Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК научный медико-генетический центр

На прапах рукописи УДК 575.113

Шленский Александр Борисович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

/ ■ / / '

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья

Научный руководитель: канд. биол. наук Рогаев Е. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Калинин В. Н. доктор биологических наук Юров Ю. Б.

Ведущее учреждение: Экспертно-Криминалистический Центр МВД РФ

Защита состоится « /2 » ОЦ_1993 г. в 1^1 час.

на заседании Специализированного совета Д.001.16.01 Научного Медико-Генетического Центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦЕНТРА

Автореферат разослан «12» Р3> 1993 г.

У-ченый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

российская академия медицинских наук

научный недико-генетический центр

На правах рукописи

апенский Александр Борисович

нолекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторявшихся последовательностей днк в геноне человека

03.00.15 - генетика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Носква «993 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В данной работе продолжено исследование гипервариабельных районов ДНК человека, представленных тандемно повторявшимися последовательностями, проводимое в течение последних нескольких лет в лаборатории молекулярной генетики ноэга НППЗ РАНН. Диссер-тапионный натериал является целостным исследованием одного из семейств таких повторов, сходных по нуклеотидной последовательности с вариабельными элементами епу-гена вируса ШУ-1, В работу вошли: разработка экспериментальных путей поиска гипервариабельных участков ДНК, генетический анализ, определение иуклеотидной последовательности и хромосомной локалиэапии таких участков. Практическим результатом явилось создание коллекции высокоэффективных полиморфных наркеров ДНК, пригодных для применения в анализе генетического спепления, популяпиошшх исследованиях, криминалистике и некоторых других областях.

Актуальность проблемы- Установление Феномена повышенной нестабильности определенных семейств генонпых зленентов, хромо-сонных локусов и доменов, является одним из центральных вопросов при исследовании молекулярно-генетической природы наследственных заболеваний. Напринер, повышенный спонтанный нутагенез может являться объяснением причин также повышенной частоты встречаемости дефектных генов некоторых болезней, поддерживающейся в различных популяциях. С другой стороны, выделение нестабильных, гипервариабельных локусов, позволяет использовать их в качестве высокоинформативных генетических маркеров для анализа спепления с дефектными генами при наследственных заболеваниях. Поскольку высокая доля средовых Факторов, генетическая гетерогенность и возможный полигенный характер болезни требуют проведения полного обсчета при анализе сцепления на возможно более ограниченном числе сеней из

- г -

генетических изолятов, информативность маркерной системы (Polymorphic Information Content) существенно зависит от велечины гетеро-зиготности (HI локуса, выявляемого маркером (Botstein et ai, I 980 I.

Наибольшее число маркеров сейчас основано на обнаружении замен или делепий/инсерпий одного нуклеотида, что может выражаться в наличии или отсутствии сайта рестрикции, определенном типе конФор-мапии анализируемого Фрагмента или показано прямым определением нуклеотидной последовательности интересующего участка ДНК при помоши полимеризапионной цепной реакции (Рсщ. Поскольку в подавлявшем большинстве случаев удается обнаружить лишь два альтернативных варианта аллеля, гетерозиготность в данном случае не может превышать 50Х. крупные инсераии и делепии, как правило, характеризуются также диаллельным состоянием локуса. Информативность таких маркерных систем невелика, что делает их непригодными для анализа большей части родословных.

Вариабельные тандемные повторы (vthi - наиболее перспективный тип полиаллельного полиморфизма для генетического картирования. Главной основой такого типа полиморфизма является вариабильное число тандемных повторов (Vntri. vtk-аллели могут отличаться также вышеперечисленными видами полиморфизма, создавая широчайший спектр межиндивиАуалыюи полиаллельнои вариабилышсти (Wyman & white, I 980 i.

Первые полиаллельные локусспениФические vnth локусы были обнаружены в начале ао-х годов в анонимной последовательности на 14-и хромосоме, а затем вблизи ряда кодирующих генов (Wyman & White, 1980, Bell et al., 1981, Illggs et al., 1981). С тех пор накоплена серия локусспепифичных vnth маркеров- Выявлены vntr-локусы, гетерозиготность которых достигает 98-99Z, а число аллелей более 60 (Jeffreys et al., 1985, Nakamura et al., 19871. Такие

- э -

чрезвычайно информативные наркери гарантируют идентификацию отцовского и материнского аллелей в сегрегапионнон анализе практически в любой анализируемой семье. Обнаружение таких проб ДНК явилось новым импульсом для развития генетики, позволило проводить систематическое изучение генетики человека, комплексные медико-генетические идентификации, изучение механизмов изменчивости геномных локусов в эволюции живых организмов, выяснение особенностей молекулярной структуры "горячих" точек рекомбинации.

Иель и задачи исследования. Пелыэ данной работы явилась разработка способов выявления сверхизменчивых участков генома человека, клонирование таких участков, опенка их популяпионной гетерогенности, изучение молекулярной и хромосомной организации и описание неизвестных ранее семемейсти элементов генома, вызывавших повышенную изменчивость генетических локусов. На основе полученных результатов была создана коллекция маркеров ДНК, характеризующихся локусспепиФическои и мультилокусной локализацией в геноме, пригодных для использования в качестве проб в медико-генетических и популяиионных исследованиях-

Для достижения поставленной пели решали следующие задачи:

I Синтез олигонуклеотидных зондов и их клонирование для получения эффективных гибрилизаиионных проб, выделение клонированных вставок гипервариабельных участков ДНК.

2. Гибридизация зондов ДНК с несколькими библиотеками для анализа распространенности тандемно повторяющихся элементов в геноме человека и отбор клонов, несущих такие повторы-

а. Создание мини-библиотек из клонов кандидатов и отбор непосредственно участков, содержащих кластеры тандомных повторов.

4. опенка степени полиморфизма клонированных участков и отбор типерварилбельннх зондов

5. Секвенирование гипервариабелышх участков ДНК человека

6. Установление хромосомной локализации полученных полиморфных маркеров методом гибридизации с ДНК клеток соматических гибридов.

Научная новизна. Для детального изучения представленности и молекулярной организации в геноне человека были выбраны повторяющиеся элементы, сходные с тандемными повторами в env-гене вируса Hiv-l (Wong-staal et ai., 19в5|. Показано, что у человека имеются участки ДНК, гомологичные повторам hiv-i (названные повторами Red-от англ. Repeat Envelope Deletion), многие из которых являются высокополинорфныни. В целом характер распределения гомологичных фрагментов при гибридизации по Саузерну напоминает таковой для повторов из гена ш бактериофага *н э по количеству фрагментов и степени их вариабельности, но отличается набором детектируемых локусов.

Было выделено несколько индивидуальных участков генома, предположительно содержащих повторы Red-семейства. Дальнейший молеку-лярно-генетический анализ отобранных клонов показал, что некоторые из них действительно несут такие фрагменты, характеризующиеся высокой нестабильностью в геноме. Различные варианты повторов Red-семейства оказались по-разному распределены в геноне человека, что касается как количества копий, так и расположения родственных локусов.

