Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация гельминтов методами молекулярной биологии

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация гельминтов методами молекулярной биологии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛ1СКОХОЗЯИСТВЕННЫХ НАУК

всероссиискии научно-исс; едовательскии институт гельминтологии имени к.и.скрябина

—гъ_п--

На правах рукописи РОМАНОВА Елена Анатольевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕЛЬМИНТОВ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Специальность 03.00.20 - гельминтология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена во Всероссийской научно-исследовательской институте гельминтологии имени академика К.И.Скрябина (ВИГИС)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор И.И.Бенедиктов; доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН А.П.Рысков;

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук А.В.Успенский кандидат биологических наук Б.А.Фомин

Ведущая организация - Институт паразитологии Российской

Академии Наук (ИПаРАН)

Зашита диссертации состоится " _1995 г.

в часов на заседании специализировано™ совета

Д-020.04.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени академика К.И.Скрябина.

Адрес: 117259, Москва, Б.Черемушкинская, 26. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС. Автореферат разослан 1995 г<

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных на;'к

С.В.Березкина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Мир гельминтов велик и многообразен, лишь у позвоночных число их видов приближается к четырем тысячам. Среди них, некоторые (эхинококк, трихинеллы, фасциолы, цистицерк и др.) вызывают опасные заболевания у человека и животных с многочисленными функциональными нарушениями и тяжелыми поражениями различных органов. Диагностика этих заболевания, особенно ранняя, впрямую связана с четкой идентификацией носителей. Однако, многочисленные данные, касавшиеся особенностей биологии, иммунологии, морфологии и биохимии ряда возбудителей этих инвазия, давая сложный спектр характеристик, часто недостаточны, а иногда и усложняют определение исследуемых обьектов. Поэтому все большее внимание привлекают молекулярно-генетические методы исследования, основанные на анализе полиморфизма ДНК. Среди них наиболее часто используется полиморфизм ДНК рестрикционных фрагментов, который выявляется с помощью различных полиморфных ДНК-зондов методом блот-гибридизации. При этом обнаруживается спектр фрагментов ДНК с различной электрофоретической подвижностью, характерный для данного генома. Другой подход - различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволявшие выявлять полиморфные участки генома.

Возмолиости этих методов ранее продемонстрированы при изучении возбудителей ряда паразитарных заболеваний лейшманий, споровиков, возбудителя малярии (Macedlo et al, 1992; Булат и др., 1992; Hancock et al, 1992), а также ряда болезнетворных грибов (Булат и др., 1990, 1992). Имеются отдельные публикации по использованию метода полимеразной цепной реакции для анализа генома гельминтов (Zurita et al, 1968; Gottsteln et al, 1991; Bishop et al, 1992) и лишь недавно стали применять вариант П11Р с единичными праймерами (RAPD-PCR) для систематики гельминтов (Arribas et al, 1993; Bandl et al, 1993; Dupouy-Camet et al, 1993).

Однако, несмотря на эти работы, гельминты

остаются до сих пор малоизученной группой животных. В связи с этим очевидна актуальность исследований генома гельминтов, на основе которых могут быть разработаны новые подходы к их идентификации и дифференциации.

Цель м задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в использовании молекулярно-генетических методов для идентификации гельминтов, наиболее опасных для здоровья человека и животных. Основные задачи исследования:

1. Отработка и усовершенствование современных молекулярно-биологических методов, таких как, метод геномной дактилоскопии, таксонопринта ДНК и полимеразной цепной реакции, в приложении к гельминтам.

2. Поиск маркеров ДНК, пригодных для идентификации гельминтов.

3. Использование молекулярно-генетических маркеров для дифференциации родов, видов и изолятов гельминтов.

Научная новизна. В работе впервые описан полиморфизм ДНК у ряда возбудителей гельминтозной инвазии. Отработаны и усовершенствованы молекулярно-биологические методы, использованные для видовой идентификации ДНК гельминтов из родов TrichineIIa, Nematodlrus, Fasciola, Taenla, Echinococcus. Выявлены особенности внутри- и межвидовой дифференциации по этим маркерам и продемонстрированы возможности их использования для таксономии и систематики гельминтов.

