Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление гипервариабельных участков генома и поиск генетических локусов наследственных болезней человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Выявление гипервариабельных участков генома и поиск генетических локусов наследственных болезней человека"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
V \ о "" на правах рукописи
- УДК 575: 599
РОГАЕВ ЕВГЕНИЙ ИВАНОВИЧ
ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНЫХ УЧАСТКОВ ГЕНОМА И ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА
0.3.00.15 - ГЕНЕТИКА
АВТОРЕФЕРАТ '
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
Москва—1996
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН и в Университете г. Торонто
Оффициальные оппоненты: доктор медицинских наук
профессор Беневоленская Л.И. доктор биологических наук Тарантул В.З.
доктор биологических наук Евграфов О.В.
Ведущее учреждение: Институт Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Защита состоится " ' " 19д6 г в /оч>^часов
на заседании Диссертационного Совета Д. 001.16.01 при Медико — Генетическом Научном Центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул.. Москворечье Д; 1 ' . • • _г " .....
Автореферат разослан " "_ 1996
Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор
Курилло Л.Ф.
Введение.
Настоящая работа представляет сабой законченное »со\ег*-оьгиие , включающее фундаментальную часгь: разработку .г-.-.' .¡¡пшентальных путей гажска гипервариабельных элементов генома человека, изучение их структурной организации и эчол^т'т'и " г?пс**е; и чрггкладпуто часть: создание г.оллекщш мо»екуляряо —генетических маркеров для ДНК — генотиттрованкя (геномной дактилоскопии, генотипоекопии, "ДНК-фингерпринтинга"), практическое внедрение гипервариабельных маркеров в биотехнологии, судебной медицине, а также в медицинской генетике с целью обнаружения генетических локусов к выделения генов наследственных болезней.
Актуальность работы
Проблема генетической изменчивости, значительно превосходящей по частоте темп обычного мутационного процесса, имеет два важных аспекта. Первый аспект — установление самого феномена гипервариабельности (высокого полиморфизма) определенных генетических структур. При изучении организмов с еысокой скоростью смены генераций — прокариот, низших эукариот, насекомых и некоторых растений сформировалось представление, согласно которому значительная доля изменчивости вызывается особыми генетическими структурами — перемещающимися элементами (обзоры: Георгиев Г.П. 1984, Хесин Р.Б. 1984), которые способны вызывать наследственные изменения ДНК и формировать значительный видовой полиморфизм генетических локусов, встраиваясь в те или иные места генома. Неоднократно высказывались предположения о способности ряда умеренно— или высокоповторяющихся последовательностей ДНК млекопитающих перемещаться, подобно мобильным элементам. К началу данного исследования традиционными методами не удавалось показать значительного межиндивидуального или межклеточного полиморфизма распределения подобных мобильных
повторов ДНК у человека. В связи с этим возникла необходимость поиска новых генетических элементов, которые могут обусловливать высокую нестабильность и, как следствие, высокую гетерогенность определенных генетических локусов человека.
Первые данные о реальном существовании гипервариабельных участков в геноме человека были получены в начале 80 —х годов. Вблизи генов инсулина и глобинов человека, а также в участке ДНК с известными функциями была показана значительная полиаллельная вариабельность, вызываемая структурными изменениями ДНК (Wyman and White, 1980; Bell et al, 1981; Higgs et al, 1981).
Данная работа, вместе с исследованиями многих других авторов за прошедшее десятилетие, является вкладом в представление о том, что особый тип повторов ДНК, состоящий из разнообразных семейств тандемно—повторяющихся элементов генома, является основным источником геномной вариабельности у человека.
Такие гипервариабельные (ГВ) повторы ДНК, в зависимости от длины тандемно—повторяющейся единицы, весьма исскуственно классифицируются в настоящее время на две группы: 1) миниповторы (мини—, мидисателлиты или VNTR — . вариабельное числа тацдемных повторов),. 2) короткие тандемны.е повторы (STR) или микросателлиты.
Идентификация геномных компонентов, способных вызывать высокую вариабельность генетических локусов, их филогенетический и сравнительный структурный анализ имеют большую ценность для понимания механизмов быстрой изменчивости в эволюции живых организмов и эволюции генома.
Клонирование гипервариабельных элементов ДНК имеет и второй важный аспект — прикладной. Обнаружение маркеров ДНК, детектирующих полилокусную и полиаллельную структурную вариабельность генома, явилось важным достижением для целого ряда биотехнологических и медицинских областей. Впервые были получены точные й универсальные способы оценки идентичности или родства любых сравниваемых биологических объектов. Гипервариабельные участки ДНК являются также наиболее эффективным.поколением маркеров для сцепления и молекулярно—генетического картирования хромосомных локусов. и генов, ответственных за наследственные заболевания.
После картирования того или иного хромосомного локуса с помощью гипервариабельных маркеров, далее, с помощью стратегии позиционного клонирования можно выделить и охарактеризовать ген, мутации которого ведут к наследственной патологии. Преимущество данной стратегии в том, что она позволяет выделять гены болезней с неизвестной биохимической природой патологии. До проведения представляемого исследования, в нашей стране не было работ по обнаружению новых генетических локусов наследственных болезней методами генетического сцепления с гипервариабельными маркерами ДНК.
Научная новизна.
В процессе работы обнаружена серия семейств гипервариабельных миниповторов ДНК, характеризующихся индивидуальным полиморфизмом структуры ДНК в хромосомных локусах.
Расшифрованы протяженные нуклеотидные последовательности (2600 и 2800 п.о.) геномных участков, содержащие данные повторы ДНК, изучена их структура и эволюция.
Обнаружен ряд особенностей данных гипервариабельных миниповторов ДНК: их сходство с геномными элементами на границах ретровирусных HIV—I — генов; организация в геноме не только в виде непрерывных тандемных единиц, но и прямых повторов, фланкирующих короткие ретропозоны; неслучайная агрегация негомологичных семейств миниповторов (tau — и аро —) в одних к тех же хромосмных локусах.
Обнаружено существование механизма модификационных вариаций нейрогена, метилирования амилоидного предшественника АРР, в различных отделах мозга человека.
На основе применения проб гипервариабельных миниповторов и STR маркеров обнаружены новые генетические локусы ряда наследственных заболеваний. В частности, показано сцепление гена, ответственного за развитие тилоза (гиперкератоз, Keratosis Palmaris et Plantaris), с локусом 17q22— 24 и гена, ответственного за развитие наследственной катаракты' (Polymorphic Congenital Cataract), с локусом 2q33 — 35.
Выявлено новое семейство генов, названных "пресенилинами Обнаружено, что мутации в этих генах вызывают ранние формы болезни Альцгеймера.
Картирование, а затем и клонирование генов пресенилинов, ответственных за болезнь Альцгеймера, явилось логическим завершением стратегии идентификаций генов наследственных болезней с помощью нового поколения высокополиморфных или гипервариабельных маркеров. Данные результаты явились также существенным достижением в области генетических исследований нейропсихических болезней и, в частности, болезни Альцгеймера, одной из наиболее распространенных патологий в человеческих популяциях.
Научно-практическая ценность
Основное научно-практическое значение данной работы заключается в разработав серии маркеров ДНК для индивидуальных генетических идентификаций человека и других живых организмов и выявление генетических локусов, ответственных за ряд наследственных болезней.
Коллекция ГЕшервариабелвных маркеров, полученных как в собственных исследованиях, так и работах других авторов, была внедрена для решения конкретных спорных случаев в медицинской экспертизе и криминалистике в нашей стране. С помощью ДНК— генотипирования были проведены видовые, половые и индивидуальные идентификации биологических следов в следственных и судебных целях. Проведены анализы отцовства или материнства в уголовных и гражданских делах. Одна из полученных мультилокусных проб ДНК (11е«14) оказалась особенно эффективной для рутинных анализов отцовства. Мультилокусные пробы были также использованы на первом этапе для тестирования отцовства, материнства и реконструкций больших родословных, отобранных с целью генетического анализа наследственных болезней, а также установления зиготности близнецов. В ходе исследования были обнаружены также хромосомные локусы, ответственные за такие наследственные заболевания, как гиперкератоз или катаракта в этнических, популяциях Средней Азии. ЯК маркеры, тесно сегрегирующие с генами этих болезней,
эгут быть использованы для диагностики и консультаций в семьях данной патологией.
Наконец, обнаружены мутации в генах пресенилинов, •ветственные за ранние формы болезни Альцгеймера {вместе с >уппой из Университета г.Торонто). Разработаны упрощенные ;тоды детекции таких мутаций с использование?! шгонуклеотидных праймеров на геномную ДНК. Эти методы -дут полезны для доклинической диагностики ранней формы )лезни Аьцгеймера в тех семьях, где данные мутации были ■ \рнгттфщпрсганы. Кроме тго,. клонирочатшпе ыутаатаые гены ^есен^лтпгсБ будут испо/\ьзованы для получения моделей >ансгенных животных с целью разработки рациональной терапии ой распространенной болезни человека.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было выделение гиперпариабельных кемептов генома и применение гипервариабельных маркеров для ирокого спектра медико — генетических исследований, включая :гделекие генетических локусов наследственных болезней. Для )стижения поставленной цели решались следующие задачи: разработка стратегий конструирования проб ДНК, актирующих гипервариабельные участки генома; клонирование гипервариабельных участков генома человека и ¡сшифровка их нуклеотидных последовательностей; применение гипервариабельных маркеров ДНК в медико— нетических и судебно-экспертных идентификациях; применение гипервариабельных маркеров ДНК для фтирования неизвестных локусов наследственных болезней: пар акты (FCC) и гиперкератоза (KPPF) ; выявление генов, ответственных за развитие болезни \ьцгеймера.
Положения, выносимые на защиту
На защиту выкосятся следующие положения:
I. Выделение и характеристика новых семейств гипервариабельньи повторов ДНК.
II. Конструирование маркеров ДНК для детекции индивидуальных ДНК— профилей человека и различных таксонов животных; применение гиперварйабельных маркеров в прикладных и. фундаментальных медико—генетических исследованиях.
III. Обнаружение модификационной вариабельности ДНК (метилирования участка АРР гена) в различных отделах мозга.
IV. Обнаружение генетических локусов наследственных болезней:
— сцепление полиморфной врожденной катаракты с хромосомным локусом 2q33 —35;
— сцепление наследственного шперкератоза (тилоза или KPPF) с хромосомным локусом 17q22—24;
— клонирование двух новых генов, ответственных за раннюю форму болезни Альцгеймера.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены на более чем 20—та международных и отечественных научных конференциях, включая I—ю Международную Конференция по "ДНК— фингерпринтингу" (Берн, Швёйцаия, 1990), П—ю Международную конференцию по "ДНК—фингерпринтингу" (Бело—Горизонте, Бразилия, 1992), Мировой Конгресс Психиатрической Генетики (Новый Орлеан, США, 1993), Мировой Генетический Конгресс (Нью—Хэвен, 1988), Конференцию американского Общества Генетики Человека (Монреаль, Канада, 1994), Конференцию Сложных Наследственных Болезней (Берлин, Германия,. 1995), ' Европейский Симпозиум по Генетике Человека'(Лондон, Великобритания, 1996). Результаты исследований докладывались также на межлабораторных семинарах Института Молекулярной Генетики РАН (1996), Института Медицинской Генетики РАМН (1988, 1994), на рабочем совещании "Геномный фигерпринтинг" (Мадрид, Испания, 1993), научных семинарах и совещаниях Института Клинической психиатрии (1995), Университета Западного Онтарио (1994), Университета Альберты (Эдмонтон, 1994), Университета г.Отгавы (Оттава, Канада, 1994), Университета • • г.Виннипег (Виннипег, 1994), Университета Британской Колумбии
(Ванкувер, 1996), Центра Полиморфизма Человека им.Дассе (Париж, Франция, 1996), Университета г.Ньюкасла (Ньго — Касл, Великобритания, 1994), а также Академии Медицинских Наук (Москва, Россия, 1996).
Публикации и благодарности.
- Представляемая работа проводилась в период 1984 — 1996 гг. Все основные результаты, изложенные в диссертации, получены при главном участии автора. Автор выражает искреннюю благодарность за участие в экспериментальных исследованиях на различных этапах: Рогаевой Е. А. (Университет г. Торонто), Шленскому А.Б., Коровайцевой Г.И., Кирьянову С .А, Соловьеву И. (лаборатория молекулярной генетики мозга НЦПЗ РАМН), Пименову М.Г., Сыроквашевой Е.А., Перепечиной И.О. (Центр Криминалистики МВД России), Алябову Ю. (МГУ им. М.В.Ломоносова), работавших под руководством автора. Работа по выделению генов болезни Альцгеймера проводилась в сотрудничестве с интернациональной группой Университета г.Торонто, Центра Нейродегенеративных Болезней, (директор П. Джорж —Хислоп). Автор благодарен также Вартаняну М. Е. за общую поддержку работы; Моляка Ю. и Бочкову Н. П. за интерес и дополнительный генетический анализ некоторых маркеров ДНК, выделенных в данной работе; а также Гинтеру Е.К. и сотрудникам его лаборатории, предоставивших обширные родословные с наследственными заболеваниями катаракты и тилоза.
По материалам диссертации опубликовано 110 научных работ (из них 56 научные статьи и 54 тезиса научных конференций).
Материалы и методы.
В работе использованы многие методы генной инженерии и молекулярной генетики.
