Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномная дактилоскопия тутового шелкопряда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Геномная дактилоскопия тутового шелкопряда"

носковсюш ордена ленина к ордена трудового красного знамени педагогический государственный университет

• име1ш_влкле11ина Специализированный совет К. 053.01.01

На правах рукописи

ТРЕТЯК Александр Петрович

ГЕНОМНАЯ ДАКТИЛОСКОПИЯ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА Специальность 03.00.04 - биологическая химия

автореферат

диссертации на соискание ученол степени кандидата биологических наук

л

Москва 19Э1

Работа выполнена в Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени педагогическом государственном университете имени 0.11. Ленина.

Н а у ч II и п руководитель: доктор биологических наук, профессор ФИЛИППОВИЧ В.Б.

Официальные оппонент и: доктор биологических наук, профессор ЯИМБОРСКАЯ С.А. кандидат биологических наук, старанл шучммл сотр'члчк

, Ведукая организация - Институт биологии ия «ке-

пи Н.К.Кольцова АН СССР.

15.30 часов на заседании специализированного совета К 033.01.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени педагогическом государственном университете имени В.И.Ленина по адресу: Москва, ул. Кибальчича, дом 6, пуд. 506.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке МПГУ ни. В.И.Ленина. Адрес библиотеки: Москва, ул. Пироговская, д 1.

МИРОШШЧЕШСО Г.П.

Завита состоится

Автореферат разослан

Учения секретарь спеииализиоованного совета

ОЖИГОВА А.П.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение генетического разнообразия, индивидуальности и родства организмов на уровне анализа вариабельности структуры ДНК является одной из актуальных проблем современной биологии. В значительной мере решение этого способствует разработка технологии геномной дактилоскопии, основанной на использовании высокоэффективных зондов полиморфизма (минисателлитные ДНК), способных детектировать различные типы гипервариабельных локусов генома (Jeffreys et al., 1985).

Выяснение генотипических различий организмов имеет важное значение для исследований фундаментального и прикладного характера. В селекционной работе для оценки генетической чистоты пород и линий тутового шелкопряда и для характеристики родительских особей значительную роль играет информация о белковом полиморфизме, о вариабельности ферментных систем тканей и органов насекомого (Егорова и соавт., 1978; Филиппович, Коничев, 1987; Егорова, Насириллаев, 1987). Изучение возможностей геномной дактилоскопии для анализа генома, маркирования генофонда и паспортизации пород тутового шелкопряда представляет значительный интерес и оправдано тем, что такого рода исследования ранее не проводились, генетика этого объекта прекрасно изучена, имеется большой спектр коллекционных и промышленных пород и их гибридов, осуществлено получение генетически строго определенных клонов и линий этого хозяйственно-ценного насекомого.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось применение метода геномной дактилоскопии для маркирования ДНК тутового шелкопряда и исследование полиморфизма гипервариабельных локусов генома на различных стадиях развития насекомого. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

провести маркирование генома особей, семей и пород тутового шелкопряда и выяснить возможность их паспортизации;

изучить полиморфизм гипервариабельных локусов, их наследование при скрещивании; генотипическую изменчивость пар-теногенетических клонов;

рассмотреть возможности метода для изучения перестроек в геноме в процессе развития, метилирования ДНК, детектирования полового диморфизма;

изучить возможности маркирования генома тутового шелкопряда мечеными олигонуклеотидными зондами.

Научная новизна работы. Впервые проведено маркирование генома тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей и пород (промышленных и коллекционных), партеногенетических клонов на различных фазах и стадиях развития насекомого. Б гибридизационных спектрах в качестве молекулярных маркеров выделено четыре характерные полосы (А, В, С и Б). Проанализирован характер распределения гипервариабельных фрагментов в ряду индивидуум-семья-порода, а также у индивидуумов, полученных путем амейотического и меиотического партеногенеза. Впервые зафиксирован факт метилирования ДНК у тутового шелкопряда.

Практическое значение работы. Представляется перспективным использование геномной дактилоскопии для паспортиза-^ ции генофонда тутового шелкопряда и оценки генетического родства (или расстояний) пород и гибридов на их основе. Точность технологии является достаточно высокой для маркирования генома особей, семей и партеногенетических клонов, что может найти широкое применение в селекции тутового шелкопряда.

