Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование области генома, ответственной за атаксию Фридрейха, с целью уточнения локализации гена и разработки ДНК-диагностических процедур заболевания

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование области генома, ответственной за атаксию Фридрейха, с целью уточнения локализации гена и разработки ДНК-диагностических процедур заболевания"

российская академия медицинских наук медико-генетический научный центр

На правах рукописи

Пугачев Владимир Владимирович

УДК 575.113.2 + 616-056.7

"исследование области генома, ответственной за атаксию

фридрейха, с целыо уточнения локализации гена и разработки днк-диагностических процедур заболевания"

03.00.15 "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

О.В. Евграфов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.К. Янковский

кандидат биологических наук Д.В. Залетаев

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН, Москва

Защита диссертации состоится "_ "_ 199 г.

в_часов на заседании Специализированного совета Д 001.16.01

по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " " ._ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

профессор Л.Ф.КУРИЛО

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Настоящая работа посвящена исследованию области локализации гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха.

Актуальность темы. Обнаружение и исследование Генов, мута- • ции в которых приводят к возникновению наследственных заболеваний человека, позволяет не только понять молекулярно-генети-ческие и биохимические механизмы возникновения этик заболеваний, но и разработать эффективные методики их диагностики (в том числе пренатальной и пресимтоматической), а в перспективе и подойти к проблеме лечения этих заболеваний. Обнаружение новых полиморфных маркеров, сцепленных с патологическим геном, позволяет сделать более эффективной косвенную ДНК-диагностику заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование области локалигании гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха. При этом ставились следующие задачи:

- Обнаружить и исследовать новые полиморфные маркеры в области наиболее вероятной локализации гена РН?А.

- Исследовать наличие неравновесия по сцеплению известных и вновь обнаруженных маркеров с патологическим геном в популяции России.

- Определить нуклеотидную последовательность участка ДНК вблизи СрБ-островка в области вероятной локализации гена РЕВА и проанализировать ее на наличке возможных кодирующих последовательностей.

- На основании вновь обнаруженных полиморфных маркеров р;а-работать процедуры косвенной ДНК-диагностики атаксии Фридрейха.

Научная новизна. В ходе данной работы обнаружены и исследованы четыре новых микросагеллитных повтора. Проведена оценка по-пуляционных частот аллелей обнаруженных микросателлитных повторов и повторов из локуса 09315 для популяции России.

Впервые определена иуклеотидная последовательность участков ДНК, содержащих пять микросателлитных повторов, а также Фрагмента ДНК зонда 26Р, прилежащего к СрБ-островку и содержащего про-моторную область одного из известных генов-кандидатов.

• Практическая ценность работы. Данные, полученные в ходе работы, позволяют проводить эффективную косвенную ДНК-диагностику атаксии Фридрейха.

- 4 -

Положения, выдвигаемые на гашдгу.

1. Обнаружены и секвенированы 4 микросателлитных повтора е области вероятной локализации гена FRDA.

2. Определены частоты аллелей двух известных и двух новых СА-поьторов в популяции России.

3. Разработаны процедуры ДНК-диагностики, основанные на нерадиоактивном определении аллелей СА-повторов.

4. Определена непрерывная нуклеогидная последовательность участка ДНУ. длиной £862 н. п., содержащего 5'-область одного из генсь-кандидатов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 2-ои Всесоюзном симпозиум« "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991) и на VI-ом Съезде ВОГиС ( Минск, 195?;).

ПуЗлмсацяи. По материалам диссертации оауАлигсовано 7 печатных kiSot.

Обгем и структура работы. Диссертация состоит из введения, сбгора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, еаключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 60 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения ЛКК использовали венозную кровь пациентов и члепоЕ их с«мей. Работа была выполнена на образцах ДКК людей, являющихся пациентами нейрогекеткчеекого отделения НИИ неврологии PAMfL

ДНК из крови выделхлл методом, предложенным Линдбломом и Холмлуядом CLíncíbloiri and Ноlmlund, 1Q83). Выход ДНК составлял 25 - 50 мкг на 1 мл крови.

Геномные бонды M-.JT112 и 26Р были любезно предоставлены доктором Ite нагом.

Штамм:-: Е. coli TGI, Е. col i JM33 получены ив музея ВНИИ Гегге-тигч- (г. Могуг-н) . Лл?i клонирования использовали оактеркоФчги Ml3 ьр13 ¡i М13 №?19 производства фирмы "Boehririger" и плазмидный вектор Bluescript ЗК+ производства фирмы "St.ratagene".

При проведении« блот-гибридизации для переноса фрагментов ДНК' на cu apo^hüi'o геля на фильтр Hyfcond N использовали метод ва-

куумного блоттинга.

Для мочения (СА)п гондон использовали меченный по 32 Р ciCTP производства "Aniershatn" или ВГЮ, г. Ташкент. Мачение гюнда проводили стандартным методом ник-трансляции.

Элюцию фрагментов ДНК и клонирование их з бактериофагах и плазмидном векторе проводили по стандартным методикам (Маниатис Т. и др. , 1984).

Приготовление компетентных клеток, трансформацию и отбор рекомбинантных колоний проводили по методикам, описанным з (Маниатис Т. и др. , 1984).

. ДНК рекомбинантных плазмид и бактериофагов выделяли в сост-вествии с (Маниатис Т. и др., 1984, Birnboim Н.С. , 1992).

Полиморазкую цепную реакцию проводили при гюмоши программируемого термоциклера РНС-2 фирмы Techne с использованием термофильной ДНК-полимеразы Thermus thermophl lu.s производства СП "Медтех", г. Москва. ПЦР проводили по стандартной схеме (Erlich Н. A. et al. , 1991) при подобранных специально для каждой пары праймеров параметрах реакции. Результаты амплификации оценивали в б - 12 % ПААГ. При ЩР с включением в ДНК радиоактивной метки, концентрация меченного праймера была в 7 раз меньше, чем немеченного, а количество циклов увеличивали в 1,5 раза. Результаты оценивали в тонком денатурирующем ПААГ с последующей радиоазтог-рафией (Sanger F. et al. , 1977).

Мечение олигонуклеотида 33 Р по 5'- концу проводили при помощи Т4 - Полинуклеотидкиназы производства НПО "Ферментас".

Секвенирование участков ДНК, клонированных в бактериофагах и плазмидном векторе, проводили по методу Сенгера ( Sanger F., et al.,1977) с соответствующими мпдификагтчми.

Получение направленных делений ДНК проводили с использованием нуклеаз Exo III и S1 производства НПО "Фэрме.чтас" з соответствии с (Smith А., 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Клииико-геиетический подбор пациентов.

В настоящее время ген, повреждения в котором вызывают А. Ф. , не найден и отсутствуют прямые генетические методы диагностики заболевания. Необходимым материалом для молекулярно-генетических исследований района предполагаемой локализации гена является ДНК больных А. Ф. и членов их семей, причем необходима максимально возмошая точность поставленного диагноза А. Ф.

Проблема диагностики А. Ф. е настоящее время решается путем рзграСоп;й едкноа разБераутсй системы крит'-фж-й, с помса-ь» которой каждый больном о первичным диагнозом А. Ф. подвергается тщательному тестированию, в результате чего определяется степень соответствия его диагноза А. &

О-л рудниками нашего икстигута совместно с яй>1 IIc-bpojsoivm РАМН на основе зарубежных данных, и накопленного в кашей стране опыта описания больных Л. Ф. разработан вариант карты обследования больных А. О., позволяющей оценивать степень соответствия симптомов больних классическим критериям для А. Ф. и таким обра-эом оценивать достоверность диагноза А. Ф. у пациентов.

Вольных А. Ф. обследовали в НИИ Неврологии р. соответствии с разработанной картой. Б результате было отобрано 10 больных, диагноз которых полностью соответствовал критериям карты обследования больного А. О., их семьи использовались в дальнейшем в генетических исследованиях.

П. П:нок и картирование СА-повторов в районе гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха.

Первым этапом при использовании наиболее распространенных подходов к тонким/ генетическому картированию является поиск по-л/морцжыу маркеров, которые долтеы удовлетворять следуюгаям условиям:

J; Otiri должны располагаться внутри минимального определенного района предполагаемой локализации патологического гена,

'¿) эти маркеры долины быть выеокополиморфнымя,

3) эти полиморфные маркеры не долины обнаруживать значительного неравновесия по епепленим друг с другом, иначе они фактически ке дает дополнительной информации для генетического анализа.

Лапнке по неравновесию по сц^плен;№ гена с МСТИ? и 26? пооъслилп щорполохмть, что ген расположи в непосредственной близости от этих маркеров, а апаяиа обнаруженных р«комбинациой-нух событий позволил исключить маркер МСТ112 и& области возможного расположения гена и предположить,- что 25Р также находится вне этой области. Таким образом, наиболее вероятно расположение гена, ответственного за возникновение А. Ф. , в районе между маркерами ЫСГ112 и 26Р. Первым этапом работы был поиск полиморфных маркеров в указанной области. В качестве наиболее удобного типа

полиморфных маркеров были выбраны СА-повторы.

Доктор Кениг любезно предоставил нам дрогазэкке клоны YAC 4 и YAC 5, содержащие данную область, и косммдную клонотеку геномной вставки клона YAC 4, насчитывающую 38 клонов.

В качество зонда для гибридизации использовали синтетический двуцепочечный СА-повтор со средней длиной 12 т. н. п. , радиоактивно меченный методом ник-трансляции.

Первоначально методом дот-гибридизации был проведен отбор космидных клонов, содержащих хотя бы один СА-повтор. При этом космидная ДНК была гидролизована реетриктазой Ваш HI и нанесена на фильтр в количестве 0.5 мкг. В качестве положительного контроля использовали ДНК зонда МСТ112, внутри которого имеется СА-повтор (Fujita et al., 1990). В результате двукратно проведенной гибридизации было отобрано 8 космидных клонов, содержащих ПД-повторы: 18, 23, Z9, 4R, 52, 121, 124 и 127 (Рис.1).

■ Клон £9 ь дальнейшем не анализировали, поскольку он содержал вставку ДНК, не принадлежащую девятой хромосоме человека. Далее проводили идентификацию обнаруженных микросателлитных повторов и их картирование. С этой целью была проведена блот-гибри-

¿kV

i

Ц--„,---,f----

;t¡H> :»

Рис. 1. Результаты дот-гибридизации ДНК космидных клонов с радиоактивно меченным синтетическим СА-повтором. Номера анализируемых клонов представлены в правой части рисунка.

дизация ДНК семи из ранее выбранных клонов с синтетическим СА-повтором. ДНК космидных клонов была гидролизована рестрикта-

зсй Та;- I. На этом этапе для дальнейшего исследования было отобрано пять :-слонов {?.<>, 40, 52, 121, 124), в ДНК. которых имелись ФР&гменти различной длины, сод^ржаше СА-поз-; оры. Для скокча-те-чьног: пдеж'-фикашге обн&рулжных микроеателлитных повторов била г.рог^лена еи,е одна блот-гибридизация с синтетическим СА-поз-ТОрОМ. ГЬф'.-л ПрйВей^йИьл! гибридизации ДНК пяти космидных клонов была обработана рестриктазами Hind III, Hind III + Taq I, Taq I. Было обнаружено 4 фрагмента ДИК, содержащих CA-повторы, в каждой группе рестржции (Рис.2).

"m -шу^'АУ^ M' Ш '&М

CF3

; с?

CD

>СГ>

CP

..i

■■I

Рис.Я. Регультаты блст-гибридизации ДШ? пяти кссмэдных кло-;:ои, гидролигюьенной рестривтазедм HindiII и T<iql, с мечекиш нерадиоактивно синтетическим СА-повторсм. Е каждой группе рестрикций присутствуют 4 фрагмента ДНК различной длины, соде-рлащие •-А-повторы.

Анализ этих Фрагментов позволил идентифицировать 4 различие <.14-пов?ора ¡f построить карту их взаимного расположения Даины-ï повторы были названы нами СА1, СА2, САЗ и СА4. Б результате дополнительной блот-гибридизации ДНК клонов 45, Ш, 124, гидолиооваяиой Eco RI, были выяснены размерь- EcoRl фрагментов,! содержащих обнаруженные повторы. От французских коллег .нами была получена карта космидной библиотека по реетриктазе Eco RI, кото-рал дала с ранее составленной картой сцепления клонов, содержащих СА- повторы.

Таким обпазом, найденные пд-довторн удовлетворяют первому

поставленному условию, а именно расположены внутри заданной области да.

Фрагменты ДНК, содержащие все обнаруженные нами СА-повторы, были клонированы в бактериофаге М13 для определения нуклеотидной последовательности. При этом Eco RI - Eco RI фрагмент ДНК длиной 650 н.п., содержащий повтор СA4, был элюирован из 0.8Z ЛПА геля, на дорожи которого была нанесена ДНК космидного клона 121, обработанная рестриктазой Eco RI. Аналогично был элюирован Hindi 11 - Hind III фрагмент ДНК длиной 1.9 т.н.п., содержащий повтор САЗ и Hind III - Taq I фрагмент ДНК длиной 0.95 т.п.н., содержащий повтор СА2. Для злюции использовали ДНК клона 124, гидролизованную соответствующими ферментами рестрикции.

Выделение фрагмента ДНК, содержащего повтор CAI, провогили в два этапа. Первоначально из геля, на который была нанесена обработанная Taq I ДНК гаона 52, был элюирован фрагмент длиной 5.1 т.н.п., содержащий данный повтор. Затем был идентифицирован и элюирован из геля Sau3AI-Sau3AI фрагмент ДНК длиной 250 н. п., содержащий СА-повтор. Элюированные фрагменты ДНК клонировали в фаге М13тр18. Фрагмент длиной 950 н. п. был дополнительно клонирован в фаге М13гар19 для получения другой ориентации фрагмента относительно универсального праймера. При помощи рестрикционного анализа отобрали рекомбинантные клоны, содержащие требуемые фрагменты, в том числе фрагменты длиной 650 и. п. , 950 н. п. и 1,9 т.н. п. в обеих ориентациях относительно универсального праймера

По методу Сенгера определили нуклеотидную последовательность клонированных фрагментов, содержащих повторы CAI, СА2, СА4 и части клонированного фрагмента, содержащего повтор САЗ.

Нуклеотиднаи последовательность ДНК вблизи повтора CAI содержит праймеры, , выбр?1нные Г. Сирудю (группа доктора Кенига, Страсбург) для найденного и описанного им независимо от нас повтора GS2 (G. S irugo et al. , 1992). Повторы СА2, САЗ и СА4 ранее-описаны не были.

III. Исследование полиморфизма обнаруженных микросателлит-ных повторов.

Вторым требованием, предъявляемым к маркерам для возможности использования их в тонком генетическом картировании, является высокая степень полиморфности. Для исследования полиморфизма СА-повторов по числу повторений звена СА использовали ампли-

фккаци» участка ДНК, еодеркагйго повтор и различающегося по длине для различных аллелей.

Кл.оче2^м элементом отработки методики аиплифи.кщии определенного фрагмента ДНК является къ¡бор оптимальных праймеров, для вторых затем подбиравтея оптимальные условия реакции.

Маркс-р Праймеры Длина фрагм. п. н. Условия амплификации

CMff] cck.

CAI й'GATCTTTAACCCTTCTGTCAGACAAG 5' С АТCCCGAАТGOTGАТ ATTGTGOAAG 1S3 2. 5inM 94 55 72 45 45 60

СА2 5' TGCAATGCTCACTGAAGAAAGAAGTC о' Т ААСАíüGAGATTTGCCACASTCTAC 105 2. 5mM 94 55 72 45 4Í5 60

САЗ о'AOTCTÜTTАТ AGCAACACTGAATGGAO Г/ ОТТПАГГОТСТТОТТТ АТСЛТЙНГТТС 118 2. 5mM 94 55 72 4b 45 60

СА4 5 * ССААТ Т СОТ Т С AGCT АА АТ С ААСС AG 5'CACCAGAGAAACAGAACCAACAGG 152 1. 5mM 94 55 72 45 4o ,60

o'TCTCCCTCAGGTCTATTGAAGAAG 5'TGGAüGTCTAATGüTAGAACATGa 205 2 nívi 94 55 72 45 45 60

Табл.1. Праймеры и условия амплификации фрагменте;? ДНК, содержи®« микросат^ллитныо повторы CAI, СА2, САЗ, СА4 и МЗ ив МОТ 112.

Особое внимание нами уделялось подбору температуры плавления праймероЕ. Мы разработали компьютерную программу, обобйдюиую литературные данные и ката наблюдения, позволяющую, о достаточной

- il -

точностью рьгаслпть теяггературь; плавления сл;ипчтк^'еогияов о длиной 20 - 50 33t?tí.bwB на основе их длины и АТ.'ЗС состава.

При помовя этой программы для зсех четырех найденных ОА-повтоооз 6 ni ли выбраны пари врчймероз, фланкирующих область повтора. Так как рекомендуемые к. Fuji ta праймеры для амплификации OA-повтора внутри М0Т112 не позволяют проводить нсрадис,.активную регистрацию аллелей этого чаркера, ш сжвенировали участок ДНК зснда MC'îll 2 к выбрали новые щ'.-а?меры для амплификации данного ьикросателлита, использование которых позволило надежно идентифицировать аллели этого повтора как о использованием радиоактивного мечекия, так и без нэго.

Руководствуясь раерабсгашюй з нашей лаборатории стратегией, мы подобрали условия проведения ЩР для всех используемых пар прайме роз, при этом выход амялифицированногс фрап-.ентн ДКК составлял, как правило, больше одного микрогренма.

Пг>и рогисгр.пции близких я.ппллей мнн'рссателлнтного псчтсра, обычно различающихся по длич^ нс. Z нуклестидн, е геле часто наблюдаются дополнительные полосы сходкой интенсивности, что значительно затрудняет анализ гонстипол. Б частности, так."с разнообразие полос характерно для регистрации аллелей поэтически всех используемых нами микрооателлчтяых повторов пои применении методик с включением радиоактивного иготоиа.

Поэтому особое ени.\глни<? мы уделяли разработке меуслкк нера-дисактивього определения аллелей микросателлитных повторов. 3 настоящее время ótot подход недостаточно широко распространен из-за сложностей с подбором условий амплификации. Крем:* того, существуют ограничения ка разделение блюжрасполояк-чпих аллелей {для микрооателлитоБ OA они различается на 2 нуклеотида) в неде-нат/рирующем полиакриламидном геле. Проведенные нами .-»кспегим^я-ты показали, что'определение аллелей ке вызывает елолнсст^й при длгае- кед» wovM". (*ргчгм»нтов ДЫ'. не более- ь?с и. п. и онтнмааьно npvi длинах Qpv'.vv.éûTOB ь пределах ICO - iôO н. п.

Так как при использовании выбранных ламп цлл повторов CAÍ к MS из МСТ112 праймеров длины амллпфицируемых фрагментов ДНК составляли соответственно около 190 и 295 я. п. , тс перед электрофорезом амплифипировакные фрагменты ДНК подвергали обработке рострикгазамк EcoRV и Rsal соответственно. Рестрикта&ы были выбраны исход?, из аналиаа рестрикткой карты нуклестидной последовательности амплкфицируемых фрагментов ДНК. Б результате длины

раадел^енчх электровозом фрагментов ДНК, содержащих СА- повтори CAÍ И из М2Г112, бш;к соответственно уменьшены до 110 и 105 Н. П,

Рис. За Результат амплификации фрагмента ДНК. содержащего. микросателлит КБ из МСТ112, с использованием 5'-меченного празмера. Электрофорез проводили в тонком денатурирующем ПААГ.

Ь-—•———-■—-—.........- ..............--I1

Рис.30. Результат амплификации фрагмента ДНК, содержавшего кикросагедлит CAI с последующей обработкой рестриктазой EcoRV. Электрофорез проводили в 8% ПААГ.

В данной работе нами были получены удовлетворительные результаты для перечисленных выше праймеров при использовании обо-

их методов регистрации аллелей мжросателлитных повторов: как с использованием радиоактивного меченш, так и без него (Рис.3).

При этом преимущества нерадиоактивного определения аллелей существенны. Таким образом часто удается избавиться от большого количества дополнительных полос, наблюдаемых при использовании радиоактивного мечения. Кроме того, методически нерадиоактивная регистрация значительно проще, дешевле и быстрее. Наконец, как свидетельствует наш опыт, часто гетерозиготность можно подтвердить наличием гетеродуплексов, и, кроме того, поскольку различные гетеродуплексы имеют различную подвижность, это значительно облегчает проведение ДНК-диагностики.

Мы исследовали полиморфизм найденных нами новых микроеател-литных повторов (СА2, САЗ и СА4). Повтор СА4 не обнаружил полиморфизма при исследовании 26 неродственных хромосом, и, следовательно, непригоден для генетического картирования и ДНК-диагностики.

Обнаруженные повторы СА2 и САЗ оказались полиморфными. Были определены частоты аллелей двух известных (МТГ 112 и GS2 - CAI) и двух новых микросателлитных повторов (СА2 и САЗ) в популяции России. Для этого было исследовано около 50 независимых "нормальных" хромосом людей.. ДНК, которых имелась в лаборатории. Для определения длины амплифицируемых фрагментов ДНК, соответствующих различным аллелям, амплифицировали с включением радиоактивной метки соответствующий участок ДНК, клонированный в бактериофаге М13 (его длина определена непосредственно секЕенированием) и наносили на высокоразреиащий денатурирующий. ПААГ рядом с

ис с ле д у с- ¡vlbiíviil 00 pclî i la ми.

На основании частот аллелей исследуемых СА-повторов определено значение PIC для них в популяции России. Для NE из МСТ112 получено значение PIC 0.70 (в других популяциях до 0.79). Для CAI значение PIC составляет 0.59, для впервые обнаруженных СА2 и САЗ - 0. 44 и 0. 59 соответственно.

Для анализа возможного неравновесия по сцеплению найденных полиморфных маркеров между собой, а также с МСТ112, были проанализированы гаплотипы, сцепленные с неповрежденными хромосомами. Для этого были определены аллели повторов CAS, ОАЗ, CAI (3S2) и МСТ112 для родителей и детей в семьях, не отягощенных Л. Ф. Кром? того, такие гаплотипы, сцепленные с неповрежденным геном, были получены при анализе аллелей у гетерозиготных носителей, дети

которых больны Л. í>. Всего било получено 20 полных (по всем четырем маркерам) гзплзтипс?, не оцепленных с мутациями, вызывающими

* г

I

к-гсмстря ка н^олызое количестве, проан&якзкрованньк галло-типов, наличие значительного неравновесия по оцеплению мевду л:о-бьми двум.-; из обнаруженных СА-повтороз между собой и любым из кия с í.fCTliS можно исключить. Таким образом, найденные нами маркеры соответствуют ец:- одному необходимому требованию, предъявляемому к полиморфным маркерам для их использовании при тонком генетическом картировании интересу ¡оц^-к нас области.

Так как значительного нерзЕновесил по сц^плекид между аллелями используемых локусов не наблюдается, то, следовательно, эти полиморфные локуоы могут быть эфйктяыю использованы для анализа неравновесия по сцеплению о локусом FRDA.

Мм просели сравнительный анализ часто? аллелей микросател-ли-íos '-Г-Т112 и CAI (GS2) длп популяций России и трех других стран, для которых имелись такие данные, - Испании (Monros et al. , 1992а), Сракцта: (Fujita el al. , 1ÖX), Англии i Wallis et ■ч). . .

Лроь-?декное нами сравнен» частот оСаар/л:ло «лодогао расп-, ределтния часто? аллелей в "нормальных" хромосомах ь различные популяциях. По полученным на настоящее время данным наиболее близкой к популяции России по критерию сходства распределений частот .аллелей макроса??¿дата Ms из ШИЗ 2 является популяция Франции, затем Англии, и наименее близкой - популяция Испании (с преобладанием ьыходцев т ¡oro-восточных областей).

IV, ИоследоЕенио ¿.еразчовееия по сцеплеьши между патологическим геном FRDA и аллелями CAI, СА2, САЗ и К0Т112 в популяции России. ,

В исследованиях французской и испанской групп было зарегистрировано неравновесие по сцеплению между FRDA и полиморфными лэкусами ,477112, 25Р и FD1 ь ряде популяций С Fu j i ta et al.,; 1S9C, Мопгоз et, al., 1992a, Sirugo et al., 1992J, но не было БарегиетрироЕако ъ английской популяции (Wallis et al. , 1990). Маркер >34. j:acnojsow>rat4? п'//м«--рно в ЗЭ т. н. п. о-" MST'.JS, по-видимому, значительно слабее оцеплен с FRDA, чем ШТ112 (3irugo et al., 1992). Таким образом, область ДНК медцу МОТ112 и FD1 - наиболее вероятный район локализации локуса FRDA. Анализ обнарумэн-

лок.уо ¿„■' ¡¡ил1* HODM. ( частота) Л. Apôi Ц; if.'Y-I'Tct О С ü M ù! ;-:-во хр-м

; G. i 23 . л и. t ¡5?

2 0. азз С. 278

МОТ 112 о 0. 00 п Iii 18

4 0. 0. 111

о Û. 276 ГУ •333

с 0. Г 35 0. 00

1 П. 392 0. Í-1C-- о »Ct.'o

CAI г» is 0. 176 г> 100 20

Г}, 3S2 с .150

•ж с. 0-40 0.

- с. 015 г* 00

2 0. 00

СА2 3 и. 712 0. 18

4 Г-S 7 0. ill

С 0. i So 0.

1 0. 020 0. 00

САЗ Л» а. Ü. 2С'0 п. 300 20

3 0. 260 0. 100

ч 0. 4-'<Û п is 10

Таблица 2. Часто?!.! аллелей локуоос М0Т112 (КО, CAÍ, CAZ и саз ь поврежденных (FK0A) и "¡юрг.ал.нкьс;" хрсмоосмах ь популяции Росеик.

аллель •Франция TJcu JHI'I.-Í

M ! FRDA M ! PODA M FKÜA M FßCA

0 о 4 ir G 0 0'1 ! 0 ПО 0. 042i Ó. 025 0. "С! 0, 590 0,0701 0.013 0. ICO! 0. 205 0.338! 0.123 0.00 ! 0.033 n. 01 ! 0. 00 0. 07 ! 0. 00 0.23 ; 0.54 0. 12 i 0. 09 0. 33 ! 0.23 0. 27 : 0.21 0.03 ! 0.05 0. СО 0. 023 0. £80 С. COS U. ¿¿ж 0. 333 0. 044 n 0. no 0. 009 •1 00 0. '//• C. 196 0. 0ü7 0 QO O! 123 0. 0?-< 0. 00 0. 1 20 0. 276 С. 035 0. 00 0. 157 0. 273 0. ni 0. ill 0. 333 0. 00

Таблица 3. Частотм аллелей м'кросйт^лл'итясго повтора МЗ и» МСТ112 а ¿¡ояулящ'.ях <Тр:а1т;|.ки. Англии, Испании к ?осс'ии в поврежденных ÍFRüA; и "ноумалькых" хромосомах.

ных рекомбинационных событий еще более сузил эту область до интервала от G32 до FD1 (наиболее вероятно от GS2 до 26Р). Полиморфные CA - повторы, изученные наш«й группой, расположены именно в этой области, и в связи с этим особенно привлекательны для тонкого генетического картирования FRDA с помощью исследования неравновесия по сцеплению этих локусов с FRDA. Б табл. 2 приведены результаты на выборке пациентов, для которых надежно подтвержден диагноз А. Ф.

На исследованном материале не удалось обнаружить неравновесия по сцеплению ни одного из анализируемых локусов с FRDA в российской популяции. Расширение выборки может выявить такое неравновесие, но сильное неравновесие по сцеплению практически исключено.

Анализ полученных гаплотипов также не позволил обнаружить какого-либо специфического гаплотипа, сцепленного с геном FRDA, хотя количество проанализированных гаплотипов, сцепленных с мутацией в гене FRDA, недостаточно для того, чтобы утверждать отсутствие неравновесия по сцеплению.-

В табл. 3 приведены частоты аллелей микросателлита MS из ШТ112 для "нормальных" и FRDA-хромосом, полученные в 4 различных странах - Испании (Monros et al. , 1992b), России, Франции (Fujita et al., 1990), Англии (Wallis et al. , 1990).

По уже имеющимся данным можно полагать, что российская популяция, так же как и английская, не имеет ярко выраженного эффекта основателя.

Обнаруженные и описанные нами повторы могут быть использованы для анализа неравновесия по сцеплению в популяциях, в которых ogrjfc-KT основателя уж; установлен. Особенно эффективным может быть использование данных повторов для анализа гаплотипов.

Найденные нами микросателлитные повторы СА2 и САЗ могут эффективно использоваться для картирования рекомбинаций, обнару-.- ле иных "нашими коллегами.

I

V. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК зонда 26Р.

В настоящее время вся область возможной локализации гена FRDA клонирована в YAC, и в этой области обнаружено 5 CpG-ост-роы-хв (Fujita et al., 1992), которые часто предшествуют генам. Один из-.таких островков расположен в непосредственной близости

от маркера 26Р, и, на наш взгляд, является наиболее реальным претендентом на соседство с геном РРОА. Поэтому мы решили определить нуклеотидную последоаателыость ДНК зонда 26Р, примыкающего к 60-богатой области.

Схема клонирования участкоа ДНК для секвенирования показана на рисунке 4. ■

'Нуклестидную последовательность участков ДНК клонированных фрагментов, прилежащих к областям отжига универсальных прямого и обратного праймеров в Bluescript 5К+, определяли согласно стандартного протокола секвенирования ДНК методом Сенгера.

Затем провели субклон ирование Фрагментов ДНК ВатН1 - ХЬа1 длиной 700 и 500 н.п. в векторе В1иезсг1р1 БК+ и определили нук-леотидную последовательность участков ДНК, прилежащих к сайту узнавания ХЬа1, в результате чего восстановили последовательность всего фрагмента 8апН1 - ВатН1 длиной 1,2 т. н.п.

Для определения полной последовательности фрагмента ВатН1-РзИ длиной 1,5 т. н. п. при помощи обработки экзонуклеазой Ехо1П получили набор клонов, содержащих направленные дедеции различной протяженности со стороны универсального праймера.

Необходимо отметить, что в результате направленного делети-•рования были получены две группы клонов' по протяженности деле-ции. Часть клонов слабо отличалась от исходного (делеции ь пределах 50 н. п.), другие клоны имели вставку до 500 н.п. (делеции протяженностью свыше 1 т.н.п.). По-видимому, это вызвано неравномерностью гидролиза ДНК различного АТ/СзС-состава экзонуклеазой ЕхоШ.

Секвенирование ДНК первой группы клонов с использованием .универсального праймера позволило получить последовательность фрагмента ДНК длиной 300 н. п., (секвенирование .сильно затруднено высоким содержанием О-С пар в последовательности), прилежащего к • 'Рей-концу ВапШ-Рэи фрагмента длиной 1,5 т.н.п. ДНК зонда 26Р.'

Секвенирование второй группы клонов с использованием универсального праймера позволило реконструировать ну^еотидную последовательность общей длиной 500 н. п., прилежащую к ВалтН! - концу фрагмента ДНК длиной 1,5 т.н.п.

Для того, чтобы определись'полную нуклеотидную последовательность фрагмента ВатН1 - Рзи длиной 1,5 т.н.п., дополнительно синтезировали два олигонуклеогидных праймера: . .

26 Р: ТОвАОЗССбССбТАЗ и Бед 26 К ОСТТСТСТССТ/ШХЗ (области

Р»иП /

ЗатШ __ ХЬа!

' 0.7 '-/'

¿а _,ВатН1

БатН! 14(1 И.рг, И.рг.

ЬатШ Ра II

К. .ргу—■

N рестрикция

ВлтШ РзИ

й рг ! В8К*4-0.7 )

У

Рис. -4. "Схема субклоиирования фрагментов ДНК зонда £6Р в В1аегсг1р1 БК+ для секвенирсвания.

•¿CAGCCCa GGGCTGTCGG GGCGACCCCC ОЗСО&Шк GG3GGACGCT (ЯАЁВГССТЗ 60

•CGGCnTCA GGCATGTCCT nGGGTGCCTT STCGA330TC TSC'GAGCTCA 7GGTC7GC7T 120

iCCTCGSGC ACTATCTGST CGATG7CCTC C7CCTGGTCG TAGCTGT-CA 7GCGCGG37A 180

îGCGCGAAC ÏCGGCCTCG7 TCTCGGGGCT GTCG3ACTCG CCGTCSGAGO 30TCGTC37A 240

'GGTGCAGC CGCGCGXCA GSGCGTCCTG GCGG7ACG03 GCCGCCTCGT CGCGCÏCC7G 300

'CGTAGA30 CGCAG3CCGT CGCGTGCS7C CASC'ICGGGC GC3TCCCCTA TCTCCTC3TA 350

or1mor SeqCGF

iCGTGCTCC! TGGAGÛCCGC CG7AG7CGGC ATA3CGCTCG GAG7AGGGC7 CoTCCTCACC 420

'GGTGGAAG AGCGGGTGCG TGTASAfGTA GCCTGAGTAG GCCSCAÍTCA TG3C77CC7C 430

'GOT CO AGO GAG7GGAAG7 GCAGGTGG7T G3GCAG0G03 CGGCGGTGCG TCGCCTCGGC 540

•0JTCGGCC TCTGGCTGCT CCG7GÏACTC CTGGCOCTCG GCGTACTGCA CAGOAIAGGO 600

'707CGTGG rr.GGGTCCTG ШСШТСТСС GCA7CGTAGC GGTCGC'GGGC GGOGC'GATCA 65G

¡TCGOCCTC GGCGGT3TCG GTG'i'GGTTGT GGAAGCC3GT CÎCCGTGCTG GCTGAGCGCG 720

AGGCATTG CC:GGGC7CCT CTÎCCTCCTG GCCGAGCTGG GCGCGGAGGT CCTCGAGGGO ?80

OXCGCGC TGGTGGCGGC CCAGAT 4G7G C7GCT3C7GC GGCGGCTGC7 GCTGT7CCTC 840

CCACC7CG GGGTGCTGOA GGTC3GCCTC CAC0GAC7CG TTCACCTCCO CAOCTGCCGC Ö00

GGT0GG7C ACCTCCACCT CCGCAGACOC CTCCAAGAGG 7TCATGGTGG GAGTOGGAAC S60 Tinier SeqSnR

CTAGGAGA GAAGCTGSGC CCGGCTCA07 GCGOTCTCAT TTTGCTCCAC TGC5GCTGAAA 1030

AGAAGAAG GGGAGAGGCT GTCACG7GG7 GCAAAGAGTC GTTATGAGCT GAG7A7TCAG ÍCSO ¡

AACCATAA AAACAAGÍGC TATTGA77CC TTTTAaTTOT GQGTCAATTA AAAAAAGACT 1140 ,

AAA7TTAÄ GTTCAATCTG ÀCAGOACATA CATAGCAGGC АГСАТААТГ7 GTAATTACAT 1200

CTAGÎTGT TTAATT3C77 'ATTGCCT7TC ТССТТГСССА (XCC7CACAC TGAGCCÏXTC 1250 ■

iGAACGTTT TGTTCTCCAC CACGCATAG3 A1TCAGG7CC CATTTCTGAT GCATCTGAAT 1320 Í

4GAGTACT ACTAAATTGA ATGGGCCAAC 7GA0ACA777 TCCA7C7GCT AAGAGATAAA 10ОД '

осл'аГ: i ;

ÏCTCCAAA 7'IAAAC7AGG ATCCTACAAC ТГТАЗЛААТО AC70T7TAAA ГСААТТТСАА 1440

AAACA7AA CTTGAACACC 777TGAAGCC A77CTGAGAS AG50ÎATCAG CCAGCAG7GT 1500

ЭЗТССССССС СОЗТТСТСТС АГТАСТСЗАСТ ТТбТСАССТС АСБСААбТбЗ СТТААТТТТС 1Е

ТОЗАССТССА СОгТеТбАСТ (ЗЗАСТСАТТТ ССТАСАТ6СА бОАТЗТТААС АбСТАТТАТА 16

тасзсатаааа аабастсшзт озтсаабтаа стттбзаааа т<зст(зл6тта сабттсастт 1с

ТТСАТТСТТА АТАТССАйАА ОЗАеаААОАТ ССАбЗАСАСА ОйбТТТСССТ ААСТТСТТТб 17

3 1дпа1

АССАОЗАБАС АСТТТТТССТ АСАИЗССААТ бТТАСАТАСС АаСТОвПТС ТААТАСТТАЙ

БС-Ьох

(эСТТСССТАТ ТОСАСАСТСА вСАТССАввА ТАСААССАСС АОТЗААбАСА АТАТТАССЙА 1?

ААААААТССА АСАСААТАСА АСААТААААА АТААЮСААб ТАААААТАСА СТАТААСААС 15

ТАТА-Ьох сар-з11е

ААТТТАТАТА (ЗСАТТТАТАТ ТЙТАТТАеЗТ АТТАТСАЗАА АТСТАйААЗА 6АТ6АТТТАС 10

АСГГАТАТШЗ АООАТВТбСА ТАБАТСАТАГ бОАААТАОТА ТАССА'ПТГА ТААТЫЗАТТТ 2С

ехоп

ттата'гссас тсооотсстс ааассаассс ссат®затас саашзшза сгататтсас 21

тттоссслте таасстсаат стал\аттсг аасатгттат баоттсссат татасстаза 21

АСТБСАТААС АОЗТЗТААТТ ТТТТААААТА ТббСТАБВТС ТСТТТСТАТТ ТТСАЗАОААА 22

СТТОТАСзСТС САвАЪАААвА ТТТШГТТСА БТСТСТТТСА АТТСТТСТТА ТСАСААААТА 22

ОСТТТАтееТ АТААГСТСТБ С АСТАТ АТАС АААТ АС-АС АС АААВААТСТА ААСААССАСА 23

АСАААСАСОС АСОЗАССССТ дТ5АТТТТед ОАТСССТАТБ СТАДАТАбБС ТСААСАЙТАТ 24

СТБТАААСТТ (ЗСТАТТАТСТ ТСТТТТбаАО АбССТТТСТТ АСАААТББАС АСЛАТСЗАТв 24

ОСААатаЛАС ТСТТАААТАТ ААТААСАБАС ААССССАбОА ЕОАССАББбА САТСТбАТОа