Выделение ДНК из жидкой крови человека или животных проводили после осаждения ядер лимфоцитов. Выделение ДНК из
сухих пятен крови осуществляли вымачиванием пятен в 3% саркозиле. При выделении ДНК из плаценты, мозга и других соматических тканей взрослых людей и эмбрионов ткани, а также различных трупных тканей в судебно-экспертных образцах клеточные ткани интенсивно гомогенизировали, предварительно заморозив их в жидком азоте.
При выделении ДНК из пятен спермы в криминалистических образцах лизис клеточного материала проводили в присутствии ß — меркаптоэтанола. Во всех случаях очистку эукариотической ДНК осуществляли с применением протеиназы "К" и фенольно — хлороформной депротоинизации.
Большинство манипуляций с ДНК (выделение плазмидной ДНК, гидролиз рестриктазами, электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях, перенос на фильтры, блот—гибридизация, гибридизация в "пятнах" и на "колониях") осуществляли, используя стандартные методы (Маниатис и др., 1986) с некоторыми модификациями. Очистку плазмидной ДНК от РНК для секвенирования проводили с помощью PEG8000.
Выделение РНК и получение RT—PCR продуктов осуществляли экспресс-методом с помощью фенол— хлороформной экстракции и протоколов, как рекомендовано (Promega, RT—PCR протокол).
Для конструирования произвольнных синтетических миниповторов ДНК и Redl пробы пары комплиментарных олигонуклеотидных праймеров, содержащих соответствующие повторы, отжигали и проводили чередующиеся реакции PCR с TthI—полимеразой и литерования для получения протяженных трактов повторов. Фракции длинных трактов вырезали из полиакриламидного или агарозного геля и клонировали в Smal— сайт вектора pUC13.
В дальнейшей работе использовали клоны Redl (repeat envelope deletion) ~150 и.о., (CGTG)„ brown 4.2 (-2000 n.o.); (GGTGT)„ blue 5.6 (-3000 и.о.); (GGGTCT)n white 6.2 (-400 n.o.).
Олигонухлеотидные пробы миниповторов были использованы также для гибридизации с бактериофаговыми клонотеками всего генома человека (EMBL3) (-100 тыс. клонов), регистрируя два типа сигналов: "интенсивный" (строгая гомология) и "средний" (нестрогая гомология).
Для выделения кДНК клонов при проведении позиционного
библиотек кДНК различных отделов мозга человека в ZAP II или в плазмидных векторах.
Скринироваиие бактериальных колоний или бактериальных бляшек проводили в жестких условиях гибридизации (O.ixSSC, 65СС) с использованием дубликатов фильтров для исключения неспецифических сигналов. Перекрывание концов YAC — клонов в участке 14q24.3 проводили с помошью "векторетного" праймера (Riïley et al, 1991). Однако, так как 50 — 70% всех YAC—клонов оказались химерными, были разработаны дополнительные PCR слесобы с исмголь?0"а1шег.1 PCR амплификации SINE и LINE, повторов YAC —клонов.
Расшифровку нуклеотидной последовательности геномной области, содержащей tau — и аро — повторы, осуществляли по методу Максама—Гилберта (Maxam, Gilbert, 1980) в твердофазном варианте. Нуклеотидную последовательость длиной 2800 и.о. определяли по стартегии "килосеквенирования" (Hong, 1982), получая систематические делеции с помощью ранее описанной стратегии с Sl-нуклеазой (Зайцев И.З. и Рогаев Е.И., 1986). В некоторых случаях для повышения денатурирующих свойств структурного геля вместо мочеины использовался 50 — 60% формамид.
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов, содержащих Red2 и Red5 повторы, проводили по методу Сэнгера (Sanger et al, 1977) с субклонированием рестриктных фрагментов в случае протяженной последовательности (~2600 п.о.) клона Red2 в М13 вектор.
Секвенирование последовательностей кДНК и RT—PCR продуктов осуществляли с помощью PCR—реакции с одним нуклеотндным праймером и автоматического секвенатора (ABl).
Результаты I. Гипервариабельные миниповторы ДНК
Стратегии поиска гипервариабельных участкоа генома.
В процессе работы с 1984 г. по 1990 г. было разработано
несколько стратегий, оказавшихся эффективными для обнаружения и клонирования гипервариабельных повторов ДНК человека: 1) просеивание случайных фрагментов ДНК из тотальной геномной библиотеки с умеренной копийностью в геноме; 2) конструирование, проб ДНК на основе вариабельных повторяющихся элементов ретровирусов (HIV I); 3} создание синтетических проб ДНК на основе произвольно выбранного простого сочетания нуклеотидов; 4} выделение клонов из геномных библиотек человека с помощью кросс—гибридизации с ретровирус—подобными или "произвольными" синтетическими тандемными повторами ДНК.
Семейство tau— и аро— повторов.
Первая проба ДНК , детектирующая множественный полиморфизм рестрикционных фрагментов генома человека, была выделена ранее из клонотеки умеренных повторов ДНК в результате целенаправленного поиска нестабильных или гипервариабельных повторов ДНК . Попарное сравнение случайных людей в группе из 21 человека позволило выявить различия между ними не менее, чем по 8 —12 вариабельным Pstl — рестрикционным фрагментам, детектируемых TVRI-6 (ГВО) пробой в блот—гибридизационном эксперименте. Неясно было, является ли ГВО фрагмент непрерывной повторяющейся единицей или состоит из различных по структуре и копийности геномных элементов. Для выяснения этого была секвенирована нуклеотидная последовательность (-2800 п.о.) этой области ДНК. Анализ расшифрованной последовательности показал, что ГВО фрагмент содержит два кластера тандемных повторов Д НК, разделённых G/C богатой областью, и уникальную последовательность в 3'— участке. Тандемные повторы длиною 36—38 и.о. из этой области были названы семейством аро~, а повторы длиною 22—24 п.о. — tau-миниповторами ДНК (рис. 1,2). Блот—гибиридизация субклонированных проб ДНК, содержащих отдельно кластер tau- и аро—повторы,, в обоих случаях, позволила детектировать полиморфные профили ДНК разных людей для обеих проб. Для выяснения представленности обнаруженных гипервариабельных повторов ДНК в геноме человека были скринированы бактериофаговые и космидные библиотеки геномной ДНК. Наиболее интригующим является обнаружение большого процента
Ьаговых клонов, гибридизующихся с tau—пробами ДНКгкоторые ;росс — гибридизуются и с аро —пробами. На основе полученных данных можно было предположить, что в геноме может :уществовать по крайней мере несколько десятков локусов, где кластеры tau — и аро — семейств ДНК тесно физически сцеплены фуг с другом.
Дальнейшие исследования гибридизации с панелью фомосомной ДНК из клеток соматических гибридов и сравнение с данными нуклеотидных последовательностей (GenBank/EMBL) юдтвердили такую ассоциацию и показали, что ряд зысокогомологичыых кластеров, как tau-, так и аро—семейств повторов, локализованы на хромосоме 19.
Весьма необычной является высокая дивергентнция аро — мономерных единиц в одном локусе хромосомы 19 (ГВО) (50—78% гомологии между собой) и их консервативность в другом локусе той же хромосомы (АроСП) (92—100% гомологии) при совпадении усредненых структур из обоих кластеров на 98%. Поскольку один из ГВО. аро - повторов ДНК имеет большую гомологию (96%) с аро—повторами из АроСП — гена, чем с аро—повторами из "своего" кластера, есть основания полагать, что в сравнительно недавнем эволюционном событии копия этого аро —элемента переместилась из ГВО в интрон 3 ЛроСИ — гена, с последующей амплификацией. В связи с этим следует отметить существенное сходство {67 — 70%) ' 36 — 38 п.о. аро —повторов ДНК с вариабельной повторённой последовательностью gag/pol гена ретровируса HIV I и участком генома ретровируса Раушера.
Другой интересной структурной особенностью данных элементов ДНК является их обнаружение в виде повторов, фланкирующих короткие Alu—ретропозоны (SINE).
Более детально структурное и эволюционное описание данных семейств повторов изложено в публикациях (Рогаев ЕМ., Доклады Академии Наук, 1988; RogaevE.1., Nucl.Ac.Res„ 1989; RogaevE., Nucl.Ac.Res., 1990).
Синтетические "произвольные" пробы ДНК.
Было выдвинуто предположение, что в процессе эволюции вероятность случайной тандемной амплификации любого простого сочетания нуклеотадов в сложном геноме может быть весьма высока. Из нашей гипотезы следовало, что произвольно выбранные
ГВО аро-кластер 172 GCCTT. GGTCACAGGAGTCCCAG.TTTCCAGCTGCCTCCT
ССЛТТ. GGACCTAGCAGTCC . AGGCCCCCAGCC. ССТССТ CCCTTCAGACCCAQGCGTCC-AGGCATCCGGCC. ССТССТ ССС. TCAGACCCAGGC - СХТ - GCGACCCCAGCCACCTCTC 32
388 GTC. ТСAGACTCAGGAGTCC. AG. CCCCCAGCCTCCTCCT 42
ГВО аро-консенсус CCCTTCAGACCCAGGAGTCCAGGCCCCCAGCCCCTCCT
ApoCII аро-консенсус СССТ. CAGAfXCAOTACTrcAG^
* > I »»•»llltlltll • I • • < • I • I « I I • » I I •
t I I lllllllttt«»! IIIIIIIII<<IIIII<
R-гаа аро-консенсус CTCT. AGGACXXAGGAGTCCGGGCCCCCAGCCCCTCX!T
ГВО ТАО-КЛАСТЕР
TAU-КОНСЕНСУС
1422 caGTCTCTGT
1 CCCCCTaTCTCc..aGGTCTCTGT
2 tCCCCTCcCTCT.. GGaTtTCTGT
3 CTCCCTCcaaCTCTGGGTC. .TGT
4 CCttCTCTCTCT. -GaGTCTCTGT
5 CCCCCTCXCTCTCXGGGTCTCTGT
6 CCCtCTCTCTCT. -GGGTCTCTGT
7 CXXXX^CTCTCTCTGGGTCTCTGT
8 CCCCtTCTgTCTgTGGGTCTCTGT
9 CCCtCTCTCTCT. .GGGTCTCTGT
10 CCCXXTTCTCrrcTCrGGGTCTCTGT
11 CCCCtTCaCTCTCTGGGTCTCTGT 1678
(XCCCTCTCTCTCTGGGTCTCTGT
Red5-M
Eed2-S
GGAATAAGGGTGGAGGGTGGGGTCATGGAGATGGAAACACCAGT GGAATAAGGGTGGAGGGTGGGGT03TGGAGATGGAAACACCAGT GGAGTAAGGGTGGAGGGTGGGGTCGTGGAGATGGAAACACCAGT GGAGTAAGGGTGGAGGGTGGGGTCGTGGAGATGGAAACACCAGT GGAGTAAGGGTGGAGGGTGGGGTCATGGAGATGGAAACACCAGT GGAATAAGGGTGGAGGGTGGGGTCATGGAGATGGAAACACCAGT
GGAGTAAGGGTGGAraJGTGGGGTCGTGGAGATGGAAACACCAGT A A •
AGGG.TGG
AGGG.TGG"
AGGGGTGG
AGGGGTGG
AGGG.TGG
AGGG.TGG
AGGG.TGG
(AGGGTGG)n
HED5 - КОНСЕНСУС
RED2 - К0НСЕНСУ1
РИСУНОК 1. КЛАСТЕРЫ ГИПЕРВАРИЙБЮЕЛЬВДХ СЕМЕЙСТВ МИНИПОВТОРОВ
ДНК, ОБНАРУЖЕННЫХ В ДАННОЙ РАБОТЕ (ГЕНОМНЫЕ ФРАГМЕНТЫ Г] KED5 и RED2).
RED5 (GGAATA AG-GGTGGAGGGTGGGGTCGTGGAGATGG AAACACCAGT) r
I I Г M « I I I I » * » »»>»/<»»
■ *«•»•■< i < ' t < i i i ( ( « i i
HIV-I env GGGGTGGAGA-TGgggg—tgEagatg
RED2 (GGGGTGGA)n
HTW-T - gaß/pol (TTTCTTCAGA____GCAQVCCüGAGCCÄACAGCCCCACCA>2
ПОВТОРЫ ; ::::::: ; :: :;:: ••: ::;;;:: : ;
АРО-ПОВТОРЫ { TCCCTTCAGACCCAGGAGTCCAG _ GCCCCCAGCCCCTCC > n ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
VIR-DOMAIN I R-DOMAIN ГВО TAU-ПОВТОРЫ СCCCCCTCTCTCTCTGGGTCTCTGT > r
DR.VIRILIS САТЕЛЛИТ (CCCCCTCTCTCTCT)r (DV1S2)
PKCi'HOK 2. ГОМОЛОГИЯ СЕМЕЙСТВ МИНИПОЕТОРОВ ДИК ЧЕЛОВЕКА.
