Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей ДНК в геноме человека"

российская академия медицинских наук научный иедиео-генетический центр

На правах рукописи

Пленений Александр Борисович

молекулярно-генетический анализ гипервариабельных повторяющихся последовательностей днк в геноме человека

оз. оо. 1 5 - генетика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва «99 3 г.

- < -

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В данной работе продолжено исследование гипервариабельных районов ДНК человека, представленных тандемно повторяющимися последовательностями, проводимое в течение последних нескольких лет в лаборатории нолекулярной генетики мозга Н1ШЭ РАИН. Диссертационный материал является целостным исследованием одного из сенейств такик повторов, сходных по нуклеотидной последовательности с вариабельными элементами еп*-гена вируса шу-1. в работу вошли: разработка экспериментальных путей поиска гипервариабельных участков ДНК, генетический анализ, определение нуклеотидной последовательности и хромосомной локализации таких участков. Практическим результатом явилось создание коллекции высокоэффективных полиморфных маркеров ДНК, пригодных для применения в анализе генетического сцепления, популяпионных исследованиях, криминалистике и некоторых других областях.

Актуальность проблемы. Установление Феномена повышенной нестабильности определенных семейств геномных элементов, хромосомных локусов и доменов, является одним из центральных вопросов при исследовании нолекулярно-генетической природы наследственных заболеваний. Например, повышенный спонтанный мутагенез может являться объяснением причин также повышенной частоты встречаемости дефектных генов некоторых болезней, поддерживавшейся в различных популяциях. С другой стороны, выделение нестабильных, гипервариабельных локусов, позволяет использовать их в качестве высокоинформативных генетических маркеров для анализа спепления с дефектными генами при наследственных заболеваниях. Поскольку высокая доля средовых Факторов, генетическая гетерогенность и возможный полигенный характер болезни требуют проведения полного обсчета при анализе спепления на возможно более ограниченном числе сеней из

- г -

генетических изолятов, информативность маркерной системы (Polymorphic Information Content) существенно зависит от велечины гетеро-зиготности (Н) локуса, выявляемого маркерон (Botstein et ai, 1980].

Наибольшее число маркеров сейчас основано на обнаружении замен или делепий/инсердий одного нуклеотида, что может выражаться в наличии или отсутствии сайта рестрикции, определенном типе конФор-маоии анализируемого Фрагмента или показано прямым определением нуклеотидной последовательности интересующего участка ДНК при помоши полинеризаиионной цепной реакпии ifcri. Поскольку в подав-ляюшем большинстве случаев удается обнаружить лишь два альтернативных варианта аллеля, гетероэиготность в данном случае не ножет превышать 50/. крупные инсерпии и делепии, как правило, характеризуются также диаллельным состоянием локуса. Информативность таких наркерных систем невелика, что делает их непригодными для анализа большей части родословных.

Вариабельные тандемные повторы ("vtri - наиболее перспективный тии полидллельного полиморфизма для генетического картирования. Главной основой такого типа полиморфизма является вариабильное число тэндемных повторов ivntr). vth-аллели ногут отличаться также вышеперечисленными видами полиморфизма, создавая широчайший спектр межиндивидуальной полиаллельнои вариабильности iwyman & White, i gao i.

Первые полиаллельные локусспециФические vmtr локусы были обнаружены в начале во-х годов в анонимной иоследовательности на (4-й хромосоме, а затем вблизи ряда кодирующих генов twyman s White, I9ÍO, Bell et al., igai, Higgs et al., 1981). с тех пор накоплена серия локусспепиФичных vntb маркеров. Выявлены vntk-локусы, гетероэиготность которых достигает 9«-99х, а число аллелей более 60 (Jeffreys et al., 19И5, NaKamura et al. , 19В7]. Такие

чрезвычайно информативные маркеры гарантируют идентификацию отцовского и материнского аллелей в сегрегационном анализе практически в любой анализируеной семье. Обнаружение таких проб ДНК явилось новым импульсом для развития генетики, позволило проводить систематическое изучение генетики человека, комплексные медико-генетические идентиФикапии, изучение механизмов изменчивости геномных локусов в эволюции живых организмов, выяснение особенностей молекулярной структуры "горячие" точек рекомбинации.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка способов выявления сверхизненчивих участков генома человека, клонирование таких участков, оценка их популяпионной гетерогенности, изучение молекулярной и хромосомной организации и описание неизвестных ранее семемейств элементов генома, вызывающих повышенную изменчивость генетических локусов. На основе полученных результатов была создана коллекция наркеров ДНК, характеризующихся локусспепиФической и мультилокусной локализацией в геноме, пригодных для использования в качестве проб в медико-генетических и популяиионных исследованиях.

Для достижения поставленной пели решали следуюшие задачи:

1- Синтез олигонуклеотидных зондов и их клонирование для получения эффективных гибрилиээнионных проб, выделение клонированных вставок гипервариабельных участков ДНК.

2. Гибридизация зондов ДНК с несколькими библиотеками для анализа распространенности тандемно повторяющихся элементов в геноме человека и отбор клонов, иссушил такие повторы.

3. Создание мини-библиотек из клонов кандидатов и отбор непосредственно участков, содержащих кластеры тапдсмных повторов-

♦ Опенка степени полиморфизма клонированных участков и отбор гинернариабелъных зондов

5. Секвенирование гипервариабельных участков ДНК человека.

б- Установление хромосомной локализации полученных полиморфных маркеров методом гибридизации с ДНЕ клеток соматических гибридов.

Научная новизна- Для детального изучения представленности и молекулярной организации в геноме человека были выбраны повторяющиеся элементы, сходные с тандемными повторами в env-гене вируса Hiv-I (Wong-staal et a I , igesj. Показано, что у человека имеются участки ДНК, гомологичные повторам hiv-i (названные повторами Red-от аигл. Bepeat Envelope Deletion), многие ИЗ которых ЯВЛЯЮТСЯ высокополиморфныни. В делом характер распределения гомологичных фрагментов при гибридизации по Саузерну напоминает таковой для повторов из гена hi бактериофага М13 по количеству Фрагментов и степени их вариабельности, но отличается набором детектируемых локусов.

Было выделено несколько индивидуальных участков генома, предположительно содержащих повторы Bed-семейства, дальнейший молеку-лярно-генетический анализ отобранных клонов показал, что некоторые из них действительно несут такие Фрагменты, характеризующиеся высокой нестабильностью в геноме- Различные варианты повторов Red-семейства оказались по-разному распределены в геноме человека, что касается как количества копий, так и расположения родственных локусов.

Определение нуклеотидной последовательности одного из участков показало наличие в нен кластера повторявшихся элементов- При сравнении структуры этих повторов с известными мотивами было установлено, что семейство Red-повторов относится к широкому классу мини-сателлитов, напоминающих по нуклеотидной последовательности реком-бинапионный сигнал е. сои, или chi-нинисателлитов, впервые описанных А. джеффрисом iJeffreys et ai., igas). ряд свойств выделенного повтора позволяет предположить эволюционную и Функциональную значимость данной последовательности и могут быть полезны при

построении классификаиии минисателлитоп как таковых и простых тандемных повторов в целом. Впервые описан минисателлит с нини-мальным периодом т-в пар оснований и показана гомология всей последовательности с теломерными структурами и генами Функционально важного класса различных глобинов и некоторых онкогенов.