Определение нуклеотидной последовательности одного из учэсткое показало наличие в нем кластера повторяющихся элементов. При сравнении структуры этих повторов с известными мотивами было установлено, что семейство Red-повторов относится к широкому классу нини-сателлитов, напоминаюших по нуклеотидной последовательности реком-бинационный сигнал е. сои, или chi-минисателлитов, впервые описанных А-Джеффрисон | Jeffreys et ai. , 19в5|. Ряд свойств выделенного повтора позволяет предположить эволюционную и Функциональную значимость данной последовательности и могут быть полезны при

построении классификации минисателлитов как таковых и простых тандемных повторов в целом- Впервые описан минисателлит с минимальным периодом 7-е пар оснований и показана гонология всей последовательности с теломерными структурами и генами Функционально важного класса различных глобинов и некоторых онкогенов-

Определена локализация участка повторявшихся элементов на хромосоме человека 21 методом гибридизации с ЛНК клеточных линий соматических гибридов хомяк/человек.

Научно-практическое значение. На основании полученных результатов оказалось возможным создать коллекцию гипервариабельных маркеров, характеризующихся моно- и мультилокусной специфичностью Впервые описаны нультилокусные маркеры, детектирующие сложные индиЕидоспениФические профили распределения вариабельных фрагментов генома человека в жестких условиях гибридизации с высокой воспроизводимостью. Эффективность идентификации индивидуальных генотипов по оценкам, сделанным в нашей лаборатории, превышает описанную в мировой литературе на несколько порядков. В нескольких совместных исследованиях было показано, что разработанные тест системы являются эффективными при анализе генетических изменений при злокачественных изменениях, эволюционных и популяпи-онных исследованиях, или при опенке генетической нестзбилъностии в ралиапионно неблагоприятных районах. С использованием разработанных проб проводятся криминалистические экспертизы и установление отпоистга в Экспертно-Криминалистическом Центре МВД России Для анализа сш.'плености геномных локусов, ответствнных за шизофрению и болезнь ллыпеимера, в нашей лаборатории проводилось тестирование о-шгошенних семей при помоши полученых гипервариабельных маркеров На основании накопленных данных можно утверждать, что разработанные системы генетической идентификации не только не уступают, но но эффективности анализа несколько превосходят широко

используемые во всен нире для генотипирования минисателлиты А. ДжеФФриса и олигонуклеотидные пробы И.Эпплена. Разработанные монолокусные гипервариабельные пробы - еше одна из многих точка отсчета для построения полной генетической карты генома человека.

Положения, выдвигаемые на защиту.

Обнаружено несколько новых семейств повторяющихся последовательностей ДНЕ человека и проведен анализ их представленности в геноме и некоторых отдельных хромосомах.

2. Выделены индивидуальные участки генома человека, содержащие последовательности, гомологичные повторам из еп»-гена вируса Н1У-1 (Ке<1-семейство|. Показано, что варианты таких повторов гомологичны различным гипервариабельным локусан в геноме человека.

3. Определена нуклеотидная последовательность неизвестной ранее вариабельной области генома человека ке<1-2.

4. Определена хромосомная локализапия участка веа-2 нетодон гибридизапии с ДНК клеток соматических гибридов человек/хомяк.

5. создана коллекция новых гипервариабельных маркеров ДНЕ, пригодных для ДНК-Фингерпринтинга, популяиионных и недико-генетических исследований

Апробация работы Результаты исследования были представлены на нежлабораторнон семинаре Института Клинической Психиатрии НШ1Э РАМН И992 г- I, Первой международной конференции по ДНК-Фингер-принтингу (Берн, 1990 г), 24 Европейской конференции по генетике человека (Эльсинор, »992 г- ), Второй международной конференции по ДНК-Фингерпринтингу (Белу-Ори:илгге, «992 г. |.

Публикации- По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ-

Структура и объен работы Работа изложена на |32> страницах машинописного текста; состоит и< нвглеиия, обзора литературы, экс-

периментальнои части и обсуждения. заключения, выполов и списки цитированном литературы (всего 16S названий!, диссертация содержит 0.4 рисунков и 6 таблиц, пометенных в тексте.

Натериалы и нетолы.

Плазмидную ДНК выделяли шелочнын нетолом, высоконолекулярную ДНК человека - метолом Фенольлои экстракции (Ианиатис и др. , 19вб|, ДНК Фага лямбда - ультрапентриФугированиен (Забаровский, Турина, 19 ее ). Нее манипуляции с ДНК (электрофорез, гидролиз рестриктаэами, клонирование, ьлоттинг-гибридизапия и т. д. 1 проводились в соответствии с протоколами, приведенными в руководстве Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., )9вб|, иногда с незначительными модификациями. При подготовке Фильтров для блоттинг-гиб-ридизаиии использовали вакуумный перенос ДНК на фильтр (Зайцев, Яковлев, 1чаэ |. Радиоактивное мочение ДНК фосфором проводили метолом случайного праймироваиия по методике Фирмы Amersham.

НасгоиФговку нуклеотидных последовательностей проводили по метолу Сэнгера (Sanaer и др., 19771 в соответствии с рекомендациями Фирмы ush или по методу Максама и Гилберта (Maxam, Gilbert, «9«0 1 в твердофазном вариште (Чувпило, Кравченко, 19вб|.

ДНК клеточных линий соматических гибридов человек/хомяк, содержащих отдельные хромосомы человека была предоставлена Фирмой bios.

l-'гзультатн и обсуждение

Клонирование простых синтетических повторов Для получения протяженных участков периодически повторяющихся структур ДНК применялась следующая стратегия: Пыли синтезированы несколько

- в -

слигснуклестидных зоилов, последовательности которых представлены на рис 1. олигонуклеотиды каждой пары взаимно комплементарны таким образом, что при образовании двухиепочечной структуры с двух сторон остаются неспаренные участки, способные взаимодействовать со следующим олигонуклеотидом и так далее, образуя кластеры тандемных побторое. Комплементарные зонды отжигали и лигировали несколько раз, протяженные участки тандемных повторов выделяли из полиакриламиднго геля Выделенные повторы клонировали в вектор рис1з, линеаризованный рестриктазой Эта I и обработанный шелочной ФосФатазой (Р11агтас»аЬ

йеч )3 ССАССТССССАССТСТ

нец )4 ссАсетеслелестсс

Беч 32 сстссстссстссстесотсссте

иеч 33 САСССАСССАСССАСССАСССАСе

йеч 35 ССИСАТСТССАСССССАТСТССАС

Беч 36 СССетССАСАТСССССТССАСАТС

Эеч 52 АСАССАСАССАСАССАСАСС

КРЧ 5 3 сстстсстстсстстсстст

Рис. 1 Иуклеотидные последовательности олигонуклеотидных

зондов, использованных для клонирования- Бея 13 и -последовательность повторяющейся единицы минисателлита А джеФФриса аз. 15 ы«<(геуз е» а! , 19в5|, эгч 32 и зз

- простои тетрануклеотидный мотив (сети!,,, яеч 35 и 36

- повторяющийся элемент <2 п. о. из еп*-гена вируса

|Уо»д-£Наа1 еI а I , 1Чв5|, Эеч 52 и 53 - пента-нуклеотидннй мотив (сстст),,.

- ч -

Для дальнейшей работы были отобраны клоны, содержащие саные длинные вставки: Seq 13/14 - около 150 и.о., Seq 35/36 - около 150 п о , seq 32/33 - около 200 ii. о и seq 52/53 - около зоо п. о. Соответстванно полученные гибрилизааионные пробы были названы: составленная из последовательностей Seq «3 и 14 - MSJ (Jeffreys mini sate 1 I I te I, из Seq 35 и 36 - Red-) (repeat envelope deletionl и ПС аналогии ИЗ Seq 32 и 33 - Brown 4. 2, и Seq 52/53 - Hlue 6. 2.