простые комбинации нуклеотидов, построенные в тандемные звенья, могли бы служить пробами для "узнавания" подобных сочетаний в любом сложном геноме. В качестве примера были тестированы: тетра —, пента — и гекса — комбинации повторов ДНК. Пробы ДНК, названные "brown" 4.2 (CGTG)B>2fl, "blue" 5.6 (GGTGT)„>50, "white" 6.2 (GGGTCT)B>20 были приготовлены in vitro синтезом олигонуклеотидов с последующим отжигом и PCR амплификацией взаимно—комплиментарных олигонуклеотидов, с последующим клонированием фракций повторяющихся трактов ДНК длиной 80—500 п.н. в плазмидные вектора. Пробы Д НК тестировались прямой блотинг—гибридизацией с панелью рестрикционных гидролизатов ДНК'разных индивидов человека и 27 — ми видов позвоночных животных. Апробирование проб ДНК проводили на геномной ДНК, рестрицированной различными эндонуклеазами. Для каждой пробы ДНК испытывали два температурных режима отмывки мембран после блотинг— гибридизации: 42°С>и 65°С. Было обнаружено, что все тестируемые
синтетические пробы ДНК выявляют специфичные картины блотинг—гибридизации, характеризующиеся как внутри— , так и межвидовой гипервариабельностью. Проба ДНК "brown" 4.2 (CGTG)n>20 выявляла 2—6 полиморфных фрагментов, часто специфичных для того или иного таксона (например, свиней, коров, лошадей, крыс). При этом не наблюдалось изменений по этим полосам у разных пород, популяций или диких и домашних представителей одного таксона (например, свиней и кабанов). Таким образом, данная проба потенциально может служить универсальным маркером видовой принадлежности, по крайней мере, для некоторых таксономических групп. Пробы ДНК "blue" 5.6 (GGTGT)n>50 и "white" 6.2 (GGGTCT)„>20 детектировали высокополиморфные профили ДНК человека: от 16 до 23 НаеШ и Hinfl— рестрикционных фрагментов у человека. В то же время, следует отметить, что частота встречаемости (средняя частота q=0.56—0.59) полиморфных полос, детектируемых этими пробами, была выше чем у минисателлитов Джеффриса (q=0.25). "Blue" 5.6 и "white" 6.2, а также Redl (см.ниже) были особенно эффективны для детекции ДНК—фингерпринтов парно— и непарнокопытных животных, выявляя профили ДНК высокоинформативные для индивидуальной и групповой идентификаций.
Семейства гапервариабелышх миниповторов ДНК человека,
сходные с элементами генома вируса иммунодефицита
человека (ВИЧ-1).
При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей аро—миниповторов ДНК было обнаружено высокое их сходство (>65% гомологии) с участками генома ретровируса Раушера и короткой повторяющейся последовательностью в участке перекрывания gag— и pol—генов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 или HIV-I). Исходя из этого, было сделано предположение, что в геноме ретровируса ВИЧ-1 могут содержаться и другие элементы ДНК, подобные пшервариабельным миниповторам ДНК человека. Для проверки этой гипотезы был отобран участок гена envelope длиной 24 п.о., состоящий из двух повторов (ССССАТСТССА.С,ССССА.ТСТССАС), вариабельных в различных штаммах ВИЧ-1 по числу копий. Проба ДНК, содержащая более 10—ти тандемных копий данного повтора и названная Redl, была сконструирована in vitro по процедуре,'
аналогичной описанной в предыдущем разделе для синтетических и
"произвольных" проб. Данная проба, как оказалось, специфично гибридизуется с ДНК человека, выявляя набор дискретных НаеШ — или Hinfl—рестрикционных полос, формирующих индивидуальные ДНК — фингерпринты. Было идентифицировано также две НаеШ — полосы, 4.0 и 6.0 т.п.о., константных у всех анализируемых индивидов.
Для клонирования участков генома человека, гибридизующихся с Redl пробой, было проведено просеивание бактериофаговой библиотеки генома человека (данные эксперименты проводились совместно с сотрудником лаборатории молекулярной генетики мозга Шленским А.Б., работавшим под руководством автора). В результате были выделены и секвенированы несколько клонов, гибридизующихся с Redl пробой. Обнаружено два семейства тандемных Red—повторов ДНК, имеющих сходство последовательности повторяющегося мономера с коротким участком envelope гена. Серия клонированных геномных Red — последовательностей была тестирована в качестве блотинг—гибридизационных проб с рестргосционными гэдролизатами ДНК человека. Профили ДНК, детектируемые этими пробами, относились к двум разным типам: мультилокусные (Red2, Red3, Red4 пробы (до 30 рестрикционных фрагментов у каждого индивида)) и мидилокусные или "среднелокусные" (Red5, Red6 (до 5 — 11 фрагментов у каждого индивида)). Проба Red5 была чрезвычайно чувствительна в блот — гибридизационных экспериментах. Red5 проба детектирует аллели со сравнительно высокой частотой в популяции (0.3 — 0.6) и может быть полезна для популяционных исследований человека. Некоторые Red пробы оказались чрезвычайно информативные, детектируя индивидуальные "ДНК— фингерпринты" человека. Например, пробы Red2, Red3, Red4 выявляли в среднем от 20 до 31 полиморфных НаеШ—фрагментов ДНК человека, в зависимости от длины разгонки геля. Вероятность случайного совпадения всех фрагментов ДНК у двух неродственных индивидов для Red4 была крайне мала (Рис.3,4).
ргоЬе п 5.0.(п) Ч Б-Шч) Р
Лей-/ 22.00 3.59 0.23 0.06 9.07-1015
Ней—2 23.14 Х22 0.22 0.10 6.07-10-"
кей-З 32.33 1.50 0.25 0.02 ч 3.43-10-"
Ней—4 31.38 3.60 0.26 0.07 4.3810-"
Яес1-5 6.96 1.34 0.35 0.20 6.70-10-"
В1ие 5.6 дщгК?* 16.42 1.98 0.59 0.13 N0
ШМе 6.2 дддШ 23.18 5.15 0.56 0.11 N0
Рисунок 3. Мультилокусные или средиелокусные пробы, полученные в данной работе. Приведены частоты и вероятности совпадения всех полос между двумя случайными индивидами.
Другой особенностью пробы является возможность детекции ДНК—фингерпринтов в жестких условиях гибридизации и высокая воспроизводимость результатов. Таким образом, данная проба не уступает по информативности пробам ДНК на основе минисат еллитов Джеффриса и' стала использоваться в рутинных процедурах установления отцовства в судебно-медицинских и медико—генетических исследованиях.
Нуклеотидные последовательности геномных участков 11е(12 (~2600 п.о.) и 11ес15 (~300 п.о.) были секвенированы. Оказалось, что семейство повторов из мультилокусной пробы Нес12, названное Ивб-в , представлено простейшими 7—8 п.о. миниповторами ДНК. В то время как семейство повторов из "среднелокусной" пробы Иес15, названное Иес1-М, представлено более дл1пшыми (46 п.о.) тандемно-повторенными единицами (рис. 1,2).
На промежуточных этапах работы была также показана гипервариабельносгь для ряда других проб на основе тандемных повторов. Так, например, гибирдизация клонированной ранее пробы классического сателлита Ш (АТТССТ)М из гетерохроматиновых прицентромерных макрокластеров хромосомы .9 (предоставленном Денинжер и др.) с ДНК,-по крайней мере, 15-ти случайных индивидов, показало, что все они отличаются друг от
Рисунок 3. ДНК- профили родственных и неродственных индивидов, выявляемых Red-пробами.
друга по профилю Тад1-рестриктных фрагментов. Аналогичные данные были получены рядом авторов при анализе других вариантов сателлита Ш из центромерных областей других хромосом..
В 1987 г. бельгийские исследователи Вассарт и др. обнаружили, что бактериофаговая ДНК фага М13 гибридизуется с геномной ДНК человека и животных в виде ДНК—фингерпринтов и установили также, что подобная гибридизация обусловлена кластером коротких миниповторов (М13 минисателлиты) в гене, кодирующем белок Ш фага М13. Рысков А.П. и др. в независимом исследовании также показали, что проба М13 детектирует индивидуальные ДНК—фингерпринты у человека и многих видов живых организмов.
Мы предположили, что другие бактериофаги, в частности, родственные бактериофагу М13, могут содержать аналогичные минисателлитаые участки, кросс—гибридизующиеся с гипервариабельными районами генома человека и других живых организмов. Действительно, проба геномной ДНК бактериофага И)103 выявила индивидо—специфический набор НаеШ— или НшП— рестриктных фрагментов ДНК человека.
Синтетические пробы и ЕОЮЗ были также эффективными для идентификации ДНК—фингерпр котов штаммов микроорганизмов.
Выделение STR с необычной вариабельностью.
Недавние исследования показали, что микросателлиты или простые тандемные повторы ДНК (STR) с мономерной единицей .меньше 5 п.о. — наиболее обильный источник гипервариабельности в геноме.
(TG)n - микросателлиты относятся к наиболее часто встречающимся динуклеотидным повторам ДНК в геноме человека. Недостатком использования {ТС)п-повторов ДНК для индивидуальных идентификаций является наличие минорных неспецифических полос ("shadow" полос), возникающих, видимо, в результате ошибок Taql-полимеразы в процессе полимеразной цепной реакции при репликации трактов (TG)„-noBTopoB ДНК. Мы предприняли поиск и тестирование иных, не (ТОп-динуклеотидных позторов ДЧК. В результате бчло описано несколько новых ■
полиморфных локусов, содержащих кластеры" динуклеотидных повторов ДНК. Суммируя наиболее значимые результаты, можно отметить следующее.
1) Был обнаружен комплексный микросателлит (SPN - локус), состоящий из (ТС)„, (TG)„, (CG)r повторов , показавший чрезвычайно высокую для STR гипервариабельность в человеческой популяции (гетерозиготность >96%).
2} Впервые были проанализированы STR, содержащие (CG)„-динуклеотиды, крайне редкие в геноме. Показана необычная особенность распределения полиморфных (GC)n аллелей в условиях электрофореза, некратная шагу в два нуклеотида. 3) STR, содержащие (CG)„, (TCjn, {АТ)а или комплексные тракты STR, показывают значительное снижение или отсутствие неспецифических минорных полос в условиях ПЦР, характерных для {ТОп-микросателлитов.
Описанные полиморфные STR имели известную хромосомную локализацию и были использованы как для поиска генов ряда наследственных болезней методом генетического сцепления (гиперкератоз, болезнь Альцгеймера, катаракта), так и для проверки отцовства в родословных.
Результаты изложены в публикациях: Rogaev Е., Keryanov S., Hum.Mol.Genet., 1992; Rogaev Е., Shlensky A., Nucl. Acid Res., 1991; Rogaev E. et al, Hum.Mol.Genet., 1992; Rogaev E. et al, Hum.Mol.Genet., 1993 и др.).
Прямая идентификация локусов с удлиненными
трактами тринуклеотидных повторов ДНК-
Нестабильность гипервариабельных трактов тринуклеотидных {CTG)B и {CCG)„ повторов ДНК обнаружена недавно для целой серии неврологических болезней, проявляющих свойство "антиципации" клинических симптомов в поколениях.
В данном исследовании было обнаружено, что пробы ДНК, сконструированные на основе (CTG)n и (COG), -трактов ДНК, могут детектировать геномные "фингерпринты ДНК" человека. Прямая гибридизация (CTG),, и (CCG)n проб с геномной ДНК нормальных индивидов выявляла простые (1—2 главных локуса) или сложные (много локусов) профили "ДНК—фингерпринтов" в зависимости от условий гибридизации . Был впервые разработан экспериментальный подход (HESR (hybridization of expanded simple
repeats)) для специфической идентификации трактов патологически удлинённых тринуклеотидных повторов в "сложном" геноме, теоретически позволяющий также клонировать ген болезни.
Ключевым этапом в данном методе является одновременная обработка геномной ДНК больного смесью множества рестрикционных эндонуклеаз (более 5). Это позволяет редуцировать размер рестрикционных фрагментов, содержащих короткие тракты тринуклеотидных повторов, и оставлять интактными удлиненные тракты тринуклеотидных повторов ДНК, не содержащих сайты для выбранных рестриктаз. Метод был успешно апробирован для прямой детекции нестабильных повторов генома с использованием образцов ДНК больных с миотонической дистрофией (MD) и у больных умственной отсталостью, связанных с ломкостью X— хромосомы.
Таким образом, метод может быть перспективен для прямого тестирования на возможную экспансию трактов тринуклеотидных повторов в небольших семьях или даже у отдельных индивидов при болезнях, проявляющих свойства "антиципации" в поколениях, гены которых до сих пор не обнаружены (шизофрения, маниакально—депрессивные психозы, некоторые мозжечковые атаксии, аутизм и другие.)
Применение гипервариабельных маркеров для генетических идентификаций.
Обнаруженные гипервариабельные маркеры ДНК, полученные в данном исследовании, показывают соматическую стабильность "ДНК— фингерпринтов" во всех анализированных тканях и органах человека {>10 клеточных тканей от каждого индивида анализировалось с использованием трупных образцов различных сроков давности ). Аналогичные результаты были продемонстрированы для ряда других гипервариабельных проб ДНК другими авторами. Таким образом, открылась возможность индивидуального отождествления большинства биологических субстратов в криминалистике. Еще одно достоинство ДНК-генотипирования — способность точно устанавливать отцовство и материнство, что было ранее невозможно имеющимися биологическими методами.
Впервые внедрение ДНК-анализа в отечественной судебно-экспертной практике было осуществлено автором в уголовном-и
гражданском делах по установлению отцовства в 1987-1988 гг.
В период с 1988 по 1991 гг. вместе с группой судебно-медицинских экспертов (Институт Судебной Медицины МЗ СССР/России, Центр Криминалистики МВД СССР/России, Институт Медицинской Генетики РАМН), проходивших обучение в НЦПЗ РАМН под руководством автора , ДНК-генотипирование было успешно апробировано для десятков уголовных или граждански; дел, где требовалась идентификация личности или установление родства по образцам крови, спермы или трупным клеточным тканям.
