Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроинъекции рекомбинантных плазид в ранние зародыши тутового шелкопряда Bomeux Nobi. L.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Микроинъекции рекомбинантных плазид в ранние зародыши тутового шелкопряда Bomeux Nobi. L."

МОСКОВСкиЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА (НОЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имена М.В.ЛОМОНОСОВА

}

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЧКОНШ Тамара ТенгазоЕиа

УДК 577.218

МИКРОИНЪЕКЦИИ РЕКОШЫАНТШХ ПДА 3?ВД В РАННИ2 ЗАРОДЫШИ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА. ВОМОТ К021. Ь.

03.03.03 - молекулярная биология

Автореферат ддссартащш на соаскаиав ученой стелена кандидата биологических наук

'Москва - 1991

Работа выполнена р институте молекулярной бяолокш га. В,А. 3;;г ельгардта АН СССР и на кафедре микробиологии, аз-русологай и молекулярной баодогии Тбилисского государственного университета иы. И.В.Дяавахшавала,

Научные руководители: доктор йиологотеоках наук, профессор К.А.Нафаанп, кандидат биологических наук А.И.Шкодаез

Офияпальнве о а а о н s a ï В! доктор блолсгачсскпя ваук Г.Й.Карьэтоз, доктор Саологдческах наук А.В.Иткео,

Ведущая оргьвазааая - Институт Сяологпн геаа АН CGC? '.

Зацата дасиерташш состоится "Z.I щ ç/cfJ^S- 19Э1 г, s час. ва заседания спеэдалиэировшшого совета &.OS3.QÎ. дра Московском государственном ушзвероатете ' • пз» 13, В, Ломоносова,

С диссертацией могшо ознакомиться в библиотеке Биологического факультета ЩУ, по адресу II8S93, Москва, Sema-cias гора, ЛГУ, Биологический факультет.

Автореферат разослан "/-С" сд-с-ч*¿>vÇaJL 1291 p..

/

,Учевы2 секретарь совета

кандидат биологических наук L.H»KarpeaaiîOB

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансформация новых видов сельскохозяйственных животных является одной из основных проблем трансгенной биотехнологии. За последнео время помямо классических объектов Трансгеноэа - дрозофиллы и мыши, получены трансгеинне свиньи, овцы, кролики / Hemmer et al., 1987/, рыбы /Бенсмов и др.,1909/» В данной работе трансгенная технология применена- к представителю отряда Чешуекрылых - тутовому шелкопряду, ЗотЪух mori, J.. Тутовый шелкопряд является ейжным объектом генетических, биохимических и молекулярно-биологическях исследования /Астауров,1979; Струнников, ISÖ7; Garel, I9ÖI; Ooldanith et al., 1984/. В настоящее йремя рассматривается возможность использования тутового шелкопряда, как продуцента чуждых ему белков.'Показана способность его гусениц накапливать высокий, титр Интер4ерона-j,2 / Maeda et al.J985/ и ин~ терлейкина-3 человека /Mtyajama et al. 1 1987/ при их заражении рекомбинантным вирусом ядерного полиэдроза, несущим соответствующие гены под контролем промотора гена полиэдрина.

Альтернативным путем биотвхяологичоского использования тутового шелкопряда может быть получение транс'генннх ланий путем введения целевых генов р клетки полового пути эмбрионов. В сочетаний с методами индуцированного партено- и андрогенетического развития, разработанными Б.Л.Астауровым и В.А.Струнниковым /Астауроа,Т968, 1979; Струнников,1987/, мэтод переноса генов путем прямого введения ДНК в клетки полового пути может открыть возможность использования тутового шелкопряда для производства белков целевого назначения.

Цель и задачи исследования;

I. Введение экзогенных рекомбянантннх ДНК в соматические а половые клетки тутового шелкопряда методом микроинъекция /Николаев

-г -

А.И..Кафиаяи К.А.,1985/ в раяяие эмбрионы. . .

2. Разработка условий микроинъекция, обеспечивающих приемлемую выживаемость оперированных эмбрионов.

3. Проверка пригодности векторной системы на основе Р-элемен-та ЮговорЬу1а те1ааовав*ег для переноса целевых генов в геном тутового шелкопряда. ' #

4. Анализ судьбы экзогенных ДНК в клетках оперированных эмбрионов и их потомства. *

Научная новизна и практическая ценность работы.В течение ряда лет единственным видом насекомых« доступным для траногенной технологии оставалась ВговорЪу1а пе1ыюб,4в1:»г. В настоящей работе этот подход применен к тутовому шелкопряду, для которого установлена принципиальная возможность введения экзогенного генетического материала в соматические и половые клетки посредством махроинъекции в ранние вародши.

В результате исследований подобраны условия шкровнъекшш, обеспечивающие выживание 10-15$ оперированных эмбрионов. Показано, что введенная в ранние эмбрионы экзогенная ДНК в клетках реципиента находится в основной в виде высокомолекулярных, автономно реплицирующихся молекул. В составе трансгеиоодеряащих экогра-хромосомнюс молекул -обнаружены последовательности геномной ДНК шелкопряда, возможно ответственные за репликацию этих молекул.

Разработка трансгеняой технологии в применении к тутовому шелкопряду открывает широкие перспективы в области биологии развития, генетики, селекции и биотехнологического использования этого хозяйственно важного неведомого.

Апробация работы. Материалы диссертации догладывались на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987), на Всесоюзном совещании "Новые направле-

ния s биотехнологии" (Пушинз,1987), на кафедре микробиология, вирусологии и молекулярной биологии Тбилисского гос. университета, на совместном семинаре группы молекулярных осноз эмбриогенеза я Лаборатории химического и биологаческого анализа биополимеров я клеток института молекулярной биологии АН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем работа. Диссертация'изложена на 11 0 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследования, их обсуждения и выьодов, списка литературы, состоящего из 151 наименования. Материалы диссертация иллюстрирован^! 3 таблицами и 17 рисунками.

' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

В работе в качества реципиентов .использовались грена туто-еого шелкопряда, полученная от скрещиваний ç (+/+, +/+# +А, +/+) X í ( re/re, ch/ch, le/la, p/p) или $ ПК29 х S (*25,4-2Э х АК.66).- '

Микрошгьекции в грену. проводили на стадии синцитиальной бластодермы. Закрепленную яа предметном стекле грену частично дехорионизировали, я в полюс, противоположный мякропЬте, ври помощи макродозатора микрокапалляром с оттянутым, заточеяннм кончиком ввощли около IÛ"6 мя раствора ДНК о концентрацией от 100 до 200 мкг/ше.

Выделена в ДНК из бабочек. Полученных аэ внызцир-аванной грены бабочек скрещивали между собоЯ в поме откладка грен» из них выделяли ДНК.' Для выделения ДНК бабочек раотиралл в жидком азота в фарфоровой ступке, гомогенизировали стеклянным гомогенизатором в растворе: 0,05 HaOt, 0,05 M ЭДТА, 0,05 трис-BCI pH

8,0 при 0- +4°С. К гомогенату добавляли иротеиназу К ( "ЗДдаа") до 50 мкг/мл, додецилсульфат натрия до 1%, Иа01 до I М и инкубировали ночь при 37°С. Лизат депротеинизировали фенолом и хлороформом, ДНК осаждали изопропанолом при комнатной температуре, дважды переосаждали этанолом и растворяли до 1-2 мг/мл в ТЕ (трис-НС1 10 М, рН 8, ЭДТА I мМ).

Искусственное "оживление" грены. Диапаузу снимали, обрабатывая грену соляной кислотой (плотность 1,124 при 15°С) 8 мин при 30° /Беляев,1932/. У грены, предназначенной для микроиньекции, диапаузу снимали 4-5 мин. обработкой соляной кислотой.

Дот-гибридизация. На нитроцеллшозные фильтры ВА-58 (ВсЬХе^ сЪвг & 8сЬив11 ) на точку в одном ряду дозами по I мкл наносили от I до 4 мкг ДНК. После высушивания фильтры помещали на бу-магуЧЬаЪтапа-ЗММ, пропитанную 0,5 М ИаОН и 1,5 М1»а01, затем на 15 мин на фильтр, пропитанный 0,5 М трис-НС1, рН 7,5 и 3 М Ыа01. ДНК иммобилизовали прогревом (70-80°С) 1,5 ч в вакууме; Предгибридизацию проводили в стандартных условиях /Маниатис,1985/ о 25 ыкг/мя Гепароинида С ("Спофа", ЧССР). Гибридизацию вели 16 час при 65°С с мечеными зондами (I млн имп/мин на I мл или около 4 мян имп/мин на 100 си? фильтра). После'отмывки фильтры высушивали. Радиоавтографию проводила на пленке РМ-В 1-3 суток при -70°С.

Блот-гибридизация. Блот-гибридизаци» проводили согласно руководству Маниатиса с соавт. /Маниатис, 1985/ с некоторыми модификациями. '

Зонды для гибридизации метиле с помощью ник-траясляцяи до 3 Ю8 имп/мин на I мкг ДНК, используя набор "АмгаЬаш" а (Ш? отечественного производства (Ташкент).

"Спасение"гшазми д из препаратов ДНК трансгенных бабочек проводили по методу Ханаана с соавт. /НапаЬаа «1., 1980/,

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Влияние уоловай мякрэянъекций яа выживание эмбрионов 'тутоЕого озлкопряда

.В отличив от оболочки яйца (хориона) дрозофиллы, хорион грены тутоЕого шелкопряда представляет собой прочную скорлупу, прокол которой - ЕысокотраЕматичная операция, ведущая в большинстве случаев к гасыхания яйца или нарушениям эмбрионального развития. Сильно влияет на выживаемость эмбрионов доза вводимой ДНК, Диаметр кончика кикропипетки, и само качество процедура мгкроинъек-ций, которое зависит от навыка оператора и в значительной степени состоит в минимизации потерь содержимого яйца при проколе хо-ряона. \

Из табл. I'видно, что выживаемость ойерированной грены была мала при концентрация евэдимой ДНК 300 мкг/мл, посоставляла приемлемую» величину при меньшей концентрации ДНК.

Выживаемость оперированных эмбрионов росла при использовании микрокапялляров о более тонким кончиком (диаметр 20-30 мкм). Дальнейшее уменьшение диаметра кончика не давало выигрыша, т.к. увеличивало Число случаев его закупорки желтком.

• При микрзинъекциях Часто происходит потеря содержимого яйца. По нашему опыту, потеря яйцом более 5-10$ содержимого Еедет к его гибели через несколько часов после операции. Эти потеря могут быть связаны с иепбльзованием микропипеток о недостаточно тонким кончиком, с недостатками аппаратуры а. с гозрастом грены.

Успех микрояяъёкции заметно зависал от возраста яиц-реципиентов. При инъекций в грену возрастом 6 час и менее после откладка чаще наблюдалось существенное вытегаяяе содержимого яйца, чем при инъекциях через 8-9 час после откладки. По-видимому, в свежа-

Таблйца I

Ji ii Число Кон-дия Диаметр Число яиц с Выход личи-

опытов • оперир. введен, кончика утечкой до яок из гре-

яиц (шт) р-ра ДНК пипетки IQ% объема ны (шт) Ы:г/мл) (мкм) (шт)

i 95 • 300 30-40 30-35 5

2 83 300 30-40 25-30 4

3 109 300 20-30 18-20 9

4 90' 300 20-30 20-25 4

5 105 300 30-40 30-40 i

6 80 ' 30ó 20-30 17-22 3

7 . 101 150 30-40 20-24 6

а 71 150 20-30 15-20 15

9 100 150 30-40 15-20 27

ю 100 150 20-30 10-20 30

ii 100 150 10-20 32-35 ii

12 105 150 20-30 26-40 ' 5

Примечание: В сериях микрванъекцйй М II я 12 возраст грены был на 2 часа меньше, чем в остальных сериях.

отложенном яйце существует значительное внутреннее давление, усиливающее утечку через продол. В дальнейшем для микройяъзк--длЯ использовалась грена возрастом 8-10 час и менее после оплодотворения.

В целом, при мвкровнъеюшях комбинации рчг25,Х / р020ЬД«2 были подобраны условия, обеспвчлваюцде выживаемость I0-I5# one-, раронанных эмбрионов. До 80$ вылупившихся на оперированной грены гусениц завили коконы л яэ 20% коконов вылетели фертильные бабочки.

2. Внедрение экзогенной ДНК р. соматически е и . половые клетки инъецированных- эмбрионов

■ В первой серии микроинъекции в полярную плазму греяы ево-дяли nápu рекомбинаят.чых плазмид, составляющие векторную Систему на основе Р-элеманта - транспозирующего элемента - Droaophyla neXanogaeter, которая разработана дм внедрения целевых генов в хслеткя полового лути дрозофилы / НиЫа, 1582/.

Первая пара включала плазмиду рОгОыз^г - дериват известной векторной плазмиды C-arnegie 20, содержащей короткие OI п.н.} обращенные повторы, Фланкирующие гея гову дрозофилы / spíaoiing, 1983/, "справа" от которого был вставлен геномный гея интерферона-и 2 человека под собственным .промоторбм (рис.1).

Рис Л. Схем» конструирования плазмиды рогом** 2.

Темный прямоугольник -бактериальный вектор, светлый прямоугольник - гэн интерферона « 2 человека под собственным промотором (2,4 т.п.я.), заштрихованный прямоугольник -ген тову (7,5 т.п.н.)

jn» тзоо ясо лъ»

Одновременно о рогоьи.* 2 вводи ля плазмиду pîr25.I / Sabia, 1982/, которая несет нормальный Р-эдемент, обеспечивающий транспозазной функцией тр^яозиции последоватапьяостей, флана-рованных 31 п.н.-повторами, в клетках полоеого пути дрозофилы.

У . 3 S 3

ал i ¡ .i

. fa

si) mit

3 S :

ГМГ ■ . i Ш!

V

: -8 - .?

Тканевая специфичность экспрессии Р-элемента определяется его третьим интроном / ХаэМ, ее а1.,1986/. Рубин и сотр. (1986) сконструировали плазмиду Р .{57 (¿2-3)3 'О делацией этого интрона, которая обеспечивает экспрессию Р-элемента так же в соматических клетках эмбрионов дрозофилы» ведя к мозаичнооти вследствии ин~ серционных мутаций. Предполагается, что деления л 2-3 может . • обеспечить Еидонеспецифичегкую экспрессию Р-элемента /Н1о et а1„, 1983/. Эту плазмиду мы вводили ео второй серии микроиньек-ций в качестве "помощника" совместно' с плаэмадой рС20Ы?^г.

В третьей серии микроянъекций использовалаоь "смешанная" пара плаэмид: совместно с р-25.1 вводилась плаэмида рРтСПМа " 1,5 /Газарян и др.,1987/, несущая длинные концевые повторы (ЬГВ) вируса саркомы Рауса и функционально не связанная о системой Р-элемента.

Таблица 2 показывает, что выход бабочек после введения пары плазмид ря25.1 + рС2СЫЗ?а2, был практически таким же, как и после введения контрольной комбинации щ25.1 + рРгС 1,5 ХДН, а также после инъекции одного растворителя. В то же время в контроле, где грена была подвергнута всем процедурам подготовки кроме собственно микроинъекции, выход бабочек был втрое выше. Таким образом, смертность с этих опытах в значительной степени определялась процедурой микроинъекции. Однако замена плазмдды ря25.1 на плазмаду Р 2-3$ приводит к почти пол-

ной смертности оперированных ембрионов. Этот'результат, возмоя-но, является следствием потери мутантным Р-алвмантом тканевой в, . вероятно, видовой специфичности. Однако прямых подтверждений. .• .этого -предположения получить не удалось.

Вместе с тем, как видно яа последней колонки Табл. 2, мак-роияъецированная в грену ДНК .действительно попадала в ткани ва-

Таблица 2

Инъекции Число Кон-иия Выход ли- Выход йа- Число

опер. ДНК чинок бочек положит,

яиц (мкг/мл) (шт) (ат) бабочек (шт)

Контроль

без ияъвк. 1300 - 450 390 (30%)

Растворитель 900 - 150 НО (12%)

PST25.I Я 1100 150-300 120 98 (10,1) 6

JJ325.I

pPv.01,5 tVK 700 400 95 80 (11%) 8 Р *>» U2-3Vf

и pC20Hf<a . IG00 100 IS 5(0,5^) 2 Растворитель: 10 М VaU

Соотношения вводимых плазмид бшш:Р г5.">/рС20ЫУч2 - i/ч-; pias.i

pPrOl,¿Igg /1 ; Р JVpOaOhS, 2 - 1/3.

Pec. 2. Дот-гибридизация препаратов тотальной ДНК из бабочек ¡?0 Г32Р1 мечены геном интер4ерояа—«2 человека.

Котрицательный контроль - ДНК контрольно« бабочки; К+- положительный контроль-фрагмент гена интерферона смзаан с ДНК контрольной бабочки е количестве 1/4 и I кошт на геном.

9 * V S3

1 8 * 0 О 0

2 2 в 0 0 О

2 з к" к" Kt/4 к t

родыша, так как чужеродные ДНК-яоследовательяостд надежно выявлялась1 ара помощи дот-гибрйдйзавд.й е составе суммарной ДНК части полученных бабочек.

На рис. 2 показано, что образцы ДНК ряда бабочек, полученных после шкроанъвкцйй пары шгазмид р®25.1 + рСЗСМга2 давали сильный сигнал прзлдот-габрлдизацкя с меченым геном интерферона

■-V

челоЕека. Содержание интерфе'роновнх последовательностей в препаратах ДНК из этих бабочек, оцененное путем сравненья о полона- . тельным контролем, составляло I копаю на гаплоидный геном. Исходя из количества ЕЕеденной ДНК (до 0,1 пг), содержания ДНК -в ба- . бочке (до 3ü0 мкг) и из найденной копийности введенных плазмид в ДИК трансгенных бабочек 20 ( I) ш можем оценить степень репликации экзогенных последовательностей в ходе развития от ота-

ч 4. "

дии инъекции до стадии Лавочки величиной 10 -10 .Эта оценка, по-видимому, минимальна, т.к. количество ДНК, реально попавшей в эмбрион, определяется неточно.

О судьбе ЕЕедениых ДНК в клетках полового пути трансгея- . них бабочек можно судить по данным гибридизации ДНК бабочек еле-' дующих поколений.

Как видно из рис. За, всего в бабочках X¡,полученных из трех кладок, зондом рС2СЫЖ*2 было выявлено 12 сигналов (25% потомства) интенсивностью 0,5-1 копия/геном. Низкий процент появления траясгенных бабочек í-j, по-видимому»: является следствием мозаицязма родителей 2?0, по содержанию экзогенных последовательностей в соматических и половых клетках. Как' видно из pao. 36, лишь у 5 бабочек из 12 положительных по зонду рС2СЫ?»2 выявлены ингерфароновые последовательности. При этом копяйяоеть интерфероновых последовательностей-в препаратах составила 1/41/2 копий на геном, 2-4 раза меньше, чем у родительских пар. Эта результаты указывают на то, что не все половые клетки эмбриона реципиента содержала полный набор последовательностей, введенных в грену в составе рекомбинантдых плазмид, а также, что разные , клетки полового пути содержали разные сочетания |НК - последовательностей. Не исключено, однако, что перестройка введенных ДНК могла происходить на пути от?0 к т,е. в, ходе-образования

кт ¡* ^ й к~

9 4 О '<5 ©

и а а <5 0

14 * о О 6

15 о о о О 1С 6 О 9 9 13 р О О о

о о * о

(5 1 1/4 > * О <0

гг г а го а?

20

¡3.5—

4,7. 3.8-

1,6.

л .'в . * О в э !» »

в

Й»

О О

0 о

- О О» )

- в . $ •! О о о & •!

'о «>''

3 4 'V » С* О ,

к" у

иг !Ь 9 в С»

£1 ' 1

«в» с^э..

1/г )

" в

ЙГГ .-■

ад

•И

о

• ">Г -----

Рис. 3. Дот-гйСриддзацця препаратов ДНК из бабочек с:

А - меченой мазмядой рС201ИгЦ2} В - меченым геном интерферона; К+-ДНК контрольной бабочки смешана с плазшдой рсгоыячг е количестве 1/ч, 1/2, I копии на геном.

Рис. 4. Нлот-гибридизация ДНК пары бабочек 15 и ях потомства 19 и 22 с меченым- геном йнтерферояа--д2 человека (а); (б) То же, что I при больней загрузке; (е) - Гибридизация с меченой рВВ 322,

-3,0

—2,4

• ^ ;Т-2>

I '' . У <; -Ч

14 —

!

; о—

1

¿Г &

Я.

К -г-'-

- 12 -

а созревания половых продуктов.

Эти результаты означают, что экзогенные ДНК способны воспроизводиться е ряду клеточных поколений как соматических, так и пологих клеток эмбриона-реципиента и могут передаваться следующему поколении в способном к репликации состоянии.

Обнаружение экзогенных ДНК в бабочках и Э?0 и особенно^ достаточно редкое событие (см. табл. 2), Поскольку микроияъек-шш е грену производились на стадии, когда эмбрион представляет собой совокупность ядер, лежащих 2 единой цитоплазме, причем кончик микрошшетки вводился в зону ("полярной плазмы"), где шоследствяа обособляются метки полового пути, внедрение плаз-мад в разные ядра а их перестройки происходили, по-видимому, как редкие, независимые события. Об этом говорят различия в содержании (копийности) экзогенных последовательностей в ДНК бабочек

по сравнению с ( различия в наследовании иятерфероиовых последовательностей между особями внутри кладок различия

в характере перестроек введенных ДНК е. бабочках и что показано блот-гибридизацией ДНК бабочек и ^ с меченым геном интерферона (рис. 4).

Рве. 4 показывает, что яереотрицярованная ДНК бабочки У0--поколеяия (дорожка I) содержит интерфероновые последовательности в основном в полосе 8,5' т.п.н.,-а также во фрагментах большего размера, которые могут быть разделены на две фракции по 12 в 14 т.п.н. (рис. 46). Дискретное распределение гибридазуювдхся полос указывает на их екстрахромосомяое состояние (Оценка размеров молекул ДНК в нерестрицированных образцах минимальны, т.к. вкстрахромосомная ДНК может быть супарсплральяой). Однако в потомстве от этих бабочек гябридязующихся о интерфароноЕым зондом полосы появились только после'рестрикции ДНК Pвt I, что

может указывать на интеграцию интерфероноЕЫх последовательностей в хромосомную ДНК. Кроме того, в гидролизате ДНК 2?0, как и г ДНК яе еыявлялся гибридизующийся о интерфероновым зондом фрагмент 2,4 т.п.н., который выщеатается из инъецированной плазмиды рС2СЬП'с<2. При этом выявленные интерфероновым зондом некоторые фрагменты (3,5 т.п.н. и 1,6 т.п.н.) также гибридизируются с рВК322. Эти результаты указывают, что внедрение введенных последовательностей в геном шелкопряда не связано со специфической функциональной активностью системы Р-элемента.

Преобладание экстрахромосомных форм, структурные перестройки, высокий процент смертности в опыте с аутантным Р-эле^ентом, не позволяют считать перспективной векторную систему на основе Р-элемента для переноса генов в геном тутового шелкопряда.

3. Экстрахромосомяая локализация и передача по наследству рекомбинантной плазмиды, в линии трансгенного тутового шелкопряда

Пра трансгенозе наиболее распространенным случаем является интеграция экзогенного материала в геном хозяина /таепАзь, 1983; РаЬв11;ег еи а1.,£986/. В этом случае трансген в клетках реципиента присутствует, как'правило, без каких-либо структурных изменений и наследуется по закону Менделя / Оогйоп, 1980/. Иэве-стно такяе, что в клетках млекопитающих организмов ДНК, микро-инъецированная в яйцеклетки, может существовать в экстрахрсмосо-мноЙ форме/МасМаЬог» е* аХ. 1985; 31;1псЬвопЬ в* а1.,1585/. Такие случаи описана такяе у млекопитающих /&1ваз11пд вt а1. £986/. Механизмы, обеспечивающие автономную репликацию не ясны.

Преобладание зкстрахромосомных форм трансгена в клетках тутового шелкопряда в опыте, где е грену инъецировали пары реком-бинантных плязмид, составляющих векторную систему Р-элемента

дрозофилы, могло быть связано как с особенностями переносимого генетического материала, так и со спецификой объекта.

В следующей серии микроинъекции, для дальнейшего изучения процесса трансгенеза у тутового шелкопряда в грену инъецирогали шшзмиду рй-С 1»5ЫГй. В результате инъекции было получено дев тр'ансгенных линий опытных животных. Содержание трансгена но всех полученных поколениях Ф0, Я,,, Т2) по данным полуколичестаенной дот-гибридизации составляла порядка I копии на геном. Однако наследование трансгена при скрещивании опытных бабочек в с контрольными внутри кладок отличались от МанделеЕСКого. Ненормальная сегрегация трансгена позволила высказать предположение о его внехромосомной локализации.

7£дя проверки этого предположения проводили блот-гибридиза-цию нерестрицированных препаратов ДНК, полученных трех поколений бабочек с меченой плазмидсй рРхС. -1,5ХТН. Как видно из рис. 5, гомологичные экзогенной ДНК последовательности е препаратах тотальной ДНК обнаруживались в дискретных полосах соответствующих экст^ахромосомным молекулам. Особо на этом рисунке выделяются препараты ДНК особей 12 и 21, 'такой"тип гибридизации внешне напоминая картину интеграции, скорее всего указывает на существование множества р'экомбинангов плазмиды рВС 1г5ьтк, более высокомолекулярных, чем е остальных случаях. Это предположение подтвер- -ждается данными блот-гибридизации ДНК этих препаратов, рестрициро-валн-'х Ш (не имеет сайтов в исходной плазмиде), с меченой рРгС. .1у5М.Е. Выявленное после гибридизации наличие множества полос трудно объяснимо для случая интеграции и свидетельствует а пользу вышеупомянутого предположения.

Данные рис. 5 свидетельствуют о значительном увеличении молекулярной массы экстрахромосомннх форм экзогенной ДНК. Известно,

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13

у л

• г---» ..

«V»

Г;.*

-23,0

-"¡3,0 -9,5

О

•5/)

Рис. 5. Блот-гпбридизащш нерестрицировакных препаратов ДНК трансгенных бабочек32pJpB?C bSLT.H, Дорожки:

I - К+ рВсС . 1»5ьтн линеаризированная ЗешЯ1; 2 ~г2 I6Ö, 3 - 146, 4 -3?2 14а, 5 -г28а ( Я2 от Л 50); 5 -ЗЦ44; 7 -^20; 8 15. 9 -?150 ( от й 4); 10 -?0 21,

II -1012, 12 -2?0 5, 13 -Г0 4.

что в некоторых случаях увеличение- молекулярного Ееса трансгенов происходят за счет образования топологически замкнутых катеняро-safinux форм, что является предпосылкой эффективной репликации-экстрахромосом /Hariai et al. JS88/. Увеличение молекуля^ :ого -веса такав может быть связано' захьатом клеточной ДНК реципиента / riasseulaad-Oßea ot al.,I986/, обеспечивающих репликации.

' Для йяаллза тонкой структуры трансгена а характеристики участков генома шелкопряда, с которыми, возможно, произошла рекомбинация экзогенных последовательностей, мы предприняли попытку "спасти" трансгенсодеряаше экстрахромосомнне молекулы из трансгэнной линии, полученной от бабочка'основателя.а 4 (рас.5, дорожка 13). '

С этой цельа была проведена трансформация бактергальнкх клеток Е. coli препаратшм нерестрицированной ДНК из трансгея-

ных бабочек поколений 70 и 3?2.В результате трансформации во всех случаях на 10 клеток Б.coli при добавлении 5 мкг ДНК из трансгенной бабочки получали 10-12 колоний с фенотипом Apr. Таким образом, уровень трансформации равен I06 на I мкг плазмидной ДНК, принимая во внимание, что е гаплоидном геноме бабочки содержится около I копии плазмиды.

Способность нерестрицированной ДНК трансформировать бактериальные клетки, обеспечивал их резистентность к. ампицялвну, пряьим образом подтверждает наше предположение об экстрахромосомной локализации трансгена и указывает о сохранности части бактериального Еектора (участков ori в Apr) без каких-либо структурных изменений.

Рестрикгнкй анализ полученных из Apr колоний плазмид показал, что они не идентичны. После трансформации препаратом ДНК бабочки Ж0 4 выявлено 4 типа плазмид (рис. 6, дорожки 1,2,3,4) среди которых присутствует, как минорный компонент (ее содержала лишь одна колония из 12 проанализированных) и исходная плаз-мидг рРгС .1,5 LTR (дорожка I). Другой минорный компонент (также одна колония из 12) составляет плазмида, имеющая размер 4,4 т.п.н. (дорожка 3), Остальные 2 типа спасенных плазмид в ДНК бабочки ?04 присутствовали приблизительно в равном соотношении (дорожки 2,4). Все спасенные из препаратов ДНК ЗТ2-поколекия (препараты 8а,166) плазмиды, как обнаруживалось рестрикцией по ?Et I, имели одинаковую'структуру (дорожки 5 и 6).

Вероятно, в поколении имеет место.стабилизация структура экстрахромссомных молекул, способных автономно реплицироваться в клетках реципиента. Отличительной чертой структуры экстрахромосомного состояния экзогенных ДНК у тутового шелкопряда, является рекомбинация их с большими фрагментами клеточной ДНК.Вы-

2 3

6

явление клеточной ДНК в состава спасенных плазшщ было продемон-

!Рис, 6. Электрофореграмма рестрицированних Ря-Ы спасенных плазид, полученных из препаратов тотальной 4д ДНК э0 а V

Пдазмида, представленные ■

слэ^, ■ , ' ад

— яб

ОЭ ....

'"..'А- •'

на дорожках 2-6 далее обозначаются рг42, р^д, рх8а, рг16б.

V;:"'Г--.'.',. ' vi.;"' СЭ •-».»

>^ ■. • ■ •'' *

W* • • •"

12 3 4 5 6;:^-

j-j, c^J_49 Рлс. 7. Блот—гибридизация

■ . ^ f , рестрицированных Put X спа-' ' _ , ! сенных плазмад о Е32Р7 меГ "> —§6 чваой клеточной ДНК шелко-

26— п V

о /

■ *J ^ »

¿1 а"

Ч» <

пряда.

Дорожки I - исходная шгаз-млда p?rC , , 2 -

рг43, 3 - рг45, 4 -4 - рг8а, 5 - р»16 б.

отряровано с помощью блот-гпбрядизацаи рестриктов спасенных плаз-мид о меченой клеточной ДНК шелкопряда. Гибридизация в этом случае Еозмояиа тплько при налачиа в спасенных плаэмидах каких-дабо

повторяющиеся последовательностей геномной ДНК / Shea, Meniabie, 1980/. Как ейдно из рис. 7, все спасенные плазмиды, исключая исходную, содержат последовательности, гомологичные тотальной ДНК. ' При обратной постановке опыта ДНК контрольных бабочек рестрициро-. ванная Pet I, гибридизоЕалась с мечеными плазмвдаш (рис. 8, дорожка 2) и рг8а (рис. 8, дорожка I).

Рис. 8. Блот-гибридизация рест-рицированной rsti геномной ДНК контрольной бабочки с £32PJ меченой плазмидой pr4,j (2) и с ?1 О f^PJ меченой плазмидой рг8а (I),

Приобретение "спасенными" плазмидами последовательностей геномной ДНК шелкопряда, как видно из рис. 6, приводит к перестройкам введенной в грену плаз. мйды. Выявленные в поколении

— 2,5

плазмиды, по-еидимому,' являются с. ..'■.' ' переходными формами, которые об-

* ; разуются вследствие сложных не-

„ " ' ■ гомологичных рекомбинадионных

fe-

ь Ц ' —10 процессов, индуцируемых процеду-

'» рой макроивъекций. Вероятно,при

V- • - .

введении рекомбияаятной плазмиды в клетки реципиента первоначально образуется нестабильный комплекс, который впоследствии за счет разного рода перестроек' стабилизируется. Об этом свидетельствует схожесть ret I-фрагментоЕ плазмид и -поколения. Сходство

структур плазмид двух поколений проявляется и при гибридизации меченых плазмид с рестроцарованной геномной ДНК шелкопряда (рис.8). Эта гибридизация выявляет две сходные системы полос, характерные¿¡в* рассеянных в геноме повторяющихся последовательностей.

Особый интерес представляла структура "спасенной" плазмиды из препаратов ДНК З^-поколения, где имеет место стабилизация структуры экстрахромосом.

Рестриктная карта "спаоенной" плазмиды рг8а изображена на рис. 10 А. Размер плазмиды составляет 7,6 т.п.д., что на2.7т.п.н. превосходит размер исходной плазмиды рРхС Т,; 5i.tr Такое увеличение молекулярного веса скорее всего произошло из-за вставки клеточной ДНК шелкопряда. Включение ДНК по нашим данным произопло в области вирусной последовательности рекомбинантной плазмиды рРгО Т,-5ЬТН. При этом произошла элиминация этих последовательностей. Действительно гибридизация ЕсоМ-ВаяН! фрагментов зируо-ной ДНК рй?С Ма1,5 о рестрицированной р*8а не выявила гомологии с ада-последовательностями и фрагментом ганабав.ВапЯГ-ЕооШ 3,6 т.п.н. - фрагмент вектора плазмиды рРгС как выявила гиб-

рздизаЦия рестрицированной ВагаН1-ЕсоН1 ргба о меченой рВР322 г ' спасенной плазмзде сохраняется бе: каких-либо перестроек. Потеря аяруо-опецифдчвсках участков, по-видимому, произошли по участкам ах отыка о фрагментом рШ322. Это следует из того, что по краям геномной вставки сохраняются сай\л узнавания для ЕсоЕ1 и ВавКГ. Блот-габрадаэация рестриктов плазмиды ргба с меченой клеточной ДНК выявила два Рв«-ЕооНХ фрагмента (2,1 в 1,5 т.л.н,>, а одая ?0«Х-ЗаяЕХ фрагмент (.1,8 т.п.н.) гомологичные только клеточной ДНК. Эта данные обосновывают приведенную рестряктяуя карту и позволяют разместить на ней участки клеточной л бактериальной ДНК.

Клеточная ДНК в составе "спасенных" плазьшд может быть эле-

pi За

|ECORI

P»ull

Y. ,

Pstl Pstl ■ Y T

Pvull |CBamHI T I t Дим—

Pvull

I T I ii 4 n 5 6

Pstl EcoRI

" pPrG'1t5LTR EcoRI admHI

' fttl |соЯ|

• • Brtl Ni »amHI

Ц1 Ц2 XP T£T

Рис. 10. Рестряктная карта спасенной плазмяды ре 8а (А);

В - рестряктная карта ияъгцрованной плаамиды рй?С 1,5 Lia.

Темный прямоугольник - последовательности рВЖ322, светлый прямоугольник - последовател ьности длинных кондовых повторов ( иа) вируса саркомы Рауса, заштрихованный ' • прямоугольник - фрагые.'-т гена gag тонкая линия - последовательности геномной ДНК шелкопряда.

- 21 - .

мантом генома или же является частью кольцевых экстрахромэсомных ДНК (кэДНК) присутствующих в клетках насекомых /БевгооЪв е.аХ989/ и млекопитающих /Бухманн и др.,1990/. Второе предположение кажется нам более вероятным, поскольку кэДНК заЕвдомо должна содержать последовательности, обеспечивающие автономную репликацию этих молекул и, следовательно, при соединении с экзогенной ДНК о большей долей вероятности передавать ей это сеойстео. Однако, как было сказано выше, среди "спасенных'1 плазмид -поколения присутствовала и исходная плазмида, не обладающая геномными последовательностями, но способная к репликации в клетках реципиента. Поскольку она присутствует как минорный компонент и элиминируется .. е следующих поколениях, можно предположить, что эффективная репликация экстрахромосомных трансгенов Еозмокна лишь при наличии определенных последовательностей генома реципиента е их составе. Сходные данные были получены и в опытах на мышах /ВааввиХеайаева et а1., 1986/ И шпорцевой лягушке /ва*апаЪв вt а!., 1984/.

Анализ природы клеточной ДНК в спасенных плазмидах, указывает о наличии в рг8а последовательности (ей), гомологичной (ых) диспергированным повторам, представленным как в ДНК насекомых (шелкопряд, дрозофила), так и млекопитающих (мышь, бык). Известно, что в большинстве случаев повторы.соседствуют и о интегрированными трансгенами /ГагахЛи1 е* а1., 1989/. Эти факты свидетельствуют о преимущественной рекомб! 1ации экзогенной ДНК в процессе переноса с повторяющими последовательностями, которые нередко являются консервативными.

Интересным является и тот факт, что при образовании внехро-мосомяой структуры, как на начальных этапах, так я при передаче по наследству происходят делеция. Эти делении затрагивают клк область внехромосомной экзогенной ДНК, так я клеточные последова-

телькоств, соседствующие с трансгеном в *0-поколении. Такого же рода процессы имеют место в случае интеграции трансгенов с геномом / И11ке в« а1., 1587; ОоуагиМав е* аШ8б/.

Таким образом по ряду параметров можно найти сходство между процессами, происходящими при интеграции экзогенной ДНК о геномом я при формировании стабильной экстрахромосомной структуры, содержащей трансген. *

ВЫВОДЫ

I. Разработаны условия микроинъекций ДНК в грену шелкопряда, обеспечивающие выживаемость 10-155? оперированных эмбрионов.

'¿. Введенная посредством микроннъекций экзогенная ДНК молекулярной гибридизации обнаруживается в тотальных ДНК оперированных эмбрионов и их потомства, что указывав!' на внедрение экзогенного генетического материала как в ооматические, тек и в половые клетки реципиента. При этом эффективность трансформация составляет 7-1

3. При использовании векторной оистемы на основе Р-элемента дрозофилы для переноса генов в геном шелкопряда, функциональная активность Р-эл.емента не.была обнаружена.

4. Инъецированная в ранние эмбрионы плазмидная ДНК в клетках шелкопряда находится в основном в виде высокомолекулярных, экстрахромосомных форм, -споообиых к автономной репликации. В составе экстрахромосомных молекул, содержащих тренсген, обнаружены повторяющиеся, рассеянные по геному шелкопряда последовательности, возможно ответственные за автономную репликацию экстрахромосом.

- 23 -

Список, работ, опубликованных по теме диссертации

1. Николаев А.И.,Чкония Т.Т., Кафиани К.А. Введение рекомбинант-ной ДНК, содержащей ген интерферона^? человека в ДНК тутового шелкопряда//Новые направления в биотехнологии (Тез. докл.), Пущино, 1987.

2. Николаев А.И.,Чкония Т.Т..Генинг Л.В.,Кафиани К.А.,Гааарян К.Г. Введение -рекомбинантных ДНК в ДНК шелкопряда путем микроинъекции в грену/ А Всесоюзный симпозиум: "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Тез. докл.), 1987, о. .36.

3. Николаев А.И. .Чкония Т.Т.»Кафиани К.А. Введение гетерологиче-скихДНК 'в клетки полового пути тутового шелкопряда посредством микровнъекции//Онтогенез, 1989, т.20, с. 364-378.

-4. Николаев А.И. .Чкония Т.Т. Микроинъекции рекомбинантных плаэ-мид в грену тутового шелкопряда; генетические эффекты, обнаружение, последовательностей введенной ДНК в суммарной ДНК бабог (чек//Онтогене8, 1987,. т. 18, о,- 440.

5. Николаев. А.И.,Чкония Т.Т,,Генинг Л.В. .Гаэаряя К.Г. .Семенова H.A.«Кафиани К.А. Микроинъекции рекомбинантных ДНК в ранние зародыши тутового шелкопряда ВовЪух norl L.

' /Аол.биол., 1989, т.23, C.II77-

II8S.

6. Николаев А.И.,Чкония Т.Т..Кафиани К.А. Экстрахромосомная лока-. лизация и передача по наследству рекомбинантной плазмиды, мик-роинъецированной в грену тутового ивлкопряда//Мол.бяол., № 4, 1991 (в печати).

7. Чкония Т.Т..Николаев А.И.,Кафиани К.А. Реотриктный анализ структура автономно-реплицирующихся молекул, содержащих экзогенную ДНК, в линии трансгенного тутового шелкопряда//^ол. биол., 1991 (в печати).

ftr^"'