Для ответа на вопрос, присутствуют ли в геноме человека семей-стеэ полиморфных повторяющихся последовательностей, гонологичннх клонированным, ДНК нескольких индивидов расщепляли поотделыюсти рестриктазами f.co ki, Pst I, Taq 1 и Пае III, разделяли в о, т/. агагозном геле и переносили на нейлоновые Фильтры ilybond N I ATiiei-fham") по сауэерну Участки клонированных повторов вырезали пслилинкерными рестриктазами Есо ki и Hind ill. отделяли от вектора в <ч легкоплавкой агароэе и вырезали области геля, содержащие ДНК вставок. Непосредственно в легкоплакой агароэе вставки метили методом случайного затравления и гибридизовали с ДНК человека, иммобилизованной на фильтрах в фосфатном буфере при

ьо"с. отмывку проводили в мягких условиях («xs.sc, о, «7sds1. В

описанных условиях всеми пробами детектировались сразу несколько гомологичных локусов в геноме человека, проявлявших нолиаллельный полиморфизм за счет различия в количестве повторяющихся единиц в каждом аллеле и, следовательно, длине вышепляемого некоторой ресгриктазои Фрагмента ДНК, соответствующего конкретному локусу, выявляемому на радиоавтографе Наибольшее разрешение полиморфных Фрагментов наблюдалось при использовании рестриктазы нае iii, видимо, чл счет максимального удаления уникальных последовательностей, прилегающих к кластеран тандемных повторов. Результаты 1'ибрилизаиии всех описанных проб с ДНК человека, расщепленной ресгриктазои пае ill. представлены на рисунке 2.

Из данных по гибридизации видно, ч'го пробой Hrown 4. 2 выявляются 2-6 полиморфных Фрагментов и несколько интенсивно гибридизую-шихся неполиморфных в области от 1 до 20 т- п.о. , то есть она может быть отнесена к зондам, выявляющим среднее количество локусов. Остальные пробы являются мультилокусными. При гибридизации ДНК человека со вставкой Blue 2. 2 на радиоавтографе наблюдаются более десяти полиморфных фрагментов, со вставкой Red 1 - более двадцати и два интенсивно гибридизуюшихся неполиморфных Фрагмента размером около 5 и б т- п- о- Проба msj использовалась в качестве своего рода контроля, поскольку подобный мультилокусный мультиаллельныи полиморфизн был описан для пробы зз.15 а. Джеффрисом Для клона Red-i на материале нескольких семей был показан менлелевский характер наследования полиморфных фрагментов (рйс-3|.

Анализ представленности повторов в геномных библиотеках. Олигонуклеотидные пробы, использованные для получения искусственных полиморфных зондов, а также некоторые другие, в том числе и клонированные геномные участки, содержащие повторяющиеся элементы tan-, аро- (Ногаев ЕИ, 19881 и принентромерные повторы PD9 ( De in ukjer et a 1. , 19811, и <>r6 (юров Ю. б идр,1У88)исп0ль30-кали для гибридизации с клонотеками Фрагментов как всего генома человека, так и отдельных хромосом (21 их) в Фаговом векторе лямбда кмш.-з.

Для выявления наибольшего количества последовательностей с нестрогой гомологиеи условия гибридизации и отмывки олигонуклео тидных зондов выбирали как наиболее мягкие при отсутствии нес не-ииФического связывания с ДНК вектора и клеток-хозяев. Клонированные фрагменты гибридизовали по той же схеме, как при блоттинг-гибридизапии по Сауперну Регистрировали сигналы, четко оишчаюши еся от Фоновой гибридизации 13сего было проанализировано юа тысяч Фаговых бляшек клонотеки фрагментов целого генома человека, so

_ Ц -

тысяч специфических лля хромосомы 21 и 25 тысяч для хромосоны х. в таблине 1 приведены данные по представленности гонологичных последовательностей в геноме человека.

тотальная 21 хромосома х-хроносома

библиотека

проба кол-во V. кол-во / кол-во

Seil 12 100 Seq 13 20-1500 Seq 32 30-2500

S e q 3 5 Seq 41 Seq 5 2 яро-

t 3U-

pPU'J <1Я6

2000 50

1 500

О, 10

0,02-1,50 О, 03-2, 50 2, 00 О, 05 1 , 50

300-5000 0,30-5.00 50-(ООО О, 05-1,ОО

2000

45

175

1 , 00 50 О, 20

10 О, 04

О, 09

О, 35

4. 00

Табл. 1 Распределение повторяющихся последовательностей в геноме человека и отдельных хроносомах. Указано количество позитивных клонов из проанализированных IOO ООО ЛИЯ 104.им,ной < и( лиотеки. 50 ООО - лля 2 1 хромосомы и 2г, ооо лля х- хромосомы и процентное количество геномных сегментов размером 20 т- п о., содержащих повторы к о(>тей длине генома человека, или /иши.ж о1/1ел1 них хромосом-

И:) представленных данных видно, что таплемные повторяющиеся "•цементы или сходные иг, структуре участки встречаются н довольно

большом количестве Фаговых клонов, однако до сих пор остается не выясненным вопрос, случайно ли распределены кластеры повторов по Есему геному. Существует точка зрения, что повторы минисателлитов локализуются главным образом в субтеломерных районах хромосом. В данной работе была предпринята попытка обнаружить припентронерные минисателлиты, для чего библиотеку клонов из 2« хромосомы гибриди-зовали с ДНК сателлита рш и альФа-повторов и олигогонуклеотидными пробами эеч 35 и эеч 52. однако при вторичнон скрининге не удалось обнаружить ни одного клона, перекрестно гибридизуюшегося с использованными пробами. С другой стороны, для минисателлитов пока не было обнаружено спепленного с полом наследования каких-либо локусов, что вполне согласуется с нашими наблюдениями относительно слабой представленности повторов минисателлитов в х-хромосоне. Не исклчено, что в половых хроносонах основная Фракция повторяющейся ДНК соствлена из простых элементов длиной не более шести нуклеоти-дов, или микросателлитов, что можно предположить из литературных данных.

Клонирование полиморфных районов генома человека. Для выделения индивидуальных участков генома человека, несущих тандемно повторяющиеся последовательности, из Фаговых библиотек изолировали отдельные бляшки, дающие положительный гибридизапионпый сигнал с тем или иным зондом. Всего после вторичного скрининга были отобраны 371 индивидуальный клон. В дальнейшей работе использовали ее клонов, содержащих Фрагменты ДНК, гомологичные пробе йеч 35. Выбор был обусловлен тем, что проба вей-! являлась наиболее информативной для выявления межиндивидуального полиморфизма, с другой стороны, ставилась задача выяснить нолекулярную организацию в геноме человека последовательностей, гомологичных повторам епу-гена вируса шу-1.

Выделяли ДНК индивидуальных Фаговых клонов и подтверждали

- I 3 -

специфичность гибридиэапионного сигнала, проводя блоттинг-гибридизацию по Саузерну с фаговой ДНК, разрезанной различными рестриктазами. Размеры вставок геномной ДНК человека, вылепляемых рестриктазой Sai Gl, варьировали от ю до 20 т. п. о. Интенсивность гибридизации рестриктных фрагментов с пробой seq 35 условно ножно было подразделить на сильную, среднюю и слабую. "Внутренним контролен" специфичности гибридизации служило отсутствие таковой с Фрагментами ДНК вектора.

