Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционно-консервативные повторяющиеся последовательности ДНК и их использование для геномной "дактилоскопии"

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционно-консервативные повторяющиеся последовательности ДНК и их использование для геномной "дактилоскопии""

Н Й

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЕИОЛОПМ

На правах рукописи УДК 575.1 , 577.1

ДДИНЧАРАДЗЕ АПОЛЛОН П130ЕВИЧ

ЭВОЛЩЮННО КОНСЕРВАТИВНЫЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ГЕНОМНОЙ "ДАКТИЛОСКОПИИ"

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии АН СССР

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

А.П. Рысков доктор биологических наук

А.С. Антонов кандидат биологических наук

МЛ. Тимофеева

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно исследовательский

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова д.32

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан .укДарЛ 1968 г.

Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Министерства медицинской и биотехнологической промышленности

Защита состоится

Ученый сещютарь Специализированного совета кандидат химических наук

Крицнн

Актуальность проблемы. Щюбдема структурной организации генома высших организмов является одной из центральных в современной биологии. Ее решение связано с раскрытием механизмов регуляции действия генов, клеточной дайеренцировки, онкогене-8а и др. Современные методы молекулярной биологии и генной инженерна позволяют на новом уровне исследовать молекулярнуп организацию отдельных генов и компонентов генома. Повторяющиеся последовательности эукариотического генома продолжают привлекать повышенное внимание в связи о их возможным участием в регуляции генной активности и жизнедеятельности клеток. Активные исследования в этой области позволили определить для ряда объектов основные типы повторяющихся последовательностей. Стало очевидным, что они существуют в виде малых и больших семейств Гомологичных последовательностей, различающихся по первичной отруктуре и типу организации. Некоторое из них диопер-гированн по геному, а другие сгруппированы в кластеры. Известны видоспецифические повторяющиеся элементы и высокогомологичные . у разных организмов /Rogers, 1985/. Характерной особенности повторяющихся последовательностей является определенная дивергенция отдельных копий - представителей одного и ¿ого S9 семейства. В связи с этим повторяющиеся последовательности рассматриваются и как возможные молекулярно-генетические. маркёры генома, способные определять полиморфизм ДНК. Как известно, полиморфизм да обусловлен либо точечными нуклеотвд-ными заменами, либо более сложными вариантами стохастической реорганизации геномных последовательностей и выявляется с помощью рестрикдаошого анализа/Bot stein , ЕЭ80/. Наиболее активно проблема полиморфизма ДЕК разрабатывается в рамках молекулярной генетики человека для решения двух

главных задач: во-первых, для тотального маркирования генома о последующим определением его полной первичной структуры; во-вторых, для медико-биологических разработок и исследований по генетике человека, поскольку сочетания аллельных вариантов полиморфных учаотков генома /называемые гаплотипами/ в равных популяциях неодинаковы и, кроме того, наблюдается избирательная принадлежнооть некоторых мутантных генов к определенным гаплотипам. В настоящее время большинство известных полиморфных маркеров относятся к уникальным последовательностям ДНК. Лишь небольшое число из известных полиморфных маркеров является повторяющимися последовательностями ДНК. На-иболеее яркий пример - это гиперварпабельная ыннисателлнтная ДНК человека, использованная А.Джеффризом и соавт. /Jeffreys e-l aI., 1985/ для выявления множественного реотрикционного полиморфизма ДНК и получения специфической для каждого индивидуума и генетически закрепленной картины гибридизации - своего рода "дактилоскопического" отпечатка его генома.

Представляет интерес обнаружение и других гипервариабельных повторяющихся последовательностей как видоспецифичных, так и аволюционно консервативных, которые могут быть использованы для подобного анализа.

ПЭдь работы» Целью настоящей работы, на первом ее этапе было определение первичной структуры клонированной последовательности генома человека гибридизирующуюоя с В2 - элементом ыыши. Шло обнаружено, что она содержит ряд коротких эволюцнонно консервативных последовательностей, и решено использовать ату последовательность как ыолекудярно-генетическиа маркёр геномов различных организмов.Основополагающим этапом исследования стали эксперименты о использованием в качестве меченной пробы последова-

тельность JIN 600 в соотаве ДНК фага MI3, когда неожиданно обнаружили, что в определенных условиях гибридизации сама векторная ДНК фага MI3 выявляла рестрикционный полиморфизм ДНК человека. Далее мы поотавили задачу изучить распространение гипервариабельных мшшсателлитных последовательностей, гомологичных участкам ДЩС фага MI3 у живых объектов различной таксономической принадлежности и продемонстрировать возможности использования метода геномной "дактилоскопии" для целей идентн фикацш личности, семейного анализа, установления родства, паспортизации линий животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов и др.

Научная новизна и практическая ценность работы. Результаты, полученные в настоящей работе, а также опубликованные Вао-

саром и соавт. /Vassart, 1987/, свидетельствует о том, что ДНК бактериофага MI3 может быть использована наподобие пробы

Джеффриза /pffi-ey s , 1985/, для анализа рестрикционного полиморфизма да. Гипервариабельные последовательности, ассоциированные с ДОС фага MI3, обнаружена в ДНК всех исследованных животных, включая млекопитающих, птиц, рыб, насекомых, кольчатых червей, моллюсков. Впервые метод геномной "дактилоскопии" применен для растений, дрожжей и бактерий. Это предполагает весьма широкие возможности практического использования геномной "дактилоскопии" в генетике человека, животных, растений и ыикр< организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на московском отделении Всесоюзного биохимического общества /1987 г./, на юбилейной научной конференции в Институте молекулярной биологии /1987 г./ и на съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров /1987 г./.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов,завлечения, выводов и спиока литературы. Работа изложена на 83 страницах машинописного текста и иллюстрирована 8 рисунками. Список цитируемой литературы насчитывает 132 ссылки на советских я зарубежных авторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВЗУВДЕНИЕ Наиболее Прямым методом изучения гомологии «езду повторяющимися элементами разных организмов является исследование структурной организации, в частности, о помощью клонирования соответствующих геномных.последовательностей н их дальнейшего секвени-рования.

Одним из аспектов нашей работы было выяснение вопроса, какова степень гомологии между мышиной повторявдиейоя последовательностью В2 Драмероз и др., 1979/ и ранее проклонированной последовательностью генома человека, дающий положительный сигнал гибридизации в "мягких" условиях. Такие данные могли бы быть важными для выяснения характера эволюционирования последовательности В2.

I. Структура Л N600 1.1. Гибрядазацяонные характеристики клона НЭ- В2

В качестве первого этапа нашей работы предполагалось определять наименьший учаоток вставки клона НБ-В2 /рШ322,содер- . жавдай вставку размером .8000 п.о./, гибрвдизувдайся с В2 - последовательностью в "мягких" условиях - при 55°С, 4х$5С в течение 12-14 часов, рестрикционным анализом и дальнейшей блот-гибряди-эацией о ншс-зфанслированной дооледова геяьноо тью Б2 был определен участок ра8мерой 1200 п.н. В дальнейшем этот фрагмент бил переклонировав в готамвдннй вектор, после чего была проведеяа

препаративная рестрикция. Извлеченная из легкоплавкой агарозы вставка подвергалась дальнейшему рестрикционному анализу и гибридизации о меченной по 32р последовательностью В2. Оказалось, что при расщеплении вставки размером 1200 п.я. рестрик-тазой Say. ЗА. образуются фрагменты, один из которых размером 600 п.н. содержит участок гомологии..

Из проведенных опытов, которые здеоь не приводятся, был сделан вывод, что в генома человека есть последовательность, гомологичная В2 - повтору мши. На следующем этапе работы ш попытались определить первичную структуру этой последовательности.

1.2. Первичная структура JIN600

Первоначально фрагмент JIN600 был клонирован в фаге MI3. Для этого две решшкативные формы mpIO и mpll были обработаны смесью рестрактаэ: Hind III и BtunHI. Далее в них был залигирован вышеупомянутые фрагмент размером 600 п.н. Таким образом, было получено два ракомбияаятных фага, имеющих одну последовательность в двух ориентациях. Были выделены одноцапоч-чачные формы рекомбинантного фага и по методу Сэнгера определена первичная структура вставки.

Цри анализе первичной структуры /см. рио.1/ оказалось, что исследуемы! фрагмент не содержит полного аналога В2-пов-тора, однако были найдены участки высокой и низкой гомологии, которые, по-видимому, и обуславливали сигнал гибридизации. В 80не высокой гомологии /с 150-го нуклеотвда по 180-й/ процент гомологии соотавляет примерно 70?. Начиная с 180-го нуклеотида, наблюдается сходство маленьких /4-5 п.н./ фрагментов, что говорит о заметном расхождении последовательностей. Второй участок гомологии - это уоредненная последовательность / 27 п.н./ общего участка воех коротких диспер-

3 САСОТССССТ СГгеТСАаЗЛЗ САТААТССТТ ТТСТАТАТСА СТСТСАСТАС ААБААЛАГК; АСТГТААССТ АСАССАСТАС (ГГССАЙОЗСАСАСАСТССТС СТАТТАССАА ААСАТАТАСТ САбАСТСАТС ТТСТТТТААС ТСАААТГССА ТСТССТСАТС

[ТАССТТСТ ТТСТТАТААА САТААСТТАА ТСТСГСТТТА АТССОТАССА

:АТ<ЮАА«5А аасаататтт статтсаатт асасасааат тасссатсст

* (ЗТСАТСАСТС АСАСТТАСИА СААТСТАСАС ААААОЗССТА АДАСАССТСТ САССАСАОТТ САТТГГТСТА АОТСАСАССА САСТАСТСАС ТСТСААТССТ СТТАСАТСТС ТТТТССССАТ ТТТСГССАСА СТССТСТСАА СТАААААСАТ ТСАСТСТСХЯ

; " ■ 11 ■ ^ 11 ,1 : : .»———- О «I '

¿АТЛАОСТбЛ СТТТТТСТАТ САААТТССТС ТТТТАААСТТ САСТАСТААА ССТТСАААТТ АТСААААТСА АССТСТТСТТ . 'ОТАТГССАСТ САААААСАТА СГТТААССАС ААААТТТСАА СТСАТСАТТТ ССА&ДТТТАА ТАСТТТТАСТ ТСЙАСААСАА

О-............ - .»I---.--

' СТТТАТСТТС АТТСТАСТТА АТАСТССТАТ САСАА<ЗСТСТ ТСТТТСТТОЙ. ААТССТТССТ СТСТСТСТТС АТССТССТТС рАААТАСААа ТААСАТСААТ ТАТСАССАТА ОТСТГССАСА АСАААСААСТ ТТАССААБСА БАБАБАСААС ТАССАСБААС

'ТГССССАСТС АТТетТАС АССТ(ЗСТССТ СТСЗССТСТАА СССССАСССС САСССССААА СТСГСАСТСТ СССАСОЗТСС ААСаЗСТСАО ТААСААААТС ТССАСОАС<ЗА САСССЗАСАТТ СОбССТСССС СТСООССГТТ САСАСТСАСА СТСТСССАСС

СТТТТТТТСС ССАТТСГСГС АААААТСССС ТССЙСТСТСА ТДОАТТСААА СТАТТСССТА ТСАСАТСАТС СТАОТСТААА САААААААО» «ЯГААСАСАС ТТТТТАСКЗСС АвОТСАСАОТ АССТАЛСГЛ! САТААОЗСАТ АСТСТАСТАС САТСАСАТТТ

-•■• II-— ' . ■•• —

■■■* ■»' .

СТАСАТСТСТ АССССТАССТ ' <ЛТСТАСА<» TC<J<3<3ATCGA

Рис.1.; Первичная структура последовательности ЛИ600 генома человека. Подчеркнуты:-/ двумя чертами области высокой гомологии с элементом В2, одной чертой - простая последовательность стрелками - прямые повторы различных типов; рамкой -

ввдвлена высококонсервативная октануклеотидная последовательность» присутствующая в промоторах и энхансерах некоторых генов.

ТТТСТСССАА ТАССТТАССС ТАЙ &Т6С&АА 1 АААОАСССТТ А1ГСИААТ<36С АТЧ ГАССГТТ Л

» 7 - /.

гарованных повторов ретропозонного происхоадения, таких кал А2а, В1, В2 и 13>. /Этиучастки подчеркнуты двумя на рисунке/.

Последовательность насыщена однонаправленными ко-

роткими повторами /см. рис. I/. Два из них, в частности длиной 12 п.о., ограничивают с двух сторон первую зону гомологии а В2 - элементом, что характерно для мобильных последовательностей, участвующих в процессах реорганизации генома. В 5* - фланкирующей гоне рамкой выделена октануквеотидыая последовательность. Это еще один примечательный участок последовательности ЛЫбОО. Указанный высококоноервативнай октануклеотид присутствует в промоторах и энхансерах генов ряда организмов /МаНа) ;

а!. > 1986/.

Кроме вышеупомянутых участков в ¿ШбОО мы обнаружили "простой" повтор, имеющий структуру ((ЗбСЮвТ,) 3, который о прилежащими основаниями представляет симметричный блок размером 21 и.о. -

Таким образом, исследуемая последовательность СШбОО содержит ряд консервативных /гомологичных у разных вадов/ сравнительно коротких последовательностей, каждая из которых повторяется с определенной.частотой и диспергирована по геному, и, по яяппгм предположениям, могла обуславливать специфический характер гибридизации при ыолакулярно-гзнетическом маркировании генома. Следующая задача, которая была поставлена в работе -гибридагационный анализ ЛИ600 в условиях, благоприятных для взаимодействий консервативных последовательностей.

2. Гипервариабельныв учаотки ДНК, выявляемые с помощью

ДНК фага ШЗ иди его рекомбинатов

На рис.2 представлены результаты блот-гибридизационного аиа

лиза ДНК человека, обработанной разными реотриктазами. В качестве меченной пробы брали рекомбинантную конструкции ДНК ИЗ/ДНК 31Н600. Поскольку нас интересовала гибридизация высококонсервативных , слабоповторяющихся последовательностей,содержащихся в JIN600, то ишеубашш вели в отоутотвии ДНК лосося, которая обычно используется в качеотве неспицифического конкурента. Видно, что картины гибридизации чрезвычайно олож-ны, характеризуются наличием множественных полос, н их вид зависит от используемых рестриктаз. Следует отметить, что подобные гибридизационяые картины получаются и при использовании пробы Джеффриза. Поэтому в дальнейшем мы провели аналогичный анализ ДНК отдельных неродственных индивидуумов. На рис.З представлены первые полученные данные. Оказалось, что при использовании одной и той же рестриктазы /BspRI/, картины гибридизации для ДНК трех неродственных индивидуумов различны /Еио, За/. В этой эксперименте в качестве меченной пробы брали рекомбинантнув ДНК М13ДШ600. Неожиданным оказался результат контрольного эксперимента /Рис. 36/, в котором в качестве меченной пробы для гибридизации о тем же блот-фильт-ром брали ДНК фага MI3 дикого типа /не содержащего вставка/. Еадно, что гибрвдизацаонные картины идентичны. Это означает, что множественный индивидуальный полиморфизм в ДНК человека выявляется о помощью векторной ДНК MI3. То есть ДНК MI3 содержит в своем составе какие-то последовательности, гомологичные ДЗК человека, и обладающие свойство« гиаервариабельности. Следует также отметить, что уже в этих первых экспериментах ваш было обнаружено, что гибридизация ДНК ЮЗ происходит а о ДНК ряда животных s растений /ом. последующие разделы/.

Я i

3.5 —

2,0 —

0,5 _

£Чз И»

•m —— —

Рис.2. Блот-гибридизационный анализ ДНК человека. На каждую дорожку наносили по 8 мкг ДНК одного и того же индивидуума, фрагментированную HiwJ III + EcoRI, ACu.1, BspRI. ß качестве меченой пробы брали ДНК J IN600 в составе фага ШЗ.

/ 2 3 12 3

Feo. 3. Гипервариабельные участка ДНК человека, детектируемые о помощью рекомбинантной ДИК MI3 (JIN600) /а/ и ДНК дикого фага MI3 /б/ I, 2, 3 - ДЫК трех индивидуумов, обработанные реотриктазой Bsp RI. Меченые пробы получали о помощью' гибридивациовного прайнера.

Уже после направления этих данных в печать /Дкинчарадзе л др., 1987/ нам отало известно, что аналогичные результаты были подучены группой бельгийских ученых во главе о Ваооаром /Va s -sort el al., 1987/. Эти авторы изучали гибридизацию суммарной pea-третированной ДНК человека о рекомбинантной конструкцией, состоящей из ДНК UI3 и вставки - ДНК гена тиреоглобулина человека. При случайном изменении условий гибридизации, когда не была добавлена ДНК лосося, также были выявлены сложные картины гибридизации о ДНК человека, специфичные для отдельных индивидуумов.Более того, Вассар и ооавт. идентифицировали в ДНК MI3 аоследова-тедьнооть, ответственную за феномен гибридизации, которая оказалась тацдещыц повтором с 15-нуклеотвдаш мотивом GAGGGTGGXGGZTCT, локализованном в гене белка III UI3. В этой же работе авторы также продемонстрировали существование гицервариабельных участков, гомологичных ДНК MI3, в геноме быка и отметили, что они имеются и у некоторых других млекопитающих. Таким образом, стало ясно, что ДНК фага MI3, - одного из наиболее употребительных в лабораторной практике фагов, - может быть использована как эффективная проба на полиморфизм ДНК. Следует подчеркнуть, что гибридизационвде картины с ДНК MI3 получаютоя лишь в отсутвие в смеси ДНК лооося. В црисутствии конкуретной ДНК картины гилервариабельных полоо исчезают, и этим объясняется тот факт, что они не наблюдались ранее другими авторами.

В дальнейшую задачу настоящей работы входило: определение распространенности гилервариабельных последовательностей данного типа у организмов различной таксономической принадлежноо-ти и установление диапазона возможностей метода геномной /или молекулярной/ "дактилоскопии", основанной на этих последовательностях, используя в качества полиморфного маркёра ДНК MI3.

- JZ -

2.1. Гипервариабельные участки в геноме человека: индивидуальные различия и соматическая стабильность как основа идентификации личности

На рис. 4а представлены более полные данные по анализу индивидуального реотрикцнонаого полиморфизма ДНК человека на примере восьми других неродственных индивидуумов. В »тих экспериментах ДНК фрагментировали о помощью рестриктазы Bsp RI, дата А широкие спектр гнбридизупцихся полос, хотя, как показано вами /см. рио.2/, и другие рестриктазы могут быть использованы для подобного анализа. В целом, полиморфизм определяется чиолом полос, их положением на дорожке и интенсивностью полосы /послед-шей фактор нами не рассматривается/. Можно отметить, что в области высокомолекулярных фрагментов число совпадающих полоо мало. Оно увеличивается в зоне низяомолекулярша фрагментов. Обще« число различающихоя полоо меаду двумя неродственными индивидуумами в высокомолекулярной зоне /2-10 килооснований/ составляет не менее 10. Можно полагать, что вероятность их одновременного случайного совпадения чрезвычайно низка. Согласно расчетам Джеффри-8а х соавт., для миниоателлитной. ДНК человека в подобном случае она составляет 3x10"*1,

На рио. 46 представлены результаты анализа ДНК еще двух индивидуумов о использованием либо одной реотриктазн, либо смеси двух реотриктаз. Обработка двумя реотриктазами, как и предполагалось, приводит к изменению картины гибридизации и появлению новых гипервариабельных фрагментов, я в целом повышает оценочную специфичность всего комплекса наблюдаемых индивидуальных отличий. Кроме того можно отметить, что некоторые рестрикционные • фрагменты после обработки второй реотриктазой не меняет своего положения. Можно предположить, что они по своей структуре явля-

/ 2 3 45 6 78 9 9 9'М40*10

23_, П ." "*.....- ——

9,4 — Ч

Аз — р - ; : —

г- г— ^— Щ '- * — «к ~~ '

I

ЕТ ■1 ** —

ЯЗ — -- ^

2,0-

■ * тК:

Ко В; .

а

Рис.4а,б. Индивидуальный полиморфизм гипервариабелышх учаотков ДНК человека. 1-10 - ДНК разных индивидуумов, рестриктярованные ВзрЫ;

9* и Ю1 - ДНК из 9 и 10, рвотриктированные А£а1; 9" и 10" - ДОС 9 я 10, рвотриктированные смесью ВзрШ я Аеи1. В качестве меченой пробы брали ДНК М13.

втоя многократно повторенными, тандемно организованными повтора-, ми некоего элементарного звена, не содержащего сайтов узнавания для этих рестриктаз.

Можно ли сравнивать гибридмзационные картины, подученные на ДНК из разных тканей? То есть обладают ли изучаемые последовательности соматической стабильностью. Чтобы ответить на этот вопрос, мы выделили ДНК из восьми тканей одного индивидуума к прове-

Рис,4 в, г. Соматическая стабильность гипервариабельных учаотков ДНК человека.

1Г-14 - ДНК сердца, печени, желудка, щитовидной железы

одного индивидуума, рестриктированного BspKI. 15-18 - ДНК мозга, надпочечников, желчного пузыря, семенников того же индивидуума, рестриктированные BspRI + Aßul.

В качестве меченой пробы брали ДНК MI3.

ли геномно-"даятилоскопический" анализ. На рио. 4 в, г представлена результаты двух независимых экспериментов по анализу разных тканей /по четыре ткани в каждом эксперименте/ одного человека. Гидролиз ДНК проводили о помощью В^рИ /рио.4 в/ или смесью ВзрКХ + Аеи.1 /рис. 4 г/. Видно, что картины гибридизации для ДНК разных тканей идентичны и зависят лишь от природы рео-триктазы, используемой в эксперименте.

Возникает вопрос: сравнивая геномные "отпечатки" разных индивидуумов, не оталкиваемся ли мы тут о полиморфизмом, вызванным другой причиной, в частности, разной степенью метилирования этих последовательностей у разных индивидуумов, что приводит 8 разным гибридизационным картинам. Мы специально подобрали рестриктазу /ВзрВ1/, которая не зависит от метилирования сайтов, что автоматически снимает вышеупомянутую проблему.

Таким образом, из приведенных данных очевидно, что в сочетании о соматической стабильностью индивидуальные различия гипервариабельных участков, выявляемые о помощью ДНК фага 1ПЗ, могут быть использованы для целей идентификации личности и других целей криминальной биологии.

2.2. Семейный анализ: возможности определения родства, отцовства и материнства

Гипервариабелыше участки генома человека, ' ассоциированные о консервативным повтором ДНК фага ЮЗ, могут быть попользованы для семейного анализа. На рио. 5а предотанлвн пример анализа семьи из четырех человек / отца, матери и двух оыновей/. ДИК обрабатывали двумя реотриктазами - ВзрМ ж А?и1. Видно, что картины гибридизации для отца к матери сильно различаются, как это ж должно быть для двух нерояо-

12 3 4

V-

5 6 7

О—I—О

Рве. 5. Использование геномной "дактилоскопии" для семейного анализа.

а - анализ гипервариабельных участков ДНК семьи из 4 человек: отца (I) , двух сыновей (2, 3) и матери

ДЙК реотриктировади смесью BspEI + A£ul.

б - анализ ДНК семьи из 3 человек; отца (5) , дочери (6) и матери (7). ДНК реотриктировади BspRI + Aeul. В качестве меченых проб брали рекомбинантную ДНК MI3 (JIN 600).

- Т7 -

твенных индивидуумов. В то же время у братьев число совпадающих гипервариабельных фрагментов значительно больше. Видно также, что те или иные варианты гипервариабельных участков наследуются детьми от двоих родителей, причем наследование носит не цнтоплазматический, а ядерный характер, т.к. вариабельные фрагменты наследуются как по материнской, так и по отцовской линии. Ядерный тип наследования /отсутствие "материнского эффекта"/ указывает на то, что тестируемые гипервариабельные участки находятся не в митохондрнаяьной, а в хромооомной ДНК.

Вместе с тем, в одном исследованном олучае результаты оказались несколько иными. На рис. 56 представлен геномный анализ этой семьи, состоящей из трех человек /отца, матери и дочери/. У дочери легко прослеживаются характеристические полосы материнского происхождения, однако фрагменты, наследуемые только от отца, не обнаруживаются. Более того, у дочери имеются гипервариабельные фрагменты, отсутствующие и у матери, и у отца. Тря независимых варианта анализа, проведенных с разными рестриктазани /на рио 56 приведены дайные для BspBI + ASul/, дали одинаковые результаты, указывающие на возможное отоутствие кровного родства между отцом и дочерью.

2.3. Универсальная распространенность и высокая консервативность гипервариабельных последовательностей, детект ируемых ДНК MI3, среди различных объектов живой природы

Выше уже отмечалось, что лшервариабелышя последовательность Ы13 обнаруживается в ДНЕ некоторых животных. На рис.6 приведены результаты блот-гибридизациовного анализа ДНК организмов различных таксономических групп, включая не-

: -'18 -

которые виды животных /позвоночных и беспозвоночных/, растений к микроорганизмов. В качестве меченных проб брали ДНКфага ЩЗ, либо ДНК MI3, содержащего вотавку JIN600. Обе пробы давали сходные картины гибридизации. В большинстве случаев использовали реотриктазу BspRI, но для ДНК некоторых видов в отдельных экспериментах подбирали подходящую реотриктазу. Были исследованы главным образом ДИК эукариот: мыши, быка, свиньи, кролика, цыпленка, барана, вьюна, дрозофилы, шмеля, таракана, шелкопряда, листоеда, беззубки, дождевого червя, хлопчатника, ячменя, соя, апельсина, трифолиаты, пшеницы, дрожжей. Кроме того исследовали ДНК некоторых срокарлогачесйих микроорганизмов: Vibrio cHoêerae, B.coBL. Видно, что все эукариотические ДНК в подходящих условиях дают сложные картины гибридизации, свидетельствующие о существовании в них множественных участков гомология с гибрвдизацаоаной пробой.

Достаточно неожиданным оказалось обнаружение таких участков в геномах прокариот. Примечательно, что число характеристических полос в случае бактериальных ДНК существенно меньше, чем у высших организмов. Гибрддизационные картины, приведенные на рис.6 исчезают, еодив пробу добавлять в качестве конкурента ДНК лосося или ДНК человека. Это является косвенным свидетельством того, что сходные типы гипервариабельннх мияжсателлитных последовательностей детектируются ДНК MIS у разных организмов. Однако прямое доказательство этому может Сыть получено путем клонирования к секвенирования участков ДНК, соответствующих индивидуальным полосам гибридизации. Остается открытым и вопрос и причине универсальной распространенности этих последовательностей у широкого круга живых объектов, охватывающей эукариотнчеокне к про-кариотические организмы н вирусн. .

/ 2 41

3 4/

5.6 7 8

9 /О Н /2\/3/4 /5/6 /Г 18 /9 20

•. ~ , «и ^" ИД - ■ '

Рис.6. Гипервйриабельные участки, детектируемые ДНК М13,а геноме животных и растений. , Меченую ДНК М13 или реномбинантную ДНК Я13 I ИМ600) гибридизовали с ДОК: I. мыши, 2. быка, 3. свиньи, 4. кролика, 5. цыпленка, 6. барана, 7. вьюна, ,9. дрозофилы, 9. шелкоп ряда, 10. таракана, II. листоеда, 12. беззубки, 13. доядевого червя, 14. хлопка, 15. ячменя, 16. сои, 17. апельсина, .. 18.; трифолиаты, 19. дрожжей, 20. ^ЬКо сйо1вгае.

В экспериментах 1-7, 9, -14,15,16,1& ДНК рестриктировали ВэрИ; в эксперименте 8 - ЕсоЫ + Шпе| Ш; 10-13 - ВврИ * АСа1; 17,19,20 ~Шас1 Ш.

<С> I

2.4. Геномная "дактилоскопия" организмов различной таксономической принадлежности

Дальнейшие наши эксперименты были направлены на выяснение диапазона возможностей использования ДНК фага М13 в качестве зонда при "дактилоскопическом" анализе генома животных, растет ний и микроорганизмов, в том числе определение видовых, линейных, сортовых и штаммовых особенностей и различий. Как и в случав ДНК человека, индивидуальный полиморфизм отчетливо проявляется при анализе ДНК неродственных особей животных /рис. 7а, дорожки 1-8/. Вто же время картины гибридизации очень близки для двух родственных ягнят /рис. 7а, дорожки 9,10/, а для трех поросят одного помета при данных условиях разрешения они практически идентичны /рио. 7а, дорожки 12-14/. Аналогично этому геномные "отпечатки" для трех мышей одной и той же линии одинаковы /рис. 7а, дорожки 15-17/. Это означает, что, как и мшшоагал-аштная ДНК человека, ДНК М13 может быть использована как универсальная проба для характеристики /паспортизации/ инбредных линий и определения мехлинейных различий. Действительно, как показано на рио. 76 /дорожки 18-22/, каждая из пяти исследованных линий одного вида дрозофилы дает свою, специфическую картину гибридизации. в то же время.разные особа одной линии /рас. 76, дорожки 23-28/ не отличаются друг от друга по своим гипервариабельным участкам.

Использование геномной "дактилоскопии" в генетике растений может иметь особый интерес. Данные, представленные на рио. 7в на примере ячменя, демонстрируют возможности идентификации сортов, выявления межсортовых различий.

Извеотно, что в современной микробиологии и практической бактериологии серьезные проблемы составляют систематика микроор

1Г>

■п

СМ

II _!ИШИ)1 } '¡Г «ШУЙМГ Н ЛШШИ ? |

I'!! »13 111 III» 112

;1ГГ Н

I !Р I I ' I II) :. I .Л I Н

Г^ТГТШГГ

.1 ¿¿.ишь: - л

•I и и пи. 11 шпптгттг:

о • я

си

ганязмов, идентификация штаммов, определение чистота бактериальных культур. На рис. 7 г приведены результаты анализа ДНК трех

коллекционных штаммов У;Ьг;о сЯо(егое,Видна характерные картины гибридизации, специфичные для каждого штамма, поэволягаие говорить о новых возможностях в плане идентификации бактерий; в частности патогенов. '

<; cj^ su t

ы > мтз д pi

сп ct i s g g fo i Соя t»

О о * £

" . р» а Д

зо О \ X О о ** »M ex rsi'd çp^P Q

^ т u> wis о о я-а о ¿3

to ti

in a

a ^ 3

ТТТМГ

HÎ I illltHilli IUI

I« i hi milium

UV ШшШЛШ

III fl I! Hl »II! I! й-1

гтигтш rt

! nimiíüMí шшцт IL i llíltrrif ■(

f IIj II tu И 1 » H! ÜÍH Ц f

Si

N>

N

o* Nj M

ИГГТГЧ îo 1 LUV lljJ £

fe u,

- -

- 23 -ВЫВОДЫ

1. Определена первичная структура клонированной последовательности генома человека (ЛЫбОО) длиной ~ 600 пар оснований. Показано, что в ее составе содержится ряд коротких эволюционно консервативных последовательностей, диспергированных по геному. Среди них - учаотки гомологии последовательности В2, октонуклео-тид промотора иммуноглобулинового гена, простая последовательность [(ХО&Л)3 .

2. Обнаружено, что рекомбинантная конструкция, состоящая из ДНК фага М13 и вставки ДНК ЛИ600, в определенных условиях гибридизации ( в отсутствии ДНК лосося) может быть использована в качестве высокоэффективной пробы для выявления индивидуального полиморфизма рестрикционных фрагментов ДНК человека. Показано, что сходные результаты получаются и при использовании в качестве меченой пробы ДНК фага М13 дикого типа (не содержащего вставок), т.е. что ДНК фага М13 может быть использована для выявления индивидуального подиморфизма.ДНК человека.

3. Установлена чрезвычайно широкая распространенность и высокая консервативность гипервариабельных участков, выявляемых о помощью ДНК фага М13. Они обнаружены у всех исследованных нами объектов живой природы различной таксономичеокой принадлежности, включая человека, животных /позвоночных и беспозвоночных/, растений а микроорганизмов.

4. Продемонстрировано, что метод геномной "дактилоскопии",основанный на высоком индивидуальном полиморфизме, соматической стабильности и характере наследования гипервариабельных участков ДНК, выявляемых с помощью ДНК фага ЮЗ, может быть эффективно исполь-эован для решения многих вопросов в рамках общей проблемы геноти-пической изменчивости,.в частности, для целей идентификации индн-

видууыов, установления родства, определения отцовства в материнства, паспортизации инбредных линий и определения ыежлинейных различий, классификации животных и растений, отбора чистопородного потомства, выявления видовых, сортовых и шташовых различий. Предполагаются перспективы использования этого подхода для решения фундаментальных проблем популяционной и эволюционной генетики человека, животных, растений и микроорганизмов, а также явлений геномной нестабильности и генных переотроек. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Джинчарадзе А.Г., Ломидзе Н.В., Крамеров A.A.,Рысков А.П. Вариации на тему последовательности В2 в геноме человека. - Тезисы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток

в культуре, Москва, 1986, о.16.

2. Подукарова Л.Г., Колядина E.H., Кораеев С.А., Джинчарадзе Д.Г., Лимборская С.А. Некоторые повторяющиеся последовательности

' ДНК человека и их локализация на хромосомах. - Тезисы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, Москва, 1986, 0.37. ;

3. Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Д., Рыоков Ä.H. Соседствование учао-тка специфического промотора IgH-генов и последовательности, гомологичной В2 в клонированном фрагменте генома человека. -Тезисы TL Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процеосов", Москва, 1987,- о.20-21.

4. Дкинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рыоков А.П. Геномная "дактилоскопия". Характеристика клонированной последовательности

ЛЫ 600 генома человека, обладающей в составе вектора ШЗ овой-отвами высокополиморфного маркёра ДНК. - Доклады АН СССР, 1987, т.295, № I, с.230-233. ■

5. Рыоков А.П., ©пшчарадзе А.Г., Просняк М.И., Иванов П.Д., Димборокая С.А. Геномная "дактилоокопия" организмов различных такоономических групп: иопользование в качеотве гибриднзапи-онной пробы ДНК фага М13. - Генетика, 1988, т.ХПУ, * 2, 0.227-238.

оАчсчгабо ап'ЬиЬ ¿д

агбЭ-пЬ аЗ"Ч1ХЗпТ)б>0Ч ^'^БЬоЛзой^'1 ¿¿>6Э01чйа50(5О плБоЭпЗедаАпйдйл «¡о Зсхяп алЗтаоБа5^ аоЕпЗдЛ

Бесплатно Заказ 32 УЭ 20273

Тираж 100

Издательство "Мецниереба".Тбилиси 380060, ул. Кутузова 19 Типография Академии наук ГССР»Тбилиси 380060, ул, Кутузова 19