Определена локализация участка повторявшихся элементов на хромосоме человека 21 методом гибридизации с ДНК клеточных линий соматических гибридов хомяк/человек-

Научно-практическое значение. На основании полученных результатов оказалось возможным создать коллекцию гипервариабельных маркеров, характеризующихся моно- и мультилокусной специфичностью Впервые описаны мультилокусные маркеры, детектирующие сложные индиЕидоспениФические профили распределения вариабельных фрагментов генома человека в жестких условиях гибридизации с высокой воспроизводимостью. Эффективность идентификации индивидуальных генотипов по оценкан, сделанным в нашей лаборатории, превышает описанную в мировой литературе на несколько порядков. В нескольких совместных исследованиях было показано, что разработанные тест-системы являются эффективными при анализе генетических изменений при злокачественных изменениях, эволюционных и популяпи-онных исследованиях, или при оценке генетической нестабильностии в ралиаиионно неблагоприятных районах. С использованием разработанных проб проводятся криминалистические экспертизы и установление отионстм в Экспертно-Криминалистическом Центре МВД России- Для анализа сисплености геномных локусов, ответствнных за шизофрению и ('Ojkv'hi. Лльнгеимера, в нашей лаборатории проводилось тестирование отягощенных семей при помощи получения гипервариабельных мар-кгрон- На основании накопленных данных можно утверждать, что разработанные системы генетической идентификации не только не уступают, но по эффективности анализа несколько превосходят широко

- « -

используемые во всем мире для генотипирования нинисателлиты А- ДжеФФриса и олигонуклеотидные пробы и.Зпплена- Разработанные нонолокусные гипервариабельные пробы - еше одна из многих точка отсчета для построения полной генетической карты генома человека-

Положения, выдвигаемые на защиту.

». Обнаружено несколько новых семейств повторяющихся последовательностей ДНК человека и проведен анализ их представленности в геноме и некоторых отдельных хромосомах.

2. выделены индивидуальные участки генома человека, содержащие последовательности, гомологичные повторам из env-гена вируса hiv-i (Red-семейство!. Показано, что варианты таких повторов гомологичны различным гипервариабельным локусан в геноме человека.

3. Определена нуклеотидная последовательность неизвестной ранее вариабельной области генома человека Hed-2.

4. определена хромосомная локализация участка неа-2 методом гибридизации с ДНК клеток соматических гибридов человек/хомяк.

5. создана коллекция новых гипервариабельных маркеров ДНЕ, пригодных для ДНК-фингерпринтинга, популяционных и недико-генетических исследований

Апробация работы Результаты исследования были представлены на межлабораторном семинаре Института Клинической Психиатрии НШ1Э РАИН 1 i992 г. 1, Первой международной конференции по ДНК-Фингер-принтингу (Берн, 1990 г. 1, 24 Европейской конференции но генетике человека (Эльсинор, 19У2 г.i, второй международной конференции по ДНК-Фингерпринтингу I Белу-Оризонте, 1992 г I.

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 19 печатных работ-

Структура и объем работы Работа изложена на /2% страницах машинописного текста-, состоит и"- хиглепия, обзора литературы, экс-

периментальнои части и обсуждения, заключения, выполов и списка иитированнои литературы Incero^i? названий|. Диссертация содержит У" рисунков и ¿> таблиц, помешенных в тексте-

Материалы и методы-

Плазмидную ДНК выделяли телочным методом, высокомолекулярную ДНК человека - метолом Фенольной экстракции (Маниатис и др. , i 9 в б|, ДНК Фага лямбда - ультрдпеитриФугированием (Забаровский, Турина, 1988]. все манипуляции с ДНК (электрофорез, гидролиз рестриктазами, клонирование, блоттинг-гибридизация и т. д. I проводились в соответствии с протоколами, приведенными в руководстве Маниатиса с соавторами (Напиатис и др., 1986 1, иногда с незначительными молиФикапияни При подготовке Фильтров для блоттинг-гибридизации использовали вакуумный перенос ДНК на Фильтр (Зайцев, Яковлев, 1983|. Радиоактивное мечение ДНК фосфором проводили методом случайного прайниронания но методике Фирмы Amerstiam.

Расшифровку иуклеотидных последовательностей проводили по методу Сэнгера isanger и др., »977 1 н соответствии с рекомендациями Фирмы usb или по методу Максама и Гилберта (Maxam, Gilbert, 19801 в твердофазном варианте (Чувпило, Кравченко, i486).

ДНК клеточных линий соматических гибридов человек/хомяк, содержащих отдельные хромосомы человека была предоставлена Фирмой

bios.

Результата и обсуждение

Клонирование простых симтртичг_ских по кто рои Для получения протяженных участков периодически повторяющихся структур ДНК применялась следующая стратегия: Были синтезированы несколько

- в -

слигонуклеотидных зондов, последовательности которых представлены на рис-i. Олигонуклеотиды каждой пары взаимно комплементарны таким образом, что при образовании двухиепочечной структуры с двух сторон остаются неспаренные участки, способные взаимодействовать со следующим олигонуклеотидом и так далее, образуя кластеры тандемных повторов. Комплементарные зонды отжигали и лигировали несколько раз, протяженные участки тандемных повторов выделяли из полиакриламиднго геля Выделенные повторы клонировали в вектор ръсиз, линеаризованный рестриктазой sina 1 и обработанный щелочной ФссФатазой (PharmacJal

Seq 13 ccacctgcccacctct

Seq 14 gcaggtggagaggtgg

Seq 32 cgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtg

Seq 3 3 cacgcacgcacgcacgcacgcacg

Seq 35 CCCCA'fCTCCACCCCCATCTCCAC

Seq 36 ggggtggagatgggggtggagatg

Seq 52 ACACCACACCACACCACACC

Seq 53 ggtgtggtgtggtgtggtgt

Рис. i Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных

зондов, использованных для клонирования, seq 13 и и -последовательность повторяющейся единицы минисателлита А ДжеФФРиса 33 15 IJíffrejs et al , J9Í5I, Seq 32 и 33

- простой тетрануклеотидный мотив icgtgi,,, seq 35 и 36

- повторяющийся элемент <2 по. из env-гена вируса HIV-l (Vong-Staal et al., 19в5|, Seq 52 и 53 - пента-нуклеотидпый мотив (ggtgt],,.

Для дальнейшей работы были отобраны клоны, содержащие самые длинные вставки: Seq 13/14 - около »50 но., Seq 35/36 - около 150 по, Seq 32/-J3 - около 200 п. о и Seq 52/53 - около 300 н о. Соответственно полученные гибридизапионные пробы были названы: составленная из последовательностей seq 13 и 14 - msj (Jetfreys mm i sat <■ 1111<! | , из Seq 35 и 36 - Red-1 (repeat envelope deletlonl и no аналогии из Seq 32 и 33 - Brovrn 4. 2, и seq 52/53 - Blue 6. 2.