С использованием рестриктаз пае ill и Pst i в Фаговых клонах 35. 1 -35. 10 были идентифицированы Фрагменты раэнерон не более 2 т- п. о. , несущие участки, гонологичные повторан епт-гена вируса HIV-1, выделены из легкоплавкой агароэы и использованы в качестве гибридиэапионной пробы. После отнывки в нягких условиях оказалось, что Pst i фрагмент клона 35. i способен гибридизоваться с ДНК человека на Фильтре как нультилокусная гипервариабельная проба. Вставки из остальных девяти клонов выявляли на фильтрах либо недиФФеренпируеный пул гомологичных Фрагментов во всен диапазоне размеров, либо один, не полинорфный для выборки из трех индивидов, локус.

Более детальное исследование пробы 35. 1, названной впоследствии для простоты Bed-2 показало, что при ее гибридизации с нае in рестриктами ДНК человека детектируются в среднем 22 четко различи-ных гонологичных фрагнента. Были проанализированы профили гибридизации с пае ш-рестриктани ДНК тридцати неродственных индивидов и выяснено, что вероятность появления у двух индивидов фрагментов одного разнера составляет о, 23. такин образон, вероятность совпадения индивидуальных профилей распределения гонологичных пробе Red-2 Фрагнентов у двух неродственных индивидов р=о,2322 или 9.07XI0"15, то есть эффективность данного нультилокусного зонда оказалась сравниной с эффективностью нинисателлитов А-Джеффриса в

сходных условиях гибридизапии. Было также установлено, что наследование полиморфных локусов происходит по законам Менделя и что индивидуальные Фингерпринты обладают соматической стабильнстью, а также являются идентичными у монозиготных близнецов. Достаточно представительной выборки для определения скорости образования новых аллелей исследовано не было. В десяти тестированных сеньях (20 родителей и ^^ детей) был обнаружен лишь один аллель, возникший de novo, при гибридизации с ДНК человека, растепленной Pst i, в жестких условиях пробой Red-2 детектируются только два гомологичных локуса. Один полиморфный с гетерозиготностью боя и размером в районе s т. п. о. Второй локус около 2 т. п. о. и является собственно тем участком генома, из которого была выделена область Hed-2, что было показано при гибридизации с тени же Фильтрами не несущего тандемных повторов Pst i/sac i Фрагмента клона Re<i-2. Его полиморФизна при разделении в о,т/. агарозе наблюдать не удается. Если использовать для растепления геномной ДНК рестрик-тазу пае ni, то возможно видеть лишь полиморфный локус, при этом различия в размерах фрагментов становятся более ошутимыми. Нело-лиморФный участок разрезается на несколько небольших фрагментов, которые выходят из агарозного геля во время электрофореза.

Для дальнейшего поиска полиморфных клонов использовали стратегию создания мини-библиотек в плазмидном векторе pucia. lie выделяя вставку, ДНК Фаговых клонов расшепляли рестриктазой sau за и клонировали в полилинкер pucie по ваш hi сайту- Высевали по юоо-2000 колоний на чашку и проводили скрининг олигонуклеотидной пробой Setl 35. Из клонов, гибридизуюшихся с пробой, выделяли плаэмидную ДНК и подтверждали специфичность сигнала гибридизацией с плазмидной ДНК по Саузерну. Было отобрано 24 клона, разнеры i-ставок варьировали от 700 до почти sooo п- о- Из клонов выделяли вставки в легкоплавкой агарозе и использовали их в качестве проб

МБЛ Вгоип В1ие Ней-) Неа-2 Нк<1-3 Не<1-4 Не<1-5 33. 15

Рис. 2 Сравнение профилей распределения полиморфных Фрагментов, выявляемых клонированными пробами на одних и тех же Фильтрах (Пае 111, три индивида!. Приведены'также результаты гибридизации минисателлитов мбл и зэ. 15.

од од од <ыютР.у о^до^оо^о

- в_ зН^****^ §М ^

. -: -==Т

м ~ --.••*«»«» «ь ■ ц ттФЛ т

в щ & М •• •

1 и Г; 1*1-

111 *л" • ■ Цр!^ "■В'' •• . - ••

11ш1ш -1!;!1" *' •

Не<1-1 Не<1-2 Ие<1-4 Вей-5

Рис. з Наследование профилей распределения полиморфных Фрагментов, детектируемых пробами

Ке<1-1, Ией-г, Не<1-4 и 1»е<1-5.

при гибридизации na Фильтрах с ДНК нескольких индивидов, растепленной рестгиктазани есо hi, Pst i, Taq 1 и нае ш. отнывку вели в жестких условиях (О, ixssc, О, 1zsds|.

Клон 35. 13 содержал вставку геномной ДНК человека размерен поо п о. Используя этот фрагмент как зонд при гибридизации по Саузерну даже в жестких условиях удается с высокой воспроизводимостью детектировать множество гомологичных полиморфных участков в геноме человека (рис. 2|. Обший профиль распределения полиморфных фрагментов на радиоавтографе не совпадает с таковым для мультилокусных зондов Ked-i и Red-z. наиболее информативным Ферментом рестрикпии для данного зонда является Пае Iii. На индивидуальном Фингерпринто выявляется около тридцати отдельных Фрагментов, гомологичных пробе- Показано менделевское наследование Фрагментов в родословных и соматическая стабильность.

фрагмент генома ДНК человека Red-4, присутствующий в виде вставки в другом клоне - 35. 14 - размером также поо п о., при гибридизации с ДНК человека в жестких условиях выявляет сложные профили распределения множества Фрагментов, похожие на таковые для пробы Red-з. как показал дальнейший анализ, около во/, гибридизу-юшихся с двумя зондами участков геномной ДНК представлены на радиоавтографе Фрагментами одного размера и лишь в 1/5 случаев обнаруживается специфический для той или иной пробы вариант. Значимых различий п числе детектируемых локусов для выборки из 20 человек также не было обнаружено: обеими пробами выявляется около тридцати Фрагментов в диапазоне размеров от '■> до 25 т- п. о. Была определена вероятность обнаружения Фрагмента определенной длины у двух неродственных индивидов 4=0,25 для я«-а-з, и о, 24 для Re<l-4, установлен менделевский характер наследования и соматическая стабильность Фингерпринтон

проба количество фрагментов

мэо

1<е<1-1 Не<1-2 Ие<1-3 Ие<1-4 Ке<1- 5 33. 15

27, 20 22, 00 23, 14 32, 33 31 , 38 б, 96 26, 66

1, 10

3, 59 2, 22

1, 50 3, 60 1 , 34

2, 50

вероятность обнаружения одинаковых фрагментов ч

0, 26 О, 23 0, 22 0, 25 О, 26 О, 35 О, 25

О, 02 О, 06 О, 10 О, 02 О, 07 О, 20 О, 02

эффективность р

1. 22 Ю-16

9. 07 I О" ' 5

6. 07 I О" 1 6

3. 43 10"20

4. 38 10-"' 6. 70 10~4 8, 89 10"17

о

Табл. 2 представлены данные по обнаружению одинаковых по

размерам Фрагментов у неродственных индивидов и их общему количеству не менее, чем по 20 измерениям. Вероятность ч рассчитывали по отношению количества обших Фрагментов у двух людей к среднему количеству Фрагментов у каждого. Эффективность пробы определяли как вероятность совпадения индивидуальных профилей распределения полиморфных фрагментов у двух неродственных людей по Формуле р=ч". Для сравнения приведены те же значения для минисателлитов ДжеФФриса, определенные в нашей лаборатории и близкие к литературный.