Аппробацмя работы. Результаты исследования докладываясь на-10-ом съезде Всесоюзного Энтомологического общества (Ленинград, 1989), Международной конференции "Актуальные проблемы мирового шелководства" (Мерефа, 1991), конференции МПГУ им. В.И.Ленина (Москва, 1991).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы по структурной организации генома насекомых и тутового шелкопряда; главы, посвященной материалам и методам исследования; 2-х глав, содержащих результаты эксперимента и их -обсуждение¡^заключения; выводов и списка литературы, включающего 181 ссылку. Работа изложена на 121 странице машинописного' текста, содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материал и методы исследования.

Работа выполнена на образцах ДНК, выделенных из тканей куколок, личинок и грены тутового шелкопряда.

Для анализа ДНК брали грену на стадии Ej , у личинок -мышечный мешок, у куколок - зачатки крыльев и гонады; для изучения изменений в процессе, развития насекомого - яйца на стадиях Dj-Е3.

Выделение суммарной клеточной ДНК проводили с использованием протеиназы К, фенола и хлороформа в качестве депроте-инизирующих агентов. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ буфере (рН 8,0). Обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили по Маниатису и соавт. (1984). Блот-гибридизаиию

осуществляли по методу Саузерна с использованием меченной т?

Р ДНК фага Ml3 в качестве зонда. Радиоавтографию проводили при -70°С на пленку РМ-В. Денситограммы получали сканировав-нием радиоавтографов на лазерном денситометре "Ultroscan XL" фирмы"ЬКВ" (Швеция). Иллюстративный материал получали на сканнере "Scan Jet Plus" и лазерном принтере "Laser Jet Plus, serles II" (Япония) при помоши пакета программ "Н.Р. Scan Jet Plus" фирмы "Gallery Plus" (ФРГ).

Результаты и их обсуждение

Изучение полиморфизма ДНК тутового шелкопряда методом геномной дактилоскопии с использованием меченой ДНК фага Ml 3 в качестве зонда.

Для проведения маркирования генома тутового шелкопряда нами был выбран вариант геномной дактилоскопии с использованием MspI в качестве эндонуклеазы рестрикции.

Проблема идентификации особей, семей и пород. Для выяснения возможности паспортизации промышленных пород тутового шелкопряда анализировали распределение гипервариабелышх полос в геноме индивидуумов, семей и пород. Учитывая то, что ДНК семей и пород, выделенная из сотен и тысяч грен, представляла собой сложную смесь индивидуальных геномов, на дак-тилограммах должны выявляться наиболее часто встречающиеся совпадающие полосы, а редкие полосы могут либо вообще гтсут-

ствовать, либо проявляться как минорные. Таким образом, "разбавление" индивидуальных геномов в препарате ДНК приводит к более четкому выражению обших для всех геномов локусов и, в результате, к менее вариабельным картинам гибридизации.

Гибридизационные спектры геномов особей пород СК2 и ПС5 представлены на рис. 1. В ДНК куколок каждой породы (рис. 1,а,б) наблюдаются индивидуальные отличия дактилограмм по числу, расположению и интенсивности полос. Наиболее часто встречающиеся четыре типичные мажорные полосы мы обозначили прописными латинскими буквами А, В, С, Б. Для данной системы анализа полиморфизма эти фрагменты могут рассматриваться как популяционные маркеры. На дактилограммах их положение было определено с- помощью молекулярных маркеров 1ДНК фага X, ре-стрицированная ЕсоЯ1). Фрагменты А, В, С, Б располагались на уровне от 2 до 6 тпн. Кроме того, были маркированы зоны: а - между 7,4 тпн и фрагментом А, Ь - между А и В, с - между ' В и С, й - между С и В. В области менее 2 тпн как правило обнаруживались лишь минорные полосы гибридизации, которые нами далее не рассматривались. Для сопоставления фрагментов гибридизации в одних и тех же зонах, но полученных в разных экспериментах, каждую зону разбивали на одинаковое число секторов: а - на 5, Ъ - на 3, с - на 3, (1 - на 5. Каждому сектору зоны присваивали собственный номер, а фрагментам, находящимся в них, присваивали номер сектора. Полосы с одинаковыми номерами считались совпадающими. В результате каждым спектр полос гибридизации можно было формализовать в виде определенных буквенных сочетаний, например

АВСГЬ1 с3с11 <а0с(3(а5.

При анализе геномов четырех семей породы ПС5 (рис. 1.в) в гибридизационных спектрах можно выявить значительно большее количество полос гибридизации. При этом наблюдается определенное сходство в проявлении типичных фрагментов А, В, С и Ъ по частоте встречаемости - и интенсивности в ДНК семейных кладок и ДНК индивидуальных куколок. Интенсивность некоторых минорных полос также соответствует их распространенности в индивидуальных геномах. Резким и неожиданным отличием в картинах гибридизации ДНК является серия новых полос в зоне над фрагментом А. По-видимому, некоторые из них (одна или две, видимые как мажорные-) достаточно распространены и индивиду-

Рис 1. Гипервариабельные последовательности в МБр1- гидролизате ДНК пород СК2 (а) и ПС5 (о,в): а,<5 - особи; в - семьи. А, В, С, В - типичные фрагменты. Гибридизация при 65°С.

альных геномах популяции породы ПС5.

Результаты анализа ДНК семей и породы Украинская 13 представлены на рис. 2,а. Видно, что все четыре типичных фрагмента А, В, С, Б имеются в ДНК породы (дор. 6). В данной выборке семей (дор. 1-5! наблюдается некоторая вариабельность ДНК по фрагментам А. С и лишь минорное проявление1 фрагмент? I). Характерным лля данной породы является наличие двух фрагментов в зоне над полосой С в ДНК отдельных семей и породы в целом. Можно отметить также наличие большого числа слабых, но вполне различимых фрагментов е зоне менее 3,5 тпн, которые обладают определенной вариабельностью для ДНК отдельных семей и сохраняются в ДНК породы. Суммарный спектр гибридизуюшихся фрагментов весьма специфичен для этой породы.

На рис. 2,6 представлены гибридизационные спектры ДНК двух семей породы Украинская 14 (дор. 1 и 2). Обшими для них являются фрагменты А, С и В. Спектр первой кладки содержит меньше гипервариабельных участков, чем Еторой I табл 2). В ДНК породы (дор. 3) отмечается общее уменьшение 1сла полос по зонам спектра по сравнению с семьями по-видим у, за счет эффекта "разбавления" индивидуальных геномов. При этом обнаруживаются Фрагменты А, В и С, а также слабо выраженный фрагмент I) и полоса над фрагментом Л. Следует отметить существенные различия е спектрах гибридизуюшихся фрагментов ДНК пород Украинская 13 и Украинская 14, достаточные для их идентификации.

На рис. 3 представлены результаты анализа ДНК различных пород тутового шелкопряда. Так как данные взяты из различных экспериментов, сравнение гибридизационных спектров основано на подвижности маркеров. Во всех случаях наблюдаются отличия гибридизационных картин 1см. рис. 3 и помписи к нему). ДНК пород имеют как близкие (Китайская 110 и Украинская 14), так и сильно отличающиеся (Даидзо, Советская 12, Мерефа 5) спектры гибридизуюшихся фрагментов. Хотя число мажорных полос на картинах гибридизации относительно невелико, представляется возможной идентификация каждой из пород.

1аким образом, примененная нами методика геномной дактилоскопии позволила провести маркирование генома тутового шгмп'"прчлп на уровн""' отдельных особей, семей и породы. I к?1.-

3 4 5

Т ПН

7,45,8. 5,6"

4,9-

Т "5

3,5-

+ В ►

«яшишвис ►

* '

тпн

Ряс '_. Гипервариабельные последовательности в Мгр1- гидроли^ате ДНК юрод Украинская 1; ■.а! и Украинская 14 16). а: 1-5 - семьи, 6 - порода.' 0: 1-2 - семьи, 3 -пзрода. А, В, С, I) -типичные фрагменты. Гибридизация при 65 С.

I

Рис 3. Гипервариабельные последовательности в М5р1-гидролизате ДНК суммарной грены пород тутового шелкопряда. 1 - партеноклон ПКА 261 ^ (АВСБа^а^а^ ^с^с^з^1 • 2 - Даидзо < АБс2с3 ), 3 - Мархамат (АВСЮс^), 4 - Китайская 110 (АВСс3 ), 5 - Украинская 14 (АВСа2 ), 6 -Украинская 13 ( АВСБс^ Сд >, 7 - Мерефа 5 ( АВСОс^ ^ ^ с^ Ь, ^ с^ с^ с^ с^ >, 8 - Украинская новая ( АВСБЬ1 с3с11с12с13с15 ), 9 - Украинская 11 с АВСБс2<11 <12с14с15 ), 10 - Советская 12 ( АСЬа2с12с15 ), И -Советская 5 (АБСБа0с12 ). 12 - Бухарская (АСБа2а3а,5Ь2Ь3С2с13 I.

А, В, С, Б - типичные фрагменты. В скобках представлены формализованные спектры. Данные независимых экспериментов. Гибридизация при 65°С.

честве молекулярнох маркеров Еыделено четыре характерные полосы (А, В, С и Б). Проанализирован характер распределения гипервариабельных фрагментов в ряду индивидуум-семья-порода. При этом отмечено, что в большинстве случаев они дают сходные спектры. Особенности в наборе гибридиэационных полос, характерные для породы, проявляются как в семьях, так и на уровне индивидуальных организмов, а индивидуальные особенности геномов, характерные лишь для небольшого числа организмов в популяции, теряются в семьях и породе. Лаже при небольшом числе мажорных полос выявляются гибридизационные спектры, достаточные в большинстве случаев для решения вопроса об идентификации пород тутового шелкопряда. Сравнительный анализ спектров вариабельных фрагментов позволяет оценить степень генетической близости пород, а также получить геномную характеристику семей тутового шелкопряда.

Исследование полиморфизма гипервариабельных локусов в геноме. Наследование гипервариабельных локусов при скрещивании рассмотрено на блоке пород СК2, ПС5.

На рис. 4 представлены гибридизационные спектры ДНК пород СК2, ПС5 и их прямого и обратного гибридов. В этих экспериментах использовали формамидную гибридизацию, позволяющую более эффективно детектировать низкомолекулярные фрагменты. Оказалось, что в данных условиях картины гибридизации ДНК пород СК2 и ПС5 практически неотличимы (дор. 1 и 2). В то же время в ДНК гибридов наблюдаются четкие отличия. Гак для ДНК прямого гибрида характерно уменьшение интенсивности двух верхних полос гибридизации (дор. 3 1. Для обратного гибрида сильно ослабляется интенсивность полосы В и появляется мажорная полоса над А (дор. 4). При сравнении гибридиэационных спектров ДНК гибридов (дор. 3, 4) видно, что число совпадающих фрагментов меньше такового для исходных пород и составляет 75%. Интерпретация этих различий может быть основана на предположении об избирательности наследования определенных генотипов в популяции. Интересно отметить, что некоторые дополнительные полосы гибридизации, обнаруживаемые в ДНК гибридов, характерны либо для материнском, либо для отцовской породы (отмечено звездочкой!. Возможно, это связано с преимущественным наследованием определенных гипервариабельных локусоЕ, и это может быть использовано для изучения

12 3 4

Рис 4. Гипервариабельные последовательности в МБр1-гидролизате ДНК пород СК2, ПС5 и их гибридов. 1 - родительская порода СК2, 2 - родительская порода ПС5, 3 - гибрид типа 1 , А - гибрид типа 2. А, В, С, Б - типичные фрагменты. Анализ ДНК суммарной грены. Формамидная гибридизация.

роли материнского генома в приобретении различных полезных признаков.

Выявление генотипической изменчивости. Для исследования взят партеногенетическии клон № 9 амейотического типа у которого анализировались как родительские особи, так и потомки, полученные амейотическим и мейотическим способами. При амепотическом типе партеногенеза индивидуумы состоят из генетически идентичных самок, являющихся точными копиями матери (2У,Аа,ВЪ -> Рр<р гИ.Аа.ВЬ). Получение потомков посредством мейотического партеногенеза (Терская, Струнников, 1974) приводит к возникновению индивидуумов только мужского пола, не сходных между собой (Р^ 24,Аа —>РрсГ 22АА: (Г 22аа), потому что яйца генотипов и УМаа погибают.

Число типов потомков возрастает пропорционально квадрату гетерозиготных пар аллелей, а особи различаются между собой сочетанием различных аллелей (АА, Аа, аа), и таких гетерозиготных пар обычно имеется очень много.

При анализе распределения гипервариабельных полос в спектрах четырнадцати родительских особей, полученных путем амейотического партеногенеза (самки), обнаруживаются идентичные гибридизационные спектры. На рис. 5,а представлены типичные картины для трех представителей данной выборки (дор. 1-3). При получении потомства данного клона таким же амейотическим типом партеногенеза ручаются особи (самки), генетически идентичные как родителям, так и друг другу. Это было показано на ДНК 12 потомков; типичные результаты представлены на дорожках 4-6 того же рисунка.

При анализе генома 13 индивидуумов, полученных путем мейотического партеногенеза (самцы), было получено 13 индивидуум-специфических спектров гибридизации, отличавшиеся друг от друга по числу и характеру распределения гипервариабельных фрагментов (рис. 5,6).

Необходимо подчеркнуть, что геномная дактилоскопия с использованном нами виде выявляет несравнимо большее число генотипических вариантов по сравнению с традиционными методами, базирующимися на данных о белковом полиморфизме и вариабельности ферментных систем тутового шелкопряда (Егорова, Насириллаев, 1987).

Таким образом, г помощью метода показано, что несмотря

/¿3456 1 г 5 1 : 6 7 2 9 /0 // 2 ¡5

Рис 5. Гипервариабельные последовательности в №р1- гидролизате ДНК особей партеногенети-ческого клона № 9, полученных двумя типами партеногенеза: амеиотическим - самки (а), меиоти-ческим - самцы (б ).

а: 1-3 родительские особи, 4-6 -потомки; б: 1-13 потомки. А, В, С, Б - типичные фрагменты. Гибридизация при 59°С.

на гетерозиготность по многим аллелям, все особи, полученные амейотическим партеногенезом (самки), имеют идентичные спектры гибридизации, наследуемые потомками при таком же типе партеногенеза. При получении потомков мейотическим типом партеногенеза (самцы) происходит расщепление по аллелям, что дает высокий индивидуальный полиморфизм на спектрах гибридизации, позволяющий выявить генотипическую изменчивость. Точность технологии является достаточно высокой для маркирования генома тутового шелкопряда и, поэтому, представляется перспективным использование метода для геномной характеристики партеногенетических клонов тутового шелкопряда.

Изучение метилирования ДНК в сайте рестрикции. Как известно, в ДНК животных клеток от 2 до 7% остатков цитоэина метилировано, что связывают с процессами регуляции активности генов.

Метилирование ДНК в сайте рестрикции можно зафиксировать на спектрах как перемещение гибридизуюшихся фрагментов из низкомолекулярной в высокомолекулярную область при использовании ферментов-изошизомеров, например, Мэр1 и НраП, узнающих одинаковую последовательность, но по разному реагирующих на метилирование остатка цитозина. Такое явление было обнаружено при изучении ДНК породы Украинская новая (рис. 6, дор. 1-4; изменение положения полос отмечено звездочками!, а также у партеногенетических клонов.

Для выяснения половых различий в метилировании ДНК анализировали грену мужской и женской популяции партеногенети-ческого клона СЮ/З/Мд (гибридизационные спектры представлены на рис. 6, дор. 5-10). Картины гибридизации по каждой из эндонуклеаз идентичны (дор. 5, 6 и 7, в), что свидетельствует об отсутствии полового диморфизма минисателлитов. При сравнении спектров гибридизации, полученных при использовании ферментов-изошизомеров (дор. 5, 6 сравниваются с дор. 7, 8), можно отметить определенные различия - появление и исчезновение некоторых полос гибридизации фрагментов (отмечено звездочками). В другом опыте (дор. 9 и 10 1 эти отличия видны более отчетливо (отмечено звездочками).

Следовательно, применение метода молекулярной дактилоскопии позволило выявить как сам факт метилирования ДНК, так и отсутствие секс-специфичности в спектрах гибридизации.

Рис 6. Гипервариабельные последовательности в ДНК тутового шелкопряда, выявляемые при помощи эндонуклеаз рестрикции Мэр1 (дор. 1, 3, 5, 6. 9) и НраП (дор. 2, 4, 7, 8, 10): ДНК суммарной грены породы Украинская новая на стадиях Е2 (дор. 1. 2) и Е3 (дор. 3, 4) эмбрионального развития; ДНК грены женской (дор. 5. 6) и мужской (дор. 7-10) популяции партеногенетического

клона СЮ/З/^. А, В, С

типичные фрагменты. Гибридизация при 59 С.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что для проведения маркирования генома тутового шелкопряда оптимальным является вариант геномной дактилоскопии с использованием рестрикционной эндонуклеазы MspI и меченой ДНК фага М13 в качестве зонда.

2. Методом геномной дактилоскопии осуществлено маркирование генома тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей, пород и партеногенетических клонов. В гибридизацион-ных спектрах в качестве молекулярных маркеров для Bombyx morí выделено четыре характерные полосы (А, В, С и D).

3. Уровень вариабельности гибридизационных спектров у реципрокных гибридов значительно выше, чем у пород, что связано с определенным механизмом наследования гипервариабельных локусов.

4. Характер распределения гипервариабельных фрагментов у индивидуумов, полученных путем амейотического и мейотичес-кого партеногенеза, свидетельствует, что, несмотря на гете-розиготность по многим аллелям, все родительские особи, полученные амеяотическим партеногенезом (самки), имеют идентичные спектры гибридизации с гипервариабельными последовательностями ДНК фага М13, которые наследуются потомками (самки) при таком же типе партеногенеза. У потомков, полученных. мейотическим типом партеногенеза (самцы), происходит расщепление по аллелям, что дает высокий индивидуальный полиморфизм на спектрах гибридизации, позволявший выявить ге-нотипическую изменчивость.

5. Применение рассмотренных вариантов геномной дактилоскопии не выявило наличия перестройки и модификации ДНК тутового шелкопряда в процессе постдиапаузного эмбрионального развития, что позволяет использовать грену на любой стадии развития для целей паспортизации.

6. Применение в технологии геномной дактилоскопии фер-ментов-изошизомеров позволило обнаружить как сам факт метилирования ДНК тутового шелкопряда, так и отсутствие секс-специфичности в спектрах гибридизации.

7. Опробованные меченые олигонуклео'тидные зонды не дают удовлетворительных результатов при маркировании генома туто'-

вого шелкопряда и не могут быть рекомендованы для изучения его генома.

8. Метод молекулярной дактилоскопии может быть широко использован в селекции тутового шелкопряда для идентификации пород и партеногенетических клонов, оценки генетической близости пород (расстояний), паспортизации семей, изучения механизма наследования у гибридов, выявления генотипической изменчивости, определения локализации метилированных последовательностей в геноме.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L.: проблема идентификации особей, семей и -пород.//Генетика, -1992, -Т.28, №2, -С.52-62.

2. Третяк А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия особей, семей и пород тутового шелкопряда. //Тезисы докладов Ленинских чтений МПГУ им. В.И.Ленина'. М.: МПГУ, 1991, -часть II. -С.71.

3. Севастьянова Г.А., Третяк А.П., Рысков А.П., Филиппович Ю.Б. Геномная^ дактилоскопия и проблема идентификации генофонда тутового шелкопряда.//Тезисы докладов Международного симпозиума "Актуальные проблемы мирового шелководства", г. Мерефа, июнь 1991. Харьков: -1991. -С.227-228.

4. Севастьянова Г.А. Акименко Л.М., Браславский М.Е., Третяк А.П. Молекулярная дактилоскопия ДНК тутового шелкопряда.//Тезисы докладов Международного симпозиума "Актуальные проблемы мирового шелководства", г. Мерефа, июнь 1991. Харьков: -1991. -С.227.

о

Подписано в печать ^11.91. «.рмат 60x84/^'Объем 1.0 п.л. __Тираж 100 зкз. Заказ_*_ 256I--------------

Ротапринт НИИСО и УК АПН СССР. 103062, Москва, Лялин п., ЗА.