Были проведены исследования стабильности ДНК в различных биологических образцах в условиях, моделирующих наиболее часто втречающиеся в экспертной практике. Проведены ДНК-экспертизы в сложных случаях: на старых образцах крови, эксгумированном трупном материале, смешанных биологических образцах от разных индивидов (например, спермы и крови или фето/плацентарном абортном материале).
Так как ряд повторов ДНК характеризуется также видовой или половой специфичностью, маркеры ДНК могут быть использованы для определения видовой и половой принадлежности материала. В качестве примера можно привести комплексную ДНК-идентификацию, проведенную в 1990 г. и доказывающую видовую, половую и индивидуальную принадлежность следов крови на ноже.
ДНК-генотипирование было также использовано для анализа ДНК животных в экспертной практике. Например, был разработан подход для выявления рестриктных фрагментов сателлитной ДНК (макросателлитов), встречающихся только в геноме лосей, но не встречающихся у других парнокопытных животных. С использованием этого подхода и гипервариабельной пробы ДНК ("Ыие"5.6 (ССТСТ)П)} была установлена видовая и индивидуальная идентичность тканей животного в случае, связанном с браконьерством.
II. Вариации метилирования гена амилоидного предшественника (АРР) в разных отделах мозга.
Дополнительным источником вариабельности генома является • метилирование Д НК. Принципиальной-особенностью
t kb
AB25
Hg Bg Eg
A168
A273
Mn
M,
n M,
l6
MPM3 мг
м„ V
r£
EXON 1
<4 U 6
- Neocortex
o
Cerebellum
•4 6
Other tissues
Рисунок 5, Вариабельность метилирования 5' —промоторной области амилоидного нейрогена (АРР) в неокортексё, в мозжечке головного мозга и других тканях.
.--вариабельности, вызываемой метилированием ДНК, является обратимый характер модификаций. Насколько нам было известно, до проведения данного исследования не было сообщений о существовании вариаций в характере метилирования генов в различных отделах мозга. Отделы неокортекса и мозжечок характеризуются разной чувствительностью к патологическим накоплениям амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера. В связи с этим мы попытались исследовать метилирование промотора амилоидного гена АРР в разных тканях и отделах мозга. Непосредственно — промоторная область АРР гена оказалась гнпометилированной без каких—либо отличий во всех сравниваемых отделах мозга и других клеточных тканей. Неожиданным результатом явилось обнаружение вариаций в метилировании 5'—участке от промоторной области в неокортексе и мозжечке. Различные участки коры головного мозга: базальные ядра, гиппокамп, другие отделы неокортекса и спинной мозг оказались гиперметшшрованы в одном из ССйв сайтов 5'—участка АРР гена (М2) (рис.5,6).
f- -et
£ W О
СМ cvj
Л л I
со I
с сс ссссс
Е г Е Е г Е Е 'Е Е £ осмоосмооооо
i— -f-СОт-т-СО'—
I I I I
I
I I I I I
roQ.toran¡Q-Q.'Q.njn>rao.a.Q.
а о. о. и <л а п а Uj L~> Х2ХХХ522ХХХ222
X X © о © ®
Г "tí
8 8
о о
<в
Г -с ооо
ООО ООО
О © О ф ш
X ч
© а>
•П С
о о
о о
о о
а> ш
и Е Е £ Е
8 25=2 ..
С а> © о> а> *о
О £> JO -О XI "Е
о 2 S £ 2 и
Ш 0> Ш Ф о
ZZZZZZZZ OÜOOO
Рис.6 Блот гибридизации А825 пробы ДНК с Mspl and 'Hpal гидролязатами ДНК неокортекса и мозжечка мозга человека.
В то же время этот сайт был, по существу, полностью свободен от метилирования в мозжечке и таламусе головного мозга. Анализ постмортальных образцов большого числа индивидов показал: данные различия в метилировании стабильны у взрослых людей и независимы от пола или возраста . Было сделано предположение, что механизм метилирования нейрогена и/или дёметилирования может осуществляться на поздних стадиях формирования центральной нервной системы. Вариабельный участок метилирования, как оказалось, содержит ряд регуляторных элементов и специфически связывается с ядерными экстрактами белков из клеток головного мозга (Rogaev et al, Genomics, 1993).
III. Сцепление генетического "локуса, ответственного за наследственный ладонно-подошвенный гиперкератоз (тилоз или Keratosis Palmaris et Plantaris Familiaris (KPPF))
KPPF является дерматологическим заболеванием, характерной особенностью которого является выраженный гиперкератоз ладоней и подошв ног, проявляющийся уже в первый год жизни. В некоторых случаях KPPF существует в ассоциации с врожденными морфологическими аномалиями или раковыми заболеваниями/
В данной работе была исследована большая родословная из Узбекистана, обнаруженная ранее Гинтером Е.К. с соавторами (Центр Медицинской Генетики, РАМН), в которой KPPF предположительно наследовался по аутосомно—доминантному типу и гистологически характеризовался гиперкератозом в отсутствии признаков эпидермблиза. Особенности фенотипа KPPF позволяли предполагать, что генетический дефект мог бы быть обусловлен мутациями в каком—либо из генов, вовлеченных в дифференцировку и рост эпидермальных клеток.'На основе этого предположения была отобрана серия хромосомных локусов-кандидатов для STR и VNTR анализа.
После исключения нескольких хромосомных локусов удалось обнаружить, что маркеры D17S250 и THRA1 из хромосомы 17q показывают предположительное сцепление с KPPF—дефектом (Z>3.7 при низких значениях 8). Чтобы подтвердить данный результат, дополнительные одиннадцать STR и VNTR маркёров, покрывающих хромосому 17, были использованы для
Рисунок 7. Сегрегация высокомолекулярного (CCG),, аллоля гена ktlO с KPPF. Эта аллель »стечется только у больных в данной родословной.
генотипирования в KPPF—родословной. В результате детального картирования было получено строгое доказательство, что KPPF дефектный ген находится на хромосоме 17ql2-q22 в минимальной, области 8сМ между THRA1 и D17S806 (рис. 7,8,9).
Ранее было известно, что локус 17qll—24 содержит несколько генов и псевдогенов (ktlO,12,13,14,15,16,17,19) -кератинов класса I (кислые кератины), которые, таким образом, являются очевидными генами—кандидатами для KPPF. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы исследовали инсерционно —делеционный полиморфизм в кодирующей области С—терминального домена ktlO. Популяционные аллельные частоты не были описаны ранее для данного участка. Это объяснялось сложностью PCR анализа 3' — участка ktlO гена, в связи с чрезвычайно высоким GC содержанием данного района. Мы разработали серию модификаций PCR анализа ktlO гена, котрый позволил с высокой надежностью генотипировать данный участок. Необычной особенностью оказалось то, что данный участок гена, кодирующий С-терминальную часть белка, оказался чрезвычайно вариабельным. Среди 96 проанализированных хромосом из европейских популяций было обнаружено не менее 12 аллелей с гетерозигогностью (Н) =81%. Природа гипервариабельности обусловлена, по всей видимости, "критическими" кластерами тринуклеотидных повторов, короткими (CCG)B трактами, 'перемежающимися "с GC-обогащенными участками ДНК. Анализ данного прлиморфизма в KPPF родословной позволил обнаружить, что чрезвычайно редкий высокомолекулярный аллель (CCG)n ktlO сегрегирует с KPPF дефектом (Z=f 8.36, 0=0.00). Таким образом, на основе полученных результатов можно предположить, что дефект в ktlO или других тесно-сцепленных генах кератинов или еще неохарактеризован— ных генов в 17q является причиной KPPF.
Более подробно анализ данного локуса изложен в нескольких научных публикациях (например, Rogaev Е., et al, Nature Genetics, 1993).
IV. Сцепление генетического локуса, ответственного за врожденную катаракту (Polymorphic Congenital Cataract (РСС))
Катаракта — главная причина слепоты у человека. К
настоящему времени описано множество наследственных форм-------------
^катаракт, как существующих в ассоциации с другими аномалиями, так и несиндромальные катаракты.
Хотя предполагаемое или строгое сцепление было описано для нескольких форм аутосомно —доминантных катаракт, до недавнего времени не удавалось обнаружить генов и мутаций, ответственных за несиндромальные формы катаракт.
Более 12 лет назад Гинтером Е.К. с соавторами были обнаружены большие семьи с врожденной формой катаракты в Туркменской популяции "нотурли". Уникальная родословная, включающая более 250 человек, в том числе 103 больных , была реконструирования и взята для- генотипирования в данном исследовании.
Особенностью катаракты в данной родословной являлась широкая вариабельность фенотипического проявления патологии даже среди больных, членов одной семьи. Катаракта отличалась от всех описанных до сих пор форм и была названа полиморфной врожденной катарактой (РСС). РСС относится к неядерным катарактам и более сходна с описанными зонулярными формами наследственной катаракты.
Около 24 —х STR и VNTR маркеров из различных хромосомных локусов, показавших отрицательные лод баллы, были исключены, пока один из STR маркеров, (GCG), на хромосоме 2q не показал намек на генетическое сцепление. (ТС) „-полиморфизм данного маркера (ген глюкагон, GCG) был обнаружен в наших собственных исследованиях (неопубликованные данные). Кластеры возможных генов —кандидатов, у — кристадлиновых генов, локализованны на том же плече хромосомы 1 (локус CRYG). В связи с этим была использована серия дополнительных STR маркеров для картирования данного локуса. До проведения данной работы точная физическая локализация кластера у — кристадлиновых генов была неизвестна. Мы впервые построили протяженный YAC—"контиг" (более 25 YAC—клонов), содержащий кластер у—кристаллиновых генов, РСС локус и серию STR маркеров.
В результате дополнительного генотипирования РСС родословной были обнаружены высокие позитивные лод баллы для STR маркеров, окружающих кластер у—кристаллинов в хромосомной области 2q33-35. Более тогог тринуклеотидный STR
28
ЬоСЦ5 0.00 0.001 0.05 0.10
01755 — со -3.34 -0.16 0.21
0175798 -СЮ -3.96 0.77 1.28
Ш75250 2.29 3.57 4.65 4.32
ТШ1А1 2.74 4.02 5.08 4.72
К«0 6.36 8.34 7.64 6.89
Б175800 7.25 7.24 6.57 5.87
Б175791 2.28 2.28 3.47 3.24
017806 -аг> 1.55 2.86 2.72
0175787 — оо 2.78 4.00 3.78
0175790 —СО -3.21 -0.05 0.30
017Б14 -СО -10.54 -1.09 0.21
Ьосив 0.00 0.01 0.05 0.10
АроВ -©о -33.83 -17.03 -10.00
ссс ■ -оо -2.03 0.10 0.85
023152 -оо -2.41 2.58 4.07
ътп 8.38 9.77 ' 9.50
02572 -оо 8.12 9.33 9.05
адап 10.62 10.45 9.72 8.75
ТОР! •оо 036 2.24 2.66
023128 -оо 3.59" 5Л6 5.59
0.20 0.30 0.40 л г /Ч 0
0.35 0.23 0.03 0.23 0.30
1.34 0.96 0.40 1.34 "0.20
3.28 2.05 0.78 4.67 0.04
3.63 2.33 0.93 5.11 0.03
5.30 3.57 1.74 8.36 0.00
4.39 2.84 1.23 7.25 0.00
2.46 1.56 0.63 3.48 0.04
2.06 1.22 0.40 2.86 0.05
2.93 1.88 0.78 4.00 0.05
0.38 0.26 0.11 0.38 0.20
0.94 0.84 0.39 0.94 0.20
А А
0.20 0.30 0.40 г 6
-3.76 -1.09 -0.03 -0.03 0.40
1.21 0.96 0.43 0.96 0.30
429 3.20 1.53 4.29 0.20
7.66 ' ' 5.07*' 2.19 9.79 0.06
738 5.12 2.56 9.34 0.06
6.61 4.22 1.68 10.62 0.00
2.42 1.74 0.82 2.66 0.10
5.02 3.67 1.91 . 5.59 0.10
Рисунок 8. Сцепление гиперкератоза КРРБ с 5ТК на хромосоме 17 (вверху) и катаракта (РСС) с ¡5ТЕ на хромосоме 2 (внизу).
Рисунок 9. Картирование генетических локусов КРРР (вверху) и РСС (внизу) методом мультилокусного сцепления.
маркер, локализованный непосредственно в интроне у-кристаллинового гена В, сегрегировал с РСС без наблюдаемых рекомбинаций с максимальным лод баллом Z= 10.62 (0=0) (рис.8,9). Так как кристаллиновые белки — главный компонент глазного хрусталика, весьма вероятно, что дефект в одном из активных генов у—кристаллинов (уА, уВ, уС или yD) или даже реактивация псевдогенов (уЕ и yF), локализованных в одном хромосомном кластере (2q33—35), может являться причиной РСС. В тоже время нельзя полностью исключить, что мутация в одном из неизвестных пока генов в том же локусе, тесно сцепленныым с уВ, может быть ответственна за РСС.
Подробно генетический анализ описан в ряде отечественных и зарубежных публикаций (см. Rogaev Е. et al, Hum. Mol.Gen., 1996). .
V. Обнаружение генов, ответственных за развитие ранней формы болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (БА) — широко распространенное дегенеративное заболевание центральной нервной системы, считается 4—й ведущей причиной смертности в развитых странах. Болезнь характеризуется прогрессивной деградацией памяти и интеллекта среди лиц среднего или пожилого возраста. Роль генетических факторов является существенной или превалирующей . в ранних формах болезни Альцгеймера (с началом развития от 30 до 60 лет).
К началу данной работы мутации (в экзонах 16 и 17 гена АРР) были обнаружены примерно в 3% семей с ранней формой болезни Альцгеймера (БА). Оставшиеся семьи представляли собой случаи с неясной генетической этиологией. На первом этапе мы предприняли поиск гипервариабельных БТР. в генах—кандидатах, кодирующих пептиды— компоненты амилоидных бляшек и нейрофибрилярных клубков. В результате было обнаружено два комплексных БТИ в 5' — участке гена легкой цепи нейрофиламента (ЫЕРЬ) и в интроне 1 АРР гена. Дальнейший анализ наследования £ГП1 аллелей в родословных показал что данные гены не сцеплены с большинством ранних форм болезни Альцгеймера. Чтобы
идентифицировать новые генетические локусы для БА мы предприняли (вместе с группой из Университета г.Торонто) скрининг хромосомных локусов с помощью STR маркеров в серии из 20—та родословных БА различного этнического происхождения (коллекция Университета г. Торонто). В результате в 1992 г. в нашем совместном исследовании был обнаружен участок на хромосоме 14q24, показывавший чрезвычайно высокий суммарный лод балл (>20 при низких значениях 0) для совокупности неродственных семей с ранней формой болезни Альцгеймера (FAD). Аналогичные данные на меньшей выборке семей были получены группой Шеленберга с соавторами из Университета г.Сиэтл.
Таким образом, стало ясно, что существует хромосомный локус в области 14q24.3, генетический дефект в котором ответственен за многие или большинство случаев ранних семейных форм болезни Альцгеймера (FAD). Несколько генов—кандидатов (например, c-fos ген), локализованных в данной области, были исключены прямым секвестрованием этих генов у больных из семей с БА, для которых был показан высокий лод балл с STR маркерами из 14q24.3.
В дальнейшем для выделения 14q24.3 гена была предпринята многостадийная стратегия .позиционнго клонирования.
На первой стадии мы построили физическую карту. Была сконструирована минимальная "контига" (100—1700 т.п.о. каждый клон) больших геномных фрагментов, состоящая из 23 YAC — клонов (от маркера D14S53 до D14S61). Данные маркеры показали, как минимум, по одному рекомбинационному событию по направлению к теломерной и центромерной областям от FAD14q24.3 локуса при анализе генетического сцепления семей с FAD. В дополнение, около 80-та космидных клонов (из библиотеки хромосомы-14; Los Alamos) было картировано в данной области. Несколько новых технических подходов (например, "missmatch priming" (ММР) метод или "amplification of restriction fragments" (ARF)) были разработаны для эффективной селекции и перекрывания YAC клонов в нужном хромосомном локусе (Rogaev Е. et al, in preparation).
"FISH" — in situ шбридизационный анализ, с использованием в качестве проб YAC клонов, показал, что минимальный размер картированной области около 5 Mb". Для того, чтобы сузить
минимальный интервал, был проведен дополнительный генетический анализ с набором STR маркеров для семей с FAD общего этнического происхождения. В результате такого анализа было обнаружено несколько редких общих аллелей для некоторых STR, сегрегирующих в итальянских и англо—саксонских семьях. Это позволило предположить, что две области, содержащие такие STR, с наибольшей вероятностью могут содержать и ген болезни Альцгеймёра. Данные области были условно обозначенных А и В.
Как следующий шаг, несколько стратегий было использовано для выделения генов из геномных регионов А и В: 1)экзон трэппинг; 2) скрининг CpG—островков, ассоциированных с 5' — участками генов; 3) выделение транскрибирующихся последовательностей прямой гибридизацией кДНК мозга с геномной ДНК YAC клонов, иммобилизованных на нейлоновых фильтрах. Последняя стратегия была наиболее эффективна. В результате ее применения около 800 транскриптов было выделено и картировано на "YAC -контиге" в области 14q24.3. Из этого набора около 150 кДНК клонов показали эволюционную консервативность и структуру, характерную для генов с экзон/интронной организацией. Данные клоны были использованы для второго раунда скринирования библиотек кДНК, чтобы выделить полноразмерные транскрипты генов. В конечном итоге были клонированы и частично секвенированы, по меньшей мере, двенадцать новых генов локализованных в области FAD14q24.3.
На следующем этапе все выделенные гены анализировались секвенированием в шести различных семьях FAD, показавших сцепление с I4q24.3. В результате такого анализа с использованием автоматического секвенатора ABI и програмного обеспечения для мутационного анализа "Фактура" и "Навигатор" (версия 1.01.Ы5) в одной из последовательностей с лабораторным наименованием S182 была обнаружена миссенс—мутация у всех больных FAD из большой семьи евреев Ашкенази, которая, в тоже время, не была найдена ни у одного из здоровых членов данной семьи или в контрольной группе здоровых людей старше 60—ти лет {>100 человек). Дальнейший анализ позволил обнаружить также шесть дополнительных миссенс—мутаций в семьях с БА различного этнического происхождения. Таким "образом, был сделан вывод о клонировании гена болезни Альцгеймера (S182), впоследствии получившего название "пресенилин 1" (PS—Ц.
Выделение гена пресенилина 2 (PS-2).
Копия полноразмерного транскрипта гена PS-1 (-2.8 т.п.о.) была клонирована и секвенирована. Не было обнаружено идентичных последовательных данных в GenBank/ EMBL к моменту, когда результаты были представлены для публикации. Однако, позднее, дополнительный компьютерный скрининг позволил обнаружить в данных GenBank новую короткую EST со значительной гомологией (60—70%) одному из участков PS-1 гена. Мы предпололсилп существование второго высокогомологичного гена пресенилина в геноме человека. Действительно, последующим скринированием библиотек кДНК мозга удалось выделить полноразмерные копии транскриптов (—2.4 т.п.о.) гомологичного гена (Е5-1), названного "пресенилин 2" (PS-2). Было установлено, что данный ген локализован на хромосоме lq. Логично было бы предположить, что мутации в гене PS-2, так же как и в PS-1, приводят к болезни Альцгеймера. Прямой секвенационный анализ кДНК, проведенный для многих случаев ранней формы БА, действительно позволил обнаружить две миссеис-мутации в PS-2 гене: в семье итальянского происхождения и у нескольких больных БА из семей Поволжских немцев, выходцев из России.
Геномная последовательность PS-1 гена и сравнительный анализ генов PS-1 и PS-2.
Полноразмерные транскрипты гена PS—1 были клонированы, секвенированы и тщательно охрактеризованы. Однако, для разработки массовых мутационных тест-систем на геномной ДНК, необходимо было также определить геномную структуру PS-1 гена и интронные последовательности, фланкирующие экзоны. Для этих целей были выделены четыре космиды размером (~20 — 40 т.п.о.) и два PI клона (-100—180 т.п.о.), содержащие ген S182 (PS-1). Затем, субфрагменты кДНК PS-1 и около 20—ти олигонуклеотидов из различных участков PS-1 гена были использованы в качестве гибридизационных проб для скринирования Pstl или BamHI плазмидных субклонов. Последовательности субклонов, после частичного или полного секвенирования с помощью автоматического секвенатора (ABI), сравнивались с кДНК PS — 1 для определения границ экзонов и иНтронов. В конечном итоге были
получены следующие результаты.
1) PS-1 занимает область не менее 50 kb и ориентирован от центромеры к теломере в участке хромосом 14о[24.3;
2) Ген состоит из 13—ти небольших экзонов. Интересной особенностью является присутствие 3-х экзонов в „ нетранслируемой 5' — области. Частичные или полные нуклеотидные последовательности всех интронов (600—3000 п.о.) были определены. ' _
3) Промоторная 5'—геномная область гена содержит CpG— островки, включая Notl—сайт и два альтернативных сайта инициации транскрипции.
4) Вариации транскриптов, выявляемые в RT—PCR анализе или в результате прямого секвенирования, обусловлены:
а) альтернативным сплайсингом экзонов в 5'—нетранслируемой области; б) необычным альтернативным донорным сайтом узнавания в 3'—участке экзона 4 (инсерция/делеция 12—ти нуклеотидов в двух видах транскриптов); в)альтернативным сплайсингом экзона 9; д)альтернативным сайтом полиаденилирования в 3'—участке PS-1. Необычной особенностью PS-1 гена является длинная 3' — нетранслируемая область в двух главных транскриптах, более 1 т.п.о. и более 6 т.п.о. соответственно, при длине открытой рамки считывания около 1.2 т.п.о..
Ген PS-2, по всей видимости, имеет сходную геномную структуру. В частности, был обнаружен сплайсинг той же последовательности PS-2, соответствующей экзону 9 в PS-1. Однако, в то время как для PS-2 гена этот сплайсинг был обнаружен в клетках мозга, для PS-1 - только в лейкоцитах крови. Оба гена пресенилинов имеют почти идентичную предполагаемую структуру белка. Структура напоминает трансмембранные белки с множественными гидрофобными доменами и большой гидрофильной петлей, варьирующей в размерах в результате сплайсинга в этой области. Интересно, что гомология между PSrl и PS-2, чрезвычайно высокая для гидрофобных участков (61—95%), является минимальной для гидрофильных последовательностей 1рис. 10). Несмотря на высокое структурное сходство, транскрипции PS-1 и PS-2 сильно различаются в различных тканях человека. Экспрессия PS—1 гена более активна во всех отделах головного мозга, нежели экспрессия PS-2. Кроме того, PS-1 ген экспрессируется почти эквивалентно в различных'тканях, в то
Рисунок 10. Предсказанная структура белков пресеннлинов РЗ-1 и РЗ-2. Показаы вариации гидрофильной петли в результате альтернативного сплайсинга. Показано также распределение мутаций, выявленных у больных БА.
время как PS-2 экспрессируется преимущественно в сердечной и скелетной мышцах, а также в поджелудочной железе.
Весьма вероятно, что PS-1 и PS-2 выпоняют сходную функцию трансмембранных белков, но имйот разную специфичность к внутриклеточным лигандам.
Более подробно результаты изложены в недавних публикацях: (Rogaev Е. et al, Neurology, 1993; Sherrington R.* & Rogaev E." (*— совместное первое авторство), et al, Nature, 1995; Rogaev E. et ai, Nature, 1995; Rogaev E. et al. Genomics, 1996, in press), а также в представлениях в GenBank/EMBL (более 30 последовательностей новых генов размерами от 600 до 3000 т.п.о.), совместно с Университетом г.Торонто.
Заключение и обсуждение.
На основании результатов многих работ за последние годы сформировалось представление, согласно которому главным источником гипервариабельности генома являются разнообразные семейства повторяющихся последовательностей ДНК с тандемной периодичностью в геноме. Одни из семейств тандемных повторов . организованы в протяженные макрокластеры центромерных и теломёрных повторов ДНК. Другие семейства мини и микроповторов ДНК диспергированы по хромосомным локусам, хотя отдельные семейства могут проявлять тенденцию к кластеризации на отдельных хромосомах (например, аро—повторы на хромосоме 19) или в некоторых хромосомных доменах (напримр, минисателлиты Джеффриса — в прителомерных районах). Очевидно, что данные семейства, объединённые по одному формальному критерию — тандемной периодичности, могут иметь совершенно разное происхождение и особенности эволюции в геноме. Например, оба описанных red—семейства родственны, но не идентичны семейству минисателлитов Джеффриса, имеющих различную длину повторяющейся единицы в разных кластерах, но ' общую "кор"—последовательность. Семейство tau—повторов ДНК длиной 22—24 п.о. имеет принципиально иную структуру, нежели •минисателлиты Джеффриса, характеризуясь высокой пурин— пиримидиновой ассиметрией комплиментарных нитей (5:1) и
внутренней периодичностью ((ТС)П, )С)П, (G)„) повторяющейся единицы.
Каково же происхождение и распространение миниповторов или простых тандемных повторов (STR) ДНК? В данной работе произвольным образом были отобраны простые сочетания нуклеотидов и на их основе сконструированы три —, тетра —, пента— и гексатанденмые повторы ДНК. Любопытным оказалось то, что использование такях произвольных проб позволило детектировать специфичные вариабельные профили рестрикционных фрагментов ДНК геномов человека и животных. Сходные результаты были получены (Vergnaud et al, 1991) при использовании в качестве проб синтетических полимеров более длинных повторов ДНК. Можно сделать предположение, что сходные кросс—гибридизующиеся простые тандемные повторы ДНК, встречающиеся в различных геномных локусах одного организма или в различных филогенетических группах, могут иметь независимое происхождение. Такие семейства простых повторов ДНК относятся, таким образом, к аналогичным, а не к гомологичным последовательностям ДНК.
Классификационная граница между микросателлитами (STR) и минисателлитами весьма условна. Так, мы обнаружили миниповтор ¡red) с наименьшей известной для минисателлитов длиной повторяющейся единицы — 7 —8 п.о., сходный в то же время с Chi сайтом Е. coli. Возможно, что некоторые простые сайты в минисателлитах, сходные с рекомбинационными участками бактерий (Chi) или ретровирусов (HIV I), могут стимулировать нестабильность и гипервариабельность в кластерах миниповторов. В процессе эволюции генома гомологичные кластеры миниповторов могут, видимо, возникать перемещениями копий повтора из одного ' локуса в другой (например, ano—повтор из ГВО в участок APOCII гена). Кластеры миниповторов могут также служить "горячими" точками инсерции и, возможное некоторых случаях, дуплицироваться в результате интеграции геномных ретропозонов (например, Alu— повтор в tau —кластере в участке R-RAS гена).
Высказывались также предположения , что присутствие нестабильных элементов в генах человека могло бы впрямую вести к патологии при некоторых наследственных болезнях.
Действительно, последующие исследования показали, что удлинение трактов вариабельных тринуклеотидных повторов ДНК
нейродегенеративных болезней, проявляющих феномен антиципации (ускорение начала болезни) в ряду поколений (например, обзор: P.Willems et al, 1994). Наблюдение антиципации в некоторых родословных с шизофренией и биполярным психозом позволяет'предположить, что подобный генетический механизм мог бы быть вовлечен также и в развитие этих распространенных психических болезней. В данной работе было продемонстрировано, что (CCG)0 и (CTG)n —пробы детектируют вариабельные профили геномной ДНК человека. Был предложен подход , который может быть полезен для прямой идентификации участков с удлиненными трактами простых повторов в неизвестных локусах.
Клонирование гипервариабельных элементов ДНК имеет и второй важный аспект — прикладной. Обнаружение маркеров ДНК, детектирующих полилокусную или полиаллельную структурную вариабельность генома, явилось принципиальным достижением для целого ряда биотехнологических и биомедицинских областей. Впервые были получены точные универсальные способы оценки генетической идентичности или родства любых сравниваемых биологических объектов. Во-первых, минисателлитные или микросателлитные участки ДНК с высокой гетерозиготностью (Н>80—90%) стали использоваться в качестве нового способа идентификации отцовства или личности по биологическим образцам различного происхождения. Вместе-с сотрудниками ряда медико—генетических и судебно-экспертных учреждений, стажировавшихся в лаборатории МГМ, на протяжении нескольких лет (1987 —1992гг.) проводилось внедрение ДНК—генотипирования в отечественную судебно-экспертную практику. При этом использовались как зарубежные зонды, так и маркеры ДНК, полученные в собственных исследованиях. Подобные работы проводились и некоторыми другими группами в нашей стране (Институт Молекулярнной Биологии, Институт Молекулярной Генетики и др.).
Гипервариабельные STR или VNTR маркеры с меньшей гетерозиготностью {Н=60—75%), к каким относится, к примеру, проба Red—5, могут быть особенно полезны для популяционных исследований человека.
Наконец, мировая коллекция STR ди —, три—, тетра— маркеров, детально картирующих в настоящее время все хромосомы человека, явилась чрезвычайно полезной для выявления
хромосомы человека, явилась чрезвычайно полезной для выявления генетических локусов, ответственных за наследственные заболевания с невыясненной этиологией. Использование таких маркеров, включая ряд STR выделенных в собственной работе, позволило нам впервые обнаружить хромосомные локусы, ответственные за такие наследственные заболевания как: ладонно— подошвенный гиперкератоз и полиморфная врожденная катаракта.
После того, как генетический локус детально картирован с помощью STR маркеров, можно провести поиск известных генов — кандидатов, локализованных в том же локусе или использовать стратегию позиционного клонирования для выделения неизвестного ранее гена, ответственного за наследственную патологию. Примером может служить выделение гена пресенилина 1, мутации в котором вызывают раннюю и наиболее агрессивнуую форму болезни Альцгеймера, и выделение высокогомологичного гена пресенилина 2, мутации в котором вызывают более редкую и менее агрессивную форму болезни Альцгеймера. Следует заметить, что позиционное клонирование не ориентируется на функциональные гипотезы о генах —кандидатах болезни. Тем самым, используя данную стратегию, можно обнаружить совершенно новые гены с неизвестными клеточными функциями. Действительно, семейство генов пресенилинов, предположительно кодирующих трансмембранные белки, не имеет-очевидной связи с ранее • известными молекулярно — биологическими моделями, предложенными для болезни Альцгеймера. Чрезвычайно интересным, в связи с этим, явилось недавнее клонирование генов С. elegans SEL12 и SPE4 — гомологов человеческих пресенилинов. Оказалось, что оба этих гена вовлечены в половое развитие червя (через Notch —систему (SEL12)) или сперматогенез (SPE4). Какова связь между подобными функциями гомологичных генов у С. elegans и дегенеративными изменениями центральной нервной системы при старении у человека, необходимо будет исследовать в трансгенных экспериментах мутантных пресенилинов как на позвоночных, так и на беспозвоночных моделях.
Еще одна заслуживающая внимание особенность — высокая эволюционная консервативность пресенилинов. На основе сравнения человеческих PS-1 и PS-2 с гомологичными генами мыши, крысы и некоторыми беспозвоночными (неопубликованные данные) можно сделать вывод, что большинство из аминокислотных1
позиций, измененных в результате мутаций у больных болезнью Альцгеймера, являются консервативными в эволюции как позвоночных, так и беспозвоночных. Следовательно, можно предположить, что пресенилины и мутантные сайты в них являются функционально важными не только в пострепродуктивный период (начало клинических симптомов БА), но и в более ранний период жизни.
ВЫВОДЫ
1. Обнаружены и охарактеризованы семейства гипервариабельных элементов генома человека, названные: tau-, apo-, Red-S и Red-M семействами миниповторов ДНК.
Установлен ряд особенностей их структурной организации и эволюции: агрегация кластеров некоторых семейств тандемных миниповторов в одних и тех же геномных участках; сходство с вариабельными участками генома ретровирусов (HIV— 1) и ■ встречаемость в виде прямых повторов на концах некоторых копий ретропозонов (SINE).
2. Разработано несколько стратегий конструирования гипервариабельных маркеров для детекции ДНК-фингерпринтов человека и животных, и получены эффективные мультилокусные пробы ДНК для анализа родства или индивидуальных идентификаций.
3. Гипервариабельные маркеры ДНК были внедрены в ряд судебно-экспертных тестирований и медико—генетические исследования для сцепления генетических локусов наследственных болезней.
4. Методом генетического сцепления впервые обнаружен локус на хромосоме 17, ответственный за редкое кожное заболевание человека — тилоз (Keratosis Palmaris et Plantaris Familaris (KPPF)). На основе детального генетического картирования и анализа гипервариабельного участка гена ktlO
/
предположено, что мутации в гене или генах кислых кератинов, кластеризованных на 17q21-24 .могут являться причиной данного заболевания.
6. Методом генетического сцепления впервые обнаружен локус на хромосоме 2, ответственный за врожденную полиморфную катаракту человека (Polymorphic Congenital Cataract (РСС)). На основе детального генетического и физического картирования установлено, что генетический дефект локализован в локусе 2q33 —35, содержащем кластер у — кристаллиновых генов .
7. Обнаружено существование вариабельности в метилировании эндогенной последовательности ДНК, в гене АРР, в различных отделах головного мозга человека.
8. Выявлено и охарактеризовано новое семейство генов — пресенилинов , локализованных на хромосоме 14 (PS — 1 ген) и на хромосоме 1 (PS—2 ген), миссенс—мутации в которых ведут к ранней форме болезни Альцгеймера.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Научные статьи.
1. Rogaev E.I. Two novel tandem DNA repeat families from the hypervariable DNA probe homologous to human apolipoprotein СП— gene intron and Dr.Virilis satellite. Nucleic Acids'Research, 1989, V. 17, P. 1246.
1. Рогаев Е.И., Шапиро ЮА, Высокий межиндивидуальный полиморфизм по длине и копийности рестрикционных фрагментов TVRI — умеренных повторов ДНК человека. Бюлл.экспериментальной биологии и медицины, 1987, январь, Nsl, с.57—58.
3. Рогаев Е.И. Структура геномного фрагмента, содержащего нестабильные элементы ДНК человека. Док. Академии Наук, СССР, 1988, т.302, N1, стр.324—328.
4. Рогаев Е.И., Шапиро ЮЛ., Плазмида pTVRI —6 для идентификации межиндивидуального полиморфизма ДНК человека и метод выделения этой плазмиды. Ж.'Бюлл.Пат., СССР,N9, 1989, стр.1-10.
5. Рогаев Е.И., Ветчинкина АЛ. Юров Ю.Б. Видо—специфичный вариант прицентромерных повторов ДНК человека: локализация на 18—й хромосоме и недавняя амплификация в предковой линяя человека. Мал. Генетика, Михобиология и Вирусология, 1989, №4, стр.10—14.
6. Рогаев ЕИ., Шленосий А.Б. Геномные элементы HIV—1 вируса из
вариабельной части envelope гена выявляют сходные гипервариабельные области в геноме человека. Бюлл. Экспер. Биологии и Медицины, 1990, т.110, стр. 1712-1714.
7. Рогаев Е.И., Шленский АБ. Бактериофаг FD103 детектирует гипервариабельные области в геноме человека. Бюлл. Экспер. Биол. и Медицины. 1990, №11, стр.525.
8. Rogaev EI., Korovaitseva G.I., Sirokvasheva E.Yu„ Spoonde A.Ya„ Shlensky A.B. Artificial tetramer—nucleotide repetitive DNA—probe for universal intra— and interspecies genotyping. Fingerprint News (Cambridge), 1991, Vol3(3), p.ll.
9. Rogaev EL, Korovaitseva G.L, Shlensky A.B. Artificial
hexamer—nucleotide repetitive DNA—probe for universal genotyping. Fingerprint News (Cambridge), 1991, Vol3(3), p. 12.
" 10. Rogaev EI., Korovaitseva G.L, Shlensky A.B. Artificial pentamer— nucleotide repetitive DNA— probe for universal genotyping. Fingerprint News (Cambridge), 1991, Vol3(3), p. 13.
11. Rogaev EI., Shlensky A.B. DNA probe containing retroviral repeated elements for universa) human and animal individual identifications. Fingerprint News (Cambridge), 1991, VoI.3(3), p. 14.
12. Rogaev EI. Simple human DNA—repeats associated with genomic hypervariability, flanking the genomic retroposons and similar to retroviral sites. Nucleic Acids Research, 1990, V.18, N7,p.l879-188S.
13. Rogaev EI., Shlensky A.B. A genomic DNA—probe FD 103 probe is sensitive marker for detection of human hypervariable regions. Nucleic Acids Research, 1990, V.18, N4, 'p. 1881. ' . ~ , .
14. Rogaev EI., Korovaitseva G., Lukianov E„ „Rjabchenko L FD103.DNA-probe identifies bacterial genotypes: Salmonella, ¡Shigella and E.coli strains. Fingerprints News (Cambridge), 1991, Vol.3(3), p.15.
15.Rogaev EI., Shlensky A.B. and Spoonde AYa. Individual— specific patterns of human variable genomic regions detected by a DNA probe from the HIV—I env gene. Biomedical Science, 1991, 2, p.311-314.
16. Рогаев Ей., Юров Ю.Б. Межиндивидуальный пшерполиморфизм аутосомных сателлитов Ш ДНК человека Генетика, 1991, т.26, стр. 1532 — 1535
17. Гинтер Е.К., Петрин АН., Спицын В А., Рогаев ЕИ. Анализ локализации гена врожденной катаракты с помощью анализа сцепления, Генетика, 1991, т.27, стр.1840-1849.
18. Рогаев ЕИ., Сыроквашева ЕЕ, Пименов М.Г., Стегнова Т. ДНК— генотипоскопия человека: видовая, половая, индивидуальная идентификации по генетическим "ДНК—отпечаткам" в случае, связанном с попыткой убийства, Судебно-медицинская экспертиза,1992, т.35, стр.10—14.
19. Якимов М., Рогожин И., Коровайцева Г., Рогаев Е Тп—мутагенез для сгерин—разлагающих штаммов Pseudomonas. Биохимия и Микробиология, 1994, т.30, cmpSS—63 , .
20. Гинтер ЕК., Рогаев ЕИ., Коровайцева Г.И. Дальнейший анализ
локализации гена доминантной врожденной нохурской катаракты. Генетика, 1993, т.29, №4, стр.670-673.
21. Rogaev H.I., Keryanov S.A. & Malyako Yu.K. Dinucleotide repeat polymorphism at the SLP1, HBE1 and MYH7. Hum.Mol.GeneL, 1992, v.!, №4.
22 . Rogaev E.I.,. Keryanov S.A. Unusual variability of the complex dinucleotide repeat block in SPN locus, Hum.Mol.Genet., 1992. v.l, N°4.
23, Стегнова T.B., Рогаев Е.И., Ионесян С., Сыроквашева Е., Пименов М.Исследование крови человека мродом геттстятюскоиии (геномной дактилоскопии). Методтгтсскис рекомендации, МВД СССР, Москва, 1991.
24. Rogaev E.I., Rogaeva Е., Lukiw W„ Vaula G., Yan L, Hancock R., Maclachan D.G., St. George— Hyslop P. An Informative Microsatellite repeat polymorphism in the human Neurofilament Light Polypeptide (NEFL) gene. Human Molecular Genetics, 1992, I, p.781.
25. Tupler R., Rogaeva E„ Vaula G„ Mortilla M., Lukiw W„ Yan L., Hancock R., Rogaev E.I. and St.George—Hyslop P. A Highly Informative Microsatellite repeat polymorphism at the intron 1 of the human Amyloid Precursor Protein (App) gene. Human Molecular Genetics, 1993, 2, N5, p.620.
26. Lukiw W., Rogaev E., Wong 1., Vaula G., Mclachan D R., St. George — Hyslop P. Protein DNA interactions at the 5' promoter of the Amyloid Precursor Protein (APP) .in human neocortex. Molecular Brain Res., 1994, 22, p. ¡21—131.
27. Wong L., Liang L., Tsuda T.,Fong Q., Galway G., Alexandrova N., Rogaeva E., Lukiw V/., Smith J., Rogaev E., Crapper Mclachlan D., St. George — Hyslop P. Mutation of the gene for the human lysosomal serine protease Cathepsin G is not the cause of aberrant APP processing in familial Alzheimer disease. Neuroscience Letter, 1993, 152, p.96-98.
28. St.George- Hyslop P., Haines J.L., Rogaev E.I., Mortilla M„ Vaula G„ • Pericak—Vance M., Foncin J.F., Montesi M., Bruni A., Sorbi S., Rainero 1., Pinessi L, Pollen D., Polinsky R., Nee L., Kennedy J., Macciardi, Rogaeva E., Liang Y., Alexandrova N„ Lukiw W., Schlumf K., Tanzi R., Tzuda Т., Faner L, Cantu J.M., Duara R., Amaducci L., Bergamini L„ Gusella J., Roses A., Mclachlan D.C. Genetic evidence for a novel familial .Alzheimer's disease locus on chromosome 14. Nature genetics, 1992, 2, p.330-334.
29. Рогаев Е.И. Сверхизменчивая ДНК. Природа, 1992, №3, стр.22— 30.
30. St. George— Hyslop P., Mclachlan C.D.R., Haines J.L., Bruni A., Foncin J.-F., Lukiw W„ Montesi M.P., Mortilla M., Pinessi L, Polinsky R.L., Pollen D., Rainero I., Rogaev E.r Sorbi S., Tanzi R., Tupler R. and Vaula G. Molecular genetic evidence for etiologic heterogeneity of Alzheimer's disease. In book: Heterogeneity of Alzheimer's Disease. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, F. Boiler et al. (Eds.], 1992, 88-95.
31. Рогаев Е.И., ГОров Ю.Б., Яковлев А.Я., Молекулярная генетика мозга, Вест. Академии Наук, (Вест. Российской Академии Медицинской Науки), 1992, 8, стр. 11-16.
32. Соловьёв И.В., Рогаев ЕИ., Юров Ю.Б. In situ гибридизация клонированных в космидах последовательностей ДНК хромосомы 21 и их идентификация в интерфазных и метафазных клетках. Сборник статей по
человека и патология", Тонек, 102—103.
33. Юров Ю.Б., Миткевич С., Александров И. и Рогаев ЕИ..ДНК диагностика наследственных болезней к.генотипирование в судебных исследованиях с использованием рекомбинантных ДНЮ коллекция ДНК зондов для биомедицинских исследований. Мин. Здравоохранения, СССР, Москва, 1988, стр.1-8.
34. Rogaev EI., Lukiw W., Vaula G., Haines J.L, Rogaeva E.A., Tsuda Т., Alexandrova N., Uang Y., Mortilla M., Amaducci L., Bergamini L, Brum AC., Foncih J—F., Maccardi F., Montesi M.P., Sorbi S., Rainero I., Pinessi L, Polinsky R.L., Pollen D„ Mclachlan D.C., SI. George—Hyslop P. Analysis of the cFos gene on chr 14 and its relationships to the 5' promoter of the Amyloid precursor Protein (APP) gene on chr 21 An familial Alzheimer's disease. Neurology, 1993, 43, p.2275— 2279. . . .
35. Рога ев ЕИ., Коровайцева Г.И., Гинтер E.K., Прьггков А и др. Поиск локуса аутосомно—доминантного гиперкератоза. Генетика , 1993, 29, Ns2, стр. 152-157.
36. Бочков Н., Рогаев Е, Моляка Ю., Шленский А, Асанов А. Детекция генетических, мутаций в гипервариабельных областях ДНК человека для генетического мониторинга, Доклады Российской Академии Наук, 1993, 329, 785-786.
37. Рогаес Е., Рогаева Е., Гинтер Е., Коровайцева Г., Фаррер Л, Джорж — Хислоп П., Мордовцев В. Картирование доминантного гена ладонно— подощвенного тилоза на хромосоме 17ql2—24. Генетика, 1994, 30, 326—329.
38. Vicente А.М., St.George-Hyslop P., Macciardi F.M., Sorbi S., Mortilla M„ Rogaev E, Heggart D.M., Kennedy 1L. Evaluation of APP codon 713 in schizophrenia and Alzheimer's disease. Psychiatric Genetics, 1993, 3, 223-225.
■■ 39.- T. Tstida, R. Lopez, M.Freedman, EA. Rogaeva, ERogaev, D.Diacham, D.Pollen, R.Duara, P.St George—Hyslop. Are the associations between Alzheimer Disease and polymorphisms in the ApoE and ApoCII genes due to linkage disequilibrium? Annals of Neurology, 1994, 36, 97-100.
40. St George-Hyslop P., Rogaeva E, Hutterer Tsuda Т., Santos J., Haines J.L, Rogaev EI., Liang Y., Crapper Mclachlan D.R., Weissenbach J., Cox D.W., Lang A, Werrett J.R.. Machado—Joseph disease in pedigrees of Azorean descent is linked to chromosome 14. Am. J. Hum. Genet, 1994, V.55, 120—125.
41. Rogaev EI., Rogaeva E.A., Ginter E.K., Korovaitseva G.L, Farrer LA, Shleasky A, Pritkov AN., Mordovtsev V.N., St George—Hyslop P. Identification of the genetic locus for Keratosis Palmaris et Plantaris on chromosome 17 near the RARA and Keratin type I genes. Nature genetics, 1993, V.5, 158-162 .
42. Rogaev EI., Lukiw WJ„ Lavrushina O., St George—Hyslop P. The upstream promoter region of the Amyloid Precursor Protein gene shows differential patterns of methylation in human brain. Genomics, 1994, 22, 340—347.
43. St George-Hyslop P., Crapper McLachlan D„ Tsuda Т., Rogaev E, Karlinsky H., lippa C.F., Pollen D. Alzheimer's disease and possible gene interaction. Science, ¡994, 263, 53.
44. Рогаев ЕИ., Овчинников И.В., Шленский АБ., Моляка Ю.К.,
i
44. Рогаев Е.И., Овчинников И.В., Шленский А.Б., Моляка Ю.К., Анализ отцовства: оценка различных методов ДНК—тестов для доказательства и исключения отцовства, Генетика, в печати.
45. Perepechina I.O. & Rogaev EI. Human sex determination using repeated arid unique genomic DNA sequences, submitted.
43, Tamaoka A., Fraser P., Ishii K„ Sahara N., Rommens J., Rogaev E., Pollen D., Farrer L„ St. George — Hyslop P. and Mori H. Incresed long isoiorm of amiloid—beta protein in brain of subjects with, presenilin I mutations and Alzheimer's disease, submitted.
47. Takiyarna Y., igarashi S., Rogaev?. E. , Endo K. E.I. Rogaev, H.Tanaka, R.Sherrington, K.Sanpei K., Y. Liang , M. Saito , T. Tsuda , H. Takano, M.Ikeda, C. Lin, H.Chi, J. Kennedy, A_Lang, J.R. Wherrett, M.Segawa, Y.Nomura, T. Yussa, J. Wissenbach, M.Yoshida, M.Nishizawa, K.K. Kidd, S.Tsuji, P. St. George-Hyslop. Evidence for inter—generational instability of the CAG repeat in the MJD1 gene and for conserved haplotypes at flanking markers amongst Japanese and Caucasian subjects with Machado— Joseph Disease. Hum. Molec. Genetics, 1995, V.4, 1137— 1146.
48. Рогаев Е.И., Рогаева E.A. и П.Джорж—Хислоп. Прямое выделение локусов с патологически удлиненными тршгуклеотидными повторами с
антисипацией. Генетика, 1995, т.31, стр.578—582.
49. AIlsop R., Chang Е., Kashefi — Aazam, E.I. Rogaev and С.В. Harley. Telomer shortening is associated with ceil division in vitro and in viva. Experimental Cell Research, 1995, V. 220, POOO-OOO.
50. Sherrington R. and ++Rogaev E.I. (sharing first co-authorship:_
CPBtributed_eqyally)., Liang Y„ Rogaeva E.A., Levesque G., Ikeda M., Chi H„ Lin C.,
. Li G., Holman K., Tsuda Т., Mar L, Forcin J.F., Brum A.C., Montesi М.Р.,- Sorbi S., Rainero I., Pinessi L., Nee L., Chumakov !., Pollen D., Brookes A., Sanseau P., Pollinsky R.L, Wasco W., Da Silva H.A., Haines J.L, Pericak —Vance MA., Tanzi R.E., Roses A., Frazer P., Rommens J., St. George — Hyslop P. Cloning of a gene bearing missense mutations in early—onset familial Alzheimer's disease. Nature (London), 1995, V.375, 754-760.
51. Sorbi S., Nacmias В., Forleo P., Piacentini S., Sherrington R., Rogaev E., St. George — Hyslop P., Amaducci L Missense mutation of SI82 gene in Italian families with erly—onset Alzheimer's disease. Lancet, 1995, August 12, 439—440 (Letter).
52. Tsuda Т., Chi H„ Liang Y„ Rogaeva E., Sherrington R., Levesque G., Ikeda M., Rogaev E., Pollen D., Freedman M.t Duara R., St. George—Hyslop P. Failure to detect missense mutations in the S182 gene in a series of late —onset Alzheimer's disease cases. Neumscience Letters, 1995, 201, 188—190.
53. Rogaev E.I., Sherrington R., Rogaeva E., Ikeda M., Levesque G., Liang Y., Chi H„ Lin C., Holman K., Tsuda Т., Mar L, Sorbi S„ Nacmias В., Piacentini S., Amaducci L, Chumakov L, Cohen D., Lannfelt L, Fraser P., Rommens J., St. George—Hyslop P. Familial Alzheimer's disease in kindreds with missense , mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer's disease type 3
. gene. Nature (London), 1995, V.376, '775-778.
55. Rogaev EI.. Sirokvasheva E, Korovaitseva G., Stegnova T. Species Specific DNA Prints and DNA Genotyping in Animal Foiensic Science, submitted.
56. Trower M., Ould S., Purvis I., Sanseau P., Riley J., Christodolou C„ Burt -D., See C„ Elgar G„ Rogaev E, Sherrington R., St George - Hyslop P., Brenner S.,
Dykes C. Conservation of synteny between the genome of the Pufferfish (FUGU rubripes) and the region on the Human Chromosome 14 (14q24.3) associated with familial Alzheimer's disease, Proc. Nat. Ac.Sc., ¡996, 9, in press.
57. Rogaev EI. and Pimenov M.G. Forensic exclusion and evidence of paternity by DNA— typing of heterogeneous fetus—placental tissue in rape case, submitted.
58. Shlensky A.B. and Rogaev EI. Human Immunodeficiency Virus Minisatellite — mimic hypervariable DNA elements in human genome, submitted.
59. Rogaev EI., Rogaeva E.A., Korovaitseva G.I.,- Farrer L, Petrin A., Keryanov S., Turaeva S., Chumakov I., St George—Hyslop P., Ginter E. Linkage of polymorphic congenital cataract to the gamma crystallin gene locus on human chromosome 2q33-35, Hum. Moi. Genet., 1996, V.5, 699-703.
60. Rogaev EI., Sherrington R., Rogaeva E„ Ikeda M., Levesque G., Lin C., Holman K., Jong P., Rommens J., St. George— Hyslop P. Genomic structure, 5'— promoter region and splicing of Presenilin 1 (PS—1 gene). Genomics, 1996, in press.
Тезисы
' 61. Рогаев Е.И. Высоконестабильная последовательность генома TVR1—6 имеет область, сходную с участками ДНК, ответственными за генетические перестройки в прокариотических системах. Доклады конференции: Генетика и . биохимия микроорганизмов, 1986 г. . .. -. -
62. Рогаев ЕИ., Шагшро ЮА Высокий межиндивидуальный полиморфизм по распределению в геноме человека членов семейства консервативных повторов ДНК. Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции по генетике соматических клеток в культуре. Москва, 1986, с.36—38.
63. Рогаев ЕИ. Конструирование и анализ библиотеки быстроренатурирующей фракции генома человека. Тезисы докладов 9—й конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений", Рига, 1987, стр. 73.
64. Rogaev Е, Shapiro Yu. A high interindividual restriction fragment lenght and copy polymorphism of TVRI—6 family moderate human DNA repetitions. J.Biochemictry Abstracts, 1988, v. 17, p.10.
65. Рогаев ЕИ., Шапиро Ю.Б. Индивидуальное распределениее рестриктов ДНК, гомологичных клонированному геномному сегменту. Тезисы докладов на конференции "Генетические маркеры в антропогенетике и медицине", г.Хмельницкий, 1988, стр.276.
66. Рогаев ЕИ. Гипервариабельные элементы генома человека и их использование в генетических идентификациях. "Структура и. функции биополимеров", гЛьвов,' 1988, с. 51.
6?. Рогаев Е.И., Ветчинкина АЛ.. Юров Ю.Б. Повторяющиеся последовательности ДНК человека, амплифидиругощиеся в эволюции приматов. "Структура и функции биополимеров", г.Львов, ¡988, с.52.
68. Rogaev EI. Hypervariable DNA elements in human genome: medical and criminalogical application. 21st International Symposium on Cytogenetics Book, Prague, 1988.
69. Yurov Yu.B., Yakovlev A.G., AJexandrov A.L, Mitkevich S.P., Rogaev EI. Collection of alpha—satellite DNA—probes: highly polymorphic markers for centromeric regions of all human chromosomes. Cytogenetic and Cell Genetic, 1989, V.51, p.1114 (HGM10).
70. Yurov Yu.B., Yakovlev A.G., Vorsanova S.G., Rogaev EI., Mazura I., Sram R., Vartanian M.E. Identification and characterization of two distinct polymorphic alpha—satellite DNA sequences from centromeric regions of the chromosomes 13 and 21. Cytogenetic and Cell Genetic, 1989, V.51, p.U14 (HGM10):
71. Yurov Yu.B., Rogaev EI., Alexandrov I.A., Mitkevich S.P., Kroumine A.R., Vorsanova S.G. Highly polymorphic "classical" satellite DNA—probes and their potential for muitiiocus linkage analysis. Cytogenetic and Cell Genetic, V.51, ¡989, p. 1012 (HGM10).
72. Rogaev EI. The unique DNA —probe reveals DNA length polymorphism. Cytogenetic and Cell Genetic, 1989, V.51, p.1068 (HGMiO).
73. Rogaev EI., Shlensky A.B., Shapiro Yu.A. The human genomic probe containing families of simple DNA —repeats for identification of multiple hypervariable restriction fragments. Cytogenetic and Cell Genetic, 1989, v.51,
p. 1068-1069 (HGM10).
74. Rogaev E.I., Yurov Yu.B. Highly specific DNA —marker on pericentromeric region of chromosome 18. Cytogenetics and Cell Genetics, 1989, V.51 (HGM10), p. 1069.
75. Rogaev E.I, Korovaitseva G.I., Shlensky A.B. Hypervariable DNA markers for linkage analysis and study of methylation of chromosomal loci in mental disorders. Biol. Psychiatry, 1991, V.29, p.666.
76. Rogaev EI., Korovaitseva G.I., Barisheva E., Ginter E.K. DNA— genotyping of cataract enriched Middle Asia isolate. Amer. J. Hum. Genet., 1991, V.49 ( supplement), p.345.
77. Rogaev E.I., Sirokvasheva E., Pimenov M., Stegnova T.V. DNA genotyping: assortment and reliability of DNA— tests in forensic practice. Am J. Hum.Genet., 1991, V.49 (supplement), p.205
78. Rogaev E.I., Shlensky A.B. Human genome contains hypervariable elements similar to the variable sites of HIV1 — retroviral genes: genetic markers and genomic organization. Am J. Hum. Genet., 1991, V.49 (supplement), p.387.
79. Rogaev EL, Shlensky A.B. Walking on chromosomes and genomic domains for variable micro—, mini—,' and macro— repeats. Cytogenetics and Cell Genetics, (HGMJ1), 1991, V.58, p.2142~ 2143.
80. Rogaev EL, Korovaitseva G., Barisheva E., Ginter EK. Data for heterogeneity of zonular forms of cataract Exclusion of ethnic cataract locus for lq21 —23 and other chromosome "candidates" loci. Cytogenetics and Cell Genetics,
(HGMÍ1), 1991, V.58, p.2118.
81. Rogaev EI., Korovaitseva G.I., Shlensky A.B. Human Genotypescopy: human specific, sex, paternity and individual identification by tandem repeats in forensic practice. DNA Fingerprinting, First International Conlerence, Bern, 1990, p.43 " .....
82. Rogaev EI., Korovaitseva G.I., Trubnikov V., Barisheva E.I., Gihter E.K. Application of VNTR markers for linkage analysis of schizophrenia and cataract. DNA Fingerprinting, First International Conference, Bern, 1990, p.47
83. Rogaev E.I., Korovaitseva G.I., Spoonde AY., Shlensky A.B. Universal Hypervariable Multiloci DNA markers. DNA fingerprinting, First International Conference, Bern, 1990, p.47
■ 84. Rogaev EI., Korovaitseva G.I.. Lukyanov E. Genotyping of Enterobácteria by DNA profiling. DNA fingerprinting, First International Conference, Bern, 1990, p.48
85. Rogaev EI., Shlensky A.B. Genotyping of mutable lines of rodents by DNA fingerprinting. DNA fingerprinting, First International Conference, Bern, 1990, p.52 .
86. Rogaev EI., Shlensky A.B. Aggregation of two unrelated hypervariable families of tandem repeats in genomic loci. DNA fingerprinting, First International Conference, Bern, 1990, p.52
87. Shlensky A.B., Rogaev EI. Polymorphic DNA probe from chromosome 21 containing genomic elements homologous to HIV—I and telomeric simple repeats. Abstracts of European Society Human Genetics (ESHG) 24th annual meeting, 1992, p. 137.
88. Rogaev E.I., Keryanov S., Solpvyev I., Korovaitseva G. (TC)n is a second abundant type of hypervariable dinucleotide micro—elements in human genome. Abstracts of ESHG 24th annual meeting, 1992, p.132
89. Yurov Y.B., Soloviev I.V., Rogaev EL, Vorsanova S.G. In situ hybridization of chromosome 21 specific cosmid clones. Abstracts of ESHG 24th annual meeting, 1992, p. 157
90. Korovaitseva G., Sirokvasheva E, Schlensky A., Rogaev E. DNA probe for DNA fingerprinting of domestic and wild ungulates; application in forensic science. DNA Fingerprinting, Second International Conference, Belo— Horizonte, ¡992, p:37.
91. Rogaev E, Pimenov M., Ovchinnicov I., Perepechina I., Sirokvasheva E., Shlensky A., Korovaitseva, Stegnova Т. DNA sex and paternity testing of tissue remains in criminal forensic cases. DNA Fingerprinting, Second International Conference, Belo- Horizonte, 1992, p.18.
92. Shlensky A., Alyabov Y„ Lavrushina O., Rogaev E Human HIV-1 minirepeat - like families of hypervariable elements in the human genome: individual DNA fingerprints and monitoring of a germline and somatic mutations. DNA Fingerprinting, Second International Conference, Belo- Horizonte, 1992, р.б
93. Rogaev EL, St. George—Hyslop P., Tupler R., Rogaeva E., Mortilla M„ Vaula G., Korovaitseva G., Karpova N., Alyabcw Y., Lukiw W. The utility of genomic variability for genetic analysis of complex inherited diseases. DNA Fingerprinting, Second International Conference, Belo— Horizonte, 1992, p.I3
94. Rogaev E.I., Kerianov S.A., St.George —Hyslop P., Milshina N., Malyako Y., Korovaitseva G., Lukiw W., Shlensky A.B. Distribution of Dinucleotide Repeat (DR) Families in taxon genojnes and DR compounds with unusual polymorphisms. DNA Fingerprinting, Second International Conference, Belo— Horizonte, 1992, p.9.
95. St George Hyslop P, Rogaev E.I., Alexandrova N., Lukiw W„ Liang Y., McLachlan D.R.C., Vaula G., Rainera I., Pinessi L., Bergamini L., Mortilla M., Sorbi S., Amaducci L, Polinsky R., Foncin J-F„ Bruni A., Mantissa M., Pericak —Vance M., Roses A.D., Haines J. Linkage of an Familial Alzheimer Disease iocus to chromosome 14. American Academy of Neurology, 45th Annual Meeting, 1993, Neurology.
95. Lukiw w.J., IîogaevE.1., Wong L„ Vaula G.-, McLachian D.R.c. anci si George — Hyslop P. Protein— DNA interactions in the promoter region of the amyloid precursor protein (APP) gene in the human neocortex. Southern Ontario Neuroscience Association, 13th Annual Meeting, 1993, p.3.
97. Rogaev E.I., Rogaeva E.A., Ginter E.K., Korovaitseva G., St George— Hyslop. Identification of genetic defect locus for palmoplantar Keratosis skin disease on 17ql2—24 and association with keratin 10 variable allele. The Clinical Research Society of Toronto, Annual Meeting, 1993, p.32.
98. Ovchinnikov I.V. and Rogaev EX. PCR typing of STR with compound dinucleotide blocks. Abstracts of 25th Annual Meeting of European Society of Human genetics. Sarselona, p.82
99. Rogaev EI., Lukiw W., Rogaeva E., Lavrushina O., McLacachlan, St. George — Hyslop P. Modifications of the upstream promoter region of the amyloid precursor protein (APP) gene in human brain. ASMB symposium, Epigenetic Modifications of the Genome. Keystone, Colorado, 1993.
,100. Rogaev EI.,.Lukiw WJ., Rogaeva'E.A., Tsuda T., Yan L, Rommens J., Chumakov L, St George— Hyslop P. Mapping and searching candidate genes for sporadic and familial Alzheimer's disease World Congress of Psychiatric Genetics, New Orlean, 1993.
101. Rogaev EX., Lukiw W.J., Chumakov I., Rogaeva E.A., St George — Hyslop P. Genomic analysis of Alzheimer disease. Genomic Fingerprinting Workshop, Madrid, 1993
102. Rogaev EL, Kerianov SA, Milshina N„ St.Geofge-Hyslop P., Malyako Y., Korovaitseva G., Lukiw W., Rogaeva E. Expansion of primitive repetitive DNA elements in genomes and utility for genotyping of eukaryotes and prokaryotes. Genomic Fingerprinting Workshop, Madrid, 1993.
103. Belev N„ Alyabov Y., Samotiya E„ Garkavtseva R. and Rogaev E Modifications of telomeric and peritelomeric chromosomal regions in tumours and normal tissues. 19th Congress of European Society of Medical Oncology, 1994.
104. Chang E., Harley C. B. and Rogaev EI. Telomere length as a biomarker for cellular aging: lack of loss in non—dividing cells and tissues. GSA Meeting, 1994.
105. Rogaev E., Lukiw W, Lavrushina O. and St George —Hyslop P.
• Differential pattern methylation of Amyloid precursor protein gene promoter in
• brain regions. Clinical Research Society of Toronto, 1994.
106. Lukiw W., Wong L, Rogaev E, St George—Hyslop P., Bazan N. and Mclachlan D.R.C. HI — DNA interaction in the proximal-promoter of the human neurofilament light {KNF—L) chain gene. The Cytoskeleton in Alzheimer's Disc:? , Rochester, 1994.
107. Rogaeva E., Korovaitseva G., St. George—Hyslop P. and Rogaev E. DNA profiling of extended tracts of primitive DNA repeats: direct identification of unstable simple repeat loci in complex genome. The American Society of Human Genetics, Montreal, 1994.
108. Rogaev E, Korovaitseva G., Kerianov S., Ginter E. and St. George— Hyslop P. Identification of the locus for human polymorphic cataract on chromosome 2q. The American Society of Human Genetics, Montreal, 1994.
109. St. George-Hyslop P., Tsuda T., Rogaev E, Liang Y., Haines J., Tanzi R. Genetic studies of chromosome 14 in early onset FAD.. Hie Fourth international Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders. Neurobiology of Agiitg, 1994, V.15, p. 149.
110. Rogaev EX. Isolation of a novel family of genes (Presenilins) bearing mutations in Alzheimer's disease. Abstracts: Complex Genetic Diseases, Symposium, Berlin, 1995.
111. Rogaev EL Approaches for isolation of genes for familial Alzheimer's disease: Transcription map on 14q24.3 and cloning of novel genes (presenilins) with mutation in Familial Alzheimer's Disease, Abstracts: 5th International Workshop on the Identification of Transcribed Sequences", Marseilles, 1995.
112. Rogaeva E., Rogaev E DNA comparison in Romanov Family for identification of putative! remains of Last Russian Tsar. 28th Annual Meeting European Society of Human Genetics, European Journal of human genetics, 4,
-SI,1996.
113. Rogaev- E and -SL George—Hyslop P: Molecular genetics of' Alzheimer's desease. Abstracts: 39th Annual Meeting Canadian Federation of Biological Sciences, London, Canada, 1996.
114. Rogaev E., Sherrington R., Lyang Y., St George—Hyslop P. Isolation of a novel family of genes (presenilins) encoding putative transmembrane proteins and bearing mutations in Alzheimer's disease. 28th Annual Meeting European ~ Society of Human Genetics, London, European Journal of Human Genetics 4, SI, 1996.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.................................................................................................1
Актуальность работы.........................................................................1
Научная яоиизпп.................................................................................3
Научно — практическая ценность....................................................1
Цели и Задачи......................................................................................5
Положения, выносимые на защиту................................................5
Апробация работы...............................................................................6
Публикации и благодарности............................................................7
Материалы и методы.........................................:................................7
Результаты.............................................................................................9
I. Гипервариабельные мигошовторы ДНК......................................9
И, Вариабельность метилирования гена амилоидного предшественника (АРР) в разных отделах мозга.......................21
III. Сцепление генетического локуса, ответственного за ладонно — подошвенный гиперкератоз (КРРР) ............................24
IV. Сцепление генетического локуса, ответственного за врожденную катаракту (РСС)...........................................................26
V. Обнаружение генов, ответственных за развитие ранней
формы болезни Альцгеймера..........................................................30
Заключение и обсуждение...............................................................36
Выводы..................................................................................................40
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации..........................................................................................41
-
Рогаев, Евгений Иванович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1996
-
ВАК 03.00.15
- Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека
- Сравнительный анализ полиморфизма некоторых коротких тандемных повторов в трех популяциях человека и их использование для генетической идентификации личности
- Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека
- Молекулярно-генетическая характеристика популяции башкир и других народов Волго-Уральского региона
- Анализ сцепления высокополиморфных локусов генома с наследственными заболеваниями: врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом
