Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка нерадиоактивного варианта геномной дактилоскопии с использованием олигонуклеотида (ЦАЦ)5 и его применение для изучения генома крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка нерадиоактивного варианта геномной дактилоскопии с использованием олигонуклеотида (ЦАЦ)5 и его применение для изучения генома крупного рогатого скота"

РГБ ОД 2 4 МАР 1997

На правах рукописи

КОРОХОВ НИКОЛАЙ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА НЕРАДИОАКТИВНОГО ВАРИАНТА ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА (ЦАЦ)5 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНОМА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

БОРОВСК - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и радиоизотопного анализа Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Научные руководители - кандидат биологических наук,

с.н.с. Шевченко В.Г. доктор биологических наук, профессор Смирнов А.Ф. Официальные оппоненты - заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Тараканов Б.В. кандидат биологических наук

___ШаГшачи Г. О.--

Ведущее учреждение - Институт общей генетики

РАН, Москва

Защита диссертации состоится " 26 " марта 1997 г. на заседании Диссертационного Совета Д.020.17.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрос института: 249010 г.Боровск-3, Калужская область,

ВНИИФБиП с.-х. животных С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан " 2 6 " февраля 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук

Г.В.Дворянчикова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Одной из основных задач генетики сельскохозяйственных животных и связанных с ней разделов биотехнологии является установление детерминации биологически важных и хозяйственно-полезных признаков. Большинство таких признаков являются полигенными, не характеризуются четкой дискретностью и контролируются несколькими или многими генами (QTL - quantitative trait locus).

Как альтернатива количественной генетики, опирающейся на статистический анализ распределения по фенотипам, уже в 2 0х годах был предложен подход идентификации QTL с помощью простых сцепленных с ними маркеров. Однако, практическая реализация этого приема с учетом дефицита простых морфологических (биохимических маркеров) стала возможна лишь после появления ДНК-проб и разработки методов оптимального картирования (Tanksley, 1993; Blottmon et al., 1996).

Открытие полиморфных ДНК-маркеров коренным образом изменило и общую ситуацию с исследованием генома животных и растений. Появился мощный инструмент для описания гетерогенности геномной ДНК, контроля происхождения, оценки генетического расстояния. Первоначально, такие ДНК-пробы были связаны с кодирующей (уникальной) фракцией ДНК, а их выявление - с тестированием полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Однако, более информативными оказались маркеры, относящиеся к повторяющейся фракции геномной ДНК и прежде всего мини- и микросателлиты, образованные короткими последовательностями нуклеотидов ("core") , повторенными в геноме в виде тандема (Sertedaki, Lindsay, 1996).

Классификация современного набора полиморфных ДНК маркеров сложна, условна и связана как с принадлежностью к определенным фракциям хромосомной ДНК, так и с приемами их детекции. Каждый из ДНК зондов и приемов детекции имеет

свой спектр практического применения и преимущественное генетическое приложение (Levin et al., 1994; Мельникова и др., 1996) .

Так, геномная дактилоскопия (фингерпринтинг) - метод, основанный на обнаружении "core" минисателлитных последовательностей с помощью процедуры блот-гибридизации, является наиболее информативным для оценки генетического полиморфизма и может рассматриваться в качестве инструмента, позволяющего описать общую картину, отражающую состояние большого количества локусов, расположенных на всех хромосомах, облегчить поиск локус-специфичных маркеров. Это позволяет использовать метод для генотипирования животных, установления степени родства между ними (Trommelen et al., 1993 а,б), для выявления локусов сцепленных с наследственными заболеваниями неизвестной генной природы (Holmes, 1994), для поиска генов влияющих на формирование хозяйственно-полезных признаков (Plotsky et al., 1993), оценки гетерозиса (Haberfeld et al., 1996), интрогрессии новых генов (Yancovich et al., 1996). Перечисленные области применения метода требуют анализа большого количества животных и, как следствие, удобства применяемых методов и доступности используемых реактивов. В случае геномной дактилоскопии это в первую очередь касается возможности избежать использования радионуклидов, заменив их на не менее чувствительные компоненты И во-вторых, создание и отработка удобной для практического использования технологии .

