс отмечен период, когда активность ренина в плазме повышена (Gomez et ai., 1988). Поскольку аналогичный ранний всплеск активности РАС наблюдался и в наших экспериментах на крысах НИСАГ, то можно полагать, чго повышение функциональной активности рениновой системы почки в раннем онтогенезе является необходимым этапом формирования гипертензивного статуса. По мере взросления и формирования гипертензивного статуса происходит понижение активности почечного ренина.

Уровень мРНК гена Сох-2 в почке взрослых крыс гипертензивной линии НИСАГ в покое понижен по сравнению с крысами нормотензивной линии WAG (Рис. 16). При водной депривации отмечено достоверное усиление экспрессии гена Сох-2: у крыс НИСАГ - в 3 раза, а у крыс WAG - только на 80% по сравнению с контрольным уровнем. В результате при стрессе уровень мРНК Сох-2 у крыс НИСАГ становился близким к таковому у крыс WAG, хотя в исходном состоянии он был в 2 раза ниже, чем у крыс WAG (Рис. 2).

Рис. 2. Относительное содержание мРНК Сох-2 в почках крыс линий WAG и НИСАГ в возрасте 4 месяцев в покое и при стрессе обезвоживания * -достоверное различие между линиями (р < 0,05), # -различие между контролем и опытом.

2S0

ж #

о _!_ #

1100 —¥—l ja WAG I ja нисаг |

J so ш d -

Контроль Стресс

Известно, что после 24-х часовой водной депривации у крыс НИСАГ наблюдается повышение активности ренина в плазме крови (Черкасова и др., 2006). С другой стороны, показано, что экспрессия СОХ-2 в ткани почки активируется при снижении объемов внеклеточной жидкости (и vice versa) и нарушении водно-электролитного баланса организма (Yang et а!., 1998). При этом простаноиды -производные СОХ-2 играют роль в регуляции секреции ренина, ко не экспрессии его гена (Kammerl et al., 2001). Поэтому можно предположить, чго при относительно непродолжительном лишении крыс воды повышение активности ренина в плазме крови происходит исключительно за счет стимулированного СОХ-2 выброса его

запасов из клеток юкстагломерулярного аппарата почки.

Экспрессия генов РАС в миокарде. В миокарде 4-месячных крыс линии НИСАГ в сравнении с крысами линии WAG уровень экспрессии гена Agirla понижен на 28%, а содержание мРНК Асе значительно повышено - на 80%. Однако в возрасте 1,5 мес. достоверных различий в экспрессии этих генов между изучаемыми линиями не наблюдалось (Рис. 3).

а) б)

сравнению с нормотензивным контролем WAG (содержание мРНК у крыс WAG для всех генов принято за 100%). Данные представлены в виде средних значений по группе ± SEM. * - достоверное различие между линиями (р < 0,05).

Многочисленные исследования указывают на связь кардиальной гипертрофии с измененной экспрессией компонентов сердечной РАС. Исследования как на людях, так и на крысах Wistar с гипертрофией левого желудочка (Schunkert et al., 1990; 1997), а также на крысах гипертензивных линий показали связь АСЕ с формированием миокардиальной гипертрофии. В гипертрофированном миокарде крыс конверсия Ang I в Ang II была увеличена, а содержание мРНК Асе повышено. Вместе с тем, уровень экспрессии гена рецептора ATI A (Agirla) в миокарде может быть как повышен, так и снижен. Существует немало экспериментальных данных, свидетельствующих о том. что нет прямой связи между гипертрофией сердца и рецепторами ATI (Crowley et al., 2006).

17-часовая водная депривация не изменяла уровень экспрессии гена Agirla в миокарде у крыс обеих линий, также как и экспрессию гена Асе у крыс контрольной линии WAG. Однако повышенный уровень мРНК Асе в сердечной мышце крыс линии НИСАГ снижался до величин, близких к таковым у нормотензивных крыс (Рис. 4). Снижение активности Асе после водной депривации может быть обусловлено снижением нагрузки на сердце в результате уменьшения объема жидкости (в том числе и плазмы) и уменьшения объема притекающей к сердцу крови (preload).

Рис. 4. Относительное содержание мРНК гена Асе в миокарде крыс линий WAG и НИСАГ в возрасте 4 месяцев в покое и при стрессе обезвоживания * -достоверное различие между линиями (р < 0,05), # -различие между контролем и опытом (р < 0,05).

I — т # . [¿WAG 1 |С НИСАГ 1

I р

Экспрессия генов РАС и Сох-2 в мозге. Как в гипоталамусе, так и в продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ мы показали повышенное содержание мРНК Agt (Рис. 5). Кроме того, в продолговатом мозге оказался повышен уровень содержания мРНК Agirla , а в гипоталамусе - Agtr2. Уровень экспрессии Асе2 оказался снижен в гипоталамусе. При этом уровень мРНК Сох-2 был повышен в обоих отделах мозга, a Th - только в гипоталамусе.

Несмотря на отсутствие достоверных различий между линиями крыс WAG и НИСАГ в уровнях мРНК ренина в этих структурах, можно предположить, что рост экспрессии гена Agt - первый шаг к повышению содержания Ang II в гипоталамусе и продолговатом мозге у молодых крыс НИСАГ. Agt наряду с ренином может играть лимитирующую роль в работе РАС (Corvol & Jeunemaitre, 1997), и скорость продукции Ang I может контролироваться концентрацией Agt. Таким образом, повышенная экспрессия Agt в гипоталамусе и продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ приводит к росту содержания в этих отделах Arig II, что влияет иа активность симпатической нервной системы (Malpas, 2010). Благодаря этому, активация центральной РАС может давать свой вклад в патогенез гипертонии.

молодых крыс НИСАГ по сравнению с нормотензивным контролем WAG. Данные представлены в виде средних значений по группе ± SEM. * - р < 0,05.

Повышенная экспрессия гена Agtrla у молодых крыс НИСАГ в продолговатом мозге может приводить к стойкому повышению симпатического тонуса, ведущему к подъему артериального давления. Известно, что нарушение в соотношении рецепторов ATI А и АТ2 в RVLM (ростральной вентро-латеральной области) продолговатого мозга вызывает у экспериментальных животных гипертензию и симпатическое возбуждение (Gao et al., 2008).