Строго говоря, приведенные данные по количеству детектируемых Фрагментов и вероятностям совпадения полос можно считать лишь ориентировочными, поскольку конкретные значения могут варьировать в зависимости от вренени проведения электрофореза и его качества,

- jg -

а также качества переноса и собственно гибридидизапии и, до некоторой степени, личных вкусов и опыта экспериментатора. В данном случае был проведен обсчет для стандартных условий и времени электрофореза и гибридизапии, при его увеличении число п в таблице 2 может возрастать, а ч наоборот, уменьшаться. Тем не менее, из представленных в таблипе данных видно, что пробы Red-э и 4 являются несколько более эффективными мультилокусными наркерани, чем Red-l и 2 и тем более, чем Drown 4. 2 и Blue 6. 2. В условиях нашей лаборатории также были определены статистические характеристики для минисателлита ДжеФФриса и искусственной пробы msj, оказавшиеся сходными с данными, представлеными в литературе. Из таблицы видно, что эффективность идентификации конкретного Фин-герпринта для этих проб сходна с таковой для Re<t-i и 2 и несколько ниже, чем для Red-з и 4. то же, вероятно, можно сказать и об условиях гибридизации. Пробы зэ, 15, msj, Red-l и 2 способны детектировать сложные профили распределения Фрагментов лишь в нягких условиях отмывки, что чаше всего связано с повышенным Фоном на Фильтре и сложной воспроизводимостью. Пробы Red-з и 4 такого недостатка лишены, поскольку гибридизация с ними проводится в жестких условиях-

Хотя индивидуальные профили распределения фрагментов для проб Red-з и Red-4 являются сходными, этого нельзя сказать об их рестриктных картах, что свидетельствует о том, что были клонированы два разных Фрагмента ДНК генома человека. В частности, рестриктазой Pst i из плазмиды pRed-з вылепляется фрагмент вставки размером около 250 п. о. ; сайта расшепления Pst i во вставке Red-4 не имеется, с другой стороны, рестриктаза Neo i отшепляет от вставки Red-4 Фрагмент длиной около боо по. со стороны Hind iil-сайта полилинкера. Если использовать эти короткие участки в качестве гибридизапионных проб, гомологичным в ДНК человека

оказывается лишь один уникальный участок генона, в то вреня как более длинные фрагменты выявляют несколько полиморфных локусов, как и исходное пробы. Для Фрагмента Neo l/Hind III с использованием для растепления геномной ДНК человека рестриктаэы нас ш, не имеющей сайтов растепления в исходной вставке и, следовательно, вышевляютей в геноме кластер повторов вместе с уникальным участком, были определены частоты появления аллелей и гетерозиготность локуса Red-4 для 25 неродственных индивидов (табл. э|.

аллель частота размер о

фрагнента

О. 045 о, 500 О, (46 О, 182 О, 045 О, 066 О, 023 О, 023

2037 2164 2348 2468 2593 2730 2882 3095

14 <6

20 23 17

35

Табл. з Аллельные варианты геномного локуса Red-4,

определенные из гибридизации Neo i/iiind ш фрагмента вставки Red-4 с нае III-рестриктами ДНК 25 неродственных индивидов. Приведены размеры . гибриоизуюшихся фрагментов и частоты встречаемости каждого аллеля. Гетерозиготность пробы в делом составила H=64Z.

Eme более похожими, даже просто совпадавшими, оказались профили выявляемых фрагментов для пробы, выделенной из тотальной

- Л) -

клонотски Фрагментов генома человека н Фаге лямбда embl-з - <35.15 I Heil ei и пробы, выделенной из специфической для хроносоны 21 клонотеки - ns. 21.15 tne<i-5|. при жесткой отмывке ими детектируется тождественные наборы Фрагменов, гибрилизуюшиеся с очень высокой интенсивностью. По количеству выявляемых фрагментов пробы можно очнести к "среднелокусным" - их число н наших экспериментах никогда не превышало десяти, распределенных в диапазоне размеров от о. 5 до ю т п о Также не очень высокой является вариабельность каждого из локусов: вероятность обнаружения гибридизуюшегося фрагмента определенного размера составила о, пь, а вероятность совпадения двух Фингерпринтон - почти t/iooo. Пробы явно не подходят для обычного ЛИК-Фингерпринтинга, но могут служить прекрасным вспомогательным инструментом для идентификации личности или подтверждения отповства, а также в нопуляпионных исследованиях.

Несмотря на полное совпадение Фингерпринтов, выявляемых каждой пробои, рестриктные карты клонов отличаются довольно сильно Размер вставки в клоне Re<i-6 - около 4 т п- о , причем в ней нет ни одного сайта рестрикции, присутствующего в полилинкере рчс t я, тогда как вставка в клоне ned-г. имеет размер i.n т. п. о. и она расщепляется рсстрикталой P-st 1 на три фрагмента размерами лоо, :юо и 200 п о. точно так же не било найдено гомологии и между частично определенными нуклеотилными последовательностями вставок в каждом клоне

Здесь необходимо заметить, что проблема гомологии участков генома, содгржагаих кластеры минисдтеллитон, до сих пор остается нерешенной Ь частности, было показано, что многие локусы, несущие танлемно повторенные минисателлитн. ло определенной степени "перекрываются" между собой то есть при выбранных условиях способны перекрестно i ибрилиюваться с несколькими известными пробами (in tter I nuten и др , t'J'Jl) что же касается соотношения нуклео -

тидных последовательностей составлявших такие минисателлиты повторявшихся единиц, то до сих пор также не разработано удовлетворительной количественной теории гибридизации таких зондов. Поэтому проблема "перекрывания" для индивидуальных проб пока решеается лишь чисто умозрительно и, может быть, некоторую ясность может внести анализ наследования отдельных Фрагментов проФилеи гибридизации различных нинисателлитов, да и то лишь до определенной степени-

Определение нуклеотидных последовательностей клонированных Фрагментов- Для выяснения, действительно ли наблюдаемые сложные профили распределния гомологичных участков при гибридизации с ДНК человека связаны с наличием повторяющихся структур и, если это ■гак, дли анализа молекулярной организации участков, гомологичных танлемным повторам env-гена вируса Hiv-l, было предпринято определение нуклеотиднои последовательности геномного Фрагмента Red-2. сначала секвенировали приблизительно по 250 по- участков вставки, непосредственно прилегающих к полилинкеру в исходном клоне pKfd-2 по методу Сэнгера с использованием в качестве матрицы лвухиепочечнои плазмиды, выделенной равновесным центрифугированием ъ градиенте плотности хлорида цезия. Частичные нуклеотидные последовательности сравнивали с банком нуклеотидных последовательностей (lenHank, в результате не было обнаружено известных участков генома человека с существенной гомологией- Далее была установлена локализация сайтов растепления различными рестриктазами, Фрагмент разделен на более короткие - Pst l/sac I, размером 540 п.о., sac i/Pst 1, размером 730 п о и наш iii/nyi и, размером 660 п о-, которые клонировали в векторы Ml э mpin и inpi'J для получения матрицы в одноцепочечной Форне-

Как выяснилось, ни модифицированная полимераза Фага T7 (USB, версия 2.01, ни Фрагнент Кленова ДНК-нолимераэы I tAmersham), ни

Taq-полимераза (Fermentasi не способны использовать в качестве матрицы цепь, обогащенную гуанином даже после предварительной денатурации- На радиоавтографах секвенируюших гелей в этом случае наблюдается лишь набор полос, соответствующих продуктам неспепи-Фической терминапии полимеразной реакции- Возможно предположить, что в данном случае е-пепь, в отличие от с-пепи, имеет сложную вторичную структуру и не способна служить удовлетворительной матрицей in vitro. Весьна вероятно, что в данном случае G-пепь уложена в "глобулы", состоящие из четырех обогащенных гуанином коротких участков, связанных водородными связями, в то время как с-цепь остается свободной. Такая модель была совсем недавно предложена для описания укладки участков тандемных повторов в я'-области гена инсулина, также характеризующихся аномальным распределением остатков гуанина и цитозина между двумя цепями (Hammond-KosacK et a I. , 19921 Нельзя также исключить, что подобные структуры стабилизированы определенными белками, в том числе имеющимися и у прокариот, поскольку удовлетворительных результатов полимеразной реакции не удалось получить даже после предварительной денатурации матриц.

Поскольку проблем с прочтением ни одной из цепей не возникало при использовании в качестве натрипы плазмидной ДНК, те же самые Фрагменты клонировали в рис «9. Как и в предыдущем случае, после щелочной денатурации плазмид с укороченными вставками, оказалось возможным нормальное определение нуклеотидной последовательности по нетолу Сэнгера с использованием как прямого, так и обратного праймеров- Несколько участков неспеииФической терминаиии в непосредственной близости от кластера тандемных повторов обнаружились при чтении с сайта Hgl 11 Фрагмента ваш Hl/Bgi и. нуклеотидную последовательность этих участков удалось однозначно вывести при помогай секвенирования по методу Наксана-Гилберта. Была определена

1 - ctgcagctca caccagctgc agcccctgct ttcctctggg ccr.agccttc

51 - gacccctcag ggactcccat gccccagcct cctacagtgt ccctcaggcc

101 - cagcagggac ccctggggat ggtcttggcc agccgcaccr. ttgaaggcag

151 - catggtcagg gagtaggaaa gagactcaca gggctgctgc cacggctccg

201 - ggtacagcca gctggtgggt tcaaggttcc agtggtccgg ggcttccagg

2 51 - ctcagggtcc ccggggagga ctgggccatg gaacgaggga cggcgcaggc

301 - aaagaatgag ctggaaggat ccaggcccac ctgggacagc gggtggccag

351 - aggtcaccag gctatggggg caaagaatct gggcgtgtcc cgcgggggcg

40I - ggaggggcgg gggcggggca gcccttcagt gccggtttgc agtgggaggg

451 - gcgaggagct gcggggggtc acttggggtg gggagctagg aagctggggc

501 - acgggcaggg aaagggaacc ctcaggtggg gagggttaag agctcagtgg

551 - ggctggggga ttggggttca gaggatgggg ccctcagggt ggagtgaggg

601 - gtggggtttg gggacctcag tggggagtgg ggttcagggg aggggtggag

661 - atgggaggac tggggatggg gcagatgagg ggggtttcag tagagggggg

701 - cccttggggt ggggtggggg ataggggtgg ctgtggggta ggggcagggc

751 - gctcagaggt ggggtttagg aaggtcatag gggtgggctt cagggcaagg

801 - gtgaagaaag ggatGAGGGT GGAGGGTGGA GGGGTGGAGG GGTGGAGGGT

851 - GGAGGGTGGA GGGTGGAGGt agggcagggc gggggttagg tggagttggc

901 - cccctgggtg gagatgggtg aggattagtg gaggtgccct cagggcaggg

951 - tgggtgggtg gagygcgggg сtlagggaga tclgttgggg gattagggag

1001 - tgggggtggg ggtggatgct gagttggaga tgggggcctt caggggaggt

1051 - ggtcr.tttgg cgggatgggg gtgatgatag ggtgagggtg ggcactccgg

1101 - ggcagggctc agtggcgggg gtcggggctc agggcaaggg tagagacggg

1151 - gtgaaagtag gaatgggggt gtgaggccga ggatgggggt ttcaggggag

1201 - gtngccttta gggcaggata ggggtgagaa tggggtgggg atgggcctca

1251 - gggatccgtt gacctgcag

Рис 4 Нуклеотидная последовательность геномного ря i

Фрагмента Hed-2. Заглавными буквами набрана последовательность кластера тандгмных повторов |815-аь<л, подчеркнуты - варианты теломерных повторов

полная нуклеотидная последовательность bctvii ни ке<1 2, 1рис 4|, ее длина составила 1278 по

Как видно из рисунка, в составе геномного Pst i Фрагмента Bed-2 обнаруживается участок танлгмпых повторов протяженностью г,< по-, занимают.^ область с eis по вбу нуклеотиды, в состав которого входят семь полных копии повторяющейся елинииы agggigitgg.

Вся последовательность характеризуется аномальным g/с-состансм (содержание g и с нуклеотидоп составляет б е, т/.) и асимметрическим распределением этих оснований между комплементарными цепями (отношение g/c в одной из пеней равно 2,74).

В нашей лаборатории были синтезированы олигонуклеотидные зонды отвечающие по структуре повторяющимся элементам в последовательности red-2 (gggtgga]4 и iggggtggai4. Елоттинг-гибрилизапией этих проб, меченых при помоши полинуклеотидкиназы Фага тф по 5'-концу было показано, что за перекрестную гибридизацию с множествен локусов в геноме человека действительно ответственны тандемны'е повторы приведенной структуры, поскольку в данном случае на радиоавтографе отмечались те же самые, или очень похожие, профили распределения полиморфных Фрагментов (данные не представлены!

Сравнение нуклеотилнои последовательности «cd-2 с последовательностями, хранящимися в базе данных kmhi,, позволило еыявть несколько г той или иной степени гомологичных известных участков ЛНК человека. Ниболее похожим 11а Hed- г оказался минисателлит ЛжеФФРиез зз. 15, несмотря на различие Фингерпринтов, выявляемых обеими пробами при гибридизации с ДНК человека по Саузерну Лва минисателлита били гомологичны на ь2/., из 537 нуклеотидов участка перекрывания 324 оказались идентичными Определенных структурных мотивов, отвечающих за такой высокии уровень гомологии, в двух последовательностях не прослеживается (за исключением короткого в клоне Kfd-2 участка заиленных повторов, что будет сбсужлено ниже). Таким образом, представляется вероятным, что .что может быть объяснена аномальным и асимметрическим G/<: составом, что в большой степени характерно не только для последовательности Кс<1 2, но также и (5. ¡та точка зрения может быть подкреплена тем, что не только с '.13.15, но и достаточно »•олыпим количеством других известных миписател.питов (:<:■• I. :i:i. а, а а. 4. :i:i. 6. ms22«ii, р кластере

глобиновых генов, в гене инсулина I, была обнаружена некоторая гомология, в среднем около 45Z, которые не настолько обогащены гуанином, как Red-2 и зз. »5.

Приведенные данные свидетельствуют о тон, что проклонированный участок относится к классу гомологичных рекомбинанионному сигналу е. coli минисателлитов- В связи с зтин представляется интереснын рассмотреть соотношение танденных повторов из гена env вируса Hiv-i, которые использовались в качестве гибридизационной пробы при скрининге геномных библиотек, повторяющейся единипы клона Red-2 и усредненной последовательности повторов нинисателлитов А Джеффриса.

гомология HIV Red кор Chi

HIV- a: GGGCTGGAGATG h: GGGgTGGA CatGgGGg - 75z 56/ 56z

GGGGTGGA GGGgTGGA GGGGtGGa 75z - 69z 75z

"kop"- AGGTGGGCAGGAXGGG GGGcaGGA XGgGaGGt 56z 69z - 63/

CHI- GCTGGTGG GGGcTGGt GGGctGGt 56z 75z 63z

1'ис- 5 а: сравнение нуклеотидных последовательностей повторяющихся единип из гена еп» вируса шу-1, Red-2, "кор"-последовательности минисателлитов и сигнала рекомбинации е. сои, ь: те же последовательности представлены как участки танденных повторов, разделенные в соответствии с периодичностью повтров в кластере Red-2.

Сравнение представленных на рисунке 5 последовательностей позволяет, видино, утверждать лишь то, что все они относятся к одному типу и что в повторявшейся единице из env-гена вируса hiv-i имеется участок протяженностью а нуклеотидов, совпадавший по последовательности с мономером Red-2, за счет чего оказалось возможным выделить этот клон из библиотеки Фрагментов генома человека- Однако повторявшийся участок клона Red-2 является наиболее пожожим на любой из трех остальных; уровни гомологии попарных сравнений этих последовательностей ни в одном случае не достигают значений гонологии Red-2 с каждой из них- Далее, как известно, для большинства chi-минисателлитов размеры повторявшейся единицы кратны <6 парам оснований - длине наименьшего повтора, представленного в минисателлите зз. 15, хотя для более длинных мономеров эта закономерность может быть менее выраженной- 13 случае повторов Red-2 раэнер мономера составляет лишь а по-, то есть половину длины повтора эх i5 - до сих пор таких минисателлитов в литературе описано не било-

Среди других структур, с которыми была обнаружена высокая гомология в базе данных нуклеотидных последовательностей емш,, наиболее похожими на Red-2 оказались Фрагменты прителомерных последовательностей ДНК человека Двум известным прителомерным последовательностям участок Фрагмента Red-2 был гомологичен на 62,37. (на о,зх больше, чем зэ. 15) и 55,1/. Довольно сложно выделить в этих последовательностях какой-либо повторявшийся усасток, кроме ttagggigi и tttgggig), однако во всех сравниваемых последовательностях прослеживается непериодический нотин, наиболее обычной Формой которого является ggggtgggg. на основании данных гибридизации in situ неоднократно было показано, что кластеры Chi-мини-сателлитов главным образом локализованы в прителомерных районах хромосом, тем не менее высокая структурная гомология с такими

участками, насколько известно, обнаружена впервые.

Были определены частичные нуклеотидные последовательности остальных гипервариабельных зондов и их сравнением с банком данных EMBL показано, что они не являются уже известными участками ДНК генома человека.

Установление хромосомной локализации фрагмента Red-2. для выяснения, на какой хромосоме человека располагается локус Red-2, использовали метод гибридизации с ДНК соматических гибридов По z мкг ДНК, выделенной из гибридных клеточных линий, несущих полный набор хромосон хомячка и одну или несколько хромосом человека (предоставлены Фирмой "Bios". США 1, расщепляли рестриктазой Fst i, разделяли по размерам в агарозном геле и проводили стандартную процедуру гибридизации по Саузерну в жестких условиях с пробой Red-2. как уже было описано, в жестких условиях пробой Red-2 детектируются только два гомологичных локуса Один полиморфным с гетерозиготностью 60'/. и размером в районе s т п о Второй леку около 2 т- п о. и является собственно тем участком генома, из которого была выделена область n<'d 2. данные по гибридизации и распределению хромосом человека в отдельных клеточных линиях представлены на рис- 6.

Что касается участка, в котором располагается последовательность Red-2, то Фра1мент, отвечающий данному искусу, обнаруживается на дорожках, на которые нанесены /IIIК клеточных линий «по, без, 9 37, 904, юоь 1049, 1П1*«47 и wai7, также на контрольных дорожках, куда наносили геномную днк человека Такое распределение может быть интерпретировано лишь одним образом - локус Red-2 располагается на 21 хромосоме человека Однозначно установить хроносомную локализацию полиморфного локуса, перекрестно гибриди-зуюшегося с пробой Hed-2, на данной выборке клеточных линий оказалось невозможным. Вероятными хромосомами-кандидатами могут

1

ХРОМОСОМА ЧЕЛОВЕКА'. 6 7 в 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X

Г>4

1 - 004 »414

2- 324

:)- 423 4

4- 7 34

5- 750

6- 803 4

7- 860 15?

8- 867 60'/

9- 940

10- 212

I1 - 507 4

12- 683

13- 811

14- 983

15- 862

16- 909

17- 937 4

18- 854 4

19- 904

20- 967

21- 968

22- 1006

2 3- 1049

24- 1079

25- 1099 4 Б

26- ДНК ХСНЯЧКа СН0104

27- НИ» 847

28- *А 17

29- Н01014 4 4 4 4

55/.

4444444444444444444

4 4 4

15/

5/

45/

4 4

40/ 25'/.

4 4

Рис. 5 локализация участка яей-2 на хромосоме человека 21. Вверху представлены результаты гибридизации с ДНК клеток сонатических гибридов- Ниже приведен список проанализированных ДНК в порядке нанесения и данные по распределению индивидуальных хромосом человека, и - делепия в области 5ч15. 1 - 5р15. 2 сч - множественные делении в области 5ч / - процент клеток в популяции, содержащих

обозначенную хромосому ♦ - более 75'/. клеток содержат хроносому человека

быть s или 20 хромосомы человека. Поскольку достоверные результаты при гибридизации in situ мультилокусной пробы получить затруднительно, прояснение этого вопроса требует более детальных исследований, для которых достаточной выборки клеточных линий наити пока не представляется возможным-

Заключение.

В геноме человека обнаружены несколько новых семейств повторяющихся последовательностей, а именно: гомологичных простому повторенному тетрануклеотидвому мотиву cgtg. Члены данного семейства главным образом представлены короткими участками, однакс в геноме человека такие повторы могут встречаться и в составе протяженных структур размером более 5 -г. п. о. В целом для кластеров таких повторов в геноме человека характерен невысокий уровень полиморфизма при гибридизации по Сауэерну. Следующее обнаруженное семейство повторяющихся элементов гомологично повторам iggtctln. Из результатов гиьридизапионного анализа можно предгюлогать, что повторы данного семейства образуют более протяженные кластеры и встречаются в большем количестве геномных сегментов, чем icutgi,,. Также для этого семейства характерен более высокий уровень межин-дииидуального полиморфизма длины рестрикпионных Фрагментов Наиболее летально в данной работе было исследовано семейство повторяющихся элементов, гомологичных повторам в гене env вируса hiv-i, названное семейством Red. Как было выяснено, по крайней мере некоторые из геномных участком, детектируемых пробои Red-i при гибридизации но Саузерну, несут кластеры танлемных повторов, по своей последовательности напоминающие рекомбинационный сигнал ciii- к. coii. однако выделенные н данной работе минисатсидиты имеют ряд свойств, до сих пор не описанных в литературе. Сюда

- а I -

юзможпо отнести короткую длину повторяющейся единицы в клоне ?е<1-2 или повышенное число обнаруживаемых гомологичных Фрагментов три гибридизации по Саузерну с пробами Ией-э и 1*е<|-4.