Следует отметить, что описано относительно немного минисателлитных проб, позволяющих получить четкий рисунок фингерпринта применительно к геномной ДНК крупного рогатого скота, еще для меньшего их числа описана информативность для исследования гетерогенности генома. Прежде всего это минисателлит ДНК фага М13, универсальные пробы 33.6 и 33.15 и ряд их производных - pV47, pITZl (Haberfeld et al., 1996;

Muebscher et al., 1995). В ряде исследований для этих целей использовались и некоторые "core" олигонуклеотидные пробы (Trommelen et al., 1993а). Предполагается, что одной из перспективных проб для геномной дактилоскопии Bos taurus является олигонуклеотид (ЦАЦ)5 (Trommelen et al. , 1993а,б). Однако, нам известно лишь одно исследование, в котором сделана попытка оценки генетической информативности данной пробы применительно к внутрипородной, индивидуальной изменчивости (Trommelen et al., 1993а,б). Отметим, что практически все процитированные исследования выполнены в трудоемком и менее практически доступном изотопном варианте.

Вышесказанное и предопределило направление данного исследования, связанного с разработкой эффективного варианта геномной дактилоскопии применительно к Bos taurus и его трансформации для установления простых монолокусных маркеров .

Цель и задачи исследований. Целью работы была разработка и оптимизация нерадиоактивного варианта метода геномной дактилоскопии и его последующее использование для создания коллекции монолокусных полиморфных маркеров.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить информативность короткого олигонуклеотида (ЦАЦ)5 в качестве зонда для генотипирования крупного рогатого скота;

2. Сравнить различные варианты нерадиоактивного мече-ния зонда для геномной дактилоскопии и оптимизировать метод для его использования в широкомасштабных исследованиях;

3. Выделить и клонировать локусспецифичные маркеры;

4 . Определить нуклеотидную последовательность одного из монолокусных маркеров и подобрать праймеры для его направленной амплификации.

Научная новизна. Впервые проведена сравнительная оценка нескольких вариантов введения репортерных групп в короткий олигонуклеотид с целью получения высокоинформативных геномных оттисков. Разработан и оптимизирован нерадиоактивный вариант геномной дактилоскопии. На примере четырех пород крупного рогатого скота оценена информативность олиго-нуклеотида (ЦАЦ)5 в качестве зонда для геномной дактилоскопии. Выделены и клонированы локусспецифичные маркеры; для одного из них определена первичная структура и подобрана пара праймеров для направленной амплификации.

Научно-практическая значимость работы. Предложенный вариант нерадиоактивного мечения коротких олигонуклеотидов

МПТГРФ т/г<-гт^тт, г^ ,, ТТТТ-. „.I .111 II I I 1.1 I II 1|1) I I 1| I 41

информативных зондов любой структуры. Разработанный метод широко использовался для установления отцовства (с 1989 по 1992 гг было выполнено свыше 1000 экспертиз) . На основе разработанного метода проводятся работы по получению моно-локусных полиморфных маркеров. Полная последовательность секвенированного микросателлита зарегистрирована Европейским институтом биоинформации под номером Y07737 (EMBL Nucleotide Sequence Database) .

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Информативность геномных оттисков, получаемых с помощью короткого олигонуклеотида (ЦАЦ)5 и возможность их использования для паспортизации животных.

2. Оптимальный вариант введения репортерных групп в состав зонда для геномной дактилоскопии, позволяющий сохранить высокую чувствительность характерную для изотопных методов.

3. Выделение и анализ монолокусных генетических маркеров по результатам генотипирования животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: I Международной конференции

по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994); Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке геномов сельскохозяйственных животных" (Санкт-Петербург, Пушкин, 1994); II Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995); 9th North American Colloquium on Domestic Animal Cytogenetics & Gene Mapping (Texas, USA, 1995); II Международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам (Киев, 1996). По материалам исследований опубликовано девять научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов и предложений, списка литературы, включающего 185 источников, в том числе 170 на иностранных языках. Изложена на 113 страницах машинописи, содержит 12 рисунков и 3 таблицы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались образцы ДНК коров эстонской черно-пестрой, эстонской красной, эстонской местной и бестужевской пород, любезно предоставленные сотрудником Института экспериментальной биологии Эстонской АН Т.Лушниковой.

Образцы крови черно-пестрой породы получали из яремной вены коров, содержавшихся на виварии ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН.

Образцы ДНК людей были любезно предоставлены Новосибирским областным бюро судебно-медицинской экспертизы.

Образцы крови от крыс линии Wistar и Spreag Dowly были забраны из хвостовой вены животных, содержавшихся на виварии Института цитологии и генетики СО РАН ( г.Новосибирск) .

В работе были использованы, с небольшими модификациями, методы, описанные в лабораторном руководстве по молекулярному клонированию (Sambrook et al., 1989).

Картины фингерпринтинга анализировались в соответствии с общепринятыми алгоритмами (Morsch, Leibenguth, 1994).

Для оценки генетического расстояния использовали формулу описанную в работе Кухнлейна с соавторами (Kuhnlein et al., 1989) и значение модифицированного расстояния по Рогеру (MRD) (Grunder et al., 1994)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Оценка информативности олигонуклеотида (ЦАЦ) 5_

в качестве зонда для геномной дактилоскопии

Геном эукариот образован как уникальными, так и повторенными последовательностями. Значительную часть повторенных последовательностей составляют мини- и микросателлиты, для которых характерен высокий полиморфизм, присутствие на всех хромосомах и большая гомология среди повторов одного типа. Перечисленные свойства позволили создать высокоинформативную технологию первичной оценки генома - ДНК фингерпринтинга или геномной дактилоскопии (Jeffreys et al., 1985) . Метод нашел широкое применение в медицине, биологии, животноводстве. Обычно, для выполнения таких работ, в качестве зонда используют клонированные минисателлитные последовательности ДНК фага М13 или короткие последовательности, образованные простыми комбинациями ди-, три- и тетрануклеотидов: (ТЦЦ)5, (ГАТА) 4, (ЦА)в и т.д.

Среди ди—, три-, и тетрануклеотидных синтетических оли-гонуклеотидных проб, используемых для получения мультилокус-ных ДНК фингерпринтов, олигонуклеотид (ЦАЦ)5 оказался максимально информативной пробой для генетической индивидуализации у человека, сопоставимой с классическими минисателлитны-

ми пробами Джеффри 33.15 и 33.6 (Epplen et al., 1991). При выборе зонда в своей работе руководствовались простотой его получения и воспроизводимостью мечения в реальных условиях.

Для оценки информативности олигонуклеотида (ЦАЦ)s в качестве зонда для геномной дактилоскопии было выполнено гено-типирование образцов ДНК человека, линейных лабораторных крыс и крупного рогатого скота. В данном случае человек брался для рассмотрения как пример максимально гетерогенной панмиксной популяции. В свою очередь линейные крысы были взяты в качестве представителей предельно однородной высоко-инбредной популяции. Во всех трех случаях (рис.1) наиболее информативной оказалась зона, содержащая фрагменты ДНК с размером от 3 до 25 т.п.о.. Это позволило подобрать оптимальные условия электрофореза для получения максимального разрешения фрагментов ДНК.

А Б В

2 3 4 5 6 7

12 3 4

б 7

1 2 3 4 5 6

са»

f«3

Мр. «и* «Ж *•»

'*' Ьт MF *

fcaäÄ

' • ... , Ьтт

*ш4

. «WI

I

I А Ш «»4

М

дети); Dowly)

i* у

W^c

♦ со

».«< 4нм

„л в —

Рис. 1 Геномные оттиски: А - человека (1,7 - родители;

Б - лабораторных крыс (1-4 - линия Wistar; 5-8 -; В - крупного рогатого скота (черно-пестрая порода).

2-6 -Spreag

*■■ я

«. *

При типировании различных образцов ДНК человека были получены высокоинформативные индивидоспецифичные графические картины (рис.1А), что задавалось числом, расположением и интенсивностью образующих их полос. Вероятность случайного совпадения оттисков оказалось близка к 10~13. Аналогичные результаты были получены в лаборатории Эпплина (Ерр1еп, 1988). Вышеизложенное позволяет предположить, что используемые условия позволяют достичь предельно возможного разрешения характерного для геномной дактилоскопии.

Полностью идентичные картины можно получить только в случае однояйцевых близнецов (Арре1тап et а1., 1994) или же в высокоинбредной популяции, что можно увидеть на примере

ппыпмиыи оиггнсие-и крши (рии.1Ь). для крыс линии Wistar

еще можно отметить индивидоспецифичные элементы образующие ДНК-фингерпринты, то у более инбредной популяции крыс линии Бргеад Оо1л/1у они полностью отсутствуют. Геномные оттиски сравниваемых животных подобны геномным оттискам однояйцевых близнецов. Однако, при этом следует отметить появление фрагментов, которые присутствуют у всех животных этой линии и полностью отсутствуют у животных других линий.

По-видимому, направление отбора при создании этой линии привело к вычленению локальных структурных изменений в геноме, отличающих крыс линии ЭР от крыс других линий, и геномная дактилоскопия позволяет выявить эти изменения. Аналогичное допущение успешно использовалось в ряде работ при поиске генов ответственных за наследственные заболевания (0о1Г е! а1., 1991, 1994) .

На основании приведенных результатов можно предположить, что в геномных оттисках крупного рогатого скота, который по своей гетерогенности занимает промежуточное положение между человеком и линейными крысами, будут присутствовать как породоспецифичные, так и индивидоспецифичные элементы. При этом, породоспецифичные элементы следовало бы использо-

вать как для паспортизации пород (Адда™а1 et а1. , 1994), так и для поиска генов участвующих в формировании характерных для данной породы признаков (Иванов и др., 1989). В свою очередь, индивидоспецифичные элементы можно было бы использовать в качестве идентификационных маркеров при паспортизации животных.

По результатам попарного сравнения геномных оттисков неродственных коров (черно-пестрой породы) , содержавшихся на виварии ВНИИФБиП с.-х. животных (рис.1В), удалось установить среднюю вероятность совпадения отдельного фрагмента у двух случайно выбранных особей (0,35) и вероятность полного совпадения геномных оттисков двух неродственных животных (1С)"9). Полученные результаты подтверждают огромные потенциал геномной дактилоскопии при выполнении работ по паспортизации животных .

2 3 4 5

9 10 11 12

13 14 15 16

Рис.2 Результаты блот-гибридизации НаеШ гидролизата ДНК разных пород с 32Р меченым (ЦАЦ)5 зондом: 1-4 - образцы ДНК коров эстонской черно-пестрой породы; 5-8 - образцы ДНК коров эстонской местной породы; 9-12 - образцы ДНК коров эстонской красной породы; 13-16 - образцы ДНК коров бестужевской породы.

С целью дальнейшей оценки возможностей используемого подхода было выполнено генотипирование четырех пород крупного рогатого скота:

1. эстонская черно-пестрая (ЭЧП);

2. эстонская местная (ЭМ) ;

3. эстонская красная (ЭК);

4. бестужевская (Б) (рис.2; таблица 1).

И если для всех трех эстонских пород значение средней вероятности выявления отдельного фрагмента колеблется в интервале от 0,42 до 0,44, то для бестужевской породы полученное значение выше и приближается к значению характерному для сиб-сов. Этот факт свидетельствует о высокой инбредности живот-ИШ1 Оны^л^ыви^ий пириЦЫ Ь конкретном стаде, на что указывает и низкое значение индекса гетерозиготности, определенное для этой породы (0,7).

Таблица 1

Результаты анализа геномных оттисков четырех пород

ЭЧП ЭМ ЭК Б Як

N 14 11 7 7 6

п 12, 4±0,3 7,3+0,5 18,0+3,5 10,2±0 ,1 14±0,6

X 0, 42+0,01 0,43+0,1 0,44+0,02 0,51±0, 14 0,5±0,04

р 2, 77х10~у 10"э 4,26x10"° 10"ь 3, 7x10"*

Ч 0, 24 0,25 0,25 0,3 0,29

к 4 4 4 3 3

Н 0,76 0,75 0,75 0,7 0,71

N - число исследованных животных;

п - среднее число различимых фрагментов, имеющих размер от 3 до 25 т.п.о. в геномном оттиске животного;

х - средняя вероятность совпадения отдельного фрагмента у двух неродственных животных;

Р - средняя вероятность полного совпадения геномных оттисков у двух неродственных животных;

q - средняя частота встречаемости аллеля(полосы); к - возможное число аллелей в отдельном локусе; Н - индекс гетерозиготности.

Вместе с тем, вероятность обнаружения животных, имеющих аналогичный геномный оттиск, не превышает одной миллионной,

что позволяет рекомендовать этот подход для паспортизации животных.

Еще большее значение средней вероятности полного совпадения ДНК-фингерпринтов было получено для эстонской местной породы (10~5) . Численность животных этой породы не превышает 500 голов, что, по-видимому, и является причиной значительной (по сравнению с эстонской красной и эстонской черно-пестрой породами) вырожденности получаемых ДНК-

фингерпринтов. Тем не менее, индекс гетерозиготности у эстонской местной породы сравним с индексом гетерозиготности двух других эстонских пород и выше - бестужевской (табл.1).

Для двух других пород (эстонской красной и эстонской черно-пестрой) значения вероятности полного совпадения ДНК-фингерпринтов у двух неродственных животных находятся в интервале от 10~8 до 10~9, подтверждая приведенные выше результаты для животных черно-пестрой породы, свидетельствующие о высокой разрешающей способности метода. Помимо четырех указанных пород бьши получены геномные оттиски для шести животных другого родственного вида яка - Bos mutur. Как показывают данные, представленные в таблице 1, и для этого объекта рисунок фингерпринта оказался достаточно информативен.

Однако, нами ни для одной из исследуемых пород не было выявлено породоспецифичных отличий в получаемых геномных оттисках. Появление породоспецифичных отличий в ДНК-фингерпринте может быть вызвано двумя причинами. Одна из них предполагает повреждение или возникновение рестрикционного сайта для используемого в методе фермента и последующую фиксацию дефекта в ходе селекции. Вторая причина заключается в изменении числа повторов, образующих конкретный мини-, микросателлит или в инсерции (делеции) небольшого фрагмента ДНК при сохранении рестрикционных сайтов. Во-втором случае изменения могут быть зарегистрированы при использовании любой мелкощепящей рестриктазы. Повреждение же конкретного рестри-

кционного сайта можно выявить только в случае использования фермента, специфичного для поврежденной последовательности. И чем большее количество мелкощепящих ферментов будет использовано в работе, тем больше вероятность выявления таких изменений.

Поэтому, ДНК коров была подвергнута одновременной обработке двумя мелкощепящими рестриктазами - Н1п1Г1 и НаеШ. Такой подход позволял, помимо анализа состояния двух рестри-кционных сайтов, увеличить зону разрешения за счет дополнительного гидролиза вторым ферментом части фрагментов, полученных при гидролизе первой рестриктазой. Для эстонской красной породы прием оказался эффективным и позволил вычленить

фрап.шпт (О, В х.ц.и.), прису'гиа'цумцм Ь геномных оттисках животных только этой породы (рис.3).

12 3 4 5 6 7 8

Рис.3 Геномные оттиски животных бестужевской (1-5) и эстонской красной (6-7) пород, полученные в результате блот-гибридизации двойного гидролизата (HaeIII+HinfI) коровьей ДНК с олигонуклеотидом (ЦАЦ) 5-

<= - породоспецифичный фрагмент (~ 6,5 т.п.о.).

Таким образом, проделанная работа позволяет предложить данный метод для выполнения работ по паспортизации животных

и установлению родственных связей, а также продолжить работы по получению отдельных генетических маркеров для картирования генома крупного рогатого скота.

3.2. Разработка и оптимизация нерадиоактивного варианта

геномной дактилоскопии

Рекомендуемые области применения геномной дактилоскопии предполагают проведение широкомасштабных работ, для которых необходимы доступные реактивы и простой в исполнении метод. Последнее и послужило основанием выполнения работы по максимальной адаптация метода для рутинного использования.

В первую очередь, это касалось выбора оптимального температурного режима. Аналогичные работы с использованием в качестве зонда ДНК фага М13 (Рысков и др., 1988) или клонированных минисателлитов (Дуброва и др., 1993) требуют строгого соблюдения температурного режима на протяжении длительного времени. Незначительные отклонения приводят к изменению гибридизационной картины - появлению или исчезновению нескольких фрагментов, образующих геномный оттиск - и, как следствие, к невоспроизводимости получаемых результатов.

В этой связи целесообразно было охватить как можно более широкий интервал температур для определения пределов допустимого отклонения. И хотя, по расчетам оптимальная температура гибридизации находится в интервале 4 0 - 4 5°С, для выбора оптимальной температуры блот-гибридизация олигонук-леотида меченного 32Р была выполнена не только при температуре 40°С или 45°С, но и при 37°С. Во всех трех случаях получались полностью идентичные по рисунку геномные оттиски, что указывает на высокую специфичность гибридизации. Конечный результат - ДНК-фингерпринт - в первом (4 0°С) и в третьем (37°С) экспериментах получали после 24 часового экспонирования рентгеновской пленки РМ-В с фильтром. В случае же проведения гибридизации при 4 5°С, аналогичный по качеству геномный

оттиск получали только после 2-Зх суток экспонирования рентгеновской пленки. Таким образом, восьмиградусный перепад температуры (37-45°С) никак не влияет на специфичность конечного результата, предоставляя достаточно широкие возможности при подборе условий пригодных для выполнения подобных работ. Оптимальная же температура гибридизации лежит в интервале от 37 С до 4 О С. В дальнейшем все обработки фильтров проводили при температуре 37°С, что позволило увеличить эффективность гибридизации при неизменном неспецифическом фоне.

Следующий этап работы состоял в определении наиболее эффективного временного режима для гибридизации. В этой области не существует единообразия подходов и порой время вы-полпешш шшлюц раи'гях'инаы'ГШ на ¿-У ^утцк. И связи с этим для выбора оптимального режима предгибридизацию проводили в течение 5, 30 или 60 мин, а гибридизацию - 0,5, 1, 4 или 18 ч. В указанных временных интервалах длительность как предги-бридизации, так и гибридизации никак не влияла на качество конечного результата (интенсивность специфического сигнала и соотношение сигнал/фон не менялись), что позволило остановиться на следующих условиях:

температура предгибридизации и гибридизации - 37°С, длительность предгибридизации - 15 мин, длительность гибридизации - 30 мин, отмывки - 15 мин. Таким образом, время выполнения анализа занимает 1ч. В этом сказалось еще одно преимущество использования короткого оли-гонуклеотида, поскольку гибридизация любого протяженного зонда не может длиться менее 18 ч (ЗашЬгоок et а1., 1989) .

При выполнении массовых анализов встают проблемы, связанные с необходимостью использования радионуклидов. Это предполагает оборудование места для работы с изотопом, соз-

дание службы транспортировки, хранения радиоактивных соединений, утилизации отходов и пр.

Существует несколько приемов, позволяющих избежать применения изотопов (Ебтап et а1., 1988; г1зсЬ1ег et а1. , 1991). В одном из наиболее чувствительных, используется система биотин-стрептавидин-щелочная фосфатаза. В состав зонда вводятся биотиновые группы, с которыми в последующем связывается конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой.

Для оценки возможностей использования биотинилированно-го олигонуклеотида в качестве зонда в геномной дактилоскопии были синтезированы три варианта олигонуклеотида:

1. Зч ЦАЦ ЦАЦ Ц0иоАЦ ЦАЦ ЦАЦ 5'

2. 3' ЦАЦ ЦАЦ ЦАЦ ЦАЦ ЦАЦ6ио 5'

3. 3~ (ЦАЦ) 5 (ЦбиоТ) зЦбиоТ 5 4

Таким образом, анализировались варианты, включающие модификацию самого олигонуклеотида (N1), 5'конца (N2) и "нефункционального хвоста" (N3). Последний вариант представлял собой комбинированный подход, позволяющий ввести биотиновую метку с помощью "модифицированного хвоста" контролируемой длины.

Наибольшая чувствительность была достигнута при использовании третьего варианта олигонуклеотида в качестве зонда (интенсивность сигнала гибридизации была в 2-4 раза выше, чем в двух других случаях). Причина состоит, по-видимому, в том, что при такой конструкции зонд содержит 4 остатка биотина, расположенные вне участка гибридизационного взаимодействия и не препятствующие образованию комплекса зонд-ДНК. Длина же "хвоста" (восьмичленник) мала для внесения каких бы то ни было помех в специфичность гибридизации.

При сравнении чувствительности радиоактивного и нерадиоактивного подходов с помощью слот-блот гибридизации были выявлены полосы, содержавшие не менее 30 нг ДНК (рис.4).

А Б

ко о к нг ДНК

120

•о,*, г.- .. б0

' : ..Я:: . 30

Рис.4 Слот-блот гибридизация биотинилированного (А) и 32Р меченого (Б) зондов с иммобилизованной на капроновых фильтрах ДНК фага лямбда (к) и ДНК коровы (о).

Увеличение продолжительности экспонирования радиоактивного фильтра с пленкой или инкубации с субстратом нерадиоак-тпицччго фильтра приводило лиши и нрд»арцыицшшпим.у уинлнчы нию как специфического сигнала, так и фона. Одним из достоинств нерадиоактивного варианта оказалась возможность визуально контролировать процесс развития окраски и прекращать его на любой, удобной для исследователя, стадии.

Таким образом, использование олигонуклеотида N3 позволяет достичь чувствительности, свойственной радиоактивному варианту геномной дактилоскопии. При этом следует отметить, что для получения конечного результата с помощью зонда, несущего "фосфор-32", требуется около 2 суток после завершения гибридизации, в то время как нерадиоактивный вариант требует не более трех часов (рис.5).

т.о.п. 23,0 6,0 3,0

Рис.5 Геномные оттиски трех неродственных коров черно-пестрой породы, полученные с помощью биотинилированного олигонуклеотида (ЦАЦ) 5.

Высокая разрешающая способность, простота и быстрота исполнения, доступность реактивов и большая длительность их хранения делают возможным широкое внедрение данного варианта метода в практику для выполнения работ по паспортизации животных и установлению родства. При этом, нерадиоактивный вариант метода геномной дактилоскопии, не уступая по чувствительности радиоактивному, имеет ряд преимуществ, а именно:

- безопасность при работе для персонала лабораторий;

- стабильность препаратов при длительном хранении;

- короткое время проведения анализа;

- доступность всех используемых реактивов.

3.3. Выделение микросателлитных маркеров

Технология геномной дактилоскопии, помимо использования для паспортизации животных и пород, нашла свое применение как для поиска генов, определяющих формирование конкретного признака, так и для оценки информативности "анонимных" зондов при поиске монолокусных полиморфных маркеров (Holmes, 19 94). Последняя из указанных областей применения является наиболее значимой в генетических и селекционных исследованиях, поскольку использование полиморфных последовательностей ДНК в качестве маркерных систем позволяет решить проблему насыщения генетической карты маркерами и маркировать практически любой интересующий исследователя ген.

Современная генетическая карта Bos taurus насыщена, в основном, маркерами такого типа. Из 877 картированных локу-сов крупного рогатого скота лишь 314 - кодирующие гены или псевдогены, а 563 - анонимные ДНК-пробы (Eggen, Fries, 1995) .

Для выделения полиморфных генетических маркеров крупного рогатого скота нами была использована методология схожая с той, что описана в работе Георгеса с соавторами (Georges et al., 1991) . Она основана на клонировании фрагментов опре-

деленного размера, выделенных после исчерпывающего гидролиза мелкощепящими рестриктазами суммарной ДНК коров. Этот подход имеет ряд важных преимуществ. Во-первых, выделение и клонирование фрагментов определенного размера позволяет осуществить первичное обогащение клонотеки необходимым материалом. Во-вторых, использование мелкощепящих рестриктаз должно привести к более точному выщеплению высокоповторенных последовательностей, что облегчает последующий анализ их первичной структуры.

После фракционирования МЬо1-гидролизата коровьей ДНК с помощью центрифугирования в сахарозном градиенте бьши получены фракции, содержащие фрагменты ДНК разного размера

<П ИГ-Й) Кяк Т/Т гтррттп^тта-пдтт^т отпттшпп! ■ тгт ч^пт, ■ ■ 1 т п р, ■ -, л г. .

имела низкую константу седиментации, обусловленную небольшим размером фрагментов (0,5-1,5 т.п.о., дорожки 13-17, рис.6).

I М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 »-*

Рис.6 Результаты электрофоретического разделения материала из разных фракций сахарозного градиента.

М - HindIII+BstEII гидролизат ДНК фага лямбда;

£ - МЬо1 гидролизат суммарной ДНК коров;

1-17 - материал из разных фракций сахарозного градиента.

Для клонирования использовали фракции, содержащие фрагменты ДНК размером 3,5-5 т.п.о. и 0,5-1 т.п.о. По результатам гибридизации с (ЦАЦ)5 зондом были отобраны пять

"положительных" клонов. Полная нуклеотидная последовательность вставки была определена для одной из пяти рекомбинант-ных (ЦАЦ)+ плазмид. Данные об этой последовательности включены в базу данных нуклеотидных последовательностей под номером Y07737 (EMBL Nucleotide Sequence Database, UK).

Клонированный фрагмент длиной 7 97 пар оснований содержит два блока, образованные ТГ-динуклеотидами. Блоки разделены короткой последовательностью протяженностью 17 п.о. Первый блок имеет длину 14 п.о., второй - 16 п.о.. Их гибридизация с (ЦАЦ)s зондом вызвана, по-видимому, нерегулярной комплиментарностью этих последовательностей олигонуклеотиду (ЦАЦ)5. Исходя из структуры уникальных последовательностей, окружающих микросателлит, можно подобрать пару праймеров, ограничивающих интересующий фрагмент - в данном случае, (ТГ) п-фрагменты - для направленного типирования с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это позволяет быстро и эффективно генотипировать образцы ДНК, используя следовые количества материала из любых тканей и органов на любой стадии развития.

ВЫВОДЫ

1. На примере четырех пород крупного рогатого скота показана высокая информативность олигонуклеотида (ЦАЦ)5 в качестве зонда для геномной дактилоскопии. Вероятность случайного совпадения геномных оттисков двух неродственных коров колеблется в интервале от 1СГ5 для эстонской местной породы до 10~9 для эстонской черно-пестрой породы

2. Показана возможность выявления породоспецифичных элементов у крупного рогатого скота с помощью геномной дактилоскопии. При гидролизе ДНК двумя мелкощепящими рестрик-тазами (Haelll + Hinfl) в геномном оттиске коров эстонской красной породы выявлен породоспецифичный фрагмент размером около 6,5 т.п.о.

3. Предложен модифицированный вариант метода геномной дактилоскопии, позволяющий сократить без потери эффективности время выполнения анализов с двух-трех суток до 5-7 часов.

4. По результатам сравнения трех разных способов введения биотиновых групп в состав олигонуклеотидного зонда определен оптимальный вариант, позволяющий достичь чувствительности радиоактивного метода.

5. Определена полная нуклеотидная последовательность (7 97 п. о.) одного из пяти клонированных микросателлитов (Y07737, EMBL Nucleotide Sequence Database).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ti качестве конечного продукта рекомендуетсянерадиоак-тивный вариант геномной дактилоскопии максимально адаптированный для рутинного использования при выполнении работ по генотипированию крупного рогатого скота для паспортизации животных и установления родства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Корохов Н.П., Симоненко В.Н., Шевченко В.Г. Bio-принт для крупного рогатого скота./ Материалы I Международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных - 1994. - Киев.

2. Корохов Н., Поповский А.В., Шаронова Д.А., Новоселов В.П. Использование синтетического олигонуклеотида (ЦАЦ)5 для геномной дактилоскопии./ Судебно-медицинская экспертиза -1993. - N3

3. Раудсеп Т., Лушникова Т., Корохов Н., Смирнов А. ДНК фи-нгерпринтинг у крупного рогатого скота с использованием (ЦАЦ) олигонуклеотидной пробы./ Материалы международного симпозиума "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных" - С.-П. - Пушкин, 1994.

4. Raudsepp Т., Lushnikova Т., Korokhov N., Smirnov A. DNA fingerprinting in four cattle breeds using (CAC)5 micro-sateliiite probe// Proc. Estonian Acad. Sci. Biol. 1994. v.43. N3. P.113-118.

5. Корохов Н.П., Лушникова Т.П., Смирнов А.Ф. Оценка генетической информативности ЦАЦ5 пробы применительно к крупному рогатому скоту// Материалы II международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" - Боровск, 1995.

6. A.Efimov, Ju.Loginova, N.Korokhov, O.Chiryaeva, S.Derjusheva Chromosome distribution of CAC sequences in the cattle detected by fluorescence in situ hybridization// Proceedings of 9th North American Colloquium on Domestic Animal, CytogeneticsSGene Mapping, Texas ASM University, College Station - Texas, USA, July 17-20, 1995, p.87.

7. Корохов Н.П., Лушникова Т.П., Раудсепп Т., Смирнов А.Ф. Оценка полиморфизма геномной ДНК у крупного рогатого скота с помощью олигонуклеотидной ЦАЦ5 пробы// Материалы II международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных." - Киев, 19 96.

8. Корохов Н.П., Ефимов A.M., Слепцов М.А., Смирнов А.Ф. Фингерпринтинг геномной ДНК лошади с помощью TGio олигонуклеотидной пробы// Материалы II международной конференции "Мо-лекулярно-генетические маркеры животных" - Киев, 1996.

9. Корохов Н.П., Карпышев Н.Н., Симоненко В.Н., Шевченко В.Г. Нерадиоактивный вариант геномной дактилоскопии для крупного рогатого скота/ Сельскохозяйственная биология - 1997, в печати.