Что касается понижения экспрессии Асе2 в гипоталамусе молодых НИСАГ, то дефицит АСЕ2 может приводить к усилению действия Ang II в этом отделе мозга. Вместе с тем, было показано, что инфузия Ang II снижает экспрессию Асе2 в паравентрикулярном ядре (Sriramula et al., 2011). Таким образом, нехватка АСЕ2 может, с одной стороны, быть обусловлена избытком Ang II в ткани гипоталамуса, а с другой, сама давать вклад в формирование повышенного содержания и усиления влияния Ang II в мозговых структурах и активацию симпатической нервной системы.

Наши данные указывают и на повышенную экспрессию гена Сох-2 как в гипоталамусе, так и в еще большей степени - в продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ. Недавние исследования нейроваскулярного сопряжения, т.е. регуляции локального церебрального кровотока в ответ на активацию мозга, показали прямое влияние СОХ-2 мозга на АД (Matsuura et al„ 2009): АД и частота сердечного ритма

заметно снижались после* ингибирования СОХ-2. Таким образом, СОХ-2 участвует в регуляции локального церебрального кровотока во время активации мозга у крыс, и можно предположить, что повышенная экспрессия СОХ-2 в мозге молодых крыс НИСАГ вносит свой вклад в повышение АД у этих животных.

Повышенная синаптическая активность и стрессовые стимулы могут индуцировать экспрессию СОХ-2. Простагландины стимулируют секрецию АКТГ гипофизом напрямую либо путем стимуляции КРГ (кортикотропин рилизинг гормона) и/или вазопрессина. Простагландины опосредуют нейрогормональные ответы на психологический стресс, включая ответ АКТГ, и могут стимулировать стероидогенез непосредственно в надпочечниках крысы. Таким образом, они могут взаимодействовать с ГГАС на уровне гипоталамуса, гипофиза или надпочечников (Bugajski et al., 2001). Методом ОТ-ПЦР была показана повышенная активность генов ГГАС у крыс линии НИСАГ по сравнению с нормотензивными крысами (Markel et al., 2007). Рост экспрессии ключевого фермента синтеза простагландинов может являться одним из начальных этапов акгивации ГГАС, наблюдаемой у крыс НИСАГ.

В мозге интактных взрослых животных различия в экспрессии исследуемых генов отсутствуют. Исключением является только ген Асе2, экспрессия которого у взрослых крыс НИСАГ, в отличие от молодых, оказалась повышена в гипоталамусе и снижена в продолговатом мозге. Снижение экспрессии гена Асе2 в продолговатом мозге может вести к нарушению чувствительности барорефлекса и росту АД (Xia et al., 2009). Повышенная экспрессия Асе2 в PVN гипоталамуса противодействует' индуцированной Ang II гипертонии (Sriramula et al., 2011), то есть носит протективный и компенсаторный характер.

В условиях мягкого обезвоживания у крыс НИСАГ, в отличие от WAG, практически отсутствуют изменения в экспрессии генов РАС в гипоталамусе. У крыс WAG в этих условиях наблюдали снижение уровня мРНК Ren в гипоталамусе, вероятно, связанное по механизму обратной связи с повышенной активностью ренина в циркуляторном русле.

Экспрессия генов РАС и Сох-2 в надпочечниках. В данном органе у крыс WAG и НИСАГ мы сравнивали экспрессию генов Agt, Agirla, Aglr2, а также гена Сох-2. На Рис. 6 видно, что уровни мРНК генов Agt и Agirla в надпочечниках молодых крыс обеих линий достоверно не отличались. Однако содержание мРНК гена Сох-2 у молодых крыс НИСАГ было повышено в 2,3 раза по сравнению с нормотензивным контролем, а уровень мРНК гена Agtr2 снижен на треть. Из литературных данных известно, что выключения экспрессии Agtr2 при помощи введения нормотензивным крысам антисенс-последовательности оказалось достаточно для стойкого эффекта повышения систолического АД и прессорного ответа на Ang II (Wang et al., 2004).

Экспрессия Agir2 может подавляться глюкокортикоидами (Matsubara, 1998) и повышенной концентрацией альдостерона (Wang et al., 1998), однако мы пока не располагаем сведениями о повышенной секреции кортикостерона или альдостерона у крыс НИСАГ в этом возрасте. С другой стороны, СОХ-2, чья экспрессия более чем вдвое повышена в надпочечниках молодых крыс НИСАГ, может стимулировать секрецию кортикостерона в ответ на АКТГ (Mohn et al., 2005). Повышенная экспрессия гена Сох-2, вероятно, отражает повышенную активность ГГАС, характерную для крыс этой линии, и высокий уровень АКГГ. Активность ГГАС, в свою очередь, может быть следствием модуляции простагландимами соответствующих мозговых структур. Кроме того, высокий уровень экспрессии Сох-2

может стимулироваться высоким уровнем Ang II и связанным с ним ремоделированием сосудистых стенок, которое сопровождает гипертонию (Cheng et al., 2005). Этот процесс может усиливаться при наблюдаемом дисбалансе в уровне экспрессии генов рецепторов Ang II, го есть снижением экспрессии Agtr2 при не измененном уровне мРНК Agtrla в надпочечниках молодых крыс НИСАГ (таким образом, формируется положительная обратная связь).

i

Тъ - i/

i ГА *

'й _ ]/ у V _ / _; J rl

PWAG ПНИСАГ

Сох-2 Agt Ace2 Agtrla Aßtr2

Рис. 6. Уровень мРНК изучаемых генов в надпочечниках молодых крыс НИСАГ по сравнению с нормотензивным контролем WAG. Данные представлены в виде средних значений по группе ± SEM. * - р < 0,05.

