Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микросателлитные маркеры в изучении наследственных заболеваний в геномной дактилоскопии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Микросателлитные маркеры в изучении наследственных заболеваний в геномной дактилоскопии"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ТУРАКУЛОВ РУСТАМЖОН ИСМАИЛЖОНОВИЧ

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ МАРКЁРЫ В ИЗУЧЕНИИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ

03.00.03 -МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Государственный научный центр "ГосНИИ генетика").

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков

кандидат биологических наук Д.А. Чистяков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Д.В. Залетаев

кандидат биологических наук Н.С. Куприянова

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии РКНТК \13 РФ

\Г < ¡Ц«^

Защита состоится ЖЛим^- 1998 г. в часов на заседании диссертационного совета Д098 12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан"

" 1998

Ученый.секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук В.И. Щербакова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы: Микросателлитные генетические маркеры, благодаря своим уникальным свойствам нашли широкое применение, как в молекулярной биологии и генетике,- так и в ряде прикладных областей. Последовательности ДНК этого типа достаточно плотно и равномерно распределены по всему геному, большинство из них имеет несколько вариаш-ов аллелей, различающихся количеством повторов коровой последовательности, при чем уровень гетерозиготности, как правило превышает 50%. Такие свойства делают их чрезвычайно привлекательными для использования в анализе структуры популяций, геномной дактилоскопии, картировании генома, генетике наследственных заболеваний. Развитие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделало доступным и простым определение генотипов микросателлитных локусов. Именно сочетание ПЦР и микросателлитных маркеров позволило разработать простой и надежный метод определения по микроколичествам биологического мст:риглг то происхождение и индивидуальную принадлежность. Данный подход получил название "геномная дактилоскопия", она широко используется большинством лабораторий судебно-медицинской экспертизы развитых стран, включая и нашу.' Идентификационные панели, включающие несколько высокоинформативных микросателлитных локусов. позволяют провести быструю и надёжную идентификацию личности, используя микроколичества материала содержащего ДНК, даже в случае частичной'деградации ДНК. Для вероятностных оценок при идентификации личности важны данные о частотах встречаемости определенных аллелей использованных локусов. которые рассчитываются на основе генетического анализа конкретных популяций, чему посвящена первая часть настоящей работы.

Другой областью широкого применення полиморфных микросателлитных маркеров, является изучение наследственных заболеваний, и вторая часть данной работы посвящена изучению ассоциации полиморфных генетических маркеров, ,рз<;паггаженных внутри или рядом с генами-качдидатами, с сахарным диабетом и сосудистыми осложнениями -ретинопатией и нефропатией. Кроме того была изучена ассоциация гена ангиотензиногена (AGT) с гипертонической болезнью и кардиопатиями. Все эти заболевания являются многофакторными, то есть для них не установлен единственный конкретный ген отвечающий за их развитие, и наряду с генетическими факторами в этиопатогенез таких заболеваний могут быть вовлечены факторы внешней среды. Исследования по изучению генетического вклада в развитие многофакторных патологий основаны на выборе так называемых "генов-кандидатов", чьи продукты прямо или косвенно вовлечены в развитие заболевания. Для сахарного диабета и его сосудистых осложнений в качестве генов-кандидатов мы рассматривали ген каталазь: (фермента отвечающего зашит}' организма от свободных радикалов), альдозоредуктазы (ключевого фермента ссобитолового пути обмена глюкозы), ангиотензиногена (компонент ренин-ангибтензиновой системы). Эти ферменты потенциально могут участвовать в патогенезе сахарного диабета и сосудистых осложнений.

Цель п залами исследования:

1. Провести на основе метода полимеразной' цепной реакции анализ аллельного полиморфизма тетрануклеотидных микросателлитов HUMF13A01, HUMCD4. SE33 в двух русскоязычных выборках из городов Москвы и Томска. Сравнить частотное распределение

1

аллелей с аналогичными данными по другим популяционным вкборкам. Изучить характер наследования аллелей данных локусов, оценить соответствие частотного распределения генотипов равновесному закону Харди-Вайнберга и определить численные критерии пригодности данной панели полиморфных маркеров для прикладных идентификационных исследований.

1- Провести сравнительный анализ распределения аллелей полиморфных динуклетидных повторов DIJS907 (расположенного рядом с геном каталазы) и ALR2 (внутри гена альдозоредуктазы). в контрольной выборке из московской популяции и в группах больных ИЗСД, НИЗСД, а также в ipynnax больных ИЗСД с сосудистыми осложнениями. Изучить двухаллельный полиморфизм типа Т174М гена ангиотензиногена (AGT) в московской популяции и у больных гипертонической болезнью и кардиопатиями (инфарктом миокарда, кардиомиопатией).

Научная новизна работы: Настоящая работа является частью комплексных исследований полиморфизма ДНК и генотипирования личности, проводимых лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ГНЦ "ГосНИИ генетика". Впервые проведен анализ полиморфизма в русской популяции локусов HUMF13A01, HUMCD-i, SE33. Впервые была исследована ассоциация микросателлита D11S907 с сахарным диабетом. Результаты исследования ассоциации аллельных вариантов генов апьдозоредуктазы и ангиотензиногена с наследственными заболеваниями в российской популяции также являются новыми.

Практическое значение работы: До настоящего времени данные по сравнительно-популяционному анализу частот встречаемости аллелей и информационному содержанию полиморфизма локусов HIIMFI3A01. HUMCD4, SE33 в русскоговорящих популяциях отсутствовали, что затрудняло их использование в исследоьани>.х но насиь.финации личности в России. Полученные результаты позволяют разрешить этот вопрос. Выявление аллельных вариантов генов CAT, ALR2, AGT обуславливающих повышенный генетический риск развития ИЗСД, НИЗСД, сосудистых осложнений ИЗСД, гипертонической болезни и кардпопатий, создало базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения этих заболеваний

Апробация работы: Результаты исследований докладывались на семинаре секции "Молекулярная биология" Ученого Совета ГНЦ "ГосНИИ генетика", на конференции ГНЦ "ГосНИИ генетика" - «ГЕНЕТИКА-97», а также на научных семинарах лаборатории геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики ГНЦ "ГосНИИ генетика".

Публикации: По материалам диссертации опубликовано более 15 работ, включая тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура диссертации: Текст диссертации изложен на 95,. машинописных ..листах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация иллюсгрироваиа 26 таблицами и 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе ис-ользовали реактивы и ферменты.

ДНК-полимер,: Taq получена от НПО "Бноте\" (Москва). Дрожжевая тРНК. ДСН. бромистый этидпп - фирмы "Seria" (Германия) dNtP - производства НПО "Ферментас" (Литва) Протеиназа К, Tpiu сачарозг. агарозз (Tvpe II), БСА, Тритон Х-100*, Твин-20\ минеральное масло. ДТТ. ДМСО. ЭДТЛ акриламид, метилен-бисакрилампд - фирмы "Sigma" (США) TEMED - производства фирмы "Реанал' (Венгрия) Уксусная кислота, азотная кислота, N¿OH, HCl, фенол, хлороформ, этанол - отечественной' производства ("Реахнч") Соли хлорид магния, сульфат аммония - фирмы "Sigma" (США). KCl производства фирмы "Merck" (Германия), NaCI - фирмы "Sena" (Германия), персульфат аммония фирмы "Реанал" (Венгрия), ацетат натрия, натрий бикарбонат - отечественного производства ("Реахим") Буферные растворы

Буфер ТЕ (1ч) — 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА. Буфер ГАЕ (I ч) — 40 мМ Трис-ацетата, 2 мМ ЭДТА.

Буфер TBE (1ч)— 0,089М Трис, 0,89 М борная кислота, 0.002 М EDTA (pH 8.0) Выделение геномной ДНК человека

Выделение ДНК методом фенол/хлороформной экстракции проводили из 300 мкл венозной крови человека, которую смешивали с равным объемом лизируюшего буфера (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 10 шМ ЭДТА. 100 мМ NaCI, ДСН (0.2%), тритон Х-100 (0,1%), 40 мМ ДТТ, протеиназа К (20 мкг/мл)) п инкубировали либо при 37°С в течение ночи, либо 2 ч при 60"С. Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии).

ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0,3 М ацетата натрия и тРНК дро-кжен (10 мкг/мл) с последующей инкубаштей при -7.0°С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сшили на воздухе и растворяли в 30 мкл бидистилллрованной волы. Препараты ДНК чранпли при -70°С

Элгктрофоретическое разделение ДНК ■

Геномтю ДНК разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле Анализ продуктов ГГЦГ'' ript:Lij_. in в ;"»-ныч агарозных гелях. 1 х ТАЕ использовали в качестве электродного буфера В качестве маркерной использовали ДНК плазмиды pUC19, pBR322 расщепленную рестриктазой Mspl. Гели окрашивали бромистым этидием и визуализировали по флюоресценции в УФ. ПЦР амплифицированнып фрагменты ДНК разделяли в 12% акриламидном геле (соотношение акриламид/бисакрнламид - 19/1), к-буфере TBE. с последующей окраской азотнокислым серебром. Амплификаиия ДНК

ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ("Techne", Великобритания) или Polychainfl ("Polygen" Германия) Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в ООО "Синтол" (Москва) И*, последовательности, а также некоторые особенности амплификации полиморфных участкок-исследовнныч генов генов приведены в табл. 1.

Таблица 1. Поаебопателыюстн npaúuepoe » особенности амплификации полиморфных участков генон САГ. Al.lt2, ПК FI3. SE33._

Прайчср Последовательность. 5— >3" MgCl;. mM Отжиг пра-меров."С

CAT DIIS907-I DI IS907-2 GCTTATTGTCCCATACCCAAA AAGCACCTTAATTTCAGGC 1.0 50

ALR2 ARI ARi GAATCTTAACATGCTCTGAACC GCCCAGCCCT-ATACCTAGT 1.5 60

CD-I HUMCD4a H(.!MCD4b TTGGAGTCGCAAGCTGAACTAGCG CCAGGAAGTTGAGGCTGCAGTGAA 1 0 60

F13 F13FOR F13REV GAGGTTGCACTCCAGCCTT ATGCCATGCAGATTAGAAA . 30 60

ы:зз SE33R SE33L AATCTGGGCGACAAGAGTGA ACATCTCCCCTACCGCTATA , ■10 50

AGI AGTI A0T2 GATGCGACAAGGTCCTG CAGGGTGCTGTCCACTGGCTCGC 1.5 60 ■

1

Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,7). 16.6 тМ сульфата аммония. 0.1°о-ным тшж-20. 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК пли 1-2 мю ДНК. полученной фенол-хлороформной экстракцией, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq Концентрации МцСЬ. использованная для амплификации исследуемых генов, приведена в табл 1. Реакционная смесь для амплификации гена AGT дополнительно содержала 10% диметилсульфооксида

На 1-й стадии проводили денатурацию при 94°С в течение 3 мин. Затем проводили 30 циклов трехступенчатой ПЦР. денатурация - 94°С/ 1 мин, отжиг праймеров в течение 1 мин и синтез второй цепи - 72°С/ 1 мин Температура отжига праймеров для каждого амплифицируемого локуса приведена в табл 1 На конечной стадии выдерживали образцы при 72°С в течение 7 мин. Статистическая обработка результатов ,-,

Частоты встречаемости аллелей, и ожидаемые частоты встречаемости генотипов, ожидаемый индекс гетерозиготности и следующие параметры информативности полиморфизма исследованных локусов: вероятность случайного совпадения генотипов двух наугад исследованных неродственных человек (probability оГ random match, рМ), дискриминационный индекс (discrimination index, или power of discrimination. PD), средний риск исключения (mean exclusion chance), информационное содержание полиморфизма (polymorphism information content, PIC), рассчитывались, с помощью компьютерной программы PUPPY, разработанной О.И. Вишничекко (Институт космического приборостроения, Москва) на основе следующих алгоритмов:

_(1-£х,:)п

Н"р п-1

4 рМ = IP,2

PD = 1 -рМ

п п-1 п PIC = l-IxM I2X.V i i j=i+l

w = Ix,;( 1 -X,)2 + £\i( 1 -X)' + £х,х,(х,+х,)( 1 -x,-x,): i i i<j Гле - аллсльные частоты, n - число аллелей. Р,- частоты встречаемости генотипов

Наблюдаемое распределение генотипов проверяли на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга с использованием критериев и G-статистики. Для данной цели использовали программу RxC (Rows х Columns). Эта программа разработана на основе алгоритма Роффа и Бениена, .который позволяет оценить статистическую значимость отклонений от ожидаемого частотного распределения в случае, когда количество наблюдений по значительному числу классов меньше пяти, и применение стандартного критерия x¡ неправомочно. Данную программу также использовали для сравнения распределения аллелей исследуемых генов в разных популяциях.

Попарное сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов у здоровых лиц и. в различных группах больных проводили с помощью точного критерия Фишера. Достоверными считали различия при р < 0.05.

Относительный риск (RR) вычисляли по формуле:

(a+0,5)(d+0,5) RR =-,

(b+0,5)(c+0,5)

Где а - число лиц с наличием и Ь - с отсутствием данного аллеля среди больных, с и (1 число лиц, соответственно, с наличием и отсутствием данного аллеля среди здоровых; параметр 0,5 в этой формуле использовался как поправка на малочисленность выборки. ЙЛ=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; КК>1 как положительную ассоциацию ("фактор предрасположенности"), ЛЯ< 1 - как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием ("фактор устойчивости").

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.1 Изучение полиморфизма локусов Н11МР1ЗА01 и Н11МРС04

Таблица 2.

Частоты встречаемости генотипов яокуса НИМИIЗАОI в городских популяциях Москвы и Томска

Микросателлиты, расположенные в локусах HUMF13A0I и HUMCD4, входят в состав идентификационной панели, разработанной в США. Ген субъединицы А фактора XIII человека (локус HUMFI3AQI) расположен на хромосоме 6р24-р25. Две субъединицы А, объединяясь с двумя субъединицами В, образуют белковый фактор XIII. Этот фактор участвует в последней стадии свертывания крови и выступает в качестве фибринолигазы, образуя межмолекулярные сшивки между аминокислотными остатками лизина и глутаминовой кислоты в соседних молекулах фибрина. При этом каталитическую функцию осуществляет именно субъединица А. В нитроне А гена HUMF13A01 находится полиморфный тандемныи повтор (AAAG)„, начинающийся с 248-го нуклеотида данного гена.

Полиморфизм Локуса HUMF13A01 был изучен на основе двух популяционных выборок, насчитывающих 109 (Москва) и 75 человек (Томск). Обнаружили 9 аллелей размером от 180 до 230 п.н.. Данные аллели классифицировали по числу содержащихся в них тандемных повторов. Аллель длиной 180 п.н. включает 3 повтора AAAG. Этому аллелю присвоили порядковый номер 3, следующему аллелю размером 184 п.н. -номер 4, и так далее. Были также обнаружены аллели размером 226 и 230 п.н., содержащие нецелое число повторов. Эти аллели нумеровали, следуя рекомендациям комиссии по стандартизации номенклатуры микросателлитных локусов. Аллель длиной 226 п.н. получил номер 14.2, поскольку содержал 14 полных повторов и еще 2 дополнительных нуклеотида. Соответственно аллель размером 230 п.н. имел номер 15.2.

В русской популяции наиболее распространенными были аллели 5, 6 и 7 (табл.2). По сравнению с популяционными данными Полимеропулоса и соавт. для европеоидов США, у русских дополнительно присутствовал аллель 11. В то же время в исследованных нами выборках отсутствовал промежуточный аллель 3 2, обнаруженный Хаммондом и соавт. у северо- • американских европеоидов. Из 91 возможного варианта геноти.ю« у москвичей наблюдали 25 (27% от общего числа), а у томичей - 22 (25%) генотипа. Как и следовало ожидать, среди наблюдаемых генотипов в обеих выборках наиболее часто встречались гомо- и гетерозиготные комбинации самых распространенных аллелей 5, 6 и 7 (табл. 2)

Ген поверхностного антигена CD-I находится на хромосоме 12pter-pl2. Белковый продукт данного гена экспонирован на клеточной поверхности Т-хелперов/пндукторов. хотя его мРНК ми,кет 'кспресснроваться в р-клетках, макрофагах и гранулоцитах Этот антиген служит Т-клиточни.м рецептором для узнавания молекул на поверхности специфических клеток-мишеней п также узнается вирусом синдрома иммунодефицита. В гене поверхностного антигена CD-I обнаружен полиморфный микросателлит, состоящий из тандемных повторов (AAAAG),,.

Частота встречаемости

Гено- Наблю Ожид Наблю Ожида

тип даем. аем. даем. ем.

Москва Томск

3-3 0,009 0,001 0 0

3-4 0,009 0,005 0 0,004

3-5 0,018 0,014 0,013 0,010

3-6 0 0,015 0,013 0,012

3-7 0,009 0,015 0,013 0,011

4-4 0,018 0,008 0,027 0,009

4-5 0,046 0,046 0,040 0,049

4-6 0,046 0,051 0,053 0,055

4-7 0,037 0,050 0,040 0,050

4-14.2 0,009 0,005 0 0,004

5-5 0,092 0,064 0,093 0,068

5-6 0,119 0,141 0,133 0,153

5-7 0,101 0,137 0,107 0,139

5-8 0 0,009 0,013 0,014

5-11 0,049 0,038 0.080 0,040

5-14,2 0,018 0,014 0,013 0,010

5-15.2 0,009 0,012 0 0,007

6-6 0,101 0,078 0,107 0,086

6-7 0,138 0,151 0,120 0,156

6-8 0.018 0,010 0.027 0,016

6-14 ; 0.018 0,015 0,013 0,012

6-15.2 0,018 0,013 0,013 0,008

7-7 0,101 0,073 0,107 0,071

7-8 0,018 0,010 0,013 0,014

7-11 0,009 0,005 0 0,004

7-14.2 0,009 0,015 0,013 0,014

7-15,2 0,018 0,012 0,013 0,007

Таблица 3. Частоты встречаемости генотипов локуса НЦМСй-! в городских популяциях Москвы V Томска.

По локусу HUMCD4 типировали ДНК 102 представителей московской популяции и 75 томичей. Среди москвичей выявили 8 аллелей длиной от 115 до 165 п.н , в томской выборке было обнаружено 7 аллелей (отсутствовал аллель размером 115 п.н). Самый короткий аллель размером 125 п.н. содержит 6 пентануклеотидных повторов и, соответственно, получил порядковый номер 6. Аллели 7, 8 и 12 обладали наибольшими частотами встречаемости. В московской выборке мы показали наличие нового аллеля 4 длиной 115 п.н., ранее не обнаруженного ни в одной из исследованных зарубежных популяций. По сравнению с европеоидами США, в русской популяции дополнительно присутствовал аллель длиной 125 п.н., ранее выявленный только у монголоидов США, но отсутствовал аллель 11 Из 91 возможной комбинации аллелей локуса HUMCD4 в московской выборке присутствовало 13, а в томской - на 2 меньше. Наиболее часто в обеих выборках встречались гетерозиготы 7/8 и 7/12 ,i гомозиготы 7/7 (табл. 3).

Было показано, что наблюдаемые распределения частот1встрвчаемостцгенотипсш,исследо-ванных локусов в обеих популяционных выборках подчиняются равновесию Хами - Вайнберга (табл. 4) Таким образом, распределение аллелей в городских выборках носитжесмещенный характер, а сами выборки являются достаточно однородными

Мы сравнили экспериментальные значения частот встречаемости аллелей локуса .'/('MI-II401 в обеих русских выборках, а также с имеющимися данными по зарубежным популяциям (рис. 1). Распределение аллелей в русских выборках носило весьма сходный характер. Также не наблюдалось статистически значимых различий между русскими и обеими популяиионными выборками из североамериканских европеоидов. Общей чертой распределения аллелей в европеоидных популяциях являлось доминирование одних и тех же аллелей (5, 6 и 7) Остальные североамериканские популяции (латиноамериканцы, негры и монголоиды) значимо отличались от русских.

Таблица 4. Значения критериев полиморфизма и тестов £ н G-аштиспшки на равновесие Xapöu - вайнберга оля локусов HUMFI3A01 и Н!IMCD4 в городских популяциях Москвы и Томска

Частота встречаемости

Генотип Наблюда Ожида Наблюд Ожи

ем ем аем даем

Москва Томск

4-7 0,039 0,018 0 0

6-6 0,010 0 0 0

6-7 0 0,009 0,013 0,006

7-7 0,216 0,217 0,227 0,224

7-8 0,255 0,247 0,280 0,259

7-12 0,186 0,183 0,173 0,189

7-13 0 0 0,027 0,025

7-14 0,020 0,014 0 0,006

8-8 0,069 0,070 0,067 0,075

'8-9 ' 0 0,003 0,027 0,025

.8-12 0,098 0,104 0,067 0,109

8-13 0,029 0,013 0,027 0,015

8-14 0,010 0,008- 0,013 0,004

9-13 0,010 0 0 0,001

12-12 0,049 0,038 0,080 0,040

12-13 0,010 0,010 0 0,011

Параметры HUMF13A0I ■ HUMCD-I

Москва Томск Москва . Томск

0,679 0.667 . 0,657 0.627.

Ночр 0,774 0.770 . 0,673 0.660

рМ 0.087 0.094 0,160 0.173

W 1,005 0.974 0,653 0.602

Р1С 0.427 0.391 0.198 0.144

X" 9.6043 4.9957 11.1737 6.5611

Вероятность 1.0000 1.0000 0.9750 0.9650

(±S.E.)" (0) '.») (0.00491 (0.0058)

С-ст;;т»стииа 11.5885 5.7527 14.71ь2 ri. U.i7

Вероятность 1.0(100 1.И000 о swm 0.9650

I.-S Е)* (0) I") (0.0056) (0.0058)

стандартная ошибка

Рис. I. Срасишиельиый анализ частотного распределения ai.ie.tcii локуса НиМ1:13А01 « московской городской папу шции и рж)е других популицшишых выСюрок. ;

Русские , Гироисонды Европеоиды Латиноамериканцы Негры Монголоид

(Москиа) (Томск)

США

Polymeropoulos et al., 1991

США

США

li a m ш о n d е t al., 1994

США

США

0,9705 3,9375 11,2519

(1.0000 ± 0,0000) (0,8?00 ± 0,0099) (0,1660 + 0,0118)

0,9810 4,4202 12,1451

(1,0000 10,0000) (0,8930 ± 0,0098) (0,2260 ± 0,0132)

22,1171.

(0,0120 ± 0,0034) 25,1003

(0,0140 ±0,0037)

26,3328 (0)

30,7621 (0)

67,4256 (0)

80,7446 (0)

Хи-квадрат Вероятность (+/-S.E.) G-ст ¡листика Вероятность (+/-S.E.)

Таблица 5.

попу шции С i

Срааиеиие распределения частот встречаемости ахчелей локуса Ш1МС04 в московской городской

Популяция Русские (Томск) Европеоиды СШЛ Европеоиды США Голландцы Белы ийцы Французы Латиноамериканцы США Монголоиды США Негры США Негры США

Ссылка /■л/и гт{\ е( а/. 1992 //шппнн^ с! а/.. 1994 '¿luuluií et а/., 1994 Hammorid et а!.. 1994 Edwards et al. 1991 Натпюпа е! а/., 1994

Размер выборки, чсломск Массив ЯхС 75 100 191 308 208 100 193 78 140 190

2x11 -■2хИ 2x11 2 х 11 2x11 2x11 2x11 2x11 2х 13 2 х 13

у/ вероятность ±Б Е * 2.2505 0,9640 0,0059 ' 8,6" 71 ' 0,5090 0,01 Лв 9,0678 0.4480 0,0157 10,1055 0,1310 0,0107 1С 5015 0.1110 0.0099 10,419 0,0900 0,0090 12,4150 0,0870 0.0089 34,2260 0 • 0 45,9446 0 0 66,2966 0 0

в-статистика Вероятность хЭ Е.' 3,0682 0,9550 0,0066 10,613 0.5Г50 0,0:57 11,4276 0,4490 . 0,0157 12.4387 0.1220 0,0103 12.4387 0.1060 0 0097 12,6057 0,1120 0,0100 14,4361 0.1110 0.0099 40,4150 0 0 56,6450 0 0 83,7507 0 0

стандартная ошпока

У латиноамериканцев с частотой выше 10% встречались сразу 5 аллелей, из них преобладали аллели 3.2, 6 и 7. Среди негров США было представлено максимальное число аллелей локуса HUMFI3A01, причем наиболее распространенными были аллели 5 и 7. Для североамериканских монголоидов характерным было как наличие аллеля 16, не обнаруженного в других популяциях, так и доминирование аллелей 3.2 и 6. При этом аллель 6 резко преобладал над остальными аллелями (частота встречаемости 0,508).

Сравнительный анализ наблюдаемых распределений частот встречаемости аллелей локуса HUMCD4 среди жителей Москвы и Томска показал их почти полную идентичность (табл. 5). Для данного микросателлита не наблюдалось статистически значимых различий между русскими и рядом европеоидных популяций, а также между русскими и двумя североамериканскими популяциями (европеоиды и латиноамериканцы США). Для этих популяций было характерным преобладание одних и тех же трех аллелей (7,8). У латиноамериканцев дополнительно присутствовал редкий аллель 10, но не было показано наличия аллелей 4 и 6, обнаруженных в русской популяции. При этом североамериканские европеоиды и латиноамериканцы отличались друг от друга в меньшей степени, чем русские и латиноамериканцы. По всей видимости, это свидетельствует об обмене генами между двумя первыми популяциями. Резкие различия по сравнению с московской популяцией наблюдались в распределении аллелей локуса HUMCD4 среди негров и монголоидов США.

Таким образом, сравнительный анализ распределения аллелей двух изученных локусов свидетельствует об однородности характера распределения в популяциях одной расовой принадлежности, тогда как между разными расами наблюдаются значительные различия.

Сравнение параметров информативности локусов HUMCD4 и HUMF13A01 позволяет выделить последний как существенно более информативный (табл. 4). Аллели обоих микросателлитов содержат примерно одинаковое число повторов, однако HUMFI3A0I характеризуется более высоким уровнем полиморфизма (9 аллелей против 7-8 для локуса HUMCD4) и большей гетерозиготностью, что повышает величину PIC данного локуса (табл. 4). Значения параметров информативности этих локусов в московской популяции сопоставимы с аналогичными данными для многих из шести ранее исследованных нами минисателлитов, а именно для гипервариабельных районов генов ретинобластомы и тяжелых цепей иммуноглобулина. Это свидетельствует о несомненной полезности данных микросателлитов для информативного использования в идентификационном анализе.

1.2 Изучение полиморфизма мшросателлита SE33 в локусе АСТВР2

Во 2-ом интроне псевдогена р-актина в локусе АСТВР2, на хромосоме 5qpterX8 расположен микросателлит SE33, содержащий множественные копии тандемного повтора AAAG. Всего известно около 20 псевдогенов b-актина, широко представленных в геноме. В исследованных европеоидных популяциях найдено максимум 26 аллелей данного микросателлита длиной от 222 до 322 п.н. По числу аллелей и информативности этот микросателлит сравним с высокополиморфным минисателлитом MCTI18 (локус DIS80), широко используемом в геномной дактилоскопии, поэтому микросатедпит SE33 достаточно интересен для использования в идентификационном анализе.

Мы провели анализ трех популяционных выборок, размер которых составил 110 (Москва), 53 (Томск) и 86 человек (удэгейцы) Обнаружено 22 аллеля микросателлита SE33 размером от 238 до 322 п.н (табл 6). В обеих городских популяциях найдено 20 аллелей длиной от 246 до 322 п н. У удэгейцев найдены еще два аллеля размером 238 и 242 п.н. (табл. 6).

Таблица 6. Частоты встречаемости аллелей локуса ЯЕЗЗ в русских популяциях Москвы, Томска и у удэгейцев

Аллель Москвичи Томнчн Удэгейцы

Число ДлиЯа, Число Частота Число Частота Число Частота

повторов п.н. наблюдений встречаемости наблюдений встречаемости наблюдений встречаемости

15 238 0 0 0 0 1 0,006 ±0,006

16 242 0 0 0 0 3 0,018 ±0,010

17 246 5 0,023 ±0,010 3 0,028 ±0,016 4 0,027 ±0,015

18 250 6 0,027 ±0,011 7 0,066 ±0,024 3 0,018 ±0,010

19 254 17 0,077 ±0,018 11 0,104 ±0,030 9 0,055 ±0,018

20 258 И 0,050 ±0,015 И 0,104 ±0,030 20 0,122 ±0,026

21 262 7 0,032 ±0,012 8 0,075 ±0,026 14 0,085 ±0,022

22 266 13 0,059 ±0,016 7 0,066 ±0,024 7 0.043±0,016

23 270 11 0,050 ±0.015 И 0,104 ±0,030 14 0.085 ±0,022

24 274 7 0,032 ±0,012 4 0,038 ±0,019 13 0,079 ±0,021

25 278 6 0,027 ±0,011 2 0,019 ±0,013 10 0.061 ±0,019

26 282 10 0.045 ±0,014 2 0,019 ±0,013 6 0,037 ±0,015

27 286 14 0,064 ±0,016 • 2 0,019 ±0,013 6 0,037 ±0,015

28 290 24 0.109 ±0,021 0 0,000 ±0,000 3 0,018 ±0,010

29 294 15 0.068 ±0.017 1 0,009 ±0,009 7 0.061 ±0.019

30 298 7 0.032 ±0,012 3 0,028 ±0,016 10 0.061 ±0,019

31 302 12 0.055 ±0.015 5 0,047 ±0,021 7 0.043 ±0.016

32 306 22 0.100 ±0,020 13 0,123 ±0.032 6 0,037 ±0.015

33 310 19 0.086 ±0,019 9 0,085 ±0,027 11 0.067 ±0.020

34 314 10 0,045 ±0,014 4 0,038 ±0.019 5 0.030 ±0,013

35 318 3 0.014 ±0,008 2 0.019 ±0,013 2 0.012 ±0,009

36 322 1 0,005 ± 0,005 1 0,009 ±0,009 3 0.018 ±0.010

Всего 220 1.000 ± 0,280 106 1,000 ±0,383 164 1.000 ±0.338

Аллели локуса БЕЗЗ нумеровали, исходя из числа содержащихся в них тетрануклеотидных повторов. Так, наименьший по длине аллель размером 238 п.н. включал 15 повторов и получил порядковый номер 15. В московской популяции с-.частотой 0.1 и выше встречались аллели 28 и 32, у томичей наиболее распространенными оказались аллели 19 и 32 (частота встречаемости 11.3%), а среди удегейцев - аллель 20 с частотой встречаемости 0.122.

Из 210 возможных генотипов обнаружены 76 (Москва) и 48 (Томск). У москвичей наибольшей распространенностью обладали гетерозиготы 32/33 и гомозиготы 19/19 (частоты встречаемости 0 055 и 0.036 соответственно). В томской выборке с наибольшей частотой (3.8%) наблюдали пять генотипов. У удэгейцев из 253 возможных генотипов найдено 64, из них наиболее часто встречались (4.9%) гетерозиготы 20/21 и 21/23.

Наблюдаемое распределение частот встречаемости генотипов локуса АСТВР2 во всех попудяционных выборках соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (значения вероятности 0 999 -1.000, табл. 7). Это свидетельствовало об отсутствии внутренней гетерогенности в исследованных популяциях.

Экспериментальное распределение частот встречаемости аллелей микросателлита БЕЗЗ было весьма сходным в обеих городских популяциях, о чем свидетельствовали результаты анализа ЯхС (рис. 2). Подобное сходство между популяциями Москвы и Томска мы наблюдали и для шести других ранее исследованных микросателлитов. Близость характеров распределения аллелей в двух удаленных друг от друга городских популяциях России позволяет уверенно экстраполировать полученные нами данные о частотах встречаемости аллелей на всю русскую популяцию.

Мы также сравнили наши данные по распределению частот встречаемости аллелей локуса SE33 о результатами аналогичных исследований зарубежных популяций. Максимальное число аллелей данного локуса найдено у немецких европеоидов в результате типи-рования выборки из 180 человек. В обеих исследованных нами выборках из городских популяций не обнаружены низкомолекулярные аллели 11-16 длиной от 222 до 242 п.н., присутствовавшие у немцев. У европеоидов США обнаружен 21 аллель с преобладанием аллелей 19 и 28-30, встречавшихся о частотой выше 9%. В сравнении с популяциями Москвы и Томска у американцев европейского происхождения присутствовали аллели 13-16, необнаруженные в первых двух популяциях. В то же время среди североамериканских европеоидов отсутствовали высокомолекулярные

Таблица 7. Значения критериев полиморфизма, тестов £ и С-статистики на равновесие Харди-Вайнберга для локуса ЗЕЗЗ у удэгейцев и в городских популяциях Москвы и Томска

Параметры Москвичи Томичи Удэгейцы

Ноы 0,873 0,830 0,854

Нехр 0,935 0,932 0,937

рМ 0,008 0,009 0,008

PD 0,992 0,991 0,992

W 1,411 1,458 1,447

PIC 0,887 0,874 0,885

х2 90,1410 41,2095 70,1047

Вероятность 0,9990 1,0000 0,9990

(±S.E.)* (0,0010) (0) (0,0010)

G-статистика 120,7776 54,1729 94,2545

Вероятность 0,9990 1,0000 0,9990

(±S.E.)* (0,0010) (0) (0,0010)

•Стандартная ошибка

аллели 34-36, найденные в обе™ городских популяциях и у немцев* RxC анализ не выявил каких-либо значимых различий в частотном распределении аллелей локуса SE33 между популяциями Москвы и Томска и зарубежными европеоидами (рис. 2).

Также присутствуют достоверные различия в распределении аллелей этого локуса между исследованными нами городскими популяциями и удэгейцами, относящимися к монголоидной расе (рис. 2). Отсутствие видимых межрасовых различий в данном случае можно объяснить значительным уровнем ассимиляции удэгейцев русскими и обменом генами между этими популяциями.

Как видно из данных нашего популяционного исследования (табл. 6), для мини-сателлита SE33 характерны высокие уровни аллельного полиморфизма (22 аллеля) и информативности (гетерозиготн'ость 0.830-0.875 для разных исследованных выборок, PIC 0.874-0.887, PD 0.991 -0.992) Большинство аллелей данного микросателлита достаточно широко представлено в исследованных популяциях; нет выраженного преобладания одного-двух аллелей, что характерно для таких мини- и микросателлитных локусов, как DIS80, АРОВ, HUMTH0I, HUMCYAR04 и ряда других. Это придает однородность характеру распределения аллелей локуса SE33 и увеличивает полезность данного локуса при идентификации личности.

Добавление локуса HUMF13A01 к имеющейся панели из четырех микросателлитов (D19S233, HYMCYAR04, D6S366, HUMvWFII) увеличивает ее разрешающую способность в 12 раз, добавление локуса HUMCD4 еще в 6 раз, и наконец, присоединение к панели локуса SE33 уменьшает вероятность случайного совпадения двух генотипов по этим девяти локусам еще в 125 раз. Таким образом, объединенное значение рМ тест-системы возрастает до 6,62х10'9, что гарантирует точную идентификацию личности в популяции размером 162 млн. человек и позволяет провести точную идентификацию личности для всего населения России.

Рис. 2. Сравнительный анализ частотного распределения аллелей SE33 в московской популяции и в других популяционных выборках.

Русские Немцы Европеоиды Удэгейцы

Европеоиды США

Москва Томск

10.0140 14.7138 17.2355 26.7985 X^»"!1"

(0.9630 ± 0,0060) (0.6111) ± 0,0074) (0.5020 ± 0,0084) (0.1600 ± 0.0116) (Вероятности ± S.E.)

10.2415 16.0245 19.1110 29.0721 G-cumciiiKa

(0.9690 ± 0,0055) (0.6350 ± 0.0070) (0.5210 1 0,0079) (0.2010 ± 0.0127) (Вероятность ± S.E.)

1.3 Сравнительный анализ полиморфизма локуса D11S907 в московской популяции и в группах больных ИЗСД и НИЗСД.

В наших исследованиях был использован микросателлитный маркер DIIS907 содержащий множественные копии повтора (СА)„, и локализованный на хромосоме 11р13 вблизи гена, каталазы. Ранее для этого микросателлита проводились исследования полиморфизма этого локуса только на французской популяции они выявили наличие шести аллелей длинной от 163 до 173 п.н. (индекс гетерозиготности 0.72)

Мы провели сравнительный анализ полиморфизма этого маркера на трех группах, состоящих из 105 неродственных здоровых индивидов (популяционный контроль), 110 пациентов с ИЗСД и 115 больных НИЗСД. Характеристики исследованных групп приведены в табл. S.

Таблица. 8. Физические ч клинические характеристики исследованных групп

Параметры Контроль ИЗСД НИЗСД

(п=105) (п=110) (п=115)

Пол (М/Ж) 57/48 46/64 38/77

Средний возраст (лет) 32,8+ 10,5 17,8 + 9,6 59,8 + 7,4

Средний возраст начала диабета (лет) 7,2 ± 3,4 49,2 ± 6,2

Гликированный гемоглобин, НЬА1 (%) 9,8 ± 1,8 6,9 ± 2,3

Инлекс массы тела (кг/м2) 24,5 ± 2,6 39,8 ± 3,8

В выборке из московской популяции было обнаружено шесть аллелей локуса 0//5907 длиной от 163 до 173 п.н. В обеих группах больных СД показали нгыичнч, се,.¡и аллелей данного лок\еа. включая дополнительный аллель размером 161 п н.. не найденный в контрольной выборке. Было обнаружено 18 вариантов генотипов из 21 возможного'(85%). Наблюдаемое распределение генотипов было достаточно близко к ожидаемому, о чем свидетельствовали результаты проверки экспериментальных частот встречаемости генотипов на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга с использованием критериев х" 11 О-стагмстики. Исходя из значения параметров РхС, наблюдаемое распределение генотипов соответствовало закону Харди - Вайнбер! а (х2 = 18.9259, Р = 0.4850 ± 0 0150; О = 21.3380; Р = 0.4850 ± 0.0158) Это указывало на несмещенность и однородность характера исследованной нами популяционной выборки.

Таблица 9. Сравнительный анализ распределении аиелеп локуса D1IS907 в контрольной выборке и среди больных ИЗСД, НИЗСД с помощью критерия Фишера

Длина Частота встречаемости Вероятность (Фишер) RR

плетя Контроль ИЗСД НИЗСД Контроль Контроль ИЗСД - Контроль К "нтроль

III н ) -ИЗСД - НИЗСД НИЗСД - ИЗСД - НИЗСД

161 0 0,054 0,052 0,00029 0,00038 0,б25#6~ '25,0 ' 23,87

163 0,095 0,099 0,172 0,51132 0,01245 0,01586 1,04 1,96

165 0.129 0,203 0,216 0,03298 0,01088 0,41313 1,71 1,85

167 0,281 0,257 0,211 0.32328 0,05558 0,15017 0,89 0,69

169 0.333 0,216 0,134 0,00432 0,00000 0,01389 0,55 0,36

171 0,133 0,108 0,151 0,31660 0,27858 0,11204 0,79 1,15

173 0,029 0,063 0,065 0,05585 0,04668 0,54899 2.19 2,24

У здоровых лиц наибольшими частотами встречаемости (выше 0 2) обладали аллели длиной 167 н 169 п н , тогда как среди больных НИЗСД чаще встречались аллели размером 165 и 167 п н. У пациентов с ИЗСД наиболее распространенными были аллели длиной 165,167 и 169 п н (табл. 9) Значения гетерозиготности и PIC в популяционной выборке составили 0 676 и 0 64S соответственно, свидетельствуя о том. что локус DIIS9II7 в достаточной мере пнформа! квен и может рассматриваться в качестве полезного генетического маркера.

\lu провели сравнительный анализ распределения аллелей данного лок\са в нсс.1«иои.:имыч гр\ппач с использованием крцтерг« Фишера В группе больных СД 1-го типа

наблюдали достоверное повышение частоты встречаемости аллелей длиной 161 (р < 0.0005) и 165 п н (/> < 0.05) на фоне значимого падения доли аллеля размером 169 п.н. (р < 0.005) по сравнению со здоровыми людьми. У пациентов с диабетом другого типа различия . в распределении аллелей по сравнению с контрольной группой были еще более выраженными: существенный характер носили различия во встречаемости пяти аллелей (табл. 9). Наряду с сохранением тех же тенденций в распределении аллелей, которые наблюдались при сравнении контрольной выборки и группы больных ИЗСД, для больных НИЗСД было характерно также достоверное возрастание доли еще двух аллелей (163 и 173 п.н.).

Максимальными значениями ЯЛ при диабете обоих типов характеризовался аллель 161 п н (25.0 для ИЗСД и 23.9 при НИЗСД), не обнаруженный в популяционном контроле. Таким образом, накопление аллеля 161 п.н. в обеих диабетических группах повышало риск развития СД в русской популяции. О предрасполагающей роли аллеля 165 п.н. в случае СД обоих типов свидетельствовало как достоверное увеличение его содержания в группах больных, так и значения НИ (1.71 для ИЗСД и 1.85 для НИЗСД). Для диабета типа 2 популяционным фактором риска мог являться аллель 163 п.н. (ЛЛ=1.96), распространенность которого у пациентов с НИЗСД возрастала почти вдвое по сравнению с контролем.. Высокие,значения ПК (более 2.0) также наблюдались для аллеля 173 п.н.. но этот аллель нельзя считать строгим предрасполагающим фактором из-за относительно невысокой встречаемости. Напротив, доля аллеля размером 169 п.н. у больных СД существенно падала по сравнению со здоровыми лицами, что указывало на защитную роль данного аллеля по отношению к СД в популяции. Это подтверждали и значения ¡Ш (0.55 при ИЗСД и 0.36 при НИЗСД).

Таблица 10. Сравнительный анализ распределения генотипов локуса йП№07 в контрольной иыооркч н среон больных ИЗСД, НИЗСД с помощью критерия Фишера

Генотип Частота встречаемости Вероятность (Фишер)

(П К 1 Контроль ИЗСД НИЗСД Контроль - Контроль - ИЗСД- Контроль Контроль

ИЗСД НИЗСД низсд -ИЗСД - НИЗСД

161/М и 0.009 0 0.51385 1.00000 0.48900 2.86 . о.90

|6|,<1кГ 0 0.018 0.026 .((.26290. 0.14283 0.52088 4.82 л 6.51

161/165 • 0 0 0.017 Г.ооооо4 " ■ 0.27440 и.26004' 0.95 ■ 4.61

161/167 1) 0.036 0.009 0.06790 • 0.52491 0.17128 8.83 2.74

161/169 0 0.027 0.009 0.13391 0 52491 0.29445 6.81 2.74

161/171 о 0.009 0.034 0.51385 0.07403 0.19882 2.86 8.44

161/171 0 0 0.009 1.00000 0.52491 0.51103 0.95 2.74

163/161 0 0.009 0.043 0.51385 0.03821 0.11684 2.86 10.41

1(.-'1&5 0.048 0.045 0.069 0.66028 0.35144 0.31361 0.94 15.75

163/107 0.029 0.045 0.052 0.39190 0.30125 0.53056 1.51 1.72

163/169 0.057 0.054 0.026 0.65396 0.20952 0.22812 0.94 0.47

163/171 0.048 0.018 0.069 0.20047 0.35144 0.05871 (1.42 1.43

163/17.1 0.010 0 0.017 0.48608 0.53748 0.26004 0.31 1.52

■ 165/165 0.038 0.036 0.034 0.66964 0.69292 0.66341 0.94 0.901

165/167 4.095 0.126 0.103 0.30741 0.50969 0.37145 1.35 1.09

165/169 0.010 0.090 0.078 0.00637 0.01416 0.45965 7.21 6.16

165/П1 0.010 0.063 0.069 0.0.1888 0.02530 0.53573 5.0 5.46

165/173 0.019 0.009 0.026 0.47903 0.54701 ■ 0.32764 0.56 1.28

167/16? 0.095 0.081 11.060 0.44894 0.23594 . 0.36294 0.84 0.62

167/169 0.210 0.099 0.052 0.01904 0.00086 0.18127 0.43 0.22

167/171 0.029 0.0(19 0.043 0.29010 11.41722 011684 0.41) 145

167/171 0.010 0.016 0.043 0.2024.1 0.13107 0.52763 2.92 1.4-1

169/109 0.152 0.063 0.043 0.02762 0.00513 0.35405 0.39 (1.27

169/171 0.086 0.027 0.009 0.05529 0.00606 0.29445 0.33 0.13

169/173 0 0.009 0.009 0.51185 0.52491 0.76204 2.88 2.74

171.-Г1 о.о-.х 0.1)18 0.026 0.3156.3 0.44491 (1.52088 0.52 0.7(1

17 1 1 71 0.019 0.054 о.о:» II. 15882 0.54701 (1.22812 1 28

ГУ |"1 О 0.1)119 о 0.51185 1.00000 (1.48900 2.86 .'.91

Наличке достоверных различий в распределении аллелей между контрольной выборкой и больными диабетом свидетельствовало об ассоциации локуса 0115907 раположенного рядом с геномкаталазы и СД обоих типов. Сравнение распределения генотипов локуса £>//5907 среди здоровых людей и больных диабетом 1-го типа показало наличие достоверных различий во встречаемости 4 генотипов: доля гетерозигот 165/169 и 165/171 у больных была существенно повышена, тогда как содержание генотипов 167/169 и 169/169 значительно понижалось (табл. 10). Такой же характер носили различия в распространенности вышеупомянутых комбинаций аллелей и при сравнении контрольной выборки с группой пациентов с диабетом 2-го типа. Кроме того, у последних наблюдались статистически значимые различия в частотах встречаемости генотипов 163/163 (увеличение) и 169/171 (снижение доли по сравнению с контролем). В сравниваемой паре контроль-ИЗСД величины КК > 4.0 были характерны для 5 генотипов, но только частоты встречаемости двух из них (165/169 и 165/171) достоверно отличались в обеих группах. В паре контроль-НИЗСД значениями Ш выше 4.0 обладали 7 генотипов, однако существенные различия во встречаемости были показаны для трех из них, а именно 163/163, 165/169 и 165/171. Таким образом, носительство генотипов 165/169 и 165/171 может являться фактором риска в случае СД обоих типов. Наименьшими значениями ЯК (0.130.27) в случае НИЗСД обладали генотипы 167/169, 169/169 и 169/171, доля которых среди больных диабетом 2-го типа была достоверно понижена по отношению к контрольной группе. Это свидетельствовало о том, что наличие данных аллельных комбинаций могло понижать риск развития диабета.

Таким образом, при сравнении Здоровых лиц н больных СД обнаруживаются различия в распределении частот встречаемости как аллелей, так и генотипов локуса £>//¿907, тесно сцепленного с геном каталазы. Это может свидетельствовать о.тесной ассоциации гена каталазы с развитием диабета в русской популяции. Результаты наших исследований интересны прежде всего тем. что найден новый потенциальный генетический маркер данной патологии н показана его реальная связь с этим заболеванием пока в одной популяции.

Ранее вовлеченность в развитие этого заболевания была строго показана и доказана только для генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) и гена инсулина. Однако в случае ИЗСД эти два локуса обеспечивают около 42% генетического риска данного заболевания. Широкомасштабное генетическое сканирование хромосомной ДНК человека выявило около 20 локусов ассоциированных с развитием ИЗСД. Проведенные нами популяционные исследования показали ассоциацию локуса 0115907, однако данный локус не входит в число ранее выявленных локусов, ассоциированных с данной" патологией.

1.4 Сравнительный анализ распределения генотипов локуса 0113907 в выборке

больных с диабетической ретинопатией и больных СД без ретинопатии

В группу больных ИЗСД с диабетической ретинопатией вошли 27 человек, группу контроля составили 30 больных ИЗСД без каких либо признаков ретинопатии (табл. 13). В исследованных группах было обнаружено семь аллелей локуса 0115907 длиной от 161 до 173 п.н.

Таблица. 11. Физические и клинические характеристики исследованных групп больных ИЗСД с наличием (ДР-) и отсутствием (ДР-) диабетической ретинопатии.

Параметры Контроль ДР- (п=30) ДР+ (п=27)

Пол (М/Ж) 13/17 11/16

Средний возраст (лет) 33,5+ 9,7 41,8 + 10,1

Средний возраст начала диабета (лет) 8,3 ± 2,4 9,2 + 5.4

Гликированный гемоглобин. НЬА1 (%) 9.1 ±2,1 9,5 ±1.6

Индекс массы тела (кг/м") 25.6 х 2,9 23.9 г 2.3

п

Таблица 12. Сравнительный анатз распределения генотипов локуса 0115907 в выборке больных с диабетической ретинопатией и больных СП. без ретинопатии с помощью критерия Фишера

В контрольной группе, как и в сравниваемой группе больных ИЗСД с ДР, наибольшими частотами встречаемости (выше 0.2) обладали аллели длиной 167 и 169 п.н. (табл. 12). Сравнительный анализа распределения аллелей данного локуса в исследованных группах больных, не выявил достоверных различий частот встречаемости аллелей. Наивысшие значения RR обладали аллели 171 (RR=1.52) и 167 п.н. (RR=1.98), содержание которых у больных ретинопатией было значительно повышено. Напротив,, частота аллелей 161 и 173 п.н. в группе ДР+ была существенно снижена, и эти аллели характеризовались наименьшими значениями RR (0.28 и 0.35 соответственно)(табл. 12)

Сравнение частот встречаемости генотипов локуса DI1S907 среди больных ДР+ и ДР- так же не выявило достоверных различий (табл. 12) Максимальными значениями RR при ИЗСД. осложненном ДР, характеризовались генотипы 165/171 п.н. (RR-\980) и 167/171 (RR=3,453). На роль I,самого устойчивого» к развитию ДР может претендовать генотип 105/173 п.н (RR=0.207). Таким образом, отсутствие достоверных различий в распределении как аллелей, так и генотипов свидетельствует о том, что в московской популяции ген С А Т не связан с ДР.

1.5 Сравнительный анализ распределения генотипов локуса 0113907 в выборке больных СД с диабетической нефропатией и без дибетической нефропатии.

Обследовали 16 больных ИЗСД с диабетической нефропатией (группа ДН+); в группу контроля (ДН-) вошел 31 больной ИЗСД с отсутствием нефропатии (табл. 13) В этих группах было обнаружено семь аллелей локуса /9//Л'УМ7 длиной от 161 до 173 п н.(табл 13). В грчппе ДН- наиболее распространенными были аллели 165 и 167 п н.. тогда как у больных ДН" -аллель 169 нн. При сравнении распределений аллелей локуса Р/1.\907 в исследуемых выборках у пациентов с ДН частота аллел» 1СА п н иозрлстала е 3 и что возрастание »"им статистически достоверным (Р=0 02392)

Частота Вероятно RR

встречаемости сть

(П,н,) ДР+ (п-27) ДР- (п=30) (Фишер)

Аллель

161 0,018 0.083 0.12935 0.283

163 0.093 0.100 0,57422 0.932

165 о.ш 0.167 0.28145 0.645

167 0.27g 0.200 0.22515 1.523

169 0.352 0.316 0.72472 1.169

171 0.130 0.067 0.20655 1.982

173 0.018 0.067 (1.21557 0.352

Генотип

161/161 0 0 1 1.109

161/163 0 0 1 1.109

161/165 0 0.033 0.52631 0.358

161/167 0.037 0.067 ' 0.54016 0.645

161/169 0 0.033 . 0.52631 0.358

161/171 0 о.озз 0.52631 0.358

[61/173 (1 0 1 1.109

163/163 0 (1 1 1.109

163/165 0.037 0 0.47368 3.453

163/167 0.037 0.033 0.78009 1.113

163/169 0.074 0.067 (1.73343 1.118

163/171 0.037 0.067 0.J4016 0.645

163/173 (1 О.ОЗЗ 0.52631 (1.358

165/165 0 0.033 (1.52631 0.358

165/167 0 0 1 1.109

165/169 0.111 0.167 0.41519 0.662

165/171 0.074 0 0.21993 5.98(1

165/173 0 0.067 0.27256 0.207

167/167 0.148 0.10(1 0.43928 1.505

167/169 0.П1 0.067 0.44890 1.629

167/171 O.Ü3 7 0 0.43768 3.453

167/173 0.037 О.ОЗЗ 0.78009 1.113

169/169 0.148 0.133 0.70626 1.128

169/171 0.111 0,033 0.08673 2.810

169/173 0 0 1 1.109

171/171 0 0 1 1.109

171/173 0 0 1 1.109

173/173 0 0 1 1.109

Таблица 13. Физические и кчинические характеристики исследованных групп больных ИЗСД с иатчием (ДН+) и отсутствием (ДН-) диабетической нефропатии._

Параметры Контроль ДН- (п=31) ДН+

(п—16)

Пол (М/Ж) 14/17 9/7

Средний вочрасг (лет) 41.2 ±8.6 39,8 ±7,1

Средний воэраст;,дшчала диабета (лет) 9.7 ±3,3 8.8 ± 4,2

Глнкированный гемоглобин, НЬА] (%) 9,5 ± 1,5 9,9 ±2,1

Экскреция белка, мг/сут 40.4 ± 7.6 1389.7 ± 278.1

Аллель длиной 167 п.н., напротив, в 2,4 раза чаще встречался в контрольной группе (Р=0.02495). Частоты остальных аллелей локуса DIIS907 статистически значимых различий в обеих группах по критерию Фишера не обнаружили (табл. 14). Таким образом, аллель 169 п.н. можно считать «предрасполагающим» к развитию ДН (RR=3.514), тогда как аллель длиной 167 п н , обладает защитным действием к данной микроангиопатии (RR=0 336). Частоты встречаемости генотипов с наивысшими значениями факторов риска (169/171 п.н. -RR=IO.Sb2, 163/171 п н. - RR=6.097), тем- не менее не показали статистически значимых различий по критерию Фишера. Генотип, имевший самый низкий показатель относительного риска (RR=0 358), содержал аллели длиной 167 и 169 п н.

Таким образом, обнаружены статистически достоверные различия частот 2-х аллелей локуса DI1S907, что свидетельствует о наличии связи между геном CAT и ДН при ИЗСД и московской популяции. Однако не показано каких-либо различий в распределении генотипов Очевидно расширение объема обследованных выборок позволит провести более точный сравнительный анализ распределения генотипов.

Существование взаимосвязи между CAT и ДН весьма вероятно, поскольку окислительный стресс, возникающий при гнпергликемии, является одной из основных причин возникновения сосудистых осложнении. и поскольку диабетические ангиопатии являются полигенными патологиями, то в этом аспекте, представляет несомненный интерес проведение ассоциативного анализа п для других генов антиоксидантной системы суперокспддпсмутазы, гипо-кс.тшнредуктззы. глутатпонтрансферазы и лр.

Таблица 14. Сравнительный анализ распределения генотипов локуса £>//5907 в выборке больных СД с диабетической нефропатией и без дибетической нефропатии с помощью критерия Фишера.

Частота Вероятно RR

встречаемости сть

(П н.) ДН (н=16) Контроль (п=31) (Фишер)

Аллель

161 0.094 0.032 0.21515 2,871

163 0.125 0.065 0.91419 2.053

165 0.219 0.306 0.25796 0.656

167 0.156 0.371 0.02495 0.336

169 0.281 0.097 0,02392 3.514

171 0.125 0.097 0.78343 1.372

173 0.000 0.032 0.43264 0.372

Генотип

161/161 0 0 1 1.909

161/163 0" 0 1 1.909

161/165 0 0 1 1.909

161/167 0.125 0.0-2 0.261395 3.506

161/169 0.063 0 032 0.88900 1.968

161/171 0 , 0 1 1.909

161/173 0 . 0 1 1.909

163/163 0 0 1 1.909

163/165 0.063 0.065 0.73605 1.142

163/167 0 0.032 0.65958 0.616

163/169 0.125 0.032 0.26.395 3.506

163/171 0.063 0 0.34043 6.097

163/173 0 0 1 1.909

165/165 0.063 0.065 0.73605 1,142

165/167 0.063 0.129 0.43897 0.591

165/169 0.125 0.097 0.79062 1,404

165/171 0.063 0.161 0,32176 0.466

165/173 0 0.032 ' 0.65958 0.616

165/175 0 0 1 1.909

167/167 0.063 0.129 0.43897 0.591

167/169 О 0.065 0.43016 0.3 5S

167/171 0 0.032 0.65958 0.616

167/173 0 0.032 0.65958 0.616

167/175 0 0 I 1.909

169/169 0.063 0.065 0.73605 1.142

169/171 0.125 0 0.11101 10.862

169/173 0 0 1 1.909

169/175 0 0 1 1.90 9

171/171 II II 1 1.909

171/173 II 0 1 1.909

171/173 О II 1 1.909

1.6 Анализ аллельного полиморфизма гена ALR2 в московской популяции

Альдозоредуктаза (КФ 1.1.1.21) относится к "суперсемейству" ферментов с альдо/кето редуктазной активностью, гены которых картированы на разных хромосомах человека. Альдозо редуктаза катализирует реакцию зависимого от НАДФН восстановления гексоз ! соответствующие шестиатомные спирты, превращая D-глюкозу в сорбитол, а галактозу - : галактитол. Экспрессия данного фермента обнаружена во многих органах и тканях. В 5'-конце вой части гена альдозоредуктазы примерно в 2.1 т.п.н. от участка начала репликации бы. локализован динуклеотидный повтор (АС)„, этот повтор был использован в наше! исследовании.

Полиморфизм локуса ALR2 исследовали на основе популяционной выборки размером 11 человек. Обнаружили 7 аллелей длиной от 132 до 144 п.н. Ко и соавт. обозначили аллель разме ром 138 п.н. как "Z". соответственно аллель длиной 134 п.н. был обозначен ими Z-2, а аллел размером 140 п.н. - 2+2, и так далее Мы использовали такую же номенклатуру при нумераци; аллелей локуса ALR2, а именно Z-б, Z-4, Z-2, Z, Z+2, Z+4 и Z+6. Среди наблюдаемых аллелей исследованной выборке наибольшими частотами встречаемости (больше 0,2) обладали 4 аллел» Z-2, Z, Z+2 и Z+4 (табл. 15). Значения Hobs и Р1С составили 0,804 и 0,703 соответственнс Таким образом, данный микросателлит представлял собой высокоинформативный маркер-ДНК.

Исходя из значени параметров R х С, распределены аллелей локуса ALR2 в изученно нами выборке статистическ достоверно отличалось о такового в исследованны зарубежных популяциях (Ta6j 15). Основное отличие заключ, лось в существенно боль высокой частоте встречаемост аллеля Z+4 в нашей выборке п сравнению с зарубежными, в т время как у британцев и китайце Гонконга самым распростране! ным был аллель Z. Кореннь различия между распределение аллелей локуса ALR2 срег исследованных нами здоровь лиц и у китайцев мож!-объяснить принадлежностью эт( популяционных групп к разны расам.

В популяционной BblÔOpi было обнаружено 19 генотипов локуса ALR2 из 28 возможных (68%). Наиоол' распространенными были генотипы Z/Z-2, Z-2/Z+2, Z-2/Z+2 и Z/Z+4 с частотами встречаемое! больше 0.1 (табл. 18). Наблюдаемое распределение частот встречаемости генотипов локуса AU не обнаруживало отклонений от равновесия Харди - Ваинберга (критерий х2=23.1755 (Р=0 58; -0 П156). С-статистика=28.9875 (Р=0.5070 ± 0.0158)

Таблица 15. Сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллелей локуса А1.Я2 у исслеоманиых нами здоровых лиц и в зарубежных попу.шциях

Частота встречаемости Москва Британцы Китайцы

(Гонконг)

.Аллель ¿-6 0,018 0,019 0,007

Аллель Ъ-4 0,080 0,044 0,053

Аллель^-2 0,205 0,221 0,217

Аллель Z 0,201 0,441 0,336

Аллель г+2 0,214 • 0,235 0,243

Аллель г+4 0.246 0,023 0,059

Аллель Z+6 0,036 0,019 0,086

Объем выборки, человек 112 102 76

хг - 30,8116 18,4468

Вероятность - 0 0,0040

(±Б Е.') - (0) (0,0020)

О-статистика - 34,6522 19,4195

Вероятность - 0 0,0050

(зЗ Е.*) - (0) (0,0040)

'Стандартная ошибка

3.7 Анализ полиморфизма динуклеотидного повтора гена А1Я2 у больных ИЗСД с наличием и отсутствием нефропатии.

Полиморфизм гена альдозоредуктазы (А1Н2) изучали в группах больных ИЗСД с наличием (ДН+, п=23) и отсутствием (ДН-, п=39) нефропатии. Характеристика данных групп приведена в таблице 16.

Таблица 16. Общая характеристика обследованных больных ИЗСД с наличием (ДН+) и отсутствием (ДИ-) диабетической нефропатии.__

Показатель ДН+ (п=24) ДН- (п=37)

Пол (МЯК) Средний возраст, лет Длительность ИЗСД лет Уровень НЬА|, % Экскреция белка, мг/суг • 10/14 27.7 ±4,1 11.8 ± 2,2 12,1 ±2,2 1453.6 ±247.8 15/22 38.2 ±9.7 27.3 ±8,0 11.4 ±2.6 36.8 ±7.3

Обнаружили 7 аллелей длиной от 132 до 144 п.н., (табл. 17). У пациентов с ДН наибольшими частотами обладали аллели Z и Z+4 (0.261). Следующими по распространенности были аллели Z+2 (0.196) и Z-2 (0.152) (табл.20). Наблюдаемая гетерозиготность (0 826) незначительно превосходила ожидаемую (0.796). Значение Р1С было равно 0.701. Было обнаружено 13 генотипов (46% от всех возможных вариантов), среди которых генотипы Z-2/Z и Z/Z+4 были наиболее широко представленными (частоты встречаемости 0.130 и 0.174 соответственно). Наблюдаемое распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайн-берга (х:=8.8762, Р=0.9890 ± 0.0033; G-статистпка= 11.6093, Р=0.9850 ± 0.0033).

В группе ДН- наибольшими частотами встречаемости обладали те же четыре аллеля, что и в группе ДН+, но преобладание аллеля Z было более выраженным (33.3%) (таб.18). Гетерозиготность составила 64.1%, что было ниже ожидаемого значения (77.6%). PIC был равен 0.666. Среди 15 обнаруженных генотипов (53% от от общего числа возможных) пять встречались с частотой выше 10%, а наиболее распространенным являлся генотип Z-2/Z (17.9%) Экспериментальное распределение генотипов подчинялось равновесному закону Харди-Вайнберга ("/."'= I1 2758. Р=0 8680 ± 00107; G-CTaT!!CTMKa= 13.7919,

Р=0 8650 г 0 0108)

Табица 17. Сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов гена АЬК2 в группах больных ИЗСД с наличием (ДН+) и отсутствием (ДН-) диабетической нефропатии

Генетиче Частота Вероятность RR

• ский встречаемости

маркер ДН+ (n=23) дн- (n=39) (Фишер)

Аллели

Z-6 0.022 0.013 0.60632 1.70

Z4 0.043 0.026 0.47493 1.72

Z-2 0.152 0.179 0.44859 0.84

Z 0.261 0.333 0.26133 0.72

Z+2 , 0.196 0.167 0.74486 1.23

Z+4 0,261 0.218 0.77898 1.27

Z+« 0.065 0.064 0.66427 1.08

Генотипы

Z-6IZ-6 0 0 1.00000 1.68

Z-6/Z-4 0 0 1.00000 1.68

Z-6/Z-2 0 0 1,00000 1.68

Z-blZ 0 0 1.00000 1.68

Z-6/Z+2 0.043 0.026 0.86621 1.71

Z-6/Z+4 0 0 1.00000 1.68

Z-6/Z+6 0 0 1.00000 1.68

Z-4/Z-4 0 0 i.ooooo 1.68

Z-4/Z-2 0.043 0 0.37097 5.27

Z-4/Z 0.043 0.026 0.86621 1.71

Z-l/Z+2 0 0.026 0.62903 0.55

Z-4/Z+4 0 0 1.00000 1.68

Z-4/Z+6 0 0 1.00000 1.68

Z-VZ-2 0 0.077 0.24164 0.22

Z-VZ 0.130 0.179 0.39568 0.67

Z-2/Z+2 0.087 0.026 0.30772 2.98

Z-2/Z+4 0.043 0 0.37097 5.27

Z-2IZ+6 0 0 1.00000 1.68

Z/Z 0 0.128 0.09898 0.13

Z/Z+2 0.087 0.026 0.30772 2.98

Z/Z+4 0.174 0.103 0.88393 1.82

Z/Z+6 0.087 0.077 0.73864 1.21

Z+2/Z+2 0.043 0.051 0.6922S 1.00

z+2/гы 0.043 0.103 0.38132 О.Я

Z+2/Z+6 0.043 0.02(1 0.8662 1 1.71

Z+4/Z+4 0.130 0.103 0.77626 1.35

Z+4/Z+6 « 0.O26 0.6290 < (1.55

Z-41/Z+6 <1 <1 1 000(1(1 I.6S

Мы провели сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов локуса ALR2 в группах ДН+ и ДН-. У больных ДН наблюдали увеличение частоты встречаемости пяти аллелей, при этом наибольшими значениями RR обладали аллели Z-6 и Z-4 (RR 1.70 и 1.72 соответственно). Доля аллелей Z-2 и Z в группе ДН+ была понижена по сравнению с больными ИЗСД без осложнений (табл. 17). Однако, проверка по Фишеру показала, что все данные различия носили несущественный характер.

Среди генотипов максимальные значення R.R были показаны для гомозигот Z-2/Z+2 н Z/Z+2 (RR 2.98), Z-4/Z-2 и Z-2/Z+4 (RR 5.27), содержание которых было повышено у больных нефропагией. Минимальными значениями относительного риска обладали генотипы Z/Z (0.13), Z-2/Z-2 (0.22), Z+4/Z+6 (0.55) и Z-4/Z+2 (0.55), доля которых в группе ДН+ была снижена. Тем не менее, изменения в частотах встречаемости аллелей не были достоверными. Таким образом, не было показано ассоциации между геном ALR2 и ДН при ИЗСД в московской популяции.

Полученные нами результаты не соответствовали данным популяциониых исследований в Великобритании, показавших четкую связь между геном альдозоредуктазы и предрасположенностью к ДН у британцев, больных ИЗСД. Они наблюдали существенное увеличение частоты встречаемости аллеля Z-2 (0.355) у пациентов с ДН по сравнению с больными ИЗСД с длительностью диабета более 15 лет (0.122). Соответственно у больных ИЗСД значительно чаще встречался аллель Z+2 (0.389) в сравнении с больными нефропатией (0.086). У пациентов с ДН также было обнаружено сильное увеличение доли гомозигот- Z/Z-2 (0.442) и одновременно уменьшение частоты генотипа Z/Z+2 (0.115) по отношению к группе больных ИЗСД без осложнений (0.089 и 0.467 соответственно) Наличие столь выраженных различий в частотном распределении аллелей и генотипов наглядно свидетельствовало о наличии ассоциации локуса ALR2 с ДН среди британцев.

1.8 Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов локуса AI.K2 у больных ИЗСД с наличием и отсутствием диабетической ретинопатии

Полиморфизм гена AI.R2 исследовали в двух группах больных ИЗСД с наличием и отсутствием ретинопатии. В группу "случай" (ДР+) вошел 31 пациент с выраженной ДР. Группу "контроль" составили 38 больных ИЗСД с отсутствием поражения глаз. Характеристика обследованных больных приведена в табл. 18.

Таблица 18. Характеристика групп больных ИЗСД с наличием (ДР<-) и отсутствием (JIP-) ретинопатии.

Характеристика Группа "ДР+" Гр\ппа "ДР-"(п=31)

<п=38)

По.1 (М/Ж) 18/20 20/11

Средний BojpacT больных, лет 27.29 ± 8.42 30.26 ±9,91

Средняя длительность диабета, лет 15.02 ± 7.23 13.96+ 6.44

В группе "ДР-" среди 7 обнаруженных аллелей локуса AI.R2 наибольшей встречаемостью обладал аллель Z+2 (36.8%) (табл. 19) Аллели Z-6, Z-4 и Z-2 встречались с частотой выше 0.1. Наблюдаемая гетерозиготность составила 0.935, что превышало ожидаемое значение (0.SI1). Значение Р1С составило 0.707. Было обнаружено 13 генотипов (46% от общего числа возможных комбинаций аллелей). Среди них наиболее распространенными были три - Z-4/Z+2 (21 1%). Z-2/Z+2 (18.4%) и Z/Z+2 (13.2%). Не было выявлено какого-либо существенного отклонения наблюдаемого распределения генотипов локуса AI.R2 от равновесия Харди-Вайиберга (у} = 13.7315, Р=0.8600 + 0.0110, С!-статнстнка= 17.0094, Р=0.8870 ± 0.0100).

У больных ретинопатией из 6 аллелей (аллель Z-6 не был найден) наивысшая частота встречаемости была показана для аллеля Z (.0.274) (таб.22). Остальные аллели, кроме Z+6. также были достаточно распространенными (частоты встречаемости выше 0.15) Наблюдаемое значение етерозиготности было равно 0.921, что также превышало ожидаемую величину (0.772) ; PIC составил 0.635 Как и в группе "ДР-", у пациентов с ДР обнаружили 13 генотипов, среди которых

ииболь'шими частотами обладали варианты 2-4Г2 (0.211), 2-2/2+2 (0.184) и 2Г2+2 (0.132). кспериментальное распределение генотипов подчинялось равновесному закону Харди-Вайнберга ;х2 = 12 8381, Р=0.9360 + 0.0077; 0-статистика=16,7057, Р=0.9260± 0.0083).

Был проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов гена А1Я2 в ■ -руппах "ДР+" и "ДР-" (табл. 18). У больных ретинопатией по сравнению с контрольной группой

наблюдали значительное увеличение

Таблица 22. Сравнительный анализ распределения частот встречаемости аглелей и генотипов гена А£Я2 в группах больных ИЗСД с наличием (ДР+) и отсутствием (ДР-) диабетической ретинопатии

Генетичес Частота Вероятно RR

кий встречаемости сть

маркер ДР+ (n=31) ДР-(n=38) (Фишер)

Аллели

Z-6 0 0,013 0,55070 0,40

Z-4 0,161 0,158 0,61498 1,03

Z-2 0.177 0.145 0,77547 1,27

Z 0.274 0.197 0,19449 1,52

Z+2 0.161 0.368 0,00535 0,34

Z+4 0.161 0.066 0,06467 ' 2,60

Z+6 0.065 0.053 0,74716 1.23

Генотипы

Z-6/Z-6 0 0 1,00000 1.00

Z-6/Z-4 0 0 1,00000 LOO

z -ыг-г 0 0 1,00000 1,00

Z-6/Z 0 0.026 0.55073 0.39

7--кг 0 0 1.00000 LOO

Z-6/Z -4 0 0 1.00000 LOO

Z-6/Z-6 0 0 1,00000 1,00

Z-4/Z-4 0 0 1,00000 LOO

2-412-1 0 0.026 0.55073 0.39

Z-4/Z 0.161 0.079 0,24623 2.11

Z-4/Z+2 0.129 0.211 0.28717 0.59

Z-4/Z+4 0.032 0 0,44929 .3.79

Z-4/Z-6 0 0 1,00000 LOO

Z-2/Z-2 0 0 1.00000 1,00

Z-2/2 0.194 0.026 0,02837 6.37

Z-2/Z-2 0.065 0.184 0,13318 ' 0.35

Z-2/Z+4 0,065 0.026 0,42305 2.11

Z-2/Z+6 0.032 0.026 0,80179 1.22

Z/Z 0 0 1,00000 1.00

Z/Z+2 0.097 0.132 0.47601 0.75

Z'Z-M 0.065 0.105 0.43915 0.65

. Z/Z+6 0.032 0.026 0.80179 1.22

Z-2/2-2 0 0.079 0.16101 0.16

Z+2/Z-4 0 0 1.00000 LOO

Z+2/Z-6 0.032 0.053 0.5 7696 0.71

Z+4/Zi-4 0.065 0 0.19821 6.53

Z»4/Z-fi 0.032 0 0.44928 3.78

Z+MZ-h 0 0 1.00000 LOO

частоты встречаемости аллелей 2+4 (16.1% против 6 6%, №=2.6) и 2 (27.4% против 19.7%, 1111=1.52), однако данные различия не были достоверными. В то же время в группе "ДР+" была существенно снижена доля аллеля 2+2 (16.1% против 36.8%), и это различие было статистически достоверным (р < 0.01). Результаты сравнительного анализа свидетельствовали о том, что данный аллель являлся своего рода защитным фактором к развитию ДР в московской популяции (№=0.34), тогда как. наблюдаемое накопление аллеля 2 и 2+4 у пациентов с ретинопатией свидетельствовало о том. что эти аллели могли играть роль генетических факторов риска развития ДР, хотя различия во встречаемости двух последних аллелей и не были значимыми.

' При сравнительном анализе распределения генотипов наибольшие значения ЯЯ наблюдали для гетерозигот 2+4/2+6 (3.79), 2-4/2+4 (3.79), 2-1/Ъ (6 37) и гомозигот 1+411+4 (6 53). Генотип 1-211 в группе "ДР+" встречался в 7.5 раз чаше, чем у пациентов с отсутствием ДР (частоты 0.194 и 0 026, соответственно), данное различие было статистически достоверным (р < 0.05) Наименьшими значениями ■ ЯЛ обладали генотипы 2+2/1+2 (0.16), 2-1/2+2 (0.35), 2-4И-2 (0.39),-г-б 11 (0.39), однако различия в частотах встречаемости этих генотипов не были значимыми Полученные нами данные указывали на то, что генотип 2212 мог бы выступать в качестве предрасполагающего фактора ДР.

Достоверные различия в распределении как аллелей (аллель 1+2), так и генотипов (генотип 2-2/2) свидетельствовали об ассоциации, хотя и не столь выраженной, гена АШ2 и ДР при ИЗСД в московской популяции. Однако

этот вывод во многом носит предварительный характер в связи с малочисленностью обследо ванных групп больных. Расширение этих выборок больных позволит уточнить полученные результаты.

Не было показано строгой ассоциации между геном /4Í.R2 и ДР у британцев. У них не было выявлено статистически значимых различий в частотном распределении аллелей между больными ДР и ИЗСД. Сравнительный анализ распределения генотипов выявил лишь существенное уменьшение доли генотипа Z/Z+2 в группе больных ДР (0.128) по отношению к группе больных ИЗСД (0.467). У китайцев Гонконга было обнаружено статистически достоверное увеличение частоты встречаемости лишь аллеля Z-2 в группе больных ДР (0.364) в сравнении с больными НИЗСД (0.045), что тем не менее позволило авторам сделать вывод о наличии связи локуса ALR2 и ДР для пациентов с НИЗСД. В японской популяции наряду с тем, что у больных НИЗСД с ретинопатией аллели Z-2 и Z+8 (последний не был обнаружен в других исследованных популяциях; были связаны с повышенными уровнями альдозоредукгазы, также было показано существеннее увеличение содержания аллеля Z+8 у осложненных пациентов, что указывало на ассоциацию генг ALR2cJ3?.

1.9 Полиморфизм Т174М гена ангиотензиногена и сердечно-сосудистые патологии в московской популяции

Ген ангиотензиногена (AGT) расположен на хромосоме Iq42-q43. Для данного гена описано lí различных полиморфизмов, из них наиболее активно исследованы два, которые расположены вс втором экзоне. Это нуклеотидные замены, в свою очередь, приводящие к заменам треонина н; метионик в 235-м (М235Т) и 174-м (Т174М) положениях аминокислотной последовательности.

Семейный анализ и популяционные исследования показали сцепленность молекулярны) вариантов ангиотензиногена, несущих треонин-235 и метионин-174, с эссенциальной гипертоние! у представителей разных рас. У британских и японских гипертоников обнаружено повышенно* содержание ангиотензиногена в плазме крови. При этом максимальные уровни плазменной ангиотензиногена наблюдались среди гомозигот Thr235/Thr235. По всей видимости, среди дву> полиморфизмов (М235Т и T174N1) гена AGT вариабельность аминокислотного остатка в нменнс 235-м положении вносит основной вклад в связь с уровнем данного белка в крови ввиду боле( частой встречаемости (в 10 раз и более) этой мутации в популяции по сравнению со 174-¡ позицией. Таким образом, накопление генотипа Thr235/Thr235 у гипертоников по сравнению i нормотониками свидетельствует о том, что данный вариант гена AGT является фактором риск: развития гипертонической болезни.

Полиморфизм Т174М (замена треонина на метионин в 174-м положении аминокислотно! последовательности) гена ангиотензиногена изучали в московской популяции и группе больны; гипертонической болезнью. В качестве базисного популяционного контроля использовал! случайную выборку (и = 149) пациентов травматологических отделений Москвы (без сахарноп диабета и других хронических системных заболеваний в анамнезе). Тип "случай-контроль' исследовали, используя эту контрольную выборку для формирования адекватной по полу i возрасту группы сравнения с группой больных гипертонической болезнью (я = 74). В групп' гипертоников вошли пациенты 64-й московской городской больницы (табл. 20) '

В результате амплификации участка гена ангиотензиногена, содержащего полиморфньй участок Т174М, получался фрагмент длиной 303 п.н. Аллель М174 расщеплялся рестриктазой Ncol образуя продукты размером 197 и 106 п.н.; аллель Т174 оставался нерасщепленным. Такш образом, наличие фрагмента длиной 303 п.н. после обработки Ncol соответствовало генотип' Т174Т, двух фрагментов (197 и 106 п.н.) - генотипу М174М и трех фрагментов (106, 197 и 303 п.н. - гетерозиготе Т174М (рис. 3).

В исследованной нами- популяционной выборке обнаружено существенное преобладай!! генотипа ТТ (77.9%), тогда как гомозиготы ММ встречались крайне редко (1.3%) (табл 20) Гетеро зиготность составила 0.208 Наблюдаемое распределение генотипов гена ЛОТ полностью подчиня лось равновесию Харди-Вайнберга (х:=0.0 при А*=1.0, G-статистика = 0.0002 при 1.0000)

2U

1С. 3. Элешрофоретическое разделение в \/-ном агарозпом геле продуктов ацетения рестриктазой Ысо! амтифи-рованиогп фрагмента гена АОТ.

- маркерная ДНК (фрагменты плазмиды .'С19, расщепленной рестриктазой АЛр1);

- 6 - результат типировання ДНК пяти родственных индивидов, выявляющий едующие генотипы: 2 и 3 - ТТ, 4 и 5 - ТМ, -ММ

и аллелей наибольшей частотой обладал аллель Т (88.3%), встречавшийся в 7.54 раза чаще 1я М (табл. 21). Подобный же характер носит распределение аллелей и генотипов гена АСТ в их популяциях европеоидов. Во всяком случае, сравнительный анализ распределения аллелей в овской и двух зарубежных популяциях с использованием программы Л х С не выявил мерных различий (табл. 20). Ля основе исследованной популя- . [ной выборки мы сформировали рольную группу из 39 человек, ватную по полу и возрасту с группой ■ ртонпков (табл. 21). Сравнительный из распределения аллелей в этих пах показал существенное (в 3.13 I увеличение содержания аллеля М у ных гипертонией при одновременном ьшении доли аллеля Т. Эти различия ли достоверный характер (Р < 0 02) .21)

В то время как в контрольной ле отсутствовали гомозиготы ММ, у ртоников их было обнаружено сразу (частота встречаемости 9.4%, Р < I. У больных гипертонической знью доля генотипа ТТ понижалась в раза Последнее различие также было оверным (Р < 0 05) (табл. 21). ^.Е. - стандартная ошибка

• Таким образом, результаты сравни-ного анализа свидетельствуют о связи полиморфизма Т174М с артериальной гипертонией в овской популяции. При этом наличие аллеям М и особенно гомозиготность по нему ивают риск развития заболевания (НЛ 2.41 и 8.78 соответственно). Аллель Т и генотип ТТ, отив, оказывают заинггное действие, о чем свидетельствуют значения ЯЯ (0.42 и 0.28 ветственно). Полученные нами данные о предрасполагающей роли аллеля М и генотипа ММ в чти» гипертонии соответствуют результатам аналогичных исследований зарубежных ляций европеоидов. Кроме того, мы провели сравнительный анализ полиморфизма Т174М ангиотензиногена в московской популяции (и = 149) и двух группах больных: с инфарктом сарда (л = 26) и гипертрофической кардиомиопатией (л=14) (табл. 22, 23). На основе исследо-ой популяционной выборки мы сформировали контрольную группу из 39 человек, адекватную олу и возрасту с группой пациентов, перенесших ИМ (табл. 22). У последних по сравнению с рольной группой наблюдали существенное возрастание (в 2.56'раза) доли аллеля М (23.1% ив-9 0%) при одновременном снижении содержания аллеля Т (76.9% против 91.0%). Данные

Таблица 20. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного участка Т174М гена АйТв трех популт{иях европеоидов.

Показатель Москва Датчане Французы

(л =149) (п =185) (п =156)

Частота встречаемости:

Аллель Т 0,883 0,876 0,862 .

Аллель М 0,117 0,124 * 0,138

Х2 0 0,1768

Р±5.Е.* 1,0 ±0,0 0,8470 ±

0,0114

в-статистика 0 0,1770

Р + БЕ.* 1,0 ±0,0 0,6860 ±

0,0147

Частота встречаемости: ■ •

Генотип ТТ 0,779 0,762 0,750

Генотип ТМ 0,208 .0,227 0,224

Генотип ММ 0,013 0,011 0,026

различия носили достовернып характер (." < 0 025) У перенесших ИМ также обнаружили достоверное уменьшен'.г (в 1.42 раза) доли носителей генотипа ТТ (Р < 0.05) (табл. 22). При этом частота встречаемости других генотипов (ММ и ТМ) у пациентов с ИМ возрастала по сравнению с контрольной группой, но эти различия не были статистически значимыми.

Таким образом, накопление у пациентов с ИМ аллеля M и генотипа ММ гена ЛОТ свидетельствует о том, что эти генетические маркеры являются факторами риска данной п..тологии (RR 2 94 и 4.65 соответственно). Б то же время снижение .содержания аллеля Т и гомозигот ТТ указывает на их предохраняющую роль в отношении ИМ (RR 0 34 и 0.31 соответственно).

Результаты сравнительного анализа свидетельствуют о строгой ассоциации полиморфизма Т174М гена АО 1 с ИМ. При этом в московской популяции защитный эффект аллеля Т и его гомозиготного генотипа выражен сильнее, чем предрасполагающее действие аллеля M и генотипа ММ.

Важно отметить, что для такой полиэтиологической и полигенной патологии как ИМ трудно ожидать сцепленности с полиморфным локусом только одного гена. Это подтверждают • результаты

' взаимодействия между генами РАС, усиливающие риск ИМ. Так, описай синергизм между генотипом 235ТТ гена AGT и генотипом DD гена АСЕ. Подобное взаимодействие показано для генов АСЕ (генотип DD ) и сосудистого рецептора ангиотензина 11 (генотип СС).

У пациентов с кардио-миопатией по сравнению с контрольной группой наблюдали примерно те же изменения в распределении аллелей и генотипов, что и у перенесших ИМ (табл 22). № них лишь снижение встречаемости

Таблица 21. Распределение аллелей (%) и генотнпш, II74M гена ангиотенитогена г контрольных ооноров m щей популяции ну пациентов с гипертонической болезнью.

Показатель Контрольная группа (м"= 39) Гипертоническая болезнь (и = 74) Р RR

Пол (М/Ж) 23/16 44/30 >0,05

Возраст, лет 48.1 î 5.1 51.3 ±6.7 >0,05

{средний ± Б О.*)

Аллель Т 89,7 77,7 0,01761 0,42

Аллель N1 10,3 32.3 0.01761 2,41

Генотип ТТ 82.1 64,9 0,04299 0,28

Генотип ТМ 17.9 25.7 >0,05 1.52

Генотип ММ 0 9.4 0.04660 8.78

*S.D. - статистическое отклонение

Таблица 22. Распределение аллелей (%) и генотипов (%) Т174М гена ангиотензиногена у контрольных доноров общей популяции и у пациентов, перенесших инфаркт миокарда

Показатель Контр, группа (п = 39) Инфаркт миокарда (п = 26) Р RR

Пол (М/Ж) 23/16 21/5 >0,05

Возраст, лет 48,1 ± 49,4 ± 11,3 >0,05

(средний ± О.*) 8,5

Аллель Т 91,0 76,9 0,02497 0,34

Аллель М 9,0 23,1 0,02497 2,94

Генотип ТТ 82,1 57,7 0,03156 0,31

Генотип ТМ 17,9 38,5 >0,05 2,76

Генотип ММ . 0 3,8 >0,05 4,65

*S.D. - статистическое отклонение

Таблица 23. Распределение аллелей (%) и генотипов (% Т174М гена ангиотензиногена у контрольных донора общей популяции и у больных гипертрофическое кардиомиопатией

Показатель <онтрольна> группа (п = 53) Гипертрофическая кар-диомиопатия <п= 14) Р RR

Пол (М/Ж) Возраст, лет (средний ± .Б.*) 30/23 45,1 ±7,8 8/6 45,4 ±11,5 >0,05 >0,05

Аллель Т Аллель М Генотип ТТ Генотип ТМ Генотип ММ 88,7 11,3 79,2 18,9 1,9 78,6 21,4 64,3 28,6 7,1 >0,05 ->0,05 0,0005 >0,05 >0,05 0,46 2,18 0,17 1,96 3,89

*S.D. - статистическое отклонение

отипа ТТ у больных ГКМП было достоверным (Р < 0 001). Это свидетельствует о наличии оциации полиморфного маркера Т174М гена AGT с ГКМП, хотя и не столь выраженной, как i ИМ. При этом аллель M и генотип ММ предрасполагают к развитию данной кардиопатии (RR 3 и 3.89 соответственно), а аллель Т и генотип ТТ, наоборот, проявляют защитное действие (RR 5 и 0.17 соответственно). Как и в случае ИМ, защитный эффект двух последних генетических жеров выражен сильнее, чем предрасполагающее действие аллеля M и гомозигот ММ.

ВЫВОДЫ

Изучено распределение аллелей трех микросателлитных локусов HUMFJ3A0I, HUMCD4, SE33 в московской и томской популяциях. Определены параметры информативности, :видетельствуюшие о несомненой пригодности этих локусов для идентификационного анализа. Добавление локусов HUMF13A01, HUMCD4, SE33 к имеющейся панели из четырех микро-:ателлитов увеличивает её разрешающую способность в 9000 раз, и доводит общее значение рМ ■ест-системы до 6,62x10"9, что гарантирует точную идентификацию личности в популяции >азмером 162 млн. человек, и позволяет провести точную идентификацию личности для всего иселения России

1зучено распределение аллелей динуклеотидного микросателлита в локусе DI1S907, >асположенного рядом с геном каталазы. Показана тесная ассоциация данного полиморфного юкуса с СД обоих типов, которая более ярко выражена при диабете 2-го типа (НИЗСД). Таким гаразом. найден новый потенциальный генетический маркер сахарного диабета.

)бнаружена ассоциация между полиморфизмом локуса D11S907 с диабетической нефропатией ipn диабете 1-го типа (ИЗСД) в московской популяции. Для выборки из больных ИЗСД с шабетической ретинопатией показано отсутствие достоверных различий в распределении как ллелей, так и генотипов по сравнению с контрольной группой больных, что свидетельствует о ом, что в московской популяции локус D11S907 расположенный внутри гена САТ не связан с 1Р.

1зучено распределение аллелей динуклеотидного повтора гена альдозоредуктазы в московской опуляшш. Не найдено ассоциации этого полиморфного маркера с диабетической нефропатией, огда как в случае ретинопатии подобная связь установлена.

[зучено распределение аллелей полиморфизма типа Т174М (замена треонина на метионин в 74-м положении аминокислотной последовательности) гена, ангиотеизиногена (AGÏ) в юсковской популяции. Обнаружена ассоциация гена ангиотеизиногена с гипертонической олезнью и кардиопатиями (инфарктом миокарда, гипертрофической кардиомиопатией).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АПФ (АСЕ) - ангиотензин-превращающий фермент; ДН - диабетическая нефропатия; ДР -¡етическая ретинопатия; СД - сахарный диабет; ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет; !СД - неинсулинзависимый сахарный диабет; ИР - инсулинорезистентность ИМ - инфаркт карда; ПДРФ - полиморфизм по длине рестрикационных фрагментов; ПЦР, PCR -1меразная цепная реакция (polymerase chain reaction); РАС - ренин-ангиотензиновая система, - polymorphism information content (информационное содержание полиморфизма); STR - short ;m repeats (микросателлиты, короткие повторяющиеся последовательности); VNTR - variable эег tandem repeats (тандемные повторы с изменяющимся числом повторов), ГКМП - пшертро-;ская кардиомиопатия. СЛТ - ген каталазы. AGT - ген ангиотеизиногена, ALR - ген озоредуктазы, HUMF13A01, HUMCD4, АСТВР2, D11S907, ALR2 - микросателлитные локусы

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Туракулов Р.И., Чистяков Д.А., Одинокова О.И., Носиков В.В. "Аллельный полиморф!

коротких тандемных повторов локусов HUMF13 и HUMCD4 в российских популяц Москвы и Томска." Генетика, 1997, Т.ЗЗ, №.7, 979-985

2. Туракулов Р.И., Чистяков Д А., Одинокова О.И., Галактионов O.K., Носиков i "Аллельный полиморфизм тетрануклеотидного тандемного повтора SE33 у Удэгейце в двух городских популяциях России". Молекулярная биология, 1997, Т.31, №6, стр. 9 987.

3. Чистяков Д.А., Туракулов Р.И., Горашко Н.М., Демуров Л.М., Рачиба Ю.М., Кондрат Я.Ю., Миленькая Т.М., Шестакова М.В., Дедов И.И. "Изучение полиморфи динуклеотидного повтора в гене альдозоредуктазы в контрольной выборке болы ИЗСД и больных с сосудистыми осложнениями". Молекулярная биология, 1997, Т №5, стр.778-783.

4. Чистяков Д.А., Туракулов Р.И., Моисеев B.C., Носиков В В., "Т174М полиморфизм г ангиотензиногена связан с эссенциальной гипертензией в московской популящ Молекулярная биология, (в печати).

5. Turakulov R.I., Chistyakov D.A., Nosikov V.V., "Allelic polymorphism of tetranucleo; microsatellite HUMF13A01 in two city populations of Russia", Abstracts of the 2nd Bal Meeting of Human Genetics, Istanbul, Turkey (September 3-6, 1996)

6. Turakulov R.I., Chistyakov D.A., Nosikov V.V.,"Allelic polymorphism of the SE33 STR sysi in a Russian population and its forensic validation", Med. Genet., v. 9 , no. 2, p. 193 (1997).

7. Tourakoulov R.I., Chistyakov DA, Kondratiev Ya.Yu., Nosikov V.V. "T174M polymorph of angiotensinogen gene is associated with essential hypertension in a Russian populatic Abstracts of the 3rd Balcan Meeting of Human Genetics, Thessaloniki, Greece (August 261998), Abstsract No. 125.

8. Tourakoulov R.I., Chistyakov D.A., Shestakova M.V., Demurov L.M., Gorashko N.: Shamkhaiova M.Sh., Chugunova L.I., Dedov I.I., Nosikov V.V. "Study of approach of t genes into diabetic nephropathy". Eur. J. Hum. Genet. V.6. Suppl. 1. p.73 (1998)

9. Efremov I.A., Aksenova M.V., Chelnokova M.V., Chistyakov D.A., Turakulov R.I., "Meas of uenetic distance between two city populations of Russia", Abstracts of the 2nd Ball Meeting of Human Genetics, Istanbul, Turkey (September 3-6, 1996)

10. Demurov L.M., Chistyakov D.A., Turakulov R.I., Gorashko N.M., Kondratiev Ya.Yu., Nosil V.V.,"Polymorphism of aldose reductase gene in Russian juvenile IDDM and NDDDM patiei common risk marker?", Med. Genet., v. 9., no. 2, p. 46 (1997).

11. Chistyakov D.A., Turakulov R.I., Gorashko N.M., Rachiba Yu.M., Kondratiev Ya.Yu., Nosil V.V.,"DUS609 locus nearby the CAT gene is associated with N1DDM in a Russ population", Med. Genet., v.9„ no. 2, p. 38 (1997).

12. Chistyakov D.A., Turakulov RI., Gorashko N.M., Demurov L.M.,"Ya.Yu., Scherbacheva L. Dedov I.I., Nosikov V.V.,"Polymorphism of aldose reductase gene in Russian juvenile ШГ and NIDDM patients: common risk marker?", Abstracts of the 16th International Diabe Federation Congress, Helsinki, Finland (July 20-25, 1997) p.A54.

13. Nosikov V.V., Chistyakov D.A., Turakulov R.I., Kondratiev Ya.Yu., Demurov L.M., Mamas G.G., Balabolkin M I., Dedov II., "Three candidate genes for diabetic angiopathy in sene Moscow population and NIDDM patients", Abstracts of the 16th International Diabe Federation Congress, Helsinki. Finland (Jule 20-25, 1997) p.A167.

14. Nosikov V.V., Chistyakov D.A., Shestakova M.V., Tourakoulov R.I. Demurov L.M.., Mamaeva G.G., Gorashko N.M, Shamkhalova M.Sh., Chugunova L.A., Balabolkin M.I. Dedov I.I. "Polymorphic markers of ACE, ALR2 and CAT genes and risk of diabetic angiopathy", Abstracts of HUGO'S Human Genome Meeting "HGM'98", Torino,-Italy (March 28-30, 1998) p.23. ~

15. Chistyakov D.A., Tourakoulov R.I., Demurov L.M., Gorashko N.M., Scherbacheva L.A., Mamaeva G.G., Balabolkin M.I.; Dedov I.M., Nosikov V V. "Three gene polymorphisms in healthy subjects and diabetic patients of Moscow population". Eur. J. Hum. Genet. V.6. Suppl. 1 p 73 (1998)

16 Kcndraticv Ya.Yu, Demurov L.M., Chistyakov D.A., Tourakoulov R.I, Gorashko N.M., Scherbacheva L.N, Mamaeva G.G., Balabolkin M.I., Dedov I.I., Nosikov V.V. "Three gene polymorphisms in general Moscow population and in IDDM and NIDDM patients", Abstracts of the IVth European Congress of Endocrinology, Sevilla, Spain (May 9-13, 1998), Abstract No. Pl-77.

17. Shestakova M.V., Chistyakov D.A., Shamkhalova M.S., Demurov L.M., Chugunova L.A., Gorashko N.M., Tourakoulov R.I., Vikulova O.K., Kondratiev Ya. Yu., Nosikov V.V., Dedov I.I. "Candidate gene approach in study of genetic suspectibility to diabetic nephropathy in Russian IDDM patients" Abstracts of tha IVth European Congress of Endocrinology, Sevilla, Spam (May 9-13, 1998) Abstract No. Pl-79.

IS Chistyakov D.A., Tourakoulov R.I.' Kondratiev Ya.Yu., Nosikov V.V. "Dinucleotide short tandem repeats polymorhisms of catalase and aldose reductase genes and diabetic retinopathy in a Russian population" Abstracts of the 3rd Balcan Meeting of Human Genetics, Thessaloniki, Greece (August 26-30, 1998), Abstsract No. 119.

19 Nosikov V.V., Shestakova M.V., Chistyakov D.A, Shamkhalova M.Sh, Chugunova L.A., Tourakoulov R.I., Kondratiev Ya.Yu., Dedov I.I. "Study of genetic suspectibility to diabetic nephropathy in Russian IDDN patients using candidate gene approach". Abstracts of the 3rd Balcan Meeting of Human Genetics, Thessaloniki, Greece (August 26-30, 1998), Abstsract No. 215.

20. Kondratiev Ya.Yu., Shestakova M.V., Shamkhalova M.S., Chugunova L A, Gorashko N.M, Chistyakov D.A., Vikulova O.K., Tourakoulov R.I., Dedov 11., Nosikov V V. "Use of extreme phenotypes in association study of gon.ti; suspectibility to diabetic nephropathy in IDDM patients", Abstracts of the 34th Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes, Barcelona, Spain (September 8*12,' 1998), p.293.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туракулов, Рустамжон Исмаилжонович, Москва

л

/

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ТУР АКУЛОВ РУСТАМЖОН ИСМАИЛЖОНОВИЧ

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ МАРКЁРЫ В ИЗУЧЕНИИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ

03.00.03 -МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

На правах рукописи

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ__2

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_____3

Вариабельные микро- и минисателлитные ДНК-локусы.__ 3

Генетические индексные маркеры___ 5

Популяционно-генетические исследования микро- и минисателлитных локусов_ 8

ЗТЯ и идентификация личности на уровне ДНК (геномная дактилоскопия). ____ 10

Полимеразная цепная реакция и аллельный анализ микро- и минисателлитных

локусов____16

Характеристика микросателлитных локусов, исследованных в настоящей работе _____ 20

Молекулярно-генетические подходы в изучении и диагностике наследственных заболеваний.___ 21

Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД): общая характеристика заболевания._ 26

Неинсулинозависимый сахарный диабет (НИЗСД): общая характеристика

заболевания.___.__ 27

Общая характеристика сосудистых осложнений диабета. Диабетическая нефро- и ретинопатия. __ 29

Гены - кандидаты и генетические маркеры ДН и ДР, исследованные в настоящей работе.__35

Генетические маркеры гипертонической болезни__39

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ_. __43

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ_ ' _47

Изучение полиморфизма локусов НиМР13А01 и НЬ'МРСШ. __ 47

Изучение полиморфизма локуса АСТВР_ 55

Сравнительный анализ полиморфизма локуса Б118907 в московской популяции ив группах больных ИЗСД и НИЗСД. ____ 62

Сравнительный анализ распределения генотипов локуса 81Ш907 в выборке

больных с диабетической ретинопатией и больных СД без ретинопатии__68

Сравнительный анализ распределения генотипов локуса 81Ш907 в выборке

больных СД с диабетической нефропатией и без дибетической нефропатии _ 69

Анализ аллельного полиморфизма гена АЛ2 в московской популяции___72

Анализ полиморфизма динуклеотидного повтора гена АЛ2 у больных ИЗСД с

наличием и отсутствием нефропатии___74

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов локуса АК2 у больных

ИЗСД с наличием и отсутствием диабетической ретинопатии_ 77

Полиморфизм Т174М гена ангиотензиногена и сердечно-сосудистые патологии в московской популяции_80

ВЫВОДЫ______84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - Ангиотензин-Превращающий Фермент

ДН - Диабетическая Нефропатия

ДР - Диабетическая Ретинопатия

СД - Сахарный Диабет

ИЗСД - Инсулинзависимый Сахарный Диабет

НИЗСД - Неинсулинзависимый Сахарный Диабет

ПДРФ - Полиморфизм по Длине Рестрикционных Фрагментов

ГГЦР, PCR — Полимеразная Цепная Реакция (Polymerase Chain Reaction)

РАС - Ренин-Ангиотензиновая Система

СЕРН - Centre сГ Etude du Polymorphisme Humain dNTP - Дезоксинуклеозидтрифосфаты

AMP-FLP - ПЦР амплифицированные полиморфные по длине фрагменты (PCR-

amplified fragment length polymorphisms) IAM - Infinite Allele Model "бесконечная аллельная модель"

PIC - Polymorphism Information Content (информационное содержание

полиморфизма)

STR - Short Tandem Repeats (Микросателлиты, короткие повторяющиеся

последовательности) STS - Sequence Tagged Sites

SMM - Stepwise Mutation Model ("ступенчатая мутационная модель") VNTR - Variable Number Tandem Repeats (варьирующие по числу тандемные повторы)

ВВЕДЕНИЕ

Микросателлитные генетические маркеры, благодаря своим уникальным свойствам нашли широкое применение в молекулярной биологии, и в прикладных областях биологии. Эти высокополиморфные повторяющиеся последовательности ДНК достаточно плотно и равномерно распределены по всему геному (через 200-300 тыс. п.н.), большинство из них имеет несколько вариантов аллелей, различающихся количеством повторов коровой последовательности, при чем уровень гетерозиготности, как правило превышает 50%. Такие свойства делают их чрезвычайно привлекательными для использования в изучении структуры популяций, геномной дактилоскопии, картировании генома. Благодаря открытию метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) определение генотипов микросателлитных локусов стало еще более практичным. На основе данного метода, разработан способ определения по микроколичествам биологического материала его происхождения и индивидуальной принадлежности. В литературе эта технология называется "геномной дактилоскопией", она широко используется большинством лабораторий судебно-медицинской экспертизы западных стран. В нашей стране также наблюдается значительный интерес к ней. Но необходимо отметить, что для правомочного интерпретирования результатов экспертизы, на предмет случайного совпадения, требуется исследование на конкретной популяции. Именно такую цель мы преследовали в нашей работе по изучению генетического полиморфизма ряда микросателлитных тандемных повторов в нескольких российских популяциях. Для этого были использованы две выборки из достаточно удаленных популяций с территории России: 1-ая -это московская, в нее вошли более 100 (случайных) пациентов травмопункта института им. Склифосовского; 2-ая выборка была специально подобрана из 80 случайных представителей Томской популяции (ДНК материал предоставлен О.Н. Одиноковой); кроме этого локус SE33 был изучен на интересной выборке из 86 представителей малой народности севера - удэгейцах (ДНК материал предоставлен O.K. Галактионовым). На основании результатов генотипи-рования представителей этих популяций по локусам HUMF13A01, HUMCD4, SE33 (ЛСТВР2). нами был проведен анализ перечисленных выше выборок на предмет их соответствия закону Харди-Вайнберга по распределению частот встречаемости аллелей. Как показывают результаты программы RxC, все три локуса полностью подчиняются закону Харди-Вайнберга, кроме того они отличаются высоким уровнем информативности, гетерозиготности, мощностью фактора дискриминации (PD). Полученные результаты хорошо согласуются с зарубежными данными. Все это позволяет не только с уверенностью рекомендовать предложенные локусы для использования в геномной дактилоскопии на территории России, но

и рассчитывать численные значения риска случайного совпадения генотипов, а также ряд других важных статистических параметров.

Вторая часть работы посвящена изучению ассоциации полиморфных генетических маркеров в генах-кандидатах с сахарным диабетом и его сосудистыми осложнениями -ретинопатией и нефропатией. Кроме того был изучен полиморфизм Т174М (замена треонина на метионин в 174-м положении аминокислотной последовательности) гена ангиотензиногена (AGT) в выборках больных с гипертонической болезнью и кардиопатиями. Все эти заболевания являются мультифакторными, то есть для них не установлен единственный конкретный ген отвечающий за их развитие, и наряду с генетическими факторами в этиопатогенез таких заболеваний могут быть вовлечены факторы внешней среды. В настоящее время работы по изучению генетического вклада в развитие мультифакторных патологий сосредоточены на так называемых "генах кандидататах", это те гены чьи продукты прямо или косвенно вовлечены в развитие заболевания. Для сахарного диабета и его сосудистых осложнений в качестве генов кандидатов мы рассматривали ген каталазы (фермента отвечающего за антиоксидантную защиту организма) и ген альдозоредуктазы (ключевого фермента сорбитолового пути обмена глюкозы). В нашем исследовании ставилась задача по изучению аллельного полиморфизма микросателлитных тандемных повторов содержащихся в этих двух генах. Для гена каталазы был использован динуклеотидный тандемный повтор D11S907 для гена AR был выбран полиморфный микросателлит AR2 содержащийся во 2-ом интроне этого гена. Исследование проводилось на специально подобранных по клиническим данным выборках из пациентов Всеросийского Эндокринологического Научного Центра. В эти выборки вошли пациенты с сахарным диабетом I и П-го типа, а также пациенты с сахарным диабетом 1-го типа с сосудистыми осложнениями. Двухаллельный полиморфизм Т174М гена ангиотензиногена (AGT) в изучали на выборках больных с гипертонической болезнью и кардиопатиями, подобранных B.C. Моисеевым из пациентов 64 московской городской больницы. По результатам генотипирования представителей этих выборок проводили статистический анализ аллельного распределения исследуемых микросателлитных локусов, проверяли на подчинение закону Харди-Вайнберга, и сравнивали выборки между собой с помощью критериев %2 и g-статистики (для этого использовали программу RxC). Также проверялись частотные различия конкретных аллелей и генотипов с помощью точного критерия Фишера. Исходя из полученных данных по частотам встречаемости отдельных аллелей и генотипов рассчитывали величины относительного риска (RR) и на основании статистического анализа выводы об ассоциации с изучаемыми заболеваниями.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вариабельные микро- и минисателлитные ДНК-локусы.

Сателлитная ДНК - это класс высокоповторяющихся последовательностей, составляющих около 10% всего генома. Сателлитная ДНК локализована преимущественно в центромерных, теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хромосом.

Особое место среди сателлитных ДНК занимают микро- и минисателлитные последовательности, представляющие собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относительно коротких тандемных повторов. Микросателлиты - это класс нуклеотидных повторов, включающих от двух до пяти звеньев. Размер повторяющихся единиц в минисателлитных последовательностях может меняться от 6 до 70 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и минисателлитов является наличие среди них большого количества участков, вариабельных по числу копий в кластере.

Вариабельные микро- и минисателлитные повторы являются чрезвычайно информативными системами. Это связано с тем, что они, как правило, состоят из большого количества аллелей с уровнем гетерозиготности, достигающем 7090% [4].

Количество высокоизменчивых микро- и минисателлитных последовательностей в геноме человека, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч; они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хромосом. Так, более 90% из 5000 идентифицированных повторов (С-А)п являются полиморфными, причем в большинстве из них уровень гетерозиготности значительно превышает 50% [176].

Микросателлиты, или STR (short tandem repeats), стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма, исходя из числа «коровых» единиц. В Х-хромосоме такие повторы обнаружены через каждые 300-500 тыс. п.н., тогда как в других частях генома они встречаются в среднем на расстоянии 10 тыс. п.н. друг от друга. По некоторым оценкам, их частота может достигать 1/20 тыс. п.н. [38]. Возможно, истинное число три- и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как они обнаружены во многих гецах.

Подобно другим повторам, STR обычно встречаются в некодирующих частях генов. Недавно обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в своих регуляторных и даже в транслируемых частях. Изменение числа этих внутригенных повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причиной ряда тяжелых наследственных заболеваний.

К гипервариабельным минисателлитным последовательностям относят варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR (variable number tandem repeats). Общее число высокополиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 [38], VNTR характеризуются наличием 10-15 нуклеотидных «коровых» последовательностей, сходных с контролирующими элементами рекомбинации Е. coli. С помощью ДНК-зондов, сконструированных на основе тандемно повторяющихся «коровых» последовательностей, можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих однотипную «коровую» последовательность. Примером может служить VNTR, обнаруженный в интроне миоглобинового гена, включающий четыре тандемных повтора из 33 п.н., фланкированных прямыми повторами из 9 п.н. Полученные из этого района зонды ДНК с успехом используются для идентификации личности методом геномной дактилоскопии (фингерпринта), так как вероятность совпадения аллелей у двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабельным локусам, гибридизующимся с этим ДНК-зондом, значительно меньше 10*7 [81].

Сведения о мутабильности высокополиморфных последовательностей в геноме человека весьма противоречивы. Тем не менее, показано, что в наиболее вариабельных минисателлитных локусах частота мутаций может достигать 5% на гамету. Многие авторы обращают внимание на достаточно высокую стабильность минисателлитных аллелей, что позволяет их широко использовать как для генетического картирования, так и для популяционных исследований и идентификации личности методом геномной дактилоскопии [8; 52].

Генетические индексные маркеры

Успешная хромосомная локализация гена в значительной степени определяется присутствием на карте фланкирующих маркеров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфических участков хромосом могут быть использованы любые локализованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем легко идентифицируемой популяционной изменчивости или полиморфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генетических маркеров производят по результатам совместного анализа их сегрегации в информативных семьях.

Популяционный анализ изоферментов позволил обнаружить существование полиморфизма для очень многих белковых систем, контролируемых разными генами, локализованными во многих хромосомах. Для этих хромосом были найдены генетические маркеры, с помощью которых были идентифицированы соответствующие группы сцепления.

Совершенствование молекулярных методов анализа специфических последовательностей ДНК привело к обнаружению большого числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных участков рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных последовательностей. Эта изменчивость также была использована для маркировки участков хромосом с целью установления более точного взаиморасположения локусов. Для определения порядка расположения , генов на хромосомах и оценки генетических расстояний между ними достаточно около 400 равномерно распределенных полиморфных маркеров.

Идентификация в геноме человека большого числа полиморфных участков рестрикции и разработка простых методов анализа индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно повысили возможности локализации неизвестных признаков на геномных картах. Уже к 1989 г. было картировано более 2000 клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различных популяциях. Более 1000 из них типировано в коллекциях СЕРН (СЕРН - Centre cl Etude du Polymorphisme Humain) родословных. В значитель-

ной степени это анонимные последовательности, связь которых со специфическими генами не установлена. Их наименования чаще всего соответствуют названию отобранного из библиотеки генов клона. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая номенклатура для обозначения используемых в качестве маркеров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква - D, что значит ДНК, затем - номер хромосомы, далее S - для уникальных и Z — для повторяющихся последовательностей, и в конце -номер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных участков рестрикции в качестве генетических маркеров имеет два ограничения - сравнительно низкая информативность (частота гетерозигот не может превышать 50%) и неравномерное распределение участков-ПДРФ по хромосомам. Этих недостатков практически лишены гипервариабельные участки -STR (ди-, три- и тетрануклеотидные повторы). Использование микро- и минисателлитных последовательностей ДНК в качестве индексных генетических маркеров открыло новую эру в построении карт сцепления генома человека. В настоящее время работа по идентификации высокополиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно распределенных по хромосомам, практически завершена [175]. Эта система построена на базе динуклеотидных повторов (С-А)п.

(C-A)n-(G-T)n представляют собой наиболее частый класс простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исключением мультимеров Ап-Тп). Такие повторы присутствуют примерно в 1 % колоний из геномных библиотек, сконструированных на базе фрагментов длиной 300-500 п.н., которые образуются после расщепления геномной ДНК эндонуклеазой Alul. Более 90% из них оказываются полиморфными по числу копий в кластере, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей.

Информативность повторов (dC-dA)n х (dG-dT)n возрастает с увеличением среднего числа повторов. Информационное содержание полиморфизма (PIC-polymorphism information content) имеет �