Практическая значимость работы заключается в разработке молекулярно-биологических методов применительно к гельминтам. Полученные данные могут быть использованы при решении задач систематики гельминтов, а также служить дополнительным критерием для ранней прижизненной диагностики возбудителей гельминтозов с использованием проб крови или биопсии.

Апробация раОотм. Материалы диссертации доложены на:

- научных конференциях молодых ученых-гельминтологов в г.Москве в 1969-1992 гг.

- на Симпозиуме "Факторы регуляции популяционных процессов у гельминтов (г. Пущино, 3-5 апреля 1990 г.).

- на Всесоюзной научно-технической конференции "Современные

проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине" (г.Нижний Новгород, 6-6 декабря 1990 г. ).

- на научно-практической конференции "Современное состояние и перспективы оздоровления хозяйств от эхинококкоэа и цистицеркоэа" (г.Караганда, 2-4 октября 1990 г.).

- на объединенных сессиях Координационного совета по ветеринарной гельминтологии. Центрального совета Общества гельминтологов России и секции "Инвазионные болезни сельскохозяйственных животных" РАСХН (Москва, 1992-1995 гг.).

- на научной конференции "Гельминтозооноэы - меры борьбы и профилактика" (Москва, 4-5 октября 1994 г.).

- на заседаниях Ученого совета ВИГИС (Москва, 1988-1995 гг.).

Основные долохения, внносиине на защиту:

1. Усовершенствованы и стандартизированы методики выделения ДНК из представителей гельминтов, относящихся к трем классам.

2. Разработаны и усовершенствованы, применительно к гельминтам, следующие молекулярно-биологические методы -геномная дактилоскопия, таксонопринт ДНК и полимеразная цепная реакция.

3. Выявлены маркеры ДНК, позволяющие проводить идентификацию гельминтов.

4. Проведено" молекулярно - генетическое маркирование некоторых представителей гельминтов для дифференциации родов, видов и изолятов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, 1 работа направлена в печать.

ООьем и структура диссертации. Диссертация изложена на /2? страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов "Материалы и методы", Ч глав собственных исследований и их обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована /5" рисунками, содержит 2 таблицы и 22 схемы. Список литературы содержит Щ отечественных и 104 зарубежных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

. В литературном обзоре представлены сведения о вариабельности генома и способах его изучения, в том числе, генома гельминтов. Рассмотрены вопросы, посвященные полиморфизму ДНК, методам геномной дактилоскопии, полимеразной цепной реакции и "таксонопринтному" анализу. Подробно представлены работы, касающиеся использования молекулярно-генетических методов для идентификации и систематики гельминтов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Материалы и методы

В работе использована ДНК гельминтов, принадлежащих к 3 классам, 5 родам, 6 видам.

В семействе Taenla (класс Cestoda) изучены представители родов Taenia и Echinococcus - Taenla ovls -личиночная стадия Cysticercus ovls и Echinococcus granulosus - личиночная стадия протосколекс. В семействе Fasclolldae (класс Trematoda) исследованы представители рода Fase1о1а -F.hepatlea. Из семейства Trlchlnellldae (класс Nematode) изучены представители рода Trichineila - T.splralls, T.pseudosplralls, T.splralls var.natlva, T.splralls var. nelsonl. В семействе Trlchostrongylldae (класс Nematoda) исследован представитель рода Nematodlrus - N.spatlger.

Сбор материала производился от разных животных -хозяев. Так, личинки эхинококка (протосколексы) выделены из печени свиней; личинки цестод (цистицерки) - на серозных покровах брюшной полости овец и нематодирусы - из кишечника овец. Взрослые особи F.hepatlca собраны из печени крупного рогатого скота и экспериментально зараженных кроликов.

Личинки трихинелл выделены из мышц спонтанно зараженных убойных животных (медведь, кабан) и экспериментально зараженных мышей линии BALB/c, выделение проводили стандартным методом переваривания в искусственном

желудочном соке (1* НС1 и 1* пепсин).

Выделение ДНК проводили стандартным методом с использованием протеиназы К, фенола и хлороформа в качестве депротеинизирующих агентов. ДНК осаждали 96* спиртом и растворяли в ТЕ буфере (рН 8,0). Обработку ДНК рестриктазами проводили по Маниатису и соавт. (1964 г.). Блот - гибридизацию осуществляли по методу Саузерна с использованием меченной Р^ДНК фага М 13 в качестве зонда (Ryskov et al, 1988).

"Таксонопринтный анализ ДНК проводился по методике, описанной авторами этого метода (Федоров и др., 1992 г.). Схематически он включал гидролиз ДНК мелкощепящей

чо

рестриктазой, введение Р - метки в 3'-концы рестриктных фрагментов ДНК с помощью Кленовской реакции, электрофорез ДНК в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и радиоавтографию гелей.

Полимеразная цепная реакция в варианте с единичными праймерами (RAPD - PCR) осуществлялась по Welsh, Мс Cleland (1990). В работе было использовано пять синтезированных олигонуклеотидных праямеров, размером от 10 до 22 нуклеотидов. Амплификацию проводили на амплификаторах НПО г.Санкт-Петербург и "MJ Research".

. В работе приведены и использованы фотографии и схемы полученных электрофореграмм и радиоавтографов. Статистическая обработка проводилась методом кластерного анализа UPGMA (программа NTSYS). Для построения дендрограмм рассчитывались матрицы генетического сходства при попарном сравнении спектров амплифицированной ДНК гельминтов по формуле (Wetton et al, 1987).

2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.1. Сравнительное изучение ДНК гельминтов методом геномной дактилоскопии

На рисунке 1а приведены данные сравнительного анализа ДНК прокариот и эукариот, полученные с использованием метода геномной дактилоскопии. В качестве представителя прокариот

Т.п.«. i 2 з Ч г 3 Z 2 5 6 3

¿,ъ-

2,0-

а.

£

Рис.1 Схематическое изображение спектров гипервариабельных . фрагментов, полученных методом геномной дактилоскопии для ДНК:.

. 1 - Brucella afcortus; 2 - Trichinella splralls; 3 - Fasciola . hepatica; 4 - Cysticercus ovls; 5 - Trlchlnella pseudosplralls (свинья); 6 - T.pseudosplralls (енот).

Во всех случаях использована рестриктаза Mva I и зонд 32Р - меченная ДНК фага М 13.

. Варианты геномных отпечатков анализированы в агарозных гелях 1,4« (а). 0,8* (б) и 1« (в).

была взята ДНК патогенного микроорганизма Brucella abortus, а для эукариот - гельминты различных классов (Cestoda, Nematoda, Trematoda) и видов - Fase lo la hepatlca, Trichinella spiralls и Cysticercus ovls.

В результате такого сравнения мы наблюдаем резкое отличие фингерпринтного спектра распределения гибридизационных фрагментов мезду прокариотами и эукариотами. Число видимых фрагментов у Brucella abortus 7 -9 и основная зона их разделения лежит в области от 9,4 до 4,3 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Молекулярная картина гибридизации у гельминтов значительно сложнее. Общее количество фрагментов, в среднем, 15 - 25, располагающихся в области от 17 до 1 т.п.н.

Между представителями разных видов гельминтов наблюдаются резкие различия как по числу полос, так и по их взаиморасположению и интенсивности окрашивания.

На рисунке 16 представлены данные, полученные для ДНК гельминтов двух родов - Trichinella и Fasclola.

При сходном количестве выявленных фрагментов (около 20), следует отметить, что у ДНК представителя рода Trichinella (Т.spiralls) основная зона располагается в районе 9,4 - 4,3 т.п.н., тогда как у Fasclola (F.hepatlca) -в области 4,5 - 1,1 т.п.н. Взаиморасположение и интенсивность гибридизационных фрагментов также резко отличается, процент совпадающих фрагментов составляет лишь 12*.

На рис.1в приведены данные генетического анализа ДНК гельминтов рода Trichinella, в том числе, Т.spiralls и T.pseudosplralls и рода Fasclola (F.hepatlca).

При сравнении спектров фрагментов для представителей родов Fasclola и Trichinella выявляются характерные различия по ДНК этих образцов, отмечаемые нами ранее (см.рис.16).

Разнороден спектр распределения фрагментов у двух видов трихинелл - Т.spiralls и T.pseudosplralls (рис.1в, 1г). Обнаруживаются довольно значительные отличия этих представителей друг от друга. Генетическая изменчивость выявляется по зонам распределения фрагментов, по числу полос

т.п.-н.

23

1 г 2 з ч s 6

9,4

4,i-

2,3 2,0

f «S

a.

Рис.2 Схематическое изображение спектров гипервариабельных фрагментов, полученных методом геномной дактилоскопии для ДНК: '

1 - Trlchinella pseudospiralis (свинья); 2 Т.pseudospiralis (енот); 3 - _T.spiralis (свинья); 4 -Т.spiralis (гиена); 5 - Т.spiralis (медведь); 6 - Т.spiralis (кабан); 7 - Fasciola hepatica (Московская обл.); 8 -F.hepatica (Мордовия).

Во всех случаях использована рестриктаза Mva I и зонд

•lo

- ДНК фага М 13; а - 1* агарозный гель, б - 1,2* агарозный гель.

и их расположению, по интенсивности окрашивания отдельных Фрагментов. Так, у Т.spiralis гибридиэационный спектр имеет достаточную протяженность по зонам распределения фрагментов (от 20 до 1 т.п.н.), а у T.pseudosplralls наиболее интенсивная зона расположена в области 9,4 - 4,5 т.п.н. Количество фрагментов у Т.spiralis составляет 21, для T.pseudosplralls - 12.

Для сравнения внутривидовых иэолятов у T.pseudosplralls были взяты ДНК трихинелл, выделенных от разных животных -хозяев, в частности, от свиньи и от енота-полоскуна. При данных условиях эксперимента, каких-либо существенных отличий между трихинеллами от разных животных, обнаружить не удалось. Так, два представленных образца геномной ДНК T.pseudosplralls имеют практически одинаковый спектр распределения гибридизационных фрагментов. Наиболее четко это проявляется в зоне 20 - 10 т.п.н.

Четыре образца Т.spiralis (см.рис.2) от разных хозяев (свиньи, лисы, гиены, кабана) практически одинаковы. В данном эксперименте не отмечено различий в спектрах гибридизации у личинок трихинелл, выделенных после спонтанного и экспериментального заражения.

На рисунке 26 дан сравнительный анализ двух изолятов Fasciola hepatlca, выделенных из печени крупного рогатого скота из двух различных регионов - Московской области и Мордовии. При анализе генетического отпечатка этих образцов с использованием геномной дактилоскопии выявлены некоторые отличия. Это проявляется и в расположении отдельных фрагментов, в том числе мажорных, в интенсивности

и взаиморасположения других гибридизуюшихся фрагментов. Распределение фрагментов является равномерным по всему спектру распределения, более четким в области от 4 - 2 т.п.н.

2.2. Сравнительное изучение ДНК гельминтов методом "таксонопринта"

На рисунке 3 представлены даные анализа геномной ДНК трихинелл и фасциол методом таксонопринта ДНК. Эксперименты

1 ¡t54S4S16>S42ii

п.-н.

- Г 30?

- 4V

- 36 s

315-

cl <5~ 4

Рис.3 -Схематическое изображение профилей ДНК, полученных методом "таксонопринта" для -ДНК: .

1 - Т.spiralis (лиса): 2 - Т.spiralis (свинья): 3 -Т.spiralis (кабан); 4 - Т.spiralis (медведь); 5 - Т.spiralis (волк); 6 - Fasciola hepatica.

. Для разделения фрагментов, полученных с помощью рестриктаэ Msp I (a), Hlnf I (б), Tag I (в) использовали 10* полиакриламидный гель.

проводились по описанной методике (см.раздел материалы и методы) с использованием мелкощепящих рестриктаз Msp I (рис.За), Hlnf I (рис.36) и Tag I (рис.Зв).

Как видно из этих экспериментов, представленные изоляты трихинелл практически одинаковы по

таксонопринтному спектру распределения фрагментов.

Картина таксонопринтного отпечатка с использованием рестриктазы Hlnf I имеет более информативный характер. Так, разделяющихся фрагментов больше (около 20), чем у образцов, обработанных рестриктазой Msp I (ок. 12) и интенсивность проявления их выше.

Зоны разделения таксонопринтных фрагментов находятся в области 600 - 50 пар нуклеотидов, что отличается от зон распределения фрагментов в методе геномной дактилоскопии. Образец исследованной ДНК печеночного сосальщика (F.hepatlca) значительно отличается от изолятов трихинелл, в особенности, по расположению таксонопринтных фрагментов относительно друг друга. Следует отметить, что таксонопринтный анализ, являясь новым методом, ранее не использовался для характеристики гельминтов. Наши результаты согласуются с данными по другим объектам (Федоров и др., 1992; Потапов, Рысков 1993; Гречко и др., 1993) и свидетельствуют о том, что этот подход выявляет ДНК -маркеры, специфичные для видов, родов и таксономических групп более высокого ранга.

2.3. Сравнительное изучение ДНК гельминтов методом полимеразной цепной реакции с' единичными праймерами

На рисунке 4 приведены спектры ДНК печеночного сосальщика Fase lo la hepatlca. полученные с помощью полимеразной цепной реакции с использованием пяти праймеров, размером от 10 до 22 нуклетидов. Для каждого из этих праймеров производился подбор оптимальных условий ПЦР-анализа (концентрации реагентов, температурный режим и т.д. ).

т.п.«. i 2 3 4 S

2,0-

V—

Рис.4

Схематическое изображение спектров ДНК-продуктов, полученных методом полимеразной цепной реакции для ДНК печеночного сосалыпика при использовании пяти праймеров:

п 1 - s

п 2 - 5

П 3 - 5

П 4 - 5

П 5 - 5

- ACCGGGAGACGGlAG)GTCTCGCT;

- CCGGCCTTAC;

- CGCCCATGGTTAGACTTAGT;

- GCTTAGCCGAATTGGC;

- GTAAAAGGACGGCCAGT.

Можно отметить существенные различия в спектрах распределения ДНК-продуктов для одной и той же ДНК в зависимости от использованного праимера. Очевидно, что из пяти использованных праймеров наиболее информативными . являются лишь те, которые дают достаточно большое количество четких, интенсивных полос.

На рисунках 5 и 6 представлены спектры амплифицированной ДНК гельминтов, полученных методом полимеразной цепной реакции с помощью трех единичных праймеров п 1 (рис.5а), п 2 (рис.6); и п 5 (рис.56). Для сравнения использовались ДНК трихинелл T.spiralls (изоляты от свиньи, волка, медведя, лисы) и T.pseudospiralis (от свиньи), отдельные виды родов Nematodirus, Echinococcus и Taenia, а также представителей Fascio 1а. \

. Следует отметить, что для каждой из изученных ДНК мы проводили неоднократные амплификации, и в работе приведены типичные результаты, подтверждающиеся в разных экспериментах.

Анализируя спектры ДНК представителей гельминтов из разных таксономических групп, мы установили, что наибольшие различия в спектрах наблюдаются между гельминтами из разных

Т.П.-Н.

i 1 3 Ч 5- 6 ? I

9 9 14

CL

Рис.5 Схематическое изображение спектров ДНК - продуктов, полученных методом полимеразноя цепноя реакции с . использованием праямеров п 1 (а) , п 5 (б). Разделение . фрагментов проводилось в агарозных гелях разной концентрации (а - 1,2%, б - 1,5%). Были использованы следующие образцы ДНК:

1 - Т.spiralis (свинья); 2 - Т.spiralis (волк); 3 -Т.spiralis (медведь); 4 - Echinococcus granulosus; 5 -Cysticercus ovis; 6 - Т.spiralis (лиса); 7 - Fasciola . hepatlca (Курская обл.); 8 - Nematodirus spatiger; Э -Trichinella pseudosplralis.

S * M 9 9 JO И 12. (п.н)

У 2 3 Ч М 5 6

№4 юм

92$ 333

CL

Рис.6 Схематическое изображение спектров ДНК - продуктов, полученных методом полимеразной цепной реакции с использованием прайыера п 2. Разделение фрагментов

проводилось в агарозных гелях разной концентрации (а - 1,6*. б - 1,2*). Были использованы следующие образцы ДНК: 1 -Trichinella spiralis (волк); 2 - Т.spiralis (лиса); 3 -T.spiralis (свинья); 4 - Nematodlrus spatiger; 5 .-Cysticercus ovis; 6 - Fasclola hepatica; 7 - Echinococcus granulosus," 8 - F.hepatica (неполовозрелые); 9 - F.hepatica (Курская обл.) ДНК единичной особи или смеси из пяти особей; 10 - F.hepatica (кролик); 11 - F.hepatica (Курская обл.); 12 - F.hepatica (Калужская обл.). .

М - маркер молекулярных масс pBR 322/Mva I. .

классов, родов и между отдельными видами.

Так, например, цистицерк, эхинококк и нематодирус имеют в своем спектре незначительное число совпадающих фрагментов (рис.5 дорожки 4, 5, 8; рис.6 дор. 4, 5, 71. По всем остальным фрагментам эти виды сильно различаются.

Заметные различия можно обнаружить при сравнении T.pseudosplralls u Echinococcus (рис.56), а также между F.hepatlca, Echlnococus и Cysticercus (рис.5а, рис.66).

Значительно меньше различии можно найти при сравнении ДНК трихинелл - изолятов от свиньи, волка, лисы и медведя (рис.5а, рис.6а).

Небольшие отличия в спектрах найдены при сравнении ДНК фасциол, выделенных из печени КРС, из разных регионов -Курская и Калужская обл. (рис.66 дорожки 9, 11, 12), а также между образцами ДНК фасциол, выделенных из печени коровы и кролика (рис.66, дорожки 10, 11, 12).

Для демонстрации связей, существующих между изученными представителями гельминтов нами были построены дендрограммы генетического сходства по спектрам амплификации ДНК гельминтов при использовании метода полимеразной цепной реакции с единичными праймерами п 1 (рис.7а) и п 2 (рис.76, в).

При таком подходе в один кластер (группа с наибольшим генетическим сходством) попадают все изоляты трихинелл (рис.7а, 6), а также изученные особи F.hepatlca (рис.7в). Представители родов Neoatodlrus, Taenla и Echinococcus значительно отличаются между собой и таклоэ отличаются от рода Trichinella и Fasclola.

. Внутри группы трихинелл изолят от лисы отличается от других изолятов (свинья, медведь, волк) - рис.7а. .

Среди фасциол наименьшим сходством обладает ДНК фасциолы, выделенной от кролика (рис.7в).

Таким образом, метод многомерного статистического анализа при сравнении полиморфных спектров ДНК гельминтов может быть эффективно использован для их классификации и выяснения вопросов внутри- и межвидовой дифференциации.

0.00

0.16

0.32

0.48

-С

— Т.¡р. ((он*)

— Т. 1р.

— Т.зр. ¿с(ин1)>)

— Т.зр. (лиса.)

— рсЛшс. $1**. _СулЬ'ихж*

аш

0.16

0.32 1

0.48

_064

— Т.:р. Своя*)

_Т. ¡р. (лиса.)

_Тф.

— КиьссЬхИи'!

_Су.гй'сггллг

_РазаеСа. ¿ер.

О.СО

0.25

а 50

€

0.75

1.00

— СугИсг&иг ош

— ёсЬмс. $глн.

— Я/Цо. (нелтЛяр.,

— Р. кер.

_р. Аер. (калчга)

_Р.Аер. С

_Р. Аер. Смолин)

Рис.7 Дендрограммы генетического сходства, построенные методом 1/РСМА /ЫТЗУЗ-рс) для ДНК гельминтов, исследованных с помощью полимераэной цепной реакции с единичными праямерами: а - праймер п 1; б,в - праямер п 2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты демонстрируют широкие возможности молекулярно-генетических методов для изучения вопросов, связанных с идентификацией, дифференциацией, систематикой и филогенией гельминтов. Следует отметить, что методические разработки, касающиеся гельминтов, немногочисленны и часто нуждаются в усовершенствовании применительно к представителям разных таксономических групп. Нами были отработаны методы выделения ДНК гельминтов трех классов - Cestoda, Trematoda, Nematoda и подобраны оптимальные условия для проведения молекулярно-генетического анализа для методов - геномной дактилоскопии, "таксонопринтного" анализа, полимеразной цепной реакции.

При использовании молекулярных маркеров. одной из главных задач является установление их "таксономической" ценности, т.е. значимости маркера для идентификации изолятов, видов, родов, семейств и т.д.

В нашем исследовании все три метода обладают разными дифференцирующими возможностями, причем каждый из методов выявляет различные участки генома. Так, метод "таксонопринтного" анализа позволяет безошибочно идентифицировать представителей разных видов, отрядов, классов. Классический ДНК-фингерпринтинг может быть эффективно использован для дифференцировки внутривидовых групп (например, фасциолы от КРС из Мордовии и Московской области). Различия между изолятами у трихинелл (Trichinella spiralis, T.pseudosplralls, а также Т.sp.var.nativa, T.sp.var.nelsonl) удалось выявить лишь при использовании RAPD-PCR анализа. Этим же методом удалось выявить некоторые генетические различия между фасциолами, выделенными из печени КРС и экспериментально

зараженного кролика, а также между особями из двух близкорасположенных регионов - Курской и Калужской областей.

Очевидно, что полученные результаты нуждаются в дополнительных более широких исследованиях с привлечением большего числа анализируемых образцов. В то же время уже

сегодня молено констатировать, что выявленный полиморфизм ДНК позволяет по-новому рассматривать вопросы, связанные с таксономическим статусом отдельных видов и изолятов, а также проблемы гостальной специфичности.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и использованы применительно к гельминтам современные методы анализа полиморфизма ДНК: геномная дактилоскопия (ДНК-фингерпринтинг), "таксонопринт ДНК" и полимеразная цепная реакция с единичными праймерами.

2. Отработаны методы выделения ДНК гельминтов трех классов - Cestoda, Nematoda и Trematoda и подобраны оптимальные условия для проведения молекулярно-генетического анализа для каждого из методов.

3. Метод геномной дактилоскопии и метод таксонопринта позволяяет выявить различия между отдельными представителями родов Trlchlnella и Fasciola,

4. С помошью геномной дактилоскопии найдены геномные отличия между F.hepatlca из ряда регионов России.

5. Метод полимеразной цепной реакции помимо межвидовых и мелфодовых отличий позволяет обнаружить различия между отдельными изолятами Trichinella, а также различия в спектрах ДНК печеночного сосальщика F.hepatlca, взятых из печени крупного рогатого скота и экспериментально зараженного кролика, а также между фасциолами от КРС из различных регионов страны.

6. Установлено, что все три использованных молекулярно--генетических метода имеют таксономическую значимость и могут быть использованы в одних случаях для характеристики родов и видов, в других - изолятов и внутривидовых групп гельминтов.

7. Методом кластерного анализа на основании спектров ДНК, полученных с помощью полимеразной цепной реакции, построены дендрограммы генетического сходства. У представителей филогенетически более отдаленных групп (семейства, рода) полиморфизм ДНК выражен в большей степени, чем у филогенетически более близких изолятов, видов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Использованные нами молекулярно-генетические методы (геномная дактилоскопия, полимеразная цепная реакция и "таксонопринтный" анализ ДНК) являются высоко информативными и могут быть использованы для определения гельминтов из различных таксономических групп /классов, родов, видов, изолятов/.

2. Использованные методы исследования могут служить дополнительным критерием для ранней прижизненной диагностики возбудителей гельминтозоонозов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Романова Е.А. Геномная "дактилоскопия" гельминтов: использование ДНК фага M 13 в качестве гибридизационного зонда// Тезисы научн.конф. "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" г.Уфа, 1989, часть II, стр. 98-99.

2. Романова Е.А., Бенедиктов И.И., Рысков А. П. Использование метода геномная "дактилоскопия" для анализа полиморфизма популяций гельминтов// Тезисы докл. Вс.научно-техн.конф. "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине" г.Нижний Новгород, 10-12 окт. 1990, стр.105-106.

3. Романова Е.А. Использование технологии геномная "дактилоскопия" в изучении строения геномов гельминтов// Бюллетень ВИГИС, вып.53, М, 1991, стр.109.

4. Рысков А.П., Романова Е.А., Бенедиктов И. И., Пенькова Р.А. Анализ генетического полиморфизма возбудителей гельминтозных заболеваний// Вестник сельскохозяйственной науки, 1990, Т 6, стр.147-149.

5.. Romanova Е.А., Benedlktov I.I., Ryskov А.P. The use of technology of genome "dactlloscopy" for studying genetic polymorphism of helminths popylatlons// Th. of YII International Congress of Parasitology: Paris, 20-24 August, 1990, Bui. De La Société frangalse de parasltologle.

Anwee, 1990, Tome 8, Sup.nl, s.31.

6. Рысков А.П., Фаиэов Т.Х., Алимов Н.М., Романова Е.А. Геномная "дактилоскопия": новые возможности в определении видовой принадлежности бруцелл// Генетика, том 26, 1990, N 1, стр.130-133.

7. Романова Е.А. Использование технологии геномная "дактилоскопия" для изучения генетической структуры популяций гельминтов//Тезисы докл. Вс.Симпозиума "Факторы регуляции популяционных процессов у гельминтов" г.Пушино, 1990, 3-5 апреля, стр.111.

8. Романова Е.А., Пенькова Р.А. Использование метода геномной дактилоскопии для генотипирования трихинелл// Тез. докл.научн.конф."Эколого-биологические и фаунистические аспекты гельминтозов", Ереван, 1991, 20-22 мая, стр.96-97.

9. Романова Е.А. Анализ ДНК фасциол методом геномной дактилоскопии// Тезисы докл.Вс.научн.конф. "Методы профилактики и борьбы с трематодозами человека и животных" г.Сумы, М., 1991, 9-11 окт., стр.99.

10..Ronanova Е.А., Ryskov А.P., Benedlktov IЛ.Analysis of genetic polymorphism of helmlnthose agents by DNA fingerprinting and random primed PCR amplification// Th. of Second International Conference on DNA Fingerprinting, Belo Horizonte, Brazil, 9-12 november, 1992, s.92.

11. Романова Е.А. Анализ гипервариабельных последовательностей ДНК Trlchlnella spiralis и Trichlnella pseudospiralls методом геномной дактилоскопии// Тезисы докл. VI научн.конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных, 12-14 мая, 1992, стр.160-161.

12. Romanova Е.А., Benedlktov 1,1., Ryskov А.P. Comparative analysis of genomic DNA of Trlchlnella by DNA fingerprinting and random primed PCR amplification// Th of Elgth International conference on trlchlnellosls, 1993, Italy, Orvleto, 7-10 September, s.128.

13. Семенова С.К., Романова Е.А., Бенедиктов И.И., Рысков А.П. Анализ генетической изменчивости печеночного сосальщика Fase lo la hepatlca с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праимерами// Генетика, 1995, N 2 (в печати).

14. Романова Е.А., Семенова С.К., Бенедиктов И.И., Рысков А.П. Использование полимеразноя цепной реакции для идентификации гельминтов из родов Trlchlnella, Fasclola, Echinococcus, Nematodlrus, Taenia// Паразитология (в печати).