На основе полученных данных создана коллекция гипервариабель-шх маркеров ДНК, выявляющих множество полиморфных участков в еноме человека (всего шесть независимых систем, характеризуюших-:я различной степенью эффективности различения отдельных индиви-юв! и обнаружен один монолокусный полиморфный маркер.

Выводы.

i Клонированы в виде периодических протяженных сруктур короткие олигонуклеотидные мотивы, в том числе из епу-гена вируса ¡иV-1. Гибридизаиионным анализом показано, что в геноме человека имеются семейства сходных повторяющихся элементов, характеризую-нихся высокой генетической нестабильностью. ^

2. Проведен анализ представленности повторяющихся элементов нескольких семейств в геноме человека и некоторых отдельных хромосомах- Показано, что в целом члены данных семейств обнаруживаются в среднем в о, 5-2/ геномных сегментов размером 20 т. п. о.

3. выделено несколько индивидуальных участков генома, содержащих повторы Не<1-семейства- Молекулярно-генетический анализ клонированных Фрагментов показал, что по крайней мере пять из них несут участки вариабельных тандемных повторов- Различные варианты повторов ие^-семейства оказались по-разному распределены в геноме человека, что касается как количества копий, так и расположения родственных локусов

4- Определением нуклеотилной последовательности участка ке<1-2 (127а по. I подтверждено наличие н нем кластера повторявшихся

элементов-

5. Впервые описан нинисателлит с минимальным периодом 7-а пар оснований и показана гомология всей последовательности с chi-минисателлитами и теломерными структурами.

6. Определена локализация участка повторяющихся элементов на хромосоме человека 2» нетодом гибридизации с ДНК клеточных линий соматических гибридов хомяк/человек.

7. на основании полученных результатов создана коллекция гипервариабельных маркеров, характеризующихся моно- и нультило-кусной специфичностью. Впервые описаны нультилокусные маркеры, детектирующие сложные индивидоспепиФические профили распределения вариабельных фрагментов генома человека в жестких условиях гибридизации с высокой воспроизводимостью. Эффективность идентификации индивидуальных генотипов по опенкам, сделанным в нашей лаборатории, превышает описанную в мировой литературе. Разработанные тест-системы успешно применяются для проведения судебно-медицинских экспертиз в Экспертно-Криминалистическом Центре МВД России и попу-лянионных исследованиях в Российском Недико-Генетическом Центре-

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1- Рогаев Е И- , Шленскии Л-Б Зонд ДНК, содержащий элементы

гена поверхностного гликопротеина вируса вич-i, - эффективный молекулярный маркер для генотипоскопии человека Еюл Эксперим Биологии и Медицины, 1990, 12, стр.646-647. 2. Рогаев Е- И , Шленский А- Б- Проба геномной ДНК бактериофага ко юз выявляет гипервариабильные области генона человека. Бюл- Эксперим- Биологии и Медицины, 1990, 11, стр 525. 3 Rogaev К. 1. , Shlenslcy А. В. , Shapiro Yu. А. , The human genomic probe containing families oi simple DNA-repeats for identifi-

cation of multiple hypervariall 1 e restriction fragments. Cytogenetic and Cell Genetic, Abstract book, 1989.

4. Rogaev E. I. , ShlensKy A. B. , A genomic DNA-probe is sensitive marker for detection of human hypervariab1e regions. - Nucleic Acid Research, 1990, v. 19, p. 4.

5. Rogaev E. I. , ShlensKy A. B. , Kotilevtsev Yu. V. , Tarantul V. 7.. , Genotyping of mutable lines of rodents by DNA-fingerprinting. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990, p. 52.

6. Rogaev E. I. , ShlensKy A. D. , Aggregation of two unrelated hypervariable families of tandem DNA-repeats in genomic loci. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990, p. 52.

7. Rogaev E. I. , ShlensKy A. B. , Systematic approaches for isolating human VTR DNA markers. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990, p. 46.

8. Rogaev "E. 1. , Eorovaitseva G. I. , Spoonde A. Ta. , ShlensKy A. B. , Universal hypervariable multiloci DNA-markers. Abstracts of First Internationa) Conference on DNA fingerprinting. 1990,

p. 47.

9. Rogaev E. I. , Korovai t seva G. I. , ShlensKy A. D. , Sirokvasheva E. Yu. , Piroenov M. G. , Stegnova T. V. , Human genotyposcopy: human specific, sex, paternity and individual identifications by tandem repeatitive DNA-eIements in forensic practice. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990, p. 43.

'.0. Rogaev E. I. , Korovai tseva G. I. , Sirokvasheva E. Yu. , Spoonde

A. Ya. , ShlensKy A. B. Artificial tetraroer-nucIeotide repetitive DNA-probe for universal intra- and interspecies genotyping. Fingerprint News, 1991, Vol. 3(3), p. 1 1.

I I. Rogaev E. 1. , Koroval t seva (3. I. , Shlensky A. 1]. Artificial hexa-mer-nuc leot ide repetitive DNA-probe for universal genotyping. Fingerprint News, 1991, Vol.3(3|, p. 12.

12. Rogaev E. 1. , Korovaitseva G. I. , Shlensky A. B. Artificial pen-

tamer-nuc1eotide repetitive DNA-probe for universal genotyping Fingerprint News, 1991, VoI.3(3|, p. 13

13. Rogaev E. I. , Shlensky A. B. DNA-probe containing retroviral repeated elements for universal human and animal individual identifications. Fingerprint News, 1991, Vol. 3(3), p. 14.

14. Rogaev E. I. , Korovaitseva G. ]. , Shlensky A. B. , Ilypervariable DNA markers for linkage analisis and study of methy 1 at ion of cromosomal loci in mental disorders. , Biol. Psychiatry, 1991, 29, p. 666S.

15. Shlensky A. B. , Rogaev E. I. , Polymorphic DNA probe from chromosome 21 containing HIV-like and telomeric repeats. , Abstracts of ESHG 24th Annual Meeting, 1992, p. 137.

16. Shlensky A. B. , Rogaev E. I. , Searching of whole genome for hypervariable DNA regions. Am. J. Hum. Genet. 1991, Vol.49, p. 388.

17. Rogaev E. I. , Shlensky A. B. , Human genome contains hypervariable sites of HIV-l retroviral genes: genetic markers and genomics organization. , Am. J. Hum. Genet. 1991, Vol.49,

p. 387.

18. Shlensky A. 1). , Lavrushina О. M. , Rogaev E. I. , Evolutionary conservative probe with HFI.P polymorphism and location in the

t e 1 omera-I i ke region at 2tq. Hum. Molec. Genet. 1993, in press.

19. Кочков H 11. , Ногаев Е. И. , нолика Ю. К. , Шленский А. Б- . Асанов А. Ю- , Выявление генетических нутаций в гипервариабельных районах ДНК человека с иелыо генетического мониторинга. Доклады АН СССР, 1993, в печати.