В процессе созревания животных картина генной экспрессии меняется, и ни по одному из исследуемых в надпочечниках генов РАС, как и Сох-2, мы не наблюдали различий между взрослыми крысами двух линий в состоянии покоя. Однако при стрессе обезвоживания возрастало содержание мРНК Agtrla у зрелых крыс контрольной линии WAG, в то время как у крыс НИСАГ оно оставалось практически неизменным. Уровень же экспрессии гена Сох-2 при водной депривации достоверно снижался у крыс НИСАГ, но не у WAG. Можно предположить, что у крыс WAG рост экспрессии гена рецептора ATI А направлен на увеличение секреции альдоегерона. У гипертензивных крыс НИСАГ этот механизм оказывается подавлен. Однако у них повышен ответ секреции альдостерона на действие АКТГ (Антонов, 2011). Для объяснения же факта снижения уровня мРНК Сох-2 в надпочечниках при водной депривации у крыс НИСАГ, видимо, требуется анализ спектра содержания простагландинов, поскольку разные продукты СОХ-2 (PGF2„ и PGE2) обладают различными и противоположными функциями в надпочечниках (Lambert-Langlais et al., 2009).

Экспрессия Th у крыс линии НИСАГ. В этих экспериментах мы не выявили различий в базальном уровне мРНК Th в надпочечниках крыс WAG и НИСАГ в возрасте 1,5 (Рис. 6) и 4 месяца.

Возрастную динамику экспрессии гена Th в мозге изучали в отделах, связанных с регуляцией артериального давления, то есть в гипоталамусе и продолговатом мозге. У молодых крыс НИСАГ уровень мРНК Th был втрое повышен по сравнению с крысами WAG в гипоталамусе, но не в продолговатом мозге (Рис. 5). К возрасту 4 мес паттерн экспрессии изменился, и повышенный вдвое уровень мРНК Th мы наблюдали в продолговатом мозге, но не в гипоталамусе. Возможно, это явление отражает хроническую гиперактивность барочувствительных нейронов RVLM, которые контролируют почечную симпатическую нервную активность (Dampney et al., 2005). Полученные данные согласуются с повышением уровня экспрессии генов в симпатических нейронах в RVLM крыс SHR (Reja et al., 2002).

Стресс водной депривации вызвал повышение содержания мРНК Th в гипоталамусе крыс НИСАГ втрое, в то время как у крыс WAG оно не изменилось. Это наблюдение указывает на повышенную реактивность центральной катехоламинергической системы крыс НИСАГ, в том числе и на такие воздействия, которые не оказывают влияния на крыс нормотензивной контрольной линии.

Секвестрование кодирующего сигнальный пептид фрагмента гена Ngfr. У

крыс гипертензивных линий SHR и SHRSP, но не у Wistar, в нуклеотидной последовательности гена Ngfr была выявлена точечная мутация, ведущая к изменению конформации полипептида, что влияет на перенос LNGFR и его встраивание в клеточную мембрану симпатических нейронов, приводя к нарушению формирования симпатической нервной системы у крыс SHR (Nemoto et al., 1994).

Была выявлена ассоциация локуса гена Ngfr с повышением АД при стрессе у молодых (3 мес.) крыс НИСАГ (Редина и др., 2003). Мы предприняли прямой поиск мутации, аналогичной упомянутой выше для SHR, у крыс линии НИСАГ и секвенировали фрагмент 5'-области гена Ngfr размером 345 п.н., который включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид предшественника рецептора (Рис. 7). Мы обнаружили, что у нормотензивной линии WAG и у гипертензивной линии НИСАГ' секвенированная последовательность одинакова и не содержит искомой мутации. Однако это не исключает возможности иного, чем у крыс SHR, механизма участия гена Ngfr в формировании гипертензивного статуса у крыс линии НИСАГ.

НИСАГ 1 ATGAGGAGGGCAGGTGCTGCCTGCAGCGCCATGGACCGGCTGCGCCTGCTGCTGCTGCTGATTCTAGGG 69

I I I I I I I I I I i I I I M I I I I I I ! 11 Г! I 11 ill I 11.1 I 11 I I I I I I I I 111 I I ! ! ! 11 I I I I ! I I I п I WAG 1 ATGAGGAGGGCAGGTGCTGCCTGCAGCGCCATGGACCGGCTGCGCCTGCTGCTGCTGCTGATTCTAGGG 69

I I m I I I I I I I I I I I I I I ! I i I I I I I I I I I 1 I H I I I I I п III I II! 1 I I H 1 î I I I Ml I 1 I I ! I SHR 1 ATGAGGAGGGCAGGTGCTGCCTGCAGCACCATGGACCGGCTGCGCCTGCTGCTGCTGCTGATTCTAGGG 69

I I III I I I III I I I I I I I I I I II I M I I I 1,1 I I I I ' I I II I I II I I I I I I I f f I I I I I I I I I И I I I 1 Wistar 1 ATGAGGAGGGCAGGTGCTGCCTGCAGCGCCATGGACCGGCTGCGCCTGCTGCTGCTGCTGATTCTAGGG 69

Рис. 7. Нуклеотидная последовательность транслируемой части ампляфицированного фрагмента, кодирующая сигнальный пептид LNGFR, крыс линий НИСАГ', WAG, SHR и Wistar . Жирным выделен пуклеотид 28, замещенный на аденин у крыс S HR. Данные по линиям SHR и Wistar приведены по (Nemoto, 1994; Nemoto, 1996).

Данный локус, помимо генов Ngfr, гормона роста и Асе, включает в себя гены субъединиц натриевых каналов, рецептора тиреоидного гормона, факторов транскрипции Sp, STAT, их супрессоров SOCS, нейропептида орексина и других рехуляторных белков. Возможно, в формирование сгресс-индуцированной

гипертонии вовлечены иные, чем Ngfr, гены данного локуса.

* * *

Изучение экспрессии генов РАС, а также тирозин-гидроксилазы и циклооксигеназы-2 показало, что развитие гипертензивного статуса у крыс НИСАГ проходит в два этана. На первом этапе, у молодых животных, мы наблюдали повышенную экспрессию гена ренина в почке, а также активацию мозговой РАС, которая выражалась в увеличенном содержании мРНК Agt и в дисбалансе рецепторов ангиотензина. В мозговых структурах и в надпочечнике был высок уровень экспрессии Сох-2, а уровень мРНК Th повышен в гипоталамусе, свидетельегвуя о высокой активности центральной катехоламинергической системы. На втором этапе, к 4-м месяцам, гены РАС почки и мозговых структур имеют сниженную активность, а высокая экспрессия Th теперь наблюдается в продолговатом мозге, где локализованы сосудодвигательные ценгры. В миокарде выявляются изменения, характерные для сопутствующей гипертонии гипертрофии левого желудочка: высокая экспрессия Асе, которая нормализуется при ограничении потребления воды.

Какова взаимосвязь наблюдаемых изменений? Экспрессия ренина в почке стимулируется симпатической нервной активностью, и ее высокая активность, как и ГГЛС, у крыс НИСАГ показана во многих работах. Но чем определяется эта активность? Мы показали высокий уровень экспрессии Agt в гипоталамусе и продолговатом мозге у молодых животных, следствием чего может быть рост содержания Ang II в этих структурах. Ang II оказывает сильное влюпше на ЦЕ1С и СНС, модулируя, среди прочего, симпатическую нервную активность. Он может активировать синтез катехоламинов мозга, а также, через рост экспрессии СОХ-2, вести к активации ГГАС. Кроме того, дисбаланс рецепторов ангиотензина с преобладанием АТ1А как в мозге, так и в надпочечниках способен сам по себе стать причиной стойкого повышения АД. Повышенная экспрессия СОХ-2 в мозге и надпочечниках молодых крыс НИСАГ также вносит свой вклад в повышение АД у этих животных.

Анализ корреляций между уровнями мРНК изучаемых генов показал существенное различие между двумя линиями животных. Не все корреляции легко объяснить, и некоторые из них, возможно, являются случайными. Однако совершенно определенно можно сделать вывод о том, что регуляция транскрипции генов САС, РАС и системы синтеза простагландинов у крыс линии НИСАГ значительно изменена в сравнении с линией WAG.

Можно с определенностью утверждать, что артериальная гипертония у крыс НИСАГ затрагивает функции множества генов из разных физиологических систем, и ренин-ангиотензиновая система, наряду с ГГАС, симпатоадреналовой и системой биосинтеза простагландинов, играет первостепенную роль в формировании гипертензивного статуса у крыс линии НИСАГ.

ВЫВОДЫ

1. Получен профиль уровней мРНК генов ренин-ангиотензиновой системы, из которого следует:

а) В почках молодых (1,5 мес) крыс линии НИСАГ повышена активность ренинового гена. У взрослых крыс НИСАГ транскрипционная активность генов почечной РАС снижена как в покое, так и при водной депривации.

б) В гипоталамусе и продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ повышена активность РАС, что выражается в росте экспрессии гена Agt и дисбалансе экспрессии генов ангиотензиновых рецепторов: в гипоталамусе повышен уровень экспрессии Agtr2, а в продолговатом мозге - Agirla. В гипоталамусе снижен уровень экспрессии Асе2. Водная депривация снижала уровень экспрессии Ren в гипоталамусе у крыс WAG, но не НИСАГ.

в) В миокарде взрослых крыс НИСАГ снижена экспрессия гена Agtrla, но повышена - Асе, что характерно для гипертрофии левого желудочка. Водная депривация снижала содержание мРНК Асе до уровня WAG.

г) в надпочечниках молодых крыс НИСАГ снижена экспрессия гена Agtr2. У взрослых интактных крыс различия в экспрессии генов РАС отсутствуют. Стресс обезвоживания усиливает экспрессию Agtrla только у крыс WAG, но не НИСАГ.

2. Показано, что система биосинтеза простагландинов активирована у молодых, но не у взрослых, крыс НИСАГ, что выражается в повышенном уровне мРНК циклооксигеназы-2 в мозговых структурах и надпочечниках. У интактных взрослых крыс НИСАГ уровень мРНК Сох-2 в почках понижен, но при водной депривации, требующей роста секреции ренина, повышается уровень мРНК Сох-2 у

НИСАГ втрое, а у WAG - менее чем вдвое. При этом экспрессия Сох-2 в надпочечнике снижается.

3. Выявлено повышенное содержание мРНК Th в гипоталамусе у молодых и в продолговатом мозге - у взрослых крыс НИСАГ. В гипоталамусе взрослых крыс уровень мРНК Th возрастал при мягком обезвоживании у крыс НИСАГ, но не WAG. В надпочечниках не выявлено межлинейных различий в экспрессии Th ни в состоянии покоя, ни при стрессе.

4. Гипертонический статус у крыс НИСАГ формируется в два этапа, что следует из разницы в транскрипционной активности изучаемых генов РАС, а также Th и Сох-2 между молодыми (1,5 мес) и взрослыми (4 мес) крысами.

5. Секвенирование фрагмента 5 '-области гена Ngfr, который включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид предшественника рецептора фактора роста нервов низкой аффинности, показало, что у крыс нормотензивной линии WAG и гипертензивной линии НИСАГ данная последовательность одинакова и не содержит мутации, свойственной линии крыс SHR со спонтанной гипертонией.

6. Существенные изменения корреляционных связей между уровнями мРНК изучаемых генов у молодых крыс НИСАГ по сравнению с нормотензивным контролем позволяют говорить о системном изменении полигенной структуры регуляции АД у гипертензивных крыс НИСАГ.

Список работ, опубликованных по теме дисертации

1. Хворостова Ю.В., Калашникова Е.В., Черкасова О П., Федосеева Л.А., Редина O.E., Дымшиц Г.М., Маркель A JI. Особенности экспрессии гена глкжокортикоидного рецептора у гипертензивных крыс линии НИСАГ // Российский физиологический журнал им. И М. Сеченова. 2003. Том 89. №12. С. 1523 - 1528.

2. Markel A.L., Redina O.E., Gilinsky M.A., Dymshits G.M., Kalashnikova E.V., Khvorostova Yu.V., Fedoseeva L.A., Jacobson G.S. Neuroendocrine profiling in ISIAH rat strain with stress-sensitive arterial hypertension // J. Endocrinol. 2007. V. 195. № 3. P. 439-450.

3. Федосеева JI.A., Дымшиц Г.М., Маркель А Л. Секвенирование 5-области гена Lngfr, ассоциированного с повышением артериального давления при стрессе у крыс линии НИСАГ // Молекулярная биология. 2008, Том 42, №1, с. 184-186.

4. Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Якобсон Г.С., Маркель А.Л. Характеристика рениновой системы почки у крыс линии НИСАГ со стресс-чувствительной артериальной гипертензией. Бюлл. эксп. биол. мед. 2009. Том 147. № 2. С. 134-138.

5. Федосеева Л.А., Рязанова М.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Характеристика экспрессии генов рениновой системы в миокарде гипертензивных крыс линии НИСАГ // Бюлл. эксп. биол. мед. 2009. Том 147. № 10. С. 430-433.

6. Fedoseeva L.A., Ryazanova М.А., Antonov E.V., Dymshits G.M., Markel A.L. Expression of the Renin Angiotensin System Genes in the Kidney and Heart of ISIAH Hypertensive Rats // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В: Biomedical Chemistry. 2011. Vol. 5. No. 1. P. 3743. // Федосеева Л.А., Рязанова M,A., Антонов E.B., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия генов рениновой системы почки и сердца у гипертензивных крыс линии НИСАГ // Биомедицинская химия: научно-пракгический журнал. 2011. Том 57. Вып. 4. С. 410-419.

7. Климов Л.О., Федосеева Л.А., Рязанова М.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия генов ренин-ангиогензиновой системы в структурах мозга крыс линии НИСАГ

со стрессчувствительной артериальной гипертензией // Бюлл. эксп. биол. мед. 2012. Том 154. №9. С. 342-345.

8. Fedoseeva L.A., Antonov E.V., Klimov L.O., Dymshits G.M., Markel A.L. Function of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System in the ISIAH Rats with Stress-Sensitive Arterial Hypertension / In: Renin-Angiotensin System: Physiology, Role in Disease and Health Implications; A. Himura, T. Sato, eds. NY: Nova Science Publishers, 2013. 216 p. (p.1-44).

Сборники трудов конференций:

9. Маркель A.JI., Редина О.Е., Смоленская С.Э., Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Иванова Л.Н. Стресс и артериальная гипертония. Генетико-физиологические механизмы. Сборник трудов конференции «Фундаментальные науки - медицине». 2-5 сентября 2008 г. Новосибирск: Изд-во «Арта». С. 67-75.

10. Климов И.О., Федосеева JI.A., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Изучение профиля экспрессии генов ренин-ангиотензиновой системы мозга у молодых и зрелых крыс гипертензивной линии НИСАГ. Сборник трудов Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 23-26 11.2010, Санкт-Петербург, Россия / под ред. АП.Кудинова, Б.В.Крылова. СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2010. Т.4. С.248-249.

11. Федосеева Л. А., Дымшиц Г.М., Маркель А. Л. Экспрессия генов ренин-ангиотензиновой системы в почках и сердце молодых и зрелых крыс гипертензивной линии НИСАГ. Сборник трудов Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 23-26 11.2010, Санкт-Петербург, Россия / под ред. А.П.Кудинова, Б.В.Крылова. СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2010. Т.1. С.232-233.

12. Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия гена тирозин-гидроксилазы в мозге и надпочечниках крыс гипертензивной линии НИСАГ. Сборник статей Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 26-28 10.2011, Санкт-Петербург, Россия / под ред. АП. Кудинова, Б.В. Крылова. СПб.. Изд-во Политехи, ун-та, 2011. Т. 2. С. 330-332.

13. Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия гена циклооксигеназы-2 в мозге крыс гипертензивной линии НИСАГ. Сборник статей Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 26-28 10.2011, Санкт-Петербург, Россия / под ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова. СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2011. Т. 2. С.332-334.

14. Климов Л.О., Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Изучение экспрессии генов рецепторов ангиотензина в мозге и надпочечниках молодых и зрелых крьге гипертензивной линии НИСАГ. Сборник статей Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». 26-28 10.2011, Санкт-Петербург, Россия / под ред. A.II. Кудинова, Б.В. Крылова. СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2011. Т. 2. С. 203-205.

Тезисы докладов:

15. Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Рязанова М.В., Маркель А.Л. Экспрессия генов рениновой системы почки у крыс гипертензивной линии НИСАГ при стрессе обезвоживания

/ IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С.112.

16. Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Маркель АЛ. Экспрессия генов рениновой системы почки у крыс линии НИСАГ в условиях стресса водной депривацил / VI Сибирский физиологический съезд, 25-27 июня 2008 г., г.Барнаул. Тезисы докладов. Т.1. С.136-137.

17. Дымшиц Г.М., Редина O.E., Федосеева Л.А., Смоленская С.Э., Антонов Е.В., Маркель АЛ. Генетика артериальной гипертонии: экспериментальное исследование. Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. V съезд ВОГИС. Москва, 21-28 июня 2009 г. Ч. I. С.418.

18. Маркель А.Л., Рязанова М.А., Федосеева Л.А., Редина O.E., Смоленская С.Э., Пыльник Т.О., Т.А. Алехина, Л.Н. Иванова. Особенности функции катехоламиновой нейромедиаторной системы мозга у гипертензивных крыс линии НИСАГ. Научн. конф. «Медицинская геномика и иротеомика», 9-13 сентября, 2009 г., Новосибирск. С. 89.

19. Маркель А.Л., Федосеева Л.А., Антонов Е.В., Рязанова М.А., Пыльник Т.О., Смоленская С.Э., Редина O.E., Иванова Л.Н.. Характеристика функций симпатоадреналовой системы в генетической модели стресс чувствительной артериальной гипертонии. Конференция «Фундаментальные науки - медицине», Сентябрь 7-10, 2010, Новосибирск, Россия. Сборник тезисов. С.43.

20. Климов Л.О., Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М. Изучение экспрессии ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у крыс гипертевдивной линии НИСАГ. IV Международная Школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки».29 ноября-3 декабря 2010 г. Москва - Звенигород. Сборник тезисов. С. 108-109.

21. Климов Л.О., Федосеева Л.А., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Экспрессия генов ренин-аипгатензиновой системы почек, надпочечников, миокарда и мозговых структур у крыс гилертеязивной линии НИСАГ. Медико-биологические аспекты мультифакториальиой патологии. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. 17-19 мая 2011 г. Курск: КГМУ, 2011. 428 с. С.63-64.

22. Маркель А.Л., Антонов Е.В., Пыльник Т.О., Климов Л.О., Смоленская С.Э., Федосеева Л. А., Редина O.E., Иванова Л.Н. Генетико-эволюционные механизмы гипертензивных состояний. Конференция «Фундаментальные науки - медицине», Сентябрь 11-15, 2012, Новосибирск, Россия. Сборник тезисов. С.37.

23. Маркель А.Л., Дубинина А.Д., Климов Л.О., Антонов Е.В., Абрамова Т.О., Редина O.E., Рязанова М.А., Федосеева Л.А, Низомов С.А., Иванова Л.Н. Состояние эффекторных звеньев ренин-ангиотензин-альдостероновой системы при стресс-чувствительной артериальной гипертонии. Конференция «Фундаментальные науки - медицине», Сентябрь 16-20, 2013, Новосибирск, Россия. Сборник тезисов. С.18-19.

24. Рязанова М.А., Федосеева Л.А. Экспрессия генов бета2-адренорецептора и тирозингидроксилазы у крыс линии НИСАГ и ПС XXII Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Волгоград, 16-20 сентября 2013 года.

Подписано к печати 05.02.2014 г. Формат бумаги 60 х 90 1\16 Печ.л.1. Уч.изд.л.0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 87.

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федосеева, Лариса Абрамовна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0420145691 б

Федосеева Лариса Абрамовна

Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., проф. А.Л.Маркель д.б.н., проф. Г.М.Дымшиц

Новосибирск 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ...............................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................14

1.1. Артериальная гипертония...............................................14

1.1.1. Моногенные, или менделевские формы гипертонии.......................15

1.1.2. Полигенные формы артериальной гипертонии. Гипертоническая болезнь, или эссенциальная гипертония........................................................16

1.1.3. Изучение гипертонии на животных моделях..............................17

1.1.3.1. Крысы НИСАГ.....................................................19

1.1.4. Стресс как фактор, провоцирующий развитие артериальной гипертонии......23

1.2. Физиологические системы и их роль в повышении АД......................24

1.2.1. Симпатоадреналовая система и контроль артериального давления...........24

1.2.2. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС): ее роль в регуляции АД и в формировании гипертензивного статуса............................................26

1.2.2.1. Регуляция циркулирующей РАС - классические пути....................26

1.2.2.2. Основные компоненты РАС..........................................27

1.2.2.2.1. Ренин............................................................27

1.2.2.2.2. Ангиотензиноген..................................................28

1.2.2.2.3. Ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ)..........................29

1.2.2.2.4. Ang II и его рецепторы.............................................31

1.2.2.2.5. «Новые» компоненты РАС..........................................33

1.2.2.3. Локальные тканевые РАС............................................39

1.2.2.3.1. Почечная РАС....................................................40

1.2.2.3.2. РАС в сердце.....................................................43

1.2.2.3.2.1. Функции кардиальной РАС.......................................49

1.2.2.3.3. РАС мозга.......................................................54

1.2.2.3.3.1. Функции мозговой РАС..........................................60

1.2.2.3.4. Адренальная РАС.................................................67

1.2.2.3.4.1. Функции РАС в надпочечнике.....................................70

1.2.2.3.5. Сосудистая РАС..................................................73

1.2.2.3.5.1. Функции сосудистой РАС.........................................76

1.2.2.3.6. Другие тканевые РАС..............................................80

1.2.2.4. Значение внутриклеточной РАС......................................82

1.2.3. Циклооксигеназы и синтез простагландинов.............................83

1.2.3.1. Структура и клеточный синтез ПГ....................................84

1.2.3.2. Формы циклооксигеназ..............................................86

1.2.3.3. Рецепторы простаноидов.............................................88

1.2.3.4. Регуляция циклооксигеназ...........................................88

1.2.3.4.1. Регуляция СОХ на уровне транскрипции..............................88

1.2.3.4.2. Регуляция циклооксигеназ на пост-транскрипционном пре-трансляционном уровне........................................................................90

1.2.3.4.3. Регуляция циклооксигеназ на пост-трансляционном уровне..............91

1.2.3.5. Циклооксигеназы и простаноиды в здоровье и болезни...................92

1.2.3.5.1. СОХ-1 и СОХ-2 в центральной нервной системе.......................92

1.2.3.5.1.1. Простагландины в ЦНС...........................................94

1.2.3.5.1.2. Простагландины и стресс - связь с ГГАС и СНС......................96

1.2.3.5.2. СОХ-2 и синтез простагландинов в надпочечниках.....................99

1.2.3.5.3. СОХ-2 в почках..................................................102

1.2.3.5.3.1. Почечные эффекты простагландинов..............................104

1.2.3.5.4. Сердечнососудистая система и простагландины.......................107

1.3. Современные представления о механизмах возникновения гипертонии........111

1.3.1. Гипотеза единого пути развития эссенциальной гипертонии...............113

1.4. Заключение..........................................................116

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 118

2.1 .Материалы...........................................................118

2.2. Праймеры...........................................................118

2.3.Экспериментальные животные..........................................121

2.3.1.Артериальное давление...............................................121

2.4. Водная депривация....................................................122

2.5. Выделение суммарной РНК из тканей....................................122

2.6. Получение кДНК (обратная транскрипция)...............................122

2.7. Определение уровней содержания мРНК.................................123

2.7.1. Построение калибровочных кривых при ПНР в реальном времени..........123

2.7.2. Определение относительных уровней мРНК методом ПЦР в реальном времени с применением красителя SYBR Green I.............................................124

2.7.3. Статистическая обработка результатов.................................125

2.8. Выделение ДНК из печени крыс........................................125

2.9. Определение нуклеотидной последовательности 5'-области гена Lngfr........126

2.9.1. Полимеразная цепная реакция.........................................126

2.9.2. Секвенирование.....................................................126

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 127

3.1. Экспрессия генов РАС у крыс WAG и НИСАГ............................127

3.1.1. Уровень экспрессии генов РАС в почках................................127

3.1.1.1. Экспрессия генов РАС в почках молодых (1,5 мес) крыс.................127

3.1.1.2. Уровень мРНК генов РАС в почках зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной депривации....................................................................130

3.1.2. Экспрессия генов РАС в миокарде.....................................130

3.1.2.1. Уровень мРНК генов РАС у молодых (1,5 мес) крыс....................130

3.4.2.2. Уровень мРНК генов РАС у зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной депривации....................................................................132

3.1.3. Экспрессия генов РАС в мозговых структурах...........................133

3.1.3.1. Уровень мРНК генов РАС у молодых (1,5 мес) крыс....................133

3.1.3.1.1. Уровень мРНК генов РАС в гипоталамусе...........................133

3.1.3.1.2. Уровень мРНК генов РАС в продолговатом мозге.....................134

3.1.3.2. Уровень мРНК генов РАС в мозге зрелых (4 мес) крыс..................135

3.1.3.2.1. Уровень мРНК генов РАС в гипоталамусе в покое и при водной депривации.. ..............................................................................135

3.4.3.2.2. Уровень мРНК генов РАС в продолговатом мозге.....................137

3.1.4. Экспрессия генов РАС в надпочечниках................................137

3.1.4.1. Уровень мРНК генов РАС у молодых (1,5 мес) крыс....................137

3.1.4.2. Уровень мРНК генов РАС у зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной депривации....................................................................138

3.1.5. Экспрессия гена Асе в легких.........................................139

3.2. Экспрессия гена Th у крыс линий WAG и НИСАГ в состоянии покоя и стресса водной депривации.............................................................140

3.2.1. Уровень мРНК гена Th в надпочечниках............................... 140

3.2.2. Уровень мРНК гена Th в мозговых структурах...........................141

3.3. Экспрессия гена Сох-2 у крыс линий WAG и НИСАГ в состоянии покоя и стресса водной депривации.............................................................143

3.3.1. Уровень мРНК гена Сох-2 в почках....................................143

3.3.1.1. Уровень мРНК гена Сох-2 в почках молодых крыс......................143

3.3.1.2. Уровень мРНК гена Сох-2 в почках взрослых крыс......................143

3.3.2. Уровень мРНК гена Сох-2 в мозге.....................................144

3.3.2.1. Уровень мРНК гена Сох-2 в гипоталамусе.............................144

3.3.2.2. Уровень мРНК гена Сох-2 в продолговатом мозге.......................145

3.3.3. Уровень мРНК гена Сох-2 в надпочечниках.............................146

3.4. Поиск корреляций в экспрессии изучаемых генов у молодых крыс WAG и НИСАГ

3.4.1. Корреляции в уровнях мРНК одноименных генов в разных органах........ 147

3.4.2. Корреляции в уровнях мРНК генов, относящихся к разным системам, внутри одного органа.................................................................148

3.4.3. Корреляции в уровнях мРНК генов разных органов и систем...............149

3.5. Секвенирование кодирующего сигнальный пептид фрагмента гена Ngfr крыс линий НИСАГ и WAG...........................................................152

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 153

4.1. Экспрессия генов ренин-ангиотензиновой системы и Сох-2 у крыс линии НИСАГ.......................................................................153

4.1.1. Экспрессия генов РАС в почке........................................153

4.1.2.Экспрессия генов РАС в миокарде......................................161

4.1.3. Экспрессия генов РАС в мозге.........................................167

4.1.4. Экспрессия генов РАС в надпочечниках.................................177

4.2. Экспрессия Th у крыс линии НИСАГ.....................................180

4.3. Секвенирование кодирующего сигнальный пептид фрагмента гена Ngfr; характеристика локуса этого гена.................................................185

4.4. Заключение..........................................................194

ВЫВОДЫ...............................................................196

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................198

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертония

АД - артериальное давление

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ГГАС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система КРГ - кортикотропин рилизинг гормон ЛПС - липополисахарид

НИСАГ (ISIAH) - линия крыс с наследственной индуцируемой стрессом артериальной гипертонией ПГ - простагландин РАС - ренин-ангиотензиновая система САС - симпатоадреналовая система СНА - симпатическая нервная активность СНС - симатическая нервная система ЦНС - центральная нервная система ЮГ - юкстагломерулярные (клетки, аппарат)

АА - арахидоновая кислота

АСЕ - angiotensin converting enzyme (ангиотензин-превращающий фермент)

Асе- ген АСЕ

ACEI - ингибитор АСЕ

Ac-SDKP - гематопоэтический фрагмент acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (субстрат АСЕ) Agt - ангиотензиноген Agí - ген ангиотензиногена

Agirla, Agtr2 - гены рецепторов ангиотензина 1А- и 2-го типа

Ang - ангиотензин

ARB - блокатор рецептора AT 1

ATI А и АТ2 - рецепторы ангиотензина 1А- и 2-го типа В2 - рецептор брадикинина ВК - брадикинин

СОХ - простагландин-эндопероксид-Н-синтаза, PGH-синтаза, КФ 1.14.99.1

Сох-2 - ген циклооксигеназы-2

CVO - циркумвентрикулярные органы

DOCA - дезоксикортикостерон ацетат

DTT - дитиотрейтол

ENaC - эпителиальный натриевый канал

GPCR - 7-трансмембранные, сопряженные с G-белком рецепторы

GR - глюкокортикоидный рецептор

ICV - интрацеребровентрикулярное (введение)

IEG - «немедленно-ранние» гены, «гены быстрого реагирования»

IL - интерлейкин

JAK - Янус-кин аза

LVH - гипертрофия левого желудочка сердца МАРК - митоген-активируемая протеин-киназа MD - плотное пятно (в почке) MR - минералокортикоидный рецептор NOS - NO-синтаза

NTS - ядро одиночного пути (солитарного тракта) PRR - рецептор проренина/ренина PVN - паравентрикулярное ядро гипоталамуса Ren - ген ренина

ROS - активные формы кислорода

Rpl30 - ген рибосомного белка большой субъединицы 30

RVLM - ростральная вентролатеральная область мозга

SDS - додецил-сульфат натрия

SFO - субфорникальный орган

SOCS - супрессор сигнальных путей цитокинов

SON - супраоптическое ядро

SPGNs - sympathetic postganglionic neurons - симпатические постганглионарные нейроны

STAT - сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции

ТН - тирозин-гидроксилаза

Th - ген тирозин-гидроксилазы

TNF-ß - цитокин фактор некроза опухолей-ß

VP - вазопрессин

VSMC - клетки гладкой мускулатуры сосудов

WAG - Wistar Albino Glaxo - нормотензивная линия крыс

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов артериальной гипертонии актуально ввиду широкого распространения этого заболевания, являющегося одной из главных причин нетрудоспособности и смертности среди населения Земли Разработанные в последние десятилетия методы позволили перейти от эмпирического описания к выяснению глубоких генетических и биохимических причин, лежащих в основе гипертонической болезни, а также к пониманию того, что спектр этих причин многообразен. Генетические факторы дают существенный вклад в регуляцию артериального давления (АД): считается, что 30-60% наблюдаемых вариаций в АД определяются генотипом. Факторы среды и питания, различный стиль жизни также играют роль в патогенезе первичной гипертонии как важные, но поддающиеся модификации факторы риска, и определяют оставшуюся часть вариации АД. Немалую роль в развитии болезненного состояния играет стресс, в том числе эмоциональный, особенно в тех случаях, когда стрессирующее воздействие падает на почву генетической предрасположенности. Адекватная модель такого состояния - линия крыс с наследственной индуцируемой стрессом артериальной гипертонией (НИСАГ) - позволяет исследовать механизмы возникновения и развития стресс-чувствительной формы артериальной гипертонии.

За годы, прошедшие с момента создания линии НИСАГ, у этих животных были исследованы физиологические функции таких систем ответа на стресс, как гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная (ГГАС) и симпатоадреналовая (САС), а также транскрипционная активность их ключевых генов. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС) получила меньше внимания исследователей, хотя в последние годы все более активно изучается функция секреции альдостерона надпочечниками.

Однако авторы обзоров литературы, посвященных гипертонии, сходятся во мнении, что развитие гипертонической болезни, независимо от исходной причины, непременно затрагивает механизмы водно-солевого обмена, а значит, и систему, непосредственно с ним связанную -РАС. Более того, в последние десятилетия усилилось понимание значимости не только системной, но и локальных РАС - в почках, сердце, надпочечниках и едва ли не в первую очередь в мозге, - функции которых могут как влиять на формирование гипертонического статуса, так и меняться под его воздействием. Поэтому анализ активности РАС в органах, связанных с сердечнососудистым гомеостазом, должен быть одним из приоритетных направлений в исследовании природы артериальной гипертонии.

Экспрессию генов РАС у крыс НИСАГ до сих пор изучали в основном на уровне белковых продуктов (например, определения активности ренина или АСЕ). Но транскрипционную активность генов РАС (за исключением ренина) в почке крыс этой линии,

как и в других органах, связанных с водно-солевым обменом и кардиоваскулярным гомеостазом, не исследовали. Более того, не была исследована и экспрессия генов РАС у молодых крыс в период становления гипертонии.

Согласно современным концепциям (Johnson et al., 2008), развитие гипертонии проходит через две фазы. Во время первой фазы гипертония соль-резистентна и ренин-зависима, а почки функционируют нормально. Ранняя гипертония ассоциирована с низким объемом крови, повышенным уровнем ренина плазмы и гиперактивной симпатической нервной системой. Спустя время, вазоконстрикторные ответы ведут к развитию прегломерулярной артериолопатии и кортикальной почечной ишемии. Последствием этого является как сокращение почечной фильтрации, так и рост тубулярной абсорбции натрия, что ведет к повышению АД.

Известно, что у крыс других линий с низкорениновой формой гипертонии в раннем возрасте экспрессия ренина в почке повышена (Gomez et al., 1988; Sassard et al., 2003), a короткая блокада РАС приводит к долговременному снижению АД и задержке формирования гипертензивного статуса. Показано, что воздействие антигипертензивных средств на крыс НИСАГ в препубертатном возрасте (до 6 нед) также смягчает проявления гипертонии в последующем (Филюшина и др., 2007). Исходя из этих данных, кажется необходимым изучать функционирование РАС не только на взрослых животных, но и на крысах в критическом возрасте формирования гипертензивного статуса.

Невозможно рассматривать действие РАС изолированно, вне связи с другими физиологическими системами. Так, симпатическая нервная система управляет экспрессией ренина в почке и сама, в свою очередь, зависит от уровня Ang II как в циркуляционном русле, так и в структурах мозга. В лаборатории эволюционной генетики ИЦиГ СО РАН было показано, что базальный уровень адреналина в надпочечниках у крыс линии НИСАГ повышен (Маркель и др., 2006; Markel et al., 2007). Это заставляет полагать, что у крыс этой линии присутствуют изменения в цепи биосинтеза катехоламинов. В работе Бузуевой и сотр. (2006) показана повышенная гормон-синтетическая активность хромаффинных клеток уже у 3-недельных крысят НИСАГ.

Высокая симпатическая нервная активность, стимулирующая РАС и ведущая к развитию гипертонии, может иметь причиной особенности формирования симпатической нервной системы. Так, у крыс широко известной гипертензивной линии SHR выявлены гипериннервация сосудистой ткани и гипертрофия симпатических ганглиев, причиной чего может являться изменение восприимчивости симпатических нервов к фактору роста нервов NGF (Nemoto et al., 1994) из-за точечной мутации в нуклеотидной последовательности, соответствующей сигнальному пептиду, гена Ngfr (рецептора NGF низкой аффинности). С

локусом этого гена у крыс SHR ассоциировано высокое АД (Hilbert et al., 1991), а у молодых крыс НИСАГ - повышение АД при стрессе (Редина и др., 2003), поэтому можно предположить наличие сходной мутации у животных этих двух линий. Выявить такую мутацию можно методом секвенирования соответствующего участка.

Ранее была показана повышенная активность ГГАС у крыс линии НИСАГ. Реакция ГГАС на стресс и секреция глюкокортикоидов требуют посредников-простагландинов, чей синтез может модулироваться главным эффектором РАС ангиотензином II и его рецепторами. Секреция ренина в почке также регулируется простагландинами - продуктами действия фермента циклооксигеназы (СОХ)-2. Но система биосинтеза простагландинов у крыс НИСАГ до сих пор оставалась вне внимания исследователей, за исключением работы Амстиславского и соавт. (Amstislavsky et al., 2005), где иммуногистохимически и ме