Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроинъекции рекомбинантных плазмид в ранние зародыши тутового шелкопряда, BOMBYX MORI, L.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Микроинъекции рекомбинантных плазмид в ранние зародыши тутового шелкопряда, BOMBYX MORI, L."

МОСКОВСкиЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА (НОЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имена М.В.ЛОМОНОСОВА

}

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЧКОНШ Тамара ТенгазоЕиа

УДК 577.218

МИКРОИНЪЕКЦИИ РЕКОШЫАНТШХ ПДА 3?ВД В РАННИ2 ЗАРОДЫШИ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА. ВОМОТ К021. Ь.

03.03.03 - молекулярная биология

Автореферат ддссартащш на соаскаиав ученой стелена кандидата биологических наук

'Москва - 1991

Работа выполнена р институте молекулярной бяолокш га. В,А. 3;;г ельгардта АН СССР и на кафедре микробиологии, аз-русологай и молекулярной баодогии Тбилисского государственного университета иы. И.В.Дяавахшавала,

Научные руководители: доктор йиологотеоках наук, профессор К.А.Нафаанп, кандидат биологических наук А.И.Шкодаез

Офияпальнве о а а о н s a ï В! доктор блолсгачсскпя ваук Г.Й.Карьэтоз, доктор Саологдческах наук А.В.Иткео,

Ведущая оргьвазааая - Институт Сяологпн геаа АН CGC? '.

Зацата дасиерташш состоится "Z.I щ ç/cfJ^S- 19Э1 г, s час. ва заседания спеэдалиэировшшого совета &.OS3.QÎ. дра Московском государственном ушзвероатете ' • пз» 13, В, Ломоносова,

С диссертацией могшо ознакомиться в библиотеке Биологического факультета ЩУ, по адресу II8S93, Москва, Sema-cias гора, ЛГУ, Биологический факультет.

Автореферат разослан "/-С" сд-с-ч*¿>vÇaJL 1291 p..

/

,Учевы2 секретарь совета

кандидат биологических наук L.H»KarpeaaiîOB

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансформация новых видов сельскохозяйственных животных является одной из основных проблем трансгенной биотехнологии. За последнео время помямо классических объектов Трансгеноэа - дрозофиллы и мыши, получены трансгеинне свиньи, овцы, кролики / Hemmer et al., 1987/, рыбы /Бенсмов и др.,1909/» В данной работе трансгенная технология применена- к представителю отряда Чешуекрылых - тутовому шелкопряду, ЗотЪух mori, J.. Тутовый шелкопряд является ейжным объектом генетических, биохимических и молекулярно-биологическях исследования /Астауров,1979; Струнников, ISÖ7; Garel, I9ÖI; Ooldanith et al., 1984/. В настоящее йремя рассматривается возможность использования тутового шелкопряда, как продуцента чуждых ему белков.'Показана способность его гусениц накапливать высокий, титр Интер4ерона-j,2 / Maeda et al.J985/ и ин~ терлейкина-3 человека /Mtyajama et al. 1 1987/ при их заражении рекомбинантным вирусом ядерного полиэдроза, несущим соответствующие гены под контролем промотора гена полиэдрина.

Альтернативным путем биотвхяологичоского использования тутового шелкопряда может быть получение транс'генннх ланий путем введения целевых генов р клетки полового пути эмбрионов. В сочетаний с методами индуцированного партено- и андрогенетического развития, разработанными Б.Л.Астауровым и В.А.Струнниковым /Астауроа,Т968, 1979; Струнников,1987/, мэтод переноса генов путем прямого введения ДНК в клетки полового пути может открыть возможность использования тутового шелкопряда для производства белков целевого назначения.

Цель и задачи исследования;

I. Введение экзогенных рекомбянантннх ДНК в соматические а половые клетки тутового шелкопряда методом микроинъекция /Николаев

-г -

А.И..Кафиаяи К.А.,1985/ в раяяие эмбрионы. . .

2. Разработка условий микроинъекция, обеспечивающих приемлемую выживаемость оперированных эмбрионов.

3. Проверка пригодности векторной системы на основе Р-элемен-та ЮговорЬу1а те1ааовав*ег для переноса целевых генов в геном тутового шелкопряда. ' #

4. Анализ судьбы экзогенных ДНК в клетках оперированных эмбрионов и их потомства. *

Научная новизна и практическая ценность работы.В течение ряда лет единственным видом насекомых« доступным для траногенной технологии оставалась ВговорЪу1а пе1ыюб,4в1:»г. В настоящей работе этот подход применен к тутовому шелкопряду, для которого установлена принципиальная возможность введения экзогенного генетического материала в соматические и половые клетки посредством махроинъекции в ранние вародши.

В результате исследований подобраны условия шкровнъекшш, обеспечивающие выживание 10-15$ оперированных эмбрионов. Показано, что введенная в ранние эмбрионы экзогенная ДНК в клетках реципиента находится в основной в виде высокомолекулярных, автономно реплицирующихся молекул. В составе трансгеиоодеряащих экогра-хромосомнюс молекул -обнаружены последовательности геномной ДНК шелкопряда, возможно ответственные за репликацию этих молекул.

Разработка трансгеняой технологии в применении к тутовому шелкопряду открывает широкие перспективы в области биологии развития, генетики, селекции и биотехнологического использования этого хозяйственно важного неведомого.

Апробация работы. Материалы диссертации догладывались на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987), на Всесоюзном совещании "Новые направле-

ния s биотехнологии" (Пушино.1987), на кафедре микробиология, вирусологии и молекулярной биологии Тбилисского гос. университета, на совместном семинаре группы молекулярных основ эмбриогенеза я Лаборатории химического и биологаческого анализа биополимеров я клеток института молекулярной биологии АН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем работа. Диссертация'изложена на 11 0 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследования, их обсуждения и выводов, списка литературы, состоящего из 151 наименования. Материалы диссертация иллюстрированы 3 таблицами и 17 рисунками.

' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

В работе в качества реципиентов .использовались грена туто-еого шёлкопряца, полученная от скрещиваний ç (+/+. +/+# +А» +/+) X í ( re/re, ch/ch, le/la, p/p) или $ ПК29 х S (*25,4-2Э х АК.66).- '

Микрошгьекции в грену. проводили на стадии синцитиальной бластодермы. Закрепленную на предметном стекле грену частично дехорвонязирогали, и в полюс, противоположный мякропЬте, при помощи макродозатора микрокапалляром с оттянутым, заточеяннм кончиком ввощли около Ю"6 мя раствора ДНК о концентрацией от 100 до 300 мкг/ше.

Выделена в ДНК из Рабочая. Полученных аэ внызцир-аванной граны бабочек скрещивали между собоЯ в поме откладки грен» из них выделяли ДНК.- Для выделения ДНК бабочек раотиралл в жидком азота в фарфоровой ступке, гомогенизировали стеклянным гомогенизатором в растворе: 0,05 HaOt, 0,05 M ЭДТА, 0,05 трис-BCI pH

8,0 при 0- +4°С. К гомогенату добавляли иротеиназу К ( "ЗДдаа") до 50 мкг/мл, додецялсульфат натрия до 1%, Иа01 до I М и инкубировали ночь при 37°С. Лизат депротеинизировали фенолом и хлороформом, ДНК осаждали изопропанолом при комнатной температуре, дважды переосаждали этанолом и растворяли до 1-2 мг/мл в ТЕ (трис-НС1 10 М, рН 8, ЭДТА I мМ).

Искусственное "оживление" грены. Дяапаузу снимали, обрабатывая грену соляной кислотой (плотность 1,124 при 15°С) 8 мин при 30° /Беляев,1932/. У грены, предназначенной для микроиньекции, дяапаузу снимали 4-5 мин. обработкой соляной кислотой.

Дот-гибридизация. На нятроцеллшозные фильтры ВА-58 (ВсЬХе^ сЪвг & 8сЬив11 ) на точку в одном ряду дозами по I мкл нано-сяля от I до 4 мкг ДНК. После Бысушигания фильтры помещали на бумагу ЧЬаЪтапа-ЗММ, пропитанную 0,5 Ы МаОН и 1,5 М1»а01, затем на 15 мян на фильтр, пропитанный 0,5 М трис-НС1, рН 7,5 и 3 М Ыа01. ДНК иммобилизовали прогревом (70-80°С) 1,5 ч в вакууме; Предгибридизацию проводили в стандартных условиях /Маниатяс,1985/ о 25 мкг/мл Гепароинида С ("Спофа", ЧССР). Гибридизацию вели 16 час при 65°С с мечеными зондами (I млн имп/мян на I мл или около 4 мян емп/мян на 100 си? фильтра). После'отмывки фильтры высушяваля. Ра-диоантографию проводили на пленке РМ-В 1-3 суток при -70°С.

Влот-гибридизация. Блот-гябрадизацию проводили согласно руководству Маниатиса с соавт. /Маниатис, 1985/ с некоторыми модификациями . '

Зонды для гябридизация метиле с помощью ник-траясдяцаи до 3 Ю8 ямп/мия на I мкг ДНК, используя набор "АмгаЬаш" а (Ш? отечественного производства (Ташкент).

"Спа сени е"гшазмид; яз препаратов ДНК трансгеняых бабочек проводили по методу Ханаана с соавт. /НапаЬаа «1., 1980/,

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ -ОБСЗДШЕ

I. Влияние уоловай мякрэянъекций яа выжиЕание эмбрионов 'тутоЕого озлкопряда

.В отличие от оболочки яйца (хориона) дрозофадлы, хорион грены тутоЕого шелкопряда представляет собой прочную скорлупу, прокол которой - высокотраЕматичная операция, ведущая в большинстве случаев к еысыхвняя яйца или нарушениям эмбрионального развития. Сильно влияет на выживаемость эмбрионов доза вводимой ДНК, Диаметр кончика кикропипетки, и само качество процедура мгкроинъек-ций, которое зависит от навыка оператора и в значительной степени состоит в минимизации потерь содержимого яйца при проколе хориона. \

Из табл. I видно, что выживаемость оперированной грены была мала при концентрации ееэдимой ДНК 300 мкг/шг, но составляла приемлемую величину при меньшей концентрации ДНК.

Выживаемость оперированных эмбрионов росла при использовании микрокапилляров о более тбнким кончиком (диаметр 20-30 мкм). Дальнейшее уыеньаевие диаметра кончика не давало выигрыша, т.к. увеличивало Число случаев его закупорки желтком.

• При микрзинъекциях Часто происходит потеря содержимого яйца. По нашему опыту, потеря яйцом более 5-10$ содержимого Еедет к его гибели через несколько часов после операции. Эти потеря могут быть связаны с иепбльзованием микропипеток о недостаточно тонким кончиком, с недостатками аппаратуры а. с гозрастом грены.

Успех микроинъёкции заметно зависал от возраста яиц-греципи-ёнтов. При инъекции в грену возрастом 6 час и менее после откладки чаще наблюдалось существенное выте~аняе содержимого яйца, чем при инъекциях через 8-9 час после откладки. По-видимому, в свежа-

Таблйца I

Ji ii Число Кон-дия Диаметр Число якц с Выход личи-

опытов - оперир. введен, кончика утечкой до яок из гре-

яиц (шт) р-ра ДНК пипетки IQ% объема ны (шт)

Ы:г/мл) (мкм) (шт)

i 95 • 300 30-40 30-35 5

2 83 300 30-40 25-30 4

3 109 300 20-30 18-20 9

4 90' 300 20-30 20-25 4

5 105 300 30-40 30-40 i

6 80 ' 30ó 20-30 17-22 3

7 . 101 150 30-40 20-24 6

а 71 150 20-30 15-20 15

9 100 150 30-40 15-20 27

ю 100 150 20-30 10-20 30

ii 100 150 10-20 32-35 ii

12 105 150 20-30 26-40 ' 5

Примечание: В сериях микрванъекций М II я 12 возраст грены был на 2 часа меньше, чем в остальных сериях.

отложенном яйце существует значительное внутреннее давление, усиливающее утечку через прокол. В дальнейшем для мякройяьзк--цяЯ использовалась грена возрастом 8-10 час и менее после оплодотворения.

В целом, при мвкровнъекциях комбинации рчг25,Х / р020ЬД«2 были подобраны условия, обеспечаваюцде выживаемость I0-I5# one-, раронанных эмбрионов. До 80$ вылупившихся на оперированной грены гусениц завали коконы и яэ 20% коконов вылетели фертильные бабочки.

2. Внедрение экзогенной ДНК р. соматически е и . половые клетки инъецированных- эмбрионов

■ В первой серии микроинъекции е полярную плазму греяы вводили nápa рекомбинант.чых плазмид, составляющие векторную Систему на основе Р-элеманта - транспозирующего элемента - Droaophyla neXanogaeter, которая разработана дм внедрения целевых генов в клетки полового пути дрозофилы / Hubia, IS82/.

Первая пара включала плаэмиду рОгОыз^г - дериват известной векторной плазмиды C-arnegie 2Q, содержащей короткие OI п.н.) обращенные повторы, Фланкирующие гея гову дрозофилы / spíaoiing, 1983/, "справа" от которого был вставлен геномный гея интерферона-и 2 человека под собственным промотором (рис.1).

Рис Л. Схем» конструирования плазмиды pC20hUT*2.

Темный прямоугольник -бактериальный вектор, светлый прямоугольник - ген интерферона « 2 человека под собственным промотором (2,4 т.п.я.), заштрихованный прямоугольник -ген тову (7,5 т.п.и.)

jn» тзоо ясо лъ»

Одновременно о рогоьи.*2 вводили плаэмиду де25.1 / Sabia, 1982/, которая несет нормальный Р-эдемент, обеспечивающий транспозазной функцией тр^Бпозвции последовательностей, флана-рованных 31 п.н.-повторами, в клетках полоеого пути дрозофилы.

У . 3 S 3

ал i ¡ .i

. fa

si) mit

3 S :

ГМГ ■ . i Ш!

V

: -8 - .?

Тканевая специфичность экспрессии Р-элемента определяется его третьим интрояом / ХаэМ, ее а1.,1986/. Рубин и сотр. (1986) сконструировали плазмиду Р .{57 (д2-3>3 'О делацией этого интрона, которая обеспечивает экспрессию Р-элемента так же в еоматячеокях клетках эмбрионов дрозофилы» ведя к мозаячности »следствия ян-серцяонных мутаций. Предполагается, что делацяя л 2-3 может . • обеспечять Еидонеспецифичегкую экспрессию Р-элемента /Н1о et а1„, 1983/. Эту плазмиду мы вводили ео второй серии микрояиьек-яий в качестве "помощника" совместно' с плаэмадой рС20Ы?^г.

В третьей серяя микроинъекцяй яспользовалаоь "смешанная" пара плаэмид: совместно с р-25.1 вводялась плаэмяда рРтСПМа " 1,5 /Газарян я др.,1987/, несущая для иные концевые повтора (ЬГй) вяруса саркомы Рауса я функционально не связанная о системой Р-элемента.

Таблица 2 показывает, что выход бабочек после введения пары плазмид рв25.1 + рС2СЫЗ?а2, был практически таким яа, как я после введения контрольной комбинации щ25.1 + рРгС 1,5 Шй, а также после инъекция одного растворителя. В то же время в контроле, где грена была подвергнута всем процедурам подготовки кроме собственно микроинъекавя, выход бабочек был втрое выше. Таким образом, смертность с этих опытах в 'значительной степени определялась процедурой микроинъекция. Однако замена плазмяды ря25.1 на плазмиду Р 2-3$ приводят к почтя пая-

ной смертностя оперированных'ембряояов. Этот результат, возмоя-но, является следствием потерн мутакткым Р-алвмантом тканегой в, . вероятно, видовой специфичности. Однако прямых подтверждений. .• .этого -предположения получать не удалось.

Вместе с тем, как видно яа последней колонка Табл. 2, вдк-рояяъецярованная в грену ДНК действительно попадала в ткаяа ва-

Таблица 2

Инъекции Число Кон-иия Выход ли- Выход бэ~ Число

опер. ДНК чинок бочек положит,

яиц (мкг/мл) (шт) (ат) бабочек (шт)

Контроль

без ияъек. 1300 - 450 390 (30%)

Растворитель 900 - 150 НО (12%)

р5Г25.1 Я 1100 150-300 120 98 (10,1) 6

JJ325.I

pPv.01,5 tVK 700 400 95 80 (11%) 8

Р *>» U2-3Vf

и pC20Hf<a . IG00 100 IS 5 (0.5Я 2

РастЕоритель: 10 М VaU

Соотношения вводимых плазмид были:Р г5.">/рС20ЫУч2 - i/ч-; pias.i

pPrOl,¿Igg /1 ;'Р JVpOaOhS, 2 - 1/3.

Pec. 2. Дот-гибридизация препаратов тотальной ДНК из бабочек ¡?0 Г32Р1 мечены геном интерферона—»2 человека.

Котрицательный контроль - ДНК контрольно« бабочки; К+- положительный контроль-фрагмент гена интерферона смзаан с ДНК контрольной бабочки е количества 1/4 и I копии на геном.

9 * V S3

1 8 * 0 О 0

2 2 в 0 0 о

2 з к" к" Kt/4 к t

родыша, так как чужеродные дНК-последовательяостд надежно выявлялись' ара помощи дот-гибридйзавд.й е состсна суммарной ДНК части полученных бабочек.

На рис. 2 показано, что образцы ДНК ряда бабочек, полученных после шкроянъякций пары шгазмид р®25.1 + рСЗСМга2 дзезля сильный сигнал прзлдот-габрлдизацкя с меченым геном интерферона

■-V

челоЕека. Содержание ингерЬероновнх последовательностей в препаратах ДНК из этих бабочек, оцененное путем сравненья с полона- . тельным контролем, составляло I копаю на гаплоидный геном. Исходя из количества ЕЕеденной ДНК (до 0,1 пг), содержания ДНК в ба- . бочке (до 3ü0 мкг) и из найденной копийноста введенных плазмвд в ДНК трансгенных бабочек 20 ( I) ми мояем оценить степень репликации экзогенных последовательностей в ходе развития от ста-

ч 4. "

дай инъекции до стадии Лавочки величиной 10 -10 .Эта оценка, по-видимому, минимальна, т.к. количество ДНК, реально попавшей в эмбрион, определяется неточно.

О судьбе ЕЕедениых ДНК в клетках пологого путл трансгея- . пых бабочек можно судить по данным гябридязаияа ДНК бабочек еле-' дующих поколений.

Как видно из рис. За, всего в бабочках X¡,полученных из трех кладок, зондом рС20ЫУ^г было выявлено 12 сигналов (25% потомства) интенсивностью 0,5-1 копия/геном. Низкий процент появления траясгенных бабочек í-j, по-видимому»: является следствием мозаицизма родителей 2?0, по содержанию экзогенных последовательностей в соматических и половых клетках. Как' видно из pao. 36, лишь у 5 бабочек вз 12 пол опт тельных по зонду рС2СЫ?»2 выявлены лнтерфзроноЕые последовательности. При этом копяйность интерферояовых последовательностей-в препаратах составила 1/41/2 копай на геном, 2-4 раза меньше, чем у родительских пар. Эти результаты указывают на то, что не все половые клетки эмбриона реципиента содержала полный набор последовательностей, введенных в грену в составе рекомбаяантдых плазмид, а также, что разные , клетки полового пути содержали разные сочетания ДНК - последовательностей. Не исключено, однако, что перестройка введенных ДНК могла происходить на пути от?0 к г,е. в, ходе-образования

кт ¡* ^ й к~

9 4 О '<5 ©

и а а <5 0

14 * о О 6

15 о о о О 1С 6 О 9 9 13 р О О о

о о * о

(5 1 1/4 > * О <0

гг г а го а?

20

¡3.5—

4,7. 3.8-

1,6.

л .'в . * О в э !» »

в

Й»

О О

0 о

- О О» )

- в . $ •! О о о & •!

'о «>''

3 4 'V » С* О ,

к" у

иг !Ь 9 в С»

£1 ' 1

«в» с^э..

1/г )

" в

ЙГГ .-■

ад

•И

о

• ">Г -----

Рис. 3. Дот-гибридизация препаратов ДНК из бабочек с:

А - чеченов Елазмядой рС201ИгЦ2} В - меченым геном интерферона; К+-ДНК контрольной бабочки смешана с плазшдой рсгоывчг Е ио_ личестЕе 1/ч, 1/2, I копии на геном.

Рис. 4. Нлот-гибрадизацйя ДНК пары бабочек 15 и йх потомства 19 и 22 с меченым- геном янтерферояа--д2 человека (а); (б) То же, что I при больней загрузке; (е) - Гибридизация с меченой рВВ 322,

-3,0

—2,4

• ^ Щ- '

I '' . У <; -Ц

14 —

!

; о—

1

¿Г &

Я.

1,0—г" 5

К -г-'-

- 12 -

а созревания половых продуктов.

Эти результаты означают, что экзогенные ДНК способны воспроизводиться в ряду клеточных поколений как соматических, так и пологих клеток эмбриона-реципиента и могут передаваться следующему поколении в способном к репликации состоянии.

Обнаружение экзогенных ДНК в бабочках и Э?0 и особенно Г^ достаточно редкое событие (см. табл. 2), Поскольку микроинъек-шш в грену производились на стадии, когда эмбрион представляет собой совокупность ядер, лежащих 2 единой цитоплазме, причем кончик микропипетки вводился в зону ("полярной плазмы"), где шоследствяа обособляются метки полового пути, внедрение плазмид в разные ядра и их перестройки происходили, по-видимому, как редкие, независимые события. Об этом говорят различия в содержании (копийности) экзогенных последовательностей в ДНК бабочек

по сравнению с ( различия в наследовании иятерфероиовых последовательностей между особями внутри кладок различия

в характере перестроек введенных ДНК е. бабочках и что показано блот-гибридизацией ДНК бабочек и ^ с меченым геном интерферона (рис. 4).

Рис. 4 показывает, что нерестрацированная ДНК бабочки У0--поколеяия (дорожка I) содержит интерфероновые последовательности в основном в полосе 8,5' т.п.н., а также во фрагментах большего размера, которые могут быть разделены на две фракции по 12 в 14 т.п.н. (рис. 46). Дискретное распределение гибридазуювдхся полос указывает на их екстрахромосомкое состояние (Оценка размеров молекул ДНК в нерестрицированных образцах минимальны, т.к. вкстрахромосомная ДНК может быть супэрспдральяой). Однако в потомстве от этих бабочек гябридязующихся о интерфароноЕым зондом полосы появились только после'рестрикции ДНК Pвt I, что

может указывать на интеграцию янтерфероноЕЫх последовательностей в хромосомную ДНК. Кроме того, в гицролизате ДНК 2?0, как и г ДНК яе выявлялся гибридазующийся о интерфероновым зондом фрагмент 2,4 т.п.н., который Еыщеатается из инъецированной плазмиды рС2№1Гв12. При этом выявленные антерферояовым зондом некоторое фрагменты (3,5 т.п.н. и 1,6 т.п.н.) также гибридазируются с рВК322. Эти результаты указывают, что внедрение введенных последовательностей в геном шелкопряда не связано со специфической функциональной активностью системы Р-элемента.

Преобладание зкстрахромосомных форм, структурные перестройки, высокий процент смертности в опыте с аутантным Р-эле^ентом, не позволяют считать перспективной векторную систему на основе Р-элемента для переноса генов в геном тутового шелкопряда.

3. Экстрахромосомяая локализация и передача по наследству рекомбинантной плазмиды, в ли ми трансгенного тутового шелкопряда

Пра трансгенозе наиболее распространенным случаем является интеграция экзогенного материала в геном хозяяна /таепАзь, 1983; РаЬв11;ег еи а1.,£986/. В этом случае трансген в клетках реципиента присутствует, как правило, без каких-либо структурных изменений и наследуется по закону Менделя / Оогйоп, 1980/. Известно такяе, что в клетках млекопитающих организмов ДНК, микро-анъецированная в яйцеклетки, монет существовать в экстрахрсмосо-мноЙ форме/МасМаЬог» е* аХ. 1985; 31;1псЬвопЬ в* а1.,1985/. Такие случаи опасанн такяе у млекопитающих /&1ваз11пд вt а1. ¿986/. Мо-ханизш, обеспечивающие автономную репликации не ясны.

Преобладание зкстрахромосомных' форм трансгена р. клетках тутового шелкопряда в опыте, где в грену инъецировали пары реком-банантных плязмид, составляющих векторную систему Р-элемента

дрозофилы, могло быть связано как с особенностями переносимого генетического материала, так и со спецификой объекта.

В следующей серии микроинъекции, для дальнейшего изучения процесса траногенеза у тутового шелкопряда в грену инъецироЕали плызмиду р&С 1»5ЫН. В результате инъекции было получено дев трансгенных линий опытных животных. Содержание трансгена но всех полученных поколениях (?0, Г/), Г2) по данным полуколичественной дот-гибридизации составляла порядка I копии на геном. Однако наследование трансгена при скрещивании опытных бабочек в с контрольными внутри кладок отличались от МанделеЕСКого. Ненормальная сегрегация трансгена позволила высказать предположение о его внехромосомной локализации.

7£дя проверки этого предположения проводили блот-гябридяза-цию нерестрицированных препаратов ДНК, полученных трех поколений бабочек с меченой плазмидой рРхС. -1,5ХТН. Как видно из рис. 5, гомологичные экзогенной ДНК последовательности е препаратах тотальной ДНК обнаруживались в дискретных полосах соответствующих экст^ахромосомным молекулам. Особо на этом рисунке выделяются препараты ДНК особей 12 и 21, 'такой"тип гибридизации внешне напоминая картину интеграции, скорее всего указывает на существование множества р'окомбинангов плазмиды рВС 1г5ьтк, более высокомолекулярных, чем в остальных случаях. Это предположение подтвер- -ждается данными блот-гибридизации ДНК этих препаратов, рестрициро-вапных Ш (не имеет сайтов в исходной плазмиде), с меченой рРгС. .1у5М.Е. Выявленное после гибридизации наличие множества полос трудно объяснимо для случая интеграции и свидетельствует а пользу Еышеупомянутого предположения.

Даяние рис. 5 свидетельствуют о значительном увеличении молекулярной масса экстрахромосомннх форм экзогенной ДНК. Известно,

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13

у л

• г---» ..

«V»

Г;.*

-23,0

-"¡3,0 -9,5

О

•5/)

Рис. 5. Блот-гибридизащш нерестрицироракных препаратов ДНК трансгенных бабочек32pJpB?C 1>5L.TR. Дорожки:

I - К+ рВсС . 1»5ьтн линеаризированная ЗешЯ1; 2 ~г2 166, 3 - 146, 4 14а, 5 -г28а ( Я2 от Я 50); 5 -ЗЦ44; V 20; 8 15. 9 -?150 ( от й 4); 10 -?0 21,

II -г012, 12 -г0 5, 13 -г0 4.

что в некоторых случаях увеличение- молекулярного Беса трансгенов происходят за счет образования топологически замкнутых катеняро-safinux форм, что является предпосылкой эффективной репликации-экстрахромосом / Hariai et ö1.J988/, Увеличение молекуля^ :ого ■ веса такав может быть связано' захьатом клеточной ДНК реципиента / n.asseulaadoßea ot al.,1986/, обеспечивающих репликации.

' Для анализа тонкой структуры трансгена а характеристики участков генома шелкопряда, с которыми, возможно, произошла рекомбинация экзогенных последовательностей, мы предприняли попытку "спасти" трансгенсодеряаше экстрахромосомнне молекулы из транеганкой линии, полученной; от бабочка'основателя.а 4 (рас.5, дорожка 13). '

С этой цельа была проведена трансформация бактериальных клеток Е. coli препаратшм нерестрицированной ДНК из трансгея-

ных бабочек поколений 70 и 3?2.В результате трансформации во всех случаях на 10 клеток Б.coli при добавлении 5 мкг ДНК из трансгенной бабочки получали 10-12 колоний с фенотипом Apr. Таким образом, уровень трансформации равен I06 на I мкг плазмидной ДНК, принимая во внимание, что е гаплоидном геноме бабочки содержатся около I копии шхазшды.

Способность нерестрицированной ДНК трансформировать бактериальные клетки, обеспечивая, их резистентность к. ампицялину, пряьим образом подтверждает наше предположение об экстрахромосомной локализации трансгена и указывает о сохранности части бактериального Еектора (участков ori и Apr) без какик-либо структурных изменений.

Рестрикгнкй анализ полученных из Apr колоний плазмид показал, что они не идентичны. После трансформации препаратом ДНК бабочки Ж0 4 выявлено 4 типа плазмид (рис. 6, дорожки 1,2,3,4) среди которых присутствует, как минорный компонент (ее содержала лишь одна колония из 12 проанализированных) и исходная плаз-мидг рРгС .1,5 LTR (дорожка I). Другой минорный компонент (также одна колония из 12) составляет плазмида, имеющая размер 4,4 т.п.н. (дорожка 3), Остальные 2 типа спасенных плазмид в ДНК бабочки ?04 присутствовали приблизительно в равном соотношении (дорожки 2,4). Все спасенные из препаратов ДНК ЗТ2-поколекЕЯ (препараты 8а,166) плазмиды, как обнаруживалось рестрикцией по ?Et I, имели одинаковую'структуру (дорожки 5 и 6).

Вероятно, в поколении имеет место.стабилизация структура экстрахромссомных молекул, способных автономно реплицироваться в клетках реципиента. Отличительной чертой структуры экстрахромосомного состояния экзогенных ДНК у тутового шелкопряда, является рекомбинация их с большими фрагментами клеточной ДНК.Вы-

2 3

6

явление клеточной ДНК в состава спасенных плазшщ было продемон-

!Рис, 6. Электрофореграмма рестрицированних Ря-Ы спасенных плазмд, полученных из препаратов тотальной 49 ДНК И V

Плазмиди, представленные ■

СЛЭ^, ■ ' ЭД

— Я6

ОЭ ....

'"..'А- •'

на дорожках 2-6 далее обозначаются Рг42, р^з» Р^, рх8а, рг!6б.

' v-:"' ^ -1-8

> ^ ■. • ■ • ' ' *

W* • • •"

12 з 4 5 6;;^-

j-j, c^J_49 Рис. 7. Блот—гибридизация

■ . ^ f , рестряцированных Put I спа-' ' _ , ! сенных плазмад о Е32Р7 меГ "> —§6 чваой клеточной ДНК шелко-

26— п V

о /

■ *J ^ »

¿1 а"

Ч» <

пряда.

Дорожки I - исходная шгаз-млда p?rC , , 2 -

рг43, 3 - рг45, 4 - рг42,-4 - рг8а, 5 - р»16 б.

отрировано с помощью блот-гибряди зацаи рестриктов спасенных плаз-мид о меченой клеточной ДНК шелкопряда. Гибридизация в этом случав Еозмояиа тплько при наличии в спасенных плазмидах каких-либо

повторяющиеся последовательностей геномной ДНК / Shea, Meniabie, 1980/. Как ейдно из рис. 7, все спасенные плазмиды, исключая исходную, содержат последовательности, гомологичные тотальной ДНК. ' При обратной постановке опыта ДНК контрольных бабочек рестрициро-. ванная Pet I, гибридизоЕалась с мечеными плазмидаш (ряс. 8, дорожка 2) и рг8а (рис. 8, дорожка I).

Рис. 8. Блот-гибридизация рест-рицированной rsti геномной ДНК контрольной бабочки с £32PJ меченой плазмидой pr4,j (2) и с ?1 О f^PJ меченой плазмидой рг8а (I),

Приобретение "спасенными" плазмидами последовательностей геномной ДНК шелкопряда, как видно из рис. 6, приводит к перестройкам введенной в грену плаз. мйды. Выявленные в поколении

— 2,5

плазмиды, ПО-ЕИДИМОМУ,' ЯЕЛЯЮТСЯ с. ..'■.' ' переходными формами, которые об-

* ; разуются вследствие сложных не-

„ " ' ■ гомологичных рекомбинационных

fe-

ь Ц ' —10 процессов, индуцируемых процеду-

'» рой шкроивъекадй. Вероятно,при

V- • - .

введении рекомбияаятной плазмиды в клетки реципиента первоначально образуется нестабильный комплекс, который впоследствии за счет разного рода перестроек' стабилизируется. Об этом свидетельствует схожесть ret I-фрагментоЕ плазмид и -поколения. Сходство

структур плазмид двух поколений проявляется и при гибридизации меченых плазмид с рестроцарованной геномной ДНК шелкопряда (рис.8). Эта гибридизация выявляет две сходные системы полос, характерные¿¡в* рассеянных в геноме повторяющихся последовательностей.

Особый интерес представляла структура "спасенной" плазмиды из препаратов ДНК Яу-поколения, где амеет место стабилизация структуры экстрахромосом.

Рестриктная карта "спаоенной" плазмиды рг8а изображена на рис. 10 А. Размер плазмиды составляет 7,6 т.п.я., что на2.7т.п.я. превосходит размер исходной плазмиды рРхС 1»; 5i.tr Такое увеличение молекулярного веса скорее всего произошло из-за вставки клеточной ДНК шелкопряда. Включение ДНК по нашим данным прризопло в области вирусной последовательности рекомбинантной плазмиды рРгО 1у5ьтн. При этом произошла элиминация этих последовательностей. Действительно гибридизация ЕсоМ-ВаяН! фрагментов зирус-ной ДНК рй?С Ма1,5 о рестрицированной р*8а не выявила гомологии с ааа-последовательностями и фрагментом ганабав.ВапЯГ-ЕооШ 3,6 т.п.н. - фрагмент вектора плаэмадн рРгС как выявила гиб-

рздизаЦия рестрицированной ВагаН1-ЕсоН1 ргба о меченой рВР322 г ' спасенной цлазмзде сохраняется бе: каких-либо перестроек. Потеря ааруо-слецафачвсках участков, по-видимому, произошла по участкам ах стыка о фрагментом рШ322. Это следует яз того, что по краям геномной вставка сохраняются сай\л узнавания для ЕсоЕ! и ВавКГ. Блот-габрадаэацая рестриктов плазмиды ргба с меченой клеточной ДНК выявила дна Рв«-ЕооНХ фрагмента (2,1 и 1,5 т.л.н,>, а одая ?0«Х-ЗаяЕХ фрагмент (.1,8 т.п.н.) гомологичные только клеточной ДНК. Эта данные обосновывают приведенную рестряктяуя карту и позволяют разместить яа ней участка клеточной л бактериальной ДНК.

Клеточная ДНК в составе "спасенных" плазмид может быть эле-

pi За

|ECORI

P»ull

Y. ,

Pstl Pstl ■ Y T

Pvull |CBamHI T I t Дим—

Pvull

I T I ii 4 n 5 6

Pstl EcoRI

" pPrG'1t5LTR EcoRI admHI

' fttl |соЯ|

• • Brtl Ni »amHI

Ц1 Ц2 XP T£T

Рис. 10. Рестряктная карта спасенной плазмяды ре 8а (А);

В - рестряктная карта ияъгцрованной плаамиды рй?С 1,5 Lia.

Темный прямоугольник - последовательности р8Я322, светлый пргмоугзльняк - последовательности длинных кондовых повторов ( иа) вируса саркомы Рауса, заштрихованный ' • прямоугольник - фрагмент гена gag тонкая линяя - последовательности геномной ДНК шелкопряда.

- 21 - .

мантом генома или же является частью кольцевых экстрахромосомных ДНК (кэДНК) присутствующих в клетках насекомых /БевгооЪв е.аХ989/ и млекопитающих /Бухманн и др.,1990/. Второе предположение кажется нам более вероятным, поскольку кэДНК заЕвдомо должна содержать последовательности, обеспечивающие автономную репликацию этих молекул и, следовательно, при соединении с экзогенной ДНК о большей долей вероятности передавать ей это свойство. Однако, как было сказано выше, среди "спасенных" плазмид -поколения присутствовала и исходная плазмида, не обладающая геномными последовательностями, но способная к репликации в клетках реципиента. Поскольку она присутствует как минорный компонент и элиминируется .. е следующих поколениях, можно предположить, что эффективная репликация экстрахромосомных трансгенов еозможнй лишь при наличии определенных последовательностей генома реципиента е их составе. Сходные данные были получены и в опытах на мышах /ВааввиХеайаева et а1., 1986/ Я шпорцевой лягушке /ва*апаЪв вt а1., 1984/.

Анализ природы клеточной ДНК в спасенных плазмидах, указывает о наличии в рг8а последовательности (ей), гомологичной (ых) диспергированным повторам, представленным как в ДНК насекомых (шелкопряд, дрозофила), так и млекопитающих (мышь, бык). Известно, что в большинстве случаев повторы.соседствуют и о интегрированными трансгенами /Гагалги1 е* а1., 1989/. Эти факты свидетельствуют о преимущественной рекомб! 1ациа экзогенной ДНК в процессе переноса с повторяющими последовательностями, которые нередко являются консервативными.

Интересным является и тот факт, что при образовании внехро-мосомяой структуры, как на начальных этапах, так я при передаче по наследству происходят делецяя. Эти делеции затрагивают клк область внехромосомной экзогенной ДНК, так я клеточные последова-

телькоств, соседствующие с трансгеном в *0-поколвнии. Такого же рода процессы имеют место в случае интеграции трансгенов с геномом / И11ке в« а1., 1587; ОоуагиМав е* аШ8б/.

Таким образом по ряду параметров можно найти сходство между процессами, происходящими при интеграции экзогенной ДНК о геномом я при формировании стабильной экстрахромосомной структуры, содержащей трансген. *

ВЫВОДЫ

I. Разработаны условия микроинъекций ДНК в грену шелкопряда, обеспечивающие выживаемость 10-155? оперированных эмбрионов.

'¿. Введенная посредством микроинъекций экзогенная ДНК молекулярной гибридизации обнаруживается в тотальных ДНК оперированных эмбрионов и их потомства, что указывает на внедрение экзогенного генетического материала как в ооматические, тек л в половый клетки реципиента. При этом эффективность трансформация составляет 7-1

3. При использования векторной оистемы на основе Р-элемента дрозофилы для переноса генов в геном шелкопряда, функциональная активность Р-эл.емента не.была обнаружена.

4. Инъецированная в ранние эмбрионы плазмидная ДНК в клетках шелкопряда находится в основном в виде высокомолекулярных, экстрахромосомных форм, -споообяых к автономной репликации. В составе экстрахромосомных молекул, содержащих тренсген, обнаружены повторяющиеся, рассеянные по геному шелкопряда последовательности, возможно ответственные за автономную репликацию экстрахромосом.

- 23 -

Список, работ, опубликованных по теме диссертации

1. Николаев А.И.,Чконяя Т.Т., Кафяаня К.А. Введение рекомбянант-ной ДНК, содержащей ген интерферона^? человека в ДНК тутового шелкопряда//Новые направления в биотехнология (Тез. докл.), Пущано, 1987.

2. Николаев А.И.,Чкония Т.Т.,Генинг Л.В.,Кафяаня К.А.,Гааарян К.Г. Введение .рекомбянантных ДНК в ДНК шелкопряда путем микроинъекции в грену/ А Всесоюзный сямпозяум: "Молекулярные механизмы генетяческях процессов" (Тез. докл.), 1987, о. .36.

3. Николаев А.И.,Чконяя Т.Т.»Кафяаня К.А. Введение гетерологяче-скяхДНК'в клеткя полового путя тутового шелкопряда пооредот-вом микрояяъекции//Октогенез, 1989, т.20, с. 364-378.

-4. Николаев А.И. .Чкония Т.Т. Млкроинъекции рекомбянантных плаэ-мяд в грену тутового шелкопряда; генетические эффекты, обнаружение, последовательностей введенной ДНК в сварной ДНК бабо-чек//Онтогенез, 1987,. т. 18, о,- 440.

5. Николаев. А.И.,Чкония Т.Т, ,Гвнянг Л.В. .Гаэаряя К.Г. .Семенова H.A.,Кафяаня К.А. Микроянъекцяя рекомбянантных ДНК в ранние зародытя тутового шелкопряда вовЪух norl L.

' /Аол.бяол., 1989, т.23, C.II77-

II8S.

6. Николаев А.И. .Чкония Т.Т..Кафланя К.А. Экстрахромосомная лока-. лизация я передача по наследству рекомбянантной плазмяды, мик-роинъецированной в грену тутового иелкопряда//Мол.бяол., № 4, 1991 (в печатя).

7. Чкоияя Т.Т..Николаев А.И.,Кафяаня К.А. Рестряктный анализ структура автономно-реплицирующихся молекул, содержащих экзогенную ДНК, в линяя трансгенного тутового шелкопряда//^ол. бяол., 1991 (в печатя).

ftr^"'