Для ответа на вопрос, присутствуют ли в геноме человека семейства полиморфных повторяющихся последовательностей, гонологичных клонированным, ДНК нескольких индивидов расщепляли поотдельности рестриктазами есо ri, Pst i, Taq i и нае in, разделяли в о,т/. агарозном геле и переносили на нейлоновые Фильтры Hybond N I "Amerstiam" | по Саузерну. Участки клонированных повторов вырезали пслилинкерными рестриктазами Есо щ и Hind ill, отделяли от вектора в легкоплавкой агарозе и вырезали области геля, содержащие ДНК неганок Непосредственно в легкоплакой агарозе вставки метили методом случайного затравления и гибридизовали с ДНК человека, иммобилизованной на Фильтрах п фосфатном буфере при ьо°с. отмывку проводили в мягких условиях i1xssc, о,1/sds). в описанных условиях всеми пробами детектировались сразу несколько гомологичных локусов в геноме человека, проявляющих полиаллельный полиморфизн за счет различия в количестве повторяющихся единиц в каждом аллеле и, следовательно, длине вншепляемого некоторой рестриктаэои фрагмента ДНК, соответствующего конкретному локусу, выявляемому на радиоавтографе- Наибольшее разрешение полиморфных Фрагментов наблюдалось при использовании ррстриктазы Нае ill, видимо, за счет максимального удаления уникальных последовательностей, прилегающих к кластерам тлнлемных повторов- Результаты гибридизации нсех описанных проб с ДНК человека, расщепленной рестриктааой пае ill, представлены на рисунке 2.

Из данных по гибридизации видно, что пробой Brown 4. г выявляются 2-е полиморфных Фрагментов и несколько интенсивно гибридизую-шихся неполиморфных в области от 1 до 20 т. п. о. , то есть она может быть отнесена к зондам, выявляющим среднее количество локусов-Остальные пробы являются мультилокусными. при гибридизации ДНК человека со вставкой Blue 2. г на радиоавтографе наблюдаются более десяти полиморфных фрагментов, со вставкой Red i - более двадцати и два интенсивно гибридизуюшихся неполиморФных Фрагмента размером около 5 и б т. п. о- проба msj использовалась в качестве своего рода контроля, поскольку подобный мультилокусный мультиаллельный полиморфизм был описан для пробы 33.15 А. Джеффрисом Для клона Red-l на материале нескольких семей был показан менделевский характер наследования полиморфных Фрагментов (рис. з|.

Анализ представленности повторов в геномных библиотеках Олигонуклеотидные пробы, использованные для получения искусственных полиморфных зондов, а также некоторые другие, в том числе и клонированные геномные участки, содержащие повторявшиеся элементы tau-, аро- (Рогаев ЕИ, 1Ч«в) и прицентромерные повторы РВ9 (Deiningeret al., 19011, и aBi (Юров И-Б И др. ,1908 1 использовали для гибридизации с клонотеками фрагментов как всего генома человека, так и отдельных хромосом (21 и X) в Фаговом векторе лямбда емш.-з.

Для выявления наибольшего количества последовательностей с нестрогой гомологиси условия гибридизации и отмывки олигонуклео тидных зондон выбирали как наиболее мягкие при отсутствии неспе-ииФического скязынания с ЛИК вектора и клеток-хозяев. Клонированные фрагменты гибрилизооали по той же схеме, как при блоттинг-гибрилизаи^и по Саузерну. регистрировали сигналы, четко отличавши еся от Фоновой г-ибрилизании Всего было проанализировано юо тысяч Фаговых бляшек клонотеки Фрагментов целого генома человека, so

- 1 I -

ТЫСЯЧ специфических ДЛЯ ХРОМОСОМЫ 21 И 25 тысяч для хромосомы х в таблице I приведены данные по представленности гомологичных последовательностей в геноме человека.

тотальная библиотека

проба

г

21 хромосома

х-хромосома

Бец 12 Беч 1 3 Яеч 3 2 Яеч 35 Веч

Яеч 52 а ро -1 аи-

рр«д

аК6

I 00

20-1500 30-2500 2000 50

( 500

О, I О

О, 02-1 , 50 О, 03-2, 50 2, 00

0, 05

1, 50

300-5000 О, 30-5, 00 50- 1 ООО О, 05- I , 00

500

2000

45 I 75

1, 00 50

О, 20

4, 00 10 0, 04

О, 09 О, 35

Табл. < Распределение повторяющихся последовательностей в геноме человека и отдельных хромосомах. Указано количество позитивных клоком из проанализированных 100 ООО ЛИЯ тог.ии,пои библиотеки, 5« ООО - ДЛЯ 21 хромосомы И 25 ООО для х-хромосомы и процентное количество геномных сегментов размером 20 т. п. о , содержащих нонторы к обшей длине генома человека, или длинам отдельных хромосом-

Из представленных л.пшых видно, что тапдемнне повторявшиеся элементы или сходные не, структуре участки встречаются в довольно

- м -

большом количестве Фаговых клонов, однако до сих пор остается не выясненным вопрос, случайно ли распределены кластеры повторов по всему геному- Существует точка зрения, что повторы минисателлитов локализуются главным образом в субтеломерных районах хромосом, в данной работе была предпринята попытка обнаружить припентромерные нинисателлиты, для чего библиотеку клонов из 2) хромосоны гибриди-зовали с ДНК сателлита PD9 и альФа-повторов и олигогонуклеотидными пробами seq зб и seq 52. Однако при вторичном скрининге не удалось обнаружить ни одного клона, перекрестно гибридизуюшегося с использованными пробами. С другой стороны, для минисателлитов пока не было обнаружено слепленного с полом наследования каких-либо локусов, что вполне согласуется с нашими наблюдениями относительно слабой представленности повторов минисателлитов в х-хромосоме- Не исклчено, что в половых хромосомах основная Фракция повторяющейся ДНК соствлена из простых элементов длиной не более шести нуклеоти-дов, или микросателлитов, что можно предположить из литературных данных-

Клонирование полиморфных районов генома человека, для выделения индивидуальных участков генома человека, несущих тандемно повторявшиеся последовательности, из Фаговых библиотек изолировали отдельные бляшки, даюшие положительный гибридизапионйый сигнал с тем или иным зондом. Всего после вторичного скрининга были отобраны 371 индивидуальный клон, в дальнейшей работе использовали 9в клонов, содержащих фрагменты ДНК, гомологичные пробе seq 35, Выбор был обусловлен тем, что проба Red-) являлась наиболее информативной для выявления межиндивидуального полиморфизма, с другой стороны, ставилась задача выяснить молекулярную организацию в геноме человека последовательностей, гомологичных повторан env-гена вируса hiv-i.

Выделяли ДНК индивидуальных Фаговых клонов и подтверждали

специфичность гибридизационного сигнала, проводя блоттинг-гибридизапию по Саузерну с Фаговой ДНК, разрезанной различными рестриктазани. Размеры вставок геномной ДНК человека, вытепляемых рестриктазой Sai Gl, варьировали от ю до 20 т. п. о- Интенсивность гибридизации рестриктных фрагментов с пробой seq 35 условно можно было подразделить на сильную, среднюю и слабую. "Внутренним контролем" специфичности гибридизации служило отсутствие таковой с Фрагментами ДНК вектора.

С использованием рестриктаз нае Iii и Pst I в Фаговых клонах 35.i - 35. 10 были идентифипированы фрагменты размером не более 2 т. п. о. , несушиё участки, гомологичные повторам env-гена вируса hiv-i, выделены из легкоплавкой агарозы и использованы в качестве гибридизапионной пробы. После отмывки в мягких условиях оказалось, что Pst i фрагмент клона 35.i способен гибридизоваться с ДНК человека на фильтре как нультилокусная гипервариабельная проба. Вставки из остальных девяти клонов выявляли на Фильтрах либо недиФФеренпируемый пул гомологичных фрагментов во всей диапазоне разнеров, либо один, не полиморфный для выборки из трех индивидов, локус.

Более детальное исследование пробы 35.1, названной впоследствии для простоты Red-2 показало, что при ее гибридизации с нае ш рестриктами ДНК человека детектируются в среднем 22 четко различимых гомологичных Фрагмента. Были проанализированы профили гибридизации с нае ш-рестриктами ДНК тридцати неродственных индивидов и выяснено, что вероятность появления у двух индивидов фрагментов одного размера составляет 0,23. Таким образом, вероятность совпадения индивидуальных профилей распределения гонологичных пробе Hed-2 Фрагментов у двух неродственных индивидов р=о, 2з22 или 9,07x10"'5, то есть эффективность данного мультилокусного зонда оказалась сравнимой с эффективностью минисателлитов А. ДжеФФриса в

сходных условиях гибридизапии. Было также установлено, что наследование полиморфных локусов происходит по законам Менделя и что индивидуальные Фингерпринты обладают соматической стабильнстыо, а также являются идентичными у нонозиготных блиэнепов. Достаточно представительной выборки для определения скорости образования новых аллелей исследовано не было. В десяти тестированных семьях (20 родителей и i 7 детей) был обнаружен лишь один аллель, возникший de novo, при гибридизапии с ДНК человека, растепленной Pst i, в жестких условиях пробой Bed-2 детектируются только два гомологичных локуса. Один полиморфный с гетерозиготностыо eoz и размером в районе 5 т. в. о. второй локус около 2 т. п. о. и является собственно тем участком генома, из которого была выделена область sed-2, что было показано при -гибридизации с теми же Фильтрами не несущего тандемных повторов Pst i/sac j фрагмента клона Bed-2. Его полиморфизма при разделении в о, т/. агарозе наблюдать не удается. Если использовать для растепления геномной ДНК рестрик-тазу Нае HI, то возможно видеть лишь полиморфный локус, при этом различия в размерах фрагментов становятся более ошутимыми. НеполиморФный участок разрезается на несколько небольших Фрагментов, которые выходят из агарозного геля во время электрофореза.

Для дальнейшего поиска полиморфных клонов использовали стратегию создания мини-библиотек в цлаэмидном векторе pucia. не выделяя вставку, ДНК Фаговых клонов расщепляли рестриктазой sau за и клонировали в полилинкер pucia по вата hi сайту. Высевали по юоо-2000 колоний на чашку и проводили скрининг олигонуклеотидной пробой seq as. Из клонов, гибридизуюшихся с пробой, выделяли плазмидную ДНК и подтверждали специфичность сигнала гибридизацией с плазмидной ДНК по Саузерну. Было отобрано 24 клона, размеры иставок варьировали от той до почти 5000 п. о- Из клонов выделяли встапки в легкоплавкой агарозе и использовали их в качестве проб

мэа Вго*гп В1ие Яе<1-1 Не<1-2 Ке<1-Э Не<1-4 Кеа-5 33.15

Рис. 2 Сравнение профилей распределения полиморфных Фрагментов, выявляемых клонированными пробами на одних и тех *е Фильтрах (Нае ш, три индивида!- Приведены'такие результаты гибридизации минисателлитов МБи и зэ. 15.

QQ^QQ^QO^ ОгР^^^O^DСу]CyJ OjOO^OO^O

sfei м** i e r f

.f - T

... --« • МВЬдакйвА.inUHkм,к

f* _ ....

I M* flli «•» Mi1 'I ^^ . t %

В f"

^ * x Ш V

... . p*.* -

f^ ** >1* t* Mi •:«

Red-1

hp <1-2

Bed-4

Рис. з Наследование профилей распределения полиморфных Фрагментов, детектируемых пробами

Red-1, Red-2, Hed-4 и Red-5.

при гибридизации на Фильтрах с ДНК нескольких индивидов, растепленной рестриктаэани £ео Ri, Pst I, Ta<i l и Hae ill. Отнывку вели в жестких условиях ю, ixssc, О, 1ZSDS).

Клон 35. 13 содержал вставку геномной ДНК человека размерен i too п.о. Используя этот Фрагмент как зонд при гибридизации по Саузерну даже в жестких условиях удается с высокой воспроизводимостью детектировать множество гомологичных полинорФных участков в геноме человека (рис.2). Обший профиль распределения полиморфных Фрагментов на радиоавтографе не совпадает с таковым для мультилокусных зондов Ked-i и Red-2. наиболее информативным Ферментом рестрикпии для данного зов да является пае т. на индивидуальном Фингерпринте выявляется около тридцати отдельных Фрагментов, гомологичных пробе. Показано менделевское наследование Фрагментов в родословных и соматическая стабильность.

фрагмент генома ДНК человека Red-4, присутствующий в виде вставки в другом клоне - 35.14 - размером также поо п о., при гибридизации с ДНК человека в жестких условиях выявляет сложные профили распределения множества фрагментов, похожие на таковые для пробы Red-з. Как показал дальнейший анализ, около во/, гибридиэу-юшихся с двумя зондами участков геномной ДНК представлены на радиоавтографе фрагментами одного размера и лишь в 1/5 случаев обнаруживается специфический для той или иной пробы вариант. Значимых различий в числе детектируемых локусов для выборки из 20 человек также не было обнаружено: обеими пробами выявляется около тридцати Фрагментов н диапазоне размеров от з по 25 т.п.о. Была определена вероятность обнаружения Фрагмента определенной длины у двух неродственных индивидов q=0, 2R для Rrd-.l, и 0,24 для Red-4, установлен менделрвскии характер наследования и соматическая стабильность Фингерпринтон.

проба количество Фрагментов г>

мэ а

Ке<1- I Не<1-2 Бе<1- 3 Яес1-4 Кеа-5 33. I 5

27, 20 22, 00 23, <4 32, 33 31 , 38 6, 96 26, 66

1 , Ю 3, 59 2, 22 I , 50 3, 60 1 , 34 2, 50

вероятность обнаружения одинаковых фрагментов ч

О, 26 О, 23 О, 22 О, 25 О, 26 О, 35 О, 25

О, 02 О, 06 О, 10 0, 02 О, 07 О, 20 О, 02

эффективность р

1.22 10"1 6

9. 07 10~15

6. 07 10"16

3. 43 1 0"20

4. 38 10"19'

б. 70 10"4

в, 89 10"17

Табл. 2 представлены данные по обнаружению одинаковых по

размерам Фрагментов у неродственных индивидов и их обшену количеству не менее, чей по 20 измерениям. Вероятность ч рассчитывали по отношению количества обших Фрагментов у двух людей к среднему количеству Фрагментов У каждого- Эффективность пробы определяли как вероятность совпадения индивидуальных профилей распределения полиморфных Фрагментов у двух неродственных людей по Формуле р=чп. Для сравнения приведены те же значения для минисателлитов ДжеФФриса, определенные в нашей лаборатории и близкие к литературным-

строго говоря, приведенные данные по количеству детектируемых Фрагментов и вероятностям совпадения полос можно считать лишь ориентировочными, поскольку конкретные значения могут варьировать в зависимости от времени проведения электрофореза и его качества,

- ig -

а также качества переноса и собственно гибридидизапии и, до некоторой степени, личных вкусов и опыта экспериментатора, в данном случае был проведен обсчет для стандартных условий и времени электрофореза и гибридизапии, при его увеличении число п в таблице 2 может возрастать, а ч наоборот, уменьшаться. Тем не менее, из представленных в таблице данных видно, что пробы Red-з и 4 являются несколько более эффективными нультилокусннми маркерами, чей Hed-l и 2 и тем более, чем Brown 4. 2 и Blue 6. 2. В условиях нашей лаборатории также были определены статистические характеристики для минисателлита ДжеФФРиса и искусственной пробы msj, оказавшиеся сходными с данными, представлеными в литературе. Из таблицы видно, что эффективность идентификации конкретного Фин-герпринта для этих проб сходна с таковой для Red-l и 2 и несколько ниже, чем для Red-з и 4. то же, вероятно, ножно сказать и об условиях гибридизации. Пробы за. 15, msj, Red-i и 2 способны детектировать сложные профили распределения Фрагментов лишь в мягких условиях отмывки, что чаше всего связано с повышенным Фоном на Фильтре и сложной воспроизводимостью. Пробы Red-з и 4 такого недостатка лишены, поскольку гибридизапия с ними проводится в жестких условиях.

Хотя индивидуальные профили распределения Фрагментов для проб Red-з и Red-4 являются сходными, этого нельзя сказать об их рестриктных картах, что свидетельствует о том, что были клонированы два разных Фрагмента ДНК генома человека. В частности, рестриктазой Fst i из плазмиды pRed-э вылепляется фрагмент вставки размером около 250 п. о. ; сайта растепления Pst 1 во вставке Red-4 не имеется. С другой стороны, рестриктаза Neo i отшепляет от вставки Red-4 фрагмент длиной около 600 по. со стороны Hind III-сайта полилинкера. Если использовать эти короткие участки в качестве гибридизапионных проб, гомологичным в ДНК человека

оказывается лишь один уникальный участок генома, в то время как более длинные фрагменты выявляют несколько полиморфных локусов, как и исходное пробы. Для Фрагмента Neo i/Hind ш с использованием для растепления геномной ДНК человека рестриктазы нае ш, не имеющей сайтов растепления в исходной вставке и, следовательно, вышепляюшей в геноме кластер повторов вместе с уникальным участ-кон, были определены частоты появления аллелей и гетерозиготность локуса Bed-4 для 25 неродственных индивидов (табл. эь

аллель частота размер о

ФРагнента

О. 945 О, 500 О, 1 4« О, I 82 О, 045 О, 068 О, 023 О, 023

2037 21 64 2 348 2468 2593 2730 2882 3095

14 16

20 23 17

35

Табл. з Аллельные варианты геномного локуса ке<1-4,

определенные из гибридизации исо 1/шпа ш Фрагмента вставки ией-4 с Нае II1-рестРйктами ДНК 25 неродственных индивидов. Приведены размеры . гибридизуюшихся фрагментов и частоты встречаемости каждого аллеля- Гетерозиготность пробы в целой составила Н=64/.

Еше более похожими, даже просто совпадающими, оказались профили выявляемых фрагментов для пробы, выделенной из тотальной

клоно-геки Фрагментом генома человека в Фаге лямбда embl-э - tas. 15 I ке<1 б i и пробы, выделенной из специфической для хроносомы 21 клопотеки - 35.21 15 i He<i-5 i. при жесткой отмывке ими детектируются тождественные наборы Фрагменов, гибрилизуюшиеся с очень высокой интенсивностью. По количеству выявляемых фрагментов пробы можно отнести к "срелнелокусннм" - их число в наших экспериментах никогда не превышало десяти, распределенных в диапазоне размеров от о. 5 до 10 т.п о- Также не очень высокой является вариабельность каждого из локусов: вероятность обнаружения гибридизуютегося фрагмента определенного размера составила о, зе, а вероятность совпадения двух Фингернринтон - почти i/iooo. Пробы явно не подходят для обычного ДНК-Фингерпринтинга, но могут служить прекрасным вспомогательным инструментом для идентификации личности или подтверждения отцовства, а также в поиуляиионных исследованиях.

Несмотря на полное совпадение Фингернринтов, выявляемых каждой пробои, рестриктные карты клонов отличаются довольно сильно Размер вставки в клоне Reii-6 - около 4 т. п. о- , причен в ней нет ни одного сайта рестрикции, присутствующего в полилинкере рис 1«, тоща как вставка в клоне Med г. имеет размер 1-Я т. п. о. и она расщепляется рестриктазой Pst i па три Фрагмента размерами «оо, .чоо и 20« п о Точно так же не было найдено гомологии и между частично определенными нуклеотилными последовательностями вставок в каждом клоне

Здесь необходимо заметить, что проблема гомологии участков генома, содержащих кластеры минисателлитов, до сих пор остается нерешенной В частности, было показано, что многие локусы, несуиие тандемно повторенные миписателлиты, ло определенной степени "перекрываются" между собой то есть при пибрапных условиях способны перекрестно гибрилизонатьси с несколькими известными пробами (ч i ti er i imieri и др , 149 I! Что же касается соотношения нуклео-

тидннх последовательностей составлявших такие минисателлиты повторяющихся единиц, то до сих пор также не разработано удовлетворительной количественной теории гибридизации таких зондов- Поэтому проблема "перекрывания" для индивидуальных проб пока решеается лишь чисто умозрительно и, может быть, некоторую ясность может внести анализ наследования отдельных Фрагментов профилен гибридизации различных минисателлитов, да и то лишь до определенной степени

Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов- Для выяснения, действительно ли наблюдаемые сложные профили распределния гомологичных участков при гибридизации с ДНК человека связаны с наличием повторявшихся структур и, если это так, для анализа молекулярной организации участков, гомологичных тандемным повторам env-гена вируса hiv-i, было предпринято определение нуклеотидной последовательности геномного Фрагмента Red- 2. Сначала секвенировали приблизительно по 250 п- о- участков вставки, непосредственно прилегающих к полилинкеру в исходном клоне pKed-2 по методу Сэнгера с использованием в качестве матрииы двухиепочечнои нлазмиды, выделенной равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия- частичные нуклеотидные последовательности сравнивали с банком нуклеотидных последовательностей <;е»напк, в результате не было обнаружено известных участков генома человека с существенной гомологией- Далее была установлена локализация сайтов расщепления различными рестриктазами, Фрагмент разделен на более короткие - Pst l/sac I, размером 540 п. о-, Sac I/Pst l, размером тзо п. о- и ваш ш/Bgl Ii, разнером 660 по., которые клонировали в векторы mi з ropi я и inpi<j для получения матрицы в одноиепочечнои Форме

Как выяснилось, ни модифицированная полимераза Фага тт iusb, версия 2.01, ни Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы i (Amersharai, ни

Taq-полинераза (Fermentasi не способны использовать в качестве матрицы пепь, обогащенную гуанином даже после предварительной денатурации. На радиоавтографах секвенируюших гелей в этом случае наблюдается лишь набор полос, соответствующих продуктам неспецифической терминами полимеразной реакции. Возможно предположить, что в данном случае е-пепь, в отличие от с-пепи. имеет сложную вторичную структуру и не способна служить удовлетворительной матрицей in vitro, весьма вероятно, что в данном случае G-пепь уложена в "глобулы", состояние из четырех обогащенных гуанином коротких участков, связанных водородными связями, в то вреня как с-пепь остается свободной. Такая нодель была совсем недавно предложена для описания укладки участков тандемных повторов в 5'-области гена инсулина, также характеризующихся аномальный распределением остатков гуанина и цитозина между двумя цепями (Hammond-KosacK et al., 19921 Нельзя также исключить, что подобные структуры стабилизированы определенными белками, в том числе имеющимися и у прокариот, поскольку удовлетворительных результатов полинеразной реакпии не удалось получить даже после предварительной денатурации матриц.

Поскольку проблем с прочтением ни одной из цепей не возникало при использовании в качестве матрицы плазмидной ДНК, те же самые Фрагменты клонировали в рис ig. как и в предыдущем случае, после щелочной денатурации плаэмил с укороченными вставками, оказалось возможным нормальное определение нуклеотидной последовательности по методу Сзнгера с использованием как прямого, так и обратного праймеров- Несколько участков неспецифической терминации в непосредственной близости от кластера тандемных повторов обнаружились при чтении с сайта Bgi II Фрагмента наш ш/пя! п. Нуклеотидную последовательность этих участков удалось однозначно вывести при помощи секненирования по методу Наксама-Гилберта. Была определена

- J4 -

1 - ctgcagctca caccagctgc agcccctgct ttcctctggg cccagccttc

SI - gacccctcag ggactcccat gccccagcct cctacagtgt ccctcaggcc

101 - cagcagggac ccctggggat ggtcttggcc agccgcaccc ttgaaggcag

151 - catggtcagg gagtaggaaa gagactcaca gggctgctgc cacggctccg

201 - ggtacagcca gctggtgggt tcaaggttcc agtggtccgg ggcttccagg

251 - ctcagggtcc ccggggagga ctgggccatg gaacgaggga cggcgcaggc

301 - aaagaatgag ctggaaggat ccaggcccac ctgggacagc gggtggccag

351 - aggtcaccag gctatggggg caaagaatct gggcgtgtcc cgcgggggcg

401 - ggaggggcgg gggcggggca gcccttcagt gccggtttgc agtgggaggg

451 - gcgaggagct gcggggggtc acttggggtg gggagctagg aagctggggc

501 - acgggcaggg aaagggaacc ctcaggtggg gagggttaag agctcagtgg

551 - ggctggggga ttggggttca gaggatgggg ccctcagggt ggagtgaggg

601 - gtggggtttg gggacctcag tggggagtgg ggttcagggg aggggtggag

661 - atgggaggac tggggatggg gcagatgagg ggggtttcag tagagggggg

701 - cccttggggt ggggtggggg ataggggtgg ctgtggggta ggggcagggc

751 - gctcagaggt ggggtttagg aaggtcatag gggtgggc.tt cagggcaagg

801 - gtgaagaaag ggatGACGGT GGAGGGTGGA GGGGTGGAGG GGTGGAGGCT

851 - GGAGGGTGGA GGGTGGAGGt agggcagggc gggggttagg tggagttggc

901 - cccctgggtg gagatgggtg aggattagtg gaggtgccct tagggr.aggg

951 - tgggtgggtg gagggcgggg cttagggaga tctgttgggg gattagggag

1001 - tgggggtggg ggtggatgct gagttggaga tgggggcctt caggggaggt

1051 - ggtcctttgg cgggatgggg gtgatgatag ggtgagggtg ggcactccgg

1101 - ggcagggctc agtggcgggg gtcggggctc agggcaaggg tagagacggg

1151 - gtgaaagtag gaatgggggt gtgaggccga ggatgggggt ttcaggggag

1201 - gtggccttta gggcaggata ggggtgagaa tggggtgggg atgggcctoa

1251 - gggatccgtt gacctgcag

Рис 4 Нуклеотидная последовательность геномного fst l

Фрагмента Ked-2. 'Заглавными буквами набрана последовательность кластера тапдемных повторов t в « 5 - в ь 9 i , подчеркнуты - варианты челомерных повторов.

полная нуклеотидная последовательность вставки к««1 2, i рис 4], ее длина составила '27» п. о

Как видно из рисунка, в составе геномного est i Фрагмента Red-2 обнаруживается участок тапдемных повторов протяженностью 54 по-, занимающей область с в)5 по «6У нуклеотиды, в состав которого входят семь полных копии повторяющейся единицы agbgicitg«.

Вся последовательность характеризуется аномальным с/с-составсм (содержание вис нуклеотидов составляет 66,7/. | и асимметрическим распределением этих оснований между комплементарными цепями (отношение ъ/с в одной из пеней равно 2,74).

В нашей лаборатории были синтезированы олигонуклеотидные зонды отвечавшие но структуре повторяющимся элементам в последовательности ле<1-2 (осстсса|4 и |сссстсса)4. Елоттинг-гибридиздпией этих проб, меченых при помощи полипуклеотидкиназы Фага Т4 по 5*-концу было показано, что за перекрестную гибридизацию с множеством локусов в геноме человека действительно ответственны танлемны'е повторы приведенной структуры, поскольку в данном случае на радиоавтографе отмечались те же самые, или очень похожие, профили распределения полиморфных фрагментов (данные не представлены!

Сравнение нуклеотилной последовательности ие<1-2 с последовательностями, хранящимися в базе данных кинь, позволило выявть несколько г, той или иной степени гомологичных известных участков ДНК человека. Ниболее похожим на к«-<1-2 оказался минисателлит Джеффриса 33.15, несмотря на различие Фингерпринтов, выявляемых обеими пробами при гибридизации с ДНК человека по саузерну Два миписателлита били гомологичны на Ь2/., из 537 нуклеотидов участка перекрывания 324 оказались идентичными. Определенных структурных мотивов, отвечающих за такой высоким уровень гомологии, в двух последовательностях не прослеживается (за исключением короткого в клоне к.-<1 г участка чаилемных повторов, что будет обсуждено ниже I < Таким образом, представляется вероятным, что это может быть объяснено аномальным и асимметрическим с/с составом, что в большой степени характерно не только для последовательности Не<1- 2, но также и на. 15. '¡та точка зрения может бить подкреплена тем, что не только с ах 15, по и достаточно 'о.пыпим количеством других известных миписзтеллитсн (1. за. а, аз. 4, аз. 6, м*22лм, г: кластере

глобиновых генов, в гене инсулина!, была обнаружена некоторая гомология, в среднем около 45'/, которые не настолько обогащены гуанином, как Яеа-2 и зз. 15.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что проклонированный участок относится к классу гомологичных рекомбинапионному сигналу е. со!1 минисателлитов. Б связи с этим представляется интересным рассмотреть соотношение тандемных повторов из гена епу вируса Н1У-1, которые использовались в качестве гибридизационной пробы при скрининге геномных библиотек, повторяющейся единипы клона яе<1-2 и усредненной последовательности повторов минисателлитов А- Джеффриса.

гомология

HIV Red кор Chi

HIV- a: GGGGTGGAGATG Ь: GGGgTGGA GatGgGGg - 75/. 56 Z 56Z

RED- GGGGTGGA GGG9TGGA GGGGtGGa 75'/ - 69Z T5Z

"KOP"- AGGTGGGCAGGAXGGG GGGcaGGA xGgGaGGt 56Z 69Z - 63Z

CHI - GCTGGTGG GGGcTGGt GGGctGGt 567. 75/ 63Z

1'ис. 5 а: сравнение нуклеотидных последовательностей повторяющихся единиц из гена env вируса hiv-i, Ked-2, "кор"-последовательности минисателлитов и сигнала рекомбинации е. coi i. t>-, те же последовательности представлены как участки тандемных повторов, разделенные в соответствии с периодичностью повтров в кластере Hed-2.

Сравнение представленных на рисунке 5 последовательностей позволяет, видимо, утверждать лишь то, что все они относятся к однону типу и что в повторявшейся единипе из env-гена вируса hiv-i имеется участок протяженностью в нуклеотидов, совпадающий по последовательности с мононерон Red-2, за счет чего оказалось воз-ножным выделить этот клон из библиотеки фрагментов генома человека- Однако повторяющийся участок клова Red-2 является наиболее пожожим на любой из трех остальных; уровни гомологии попарных сравнений этих последовательностей ни в одном случае не достигают значений гомологии Red-2 с каждой из них. Далее, как известно, для большинства сш-нинисателлитов разнеры повторяющейся единипы кратны «6 парам оснований - длине наименьшего повтора, представленного в минисателлите зз.15, хотя для более длинных мономеров эта закономерность может быть менее выраженной. В случае повторов Red-2 размер мономера составляет лишь в п.о., то есть половину длины повтора зз. is - до сих пор таких минисателлитов в литературе описано не было-

Среди других структур, с которыми была обнаружена высокая гомология в базе данных нуклеотидных последовательностей емвь, наиболее похожими на Red-2 оказались Фрагменты прителомерных последовательностей ДНК человека. Двум известным прителомерным последовательностям участок Фрагмента Red-2 был гонологичен на 62, 3Z (на о, зх больше, чем зз. 15| и 55, iz. довольно сложно выделить в этих последовательностях какой либо повторяющийся усасток, кроме ttagggigi и tttggg(g), однако во всех сравниваемых последовательностях прослеживается непериодический мотив, наиболее обычной формой которого является ggggtcggg. На основании данных гибридизации in sitn неоднократно было показано, что кластеры сы-мини-сателлитов главным образом локализованы в прителомерных районах хроносом, тем не менее высокая структурная гомология с такими

- 2й -

участками, насколько известно, обнаружена впервые.

Были определены частичные нуклеотидные последовательности остальных гипервариабельных зондов и их сравнением с банком данных EMBL показано, что они не являются уже известными участками ДНК генома человека.

Установление хромосомной локализапии Фрагмента Hed-z. для выяснения, на какой хромосоме человека располагается локус Red-2, использовали метод гибридизации с ДНК соматических гибридов По 2 мкг ДНК, выделенной из гибридных клеточных линий, несущих полный набор хромосом хомячка и одну или несколько хромосом человека (предоставлены Фирмой "Bios". США], расщепляли рестриктазой Pst i, разделяли по размерам в агарозном геле и проводили стандартную процедуру гибридизации по Саузерну i- жестких условиях с пробой Red-2. Как уже было описано, н жестких условиях пробой Red-2 детектируются только два гомологичных локуса- один полиморфный с гетерозиготностыо 60/ и размером в районе 5 т п. о- второй лркуг около 2 т. ц. о. и является собственно тем участком генома, из которого была выделена область ке<1 2 Данные но гибридизации и распределению хромосом человека в отдельных клеточных линиях представлены на рис ь.

Что касается участка, в котором располагается последовательность кеи-2, то Фра!мент, отиечакшии данному иокугу, обнаруживается на дорожках, на которые нанесены ЛИК клеточных линий «fio. без, 937, 404, юоь, losisi, mw«47 и WAI7, а также па контрольных дорожках, кула наносили геномную ДНК человека- Такое распределение может быть интерпретировано лишь одним образом - локус Red 2 располагается на 2) хромосоме человека. Однозначно установить хромосомную локализацию полиморфного локуса, перекрестно гибриди-зуюшегося с пробой Ked-2, на данной выборке клеточных линий оказалось невозможным. Вероятными хромосонами-кандидатами могут

х

!■ -тс *

щ

-" "7 V .

2 Т П. О-

I

ХРОМОСОМА ЧЕЛОВЕКА: 4 5 б 7 а 9 10 II 12 43 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X

(2-з-

45678910-II-121314151617181920212223242526272829-

004 I

324

423

734

750

Я0Э

а&о

867 60/ 940 212 507 683 81 1 983 862 909

937 4

854

904

967

968 1006 1049 1079 1099 4

15'/

ПЧ

557

О

днк хомячка СН0Ю4

НМ 847 *А 17

НОЮ! 4 4 4 4 4

15/

25*

57.

г

4

4

4

?ис 5 локализация участка Вел-2 на хромосоме человека 21. Вверху представлены результаты гибридизации с ДНК клеток соматических гибридов- Ниже приведен список проанализированных ДНК в порядке нанесения и данные по распределению индивидуальных хромосом человека, п - деления в области 5ч15. I - 5р15.2 ич - множественные делепии в области 5q У- - процент клеток в популяпии, содержащих

обозначенную хромосому 4 - более 75* клеток содержат хромосому человека

-побыть 5 или 20 хромосомы человека- Поскольку достоверные результаты при гибридизации in situ мультилокусной пробы получить затруднительно, прояснение этого вопроса требует более детальных исследовании, для которых достаточной выборки клеточных линий наити пока не представляется возможным.

Заключение

В геноме человека обнаружены несколько новых семейств повторяющихся последовательностей, а именно: гомологичных простому повторенному тетрануклеотидному мотиву cgtg. Члены данного семейства главным образом представлены короткими участками, однако в геноме человека такие повторы могут встречаться и в составе протяженных структур размером более 5 т.п- о. Б целом для кластеров таких повторов в геноме человека характерен невысокий уровень полиморфизма при гибридизации по Саузерну- Следующее обнаруженное семейство повторявшихся элементов гомологично повторам »сстст|п. Из результатов гибридизапионного анализа можно предпологать, что повторы данного семейства образуют более протяженные кластеры и встречаются в большем количестве геномных сегментов, чем |cgtg]n. Также для этйго семейства характерен более пысокии уровень иеяин-дивидуального полиморфизма ллины рестрикпионных Фрагментов Наиболее летально в данной работе было исследовано семейство повторяющихся элементов, гомологичных повторам в гене env вируса Hiv-l, названное семейством Red Как было выяснено, по крайней мере некоторые из геномных участков, детектируемых пробой Red-i при гибрилипамии но Саузерну, несут кластеры тандемннх повторов, по своей последовательности напоминавшие рекомбинационный сигнал ctii- е. coli, однако выделенные в /данной работе минисателлиты имеют ряд свойств, до сих пор не описанных в литературе. Сюда

- Э1 -

возможно отнести короткую длину повторяющейся единицы в клоне Red-2 или повышенное число обнаруживаемых гомологичных Фрагментов при гибридизации по Сауэерну с пробами Red-з и Red-4.

На основе полученных данных создана коллекция гипервариабельных маркеров ДНК, выявлявших множество полиморфных участков в геноме человека |всего шесть независимых систем, характеризующихся различной степенью эффективности различения отдельных индивидов! и обнаружен один монолокусный полиморфный маркер.

Выводы.

1. Клонированы в виде периодических протяженных сруктур короткие олигонуклеотидные мотивы, в том числе из en-v-гена вируса Hiv-l. Гибридизапионнын анализом показано, что в геноме человека имеются семейства сходных повторяющихся эленентов, характеризующихся высокой генетической нестабильностью- ^

2. Проведен анализ представленности повторяющихся эленентов нескольких семейств в геноме человека и некоторых отдельных хромосомах Показано, что в целом члены данных семейств обнаруживаются в среднем в 0,5-2/. геномных сегментов размером 20 т. п. о-

3. Выделено несколько индивидуальных участков генома, содержащих повторы Red-семейства. Нолекулярно-генетический анализ клонированных Фрагментов показал, что по крайней мере пять из них несут участки вариабельных тандемных повторов- Различные варианты повторов Red-семейства оказались ио-разному распределены в геноне человека, что касается как количества копий, так и расположения родственных локусов

4- Определением нуклеотиднои последовательности участка Bed-2 »1278 по) подтверждено наличие в нем кластера повторяющихся

- з z -

элементов.

5. впервые описан минисателлит с минимальным периодом 7-е пар оснований и показана гомология всей последовательности с chi-минисателлитами и теломерными структурами.

е. Определена локализация участка повторяющихся элементов на хромосоме человека 21 методом гибридизации с ДНК клеточных линий соматических гибридов хомяк/человек.

7. На основании полученных результатов создана коллекпия гипервариабельных маркеров, характеризующихся моно- и мультило-кусной специфичностью. Впервые описаны мультилокусные маркеры, детектируюшие сложные ишшвидоспециФические профили распределения вариабельных Фрагментов генома человека в жестких условиях гибридизации с высокой воспроизводимостью. Эффективность идентификации индивидуальных генотипов по оценкам, сделанным в нашей лаборатории, превышает описанную в мировой литературе. Разработанные тест-системы успешно применяются для проведения судебно-медицинских экспертиз в Экспертно-Криминалистическом Центре МВД России и попу-лннионных исследованиях в Российском Недико-Генетическом Центре-

Список работ, опубликованных но теме диссертации-

1- РогаеЕ Е-И-, Пленений Л. Б- 'Зонд ДНК, содержащий элементы

гена поверхностного гликопротеина вируса ВИЧ-i, - эффективный молекулярный маркер для генотипоскопии человека Бюл-Эксперим. Биологии и Медицины, 19УО, 12, стр 646-647. 2. Рогаев Е И- , Шленский А. Б. Проба геномной ДНК бактериофага ко юз выявляет гиаервариабилыше области генома человека Бюл- Эксперим. Биологии и Медицины, 1990, а, стр.525. 3 Rogaev К. I. , Slilensfcy А. В. , Shapiro Vu. А. , The human genomic probe containing families of simple DNA-repeats for identifi-

cation of multiple hypervari at) 1 e restriction fragments. Cytogenetic and Cell Genetic, Abstract hook, 1989.

4. Rogaev E. I. , Shi ens Icy A. B. , A genomic ENA-probe is sensitive marker for detection of human hypervariable regions. - Nucleic Acid Research, 1990, v. 18, p. 4.

5. Rogaev E. I., ShlensKy A. B. , Kotilevtsev Yu. V. , Tarantul V. Z. , Genotyping of mutable lines of rodents by DMA-fingerprinting. Abstracts of First International Conference on ENA fingerprinting. 1990, p. 52.

6. Rogaev E. I. , ShlensKy A. B. , Aggregation of two unrelated hypervariable families of tandem ENA-repeats in genomic loci. Abstracts of First International Conference on ENA fingerprinting. 1990, p. 52.

7. Rogaev E. I. , ShlensKy A. B. , Systematic approaches for isolating human VTR DNA markers. Abstracts of First International Conference on UNA fingerprinting. 1990, p. 46.

8. Rogaev 'E. I. , Korovaitseva G. I. , Spoonde A. Ya. , ShlensKy A. B. , Universal hypervariable multiloci DNA-marKers. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990,

p. 47.

9. Rogaev E. I. , Korovaitseva G. 1. , ShlensKy A. B. , Sirokvasheva E. Yu, , Fimenov M. G. , Stegnova T. V. , Human genotyposcopy: human specific, sex, paternity and individual identifications by tandem repeatitive DNA-elements in forensic practice. Abstracts of First International Conference on DNA fingerprinting. 1990, p. 43.

10. Rogaev E. I., Korovaitseva G. I. , Sirokvasheva E. Yu. , Spoonde

A. Ya. , ShlensKy A. B. Artificial tetramer-nucl eotide repetitive DNA-probe for universal intra- and interspecies genotyping. Fingerprint News, 1991, Vol.3|3|, p. II.

- зф -

<1. Bogaev К 1. , Korovai t s eva G. I. , Sljlensky A. B. Artificial hexa-шг-nucleotide repetitive DNA-probe lor universal genotyping. Fingerprint News, 199), Vol.3|3|, p. 12.

12. Bogaev E. I. , Korovaitseva С. I. , SiilensKy A. B. Artificial pen-tamer-nucleotide repetitive DNA-probe for universal genotyping Fingerprint News, 199), Vol.3|3|, p. 13

13. Kogaev E. 1., SlilensKy A. B. DNA-probe containing retroviral repeated elements for universal human and animal individual identifications. Fingerprint News, 1991, Vol. 3(3), p. 14.

14. Bogaev E. I. , Korovaitseva G. 1. , ShlensKy A. B. , Hypervariable DMA markers for linkage analisis and study of inethy 1 at ion of cromosomal loci Jn mental disorders. , Bio). Psychiatry, 1991, 29, p. 666S.

15. Shlensfcy A. B. , Bogaev E. I. , Polymorphic DNA probe from chromosome 21 containing HIV-like and telomeric repeats. , Abstracts of ESHG 24tti Annual Meeting, 1992, p. 137.

16. Shi ensky A. B. , Bogaev E. I. , Searching of whole genome for hypervariable DMA regions. Am. J. Hum. Genet. 1991, Vol.49, p. 38«.

17. Rogaev E. I. , ShiensKy A. B. , Human genome contains hypervariable sites of HIV-1 retroviral genes: genetic markers and genomics organization., Am. J. Hum. Genet. 1991, Vol.49,

p. 387.

la. Shlensky A. B. , Lavrushina O. M. , Rogaev E. I. , Evolutionary conservative probe with KH.P polymorphism and location in the t e 1 omera-1 i Ke region at 2lq. Hum. Molec. Genet. 1993, in

press.

19. Ьочков н. ¡1 , Рогаев Е- И- ,. Поляка Ю- К. , Шленский А. Б. , Асанов А Ю- , Выявление генетических мутаций в гипервариабельных районах ДНК человека с нелыо генетического мониторинга. Доклады АН СССР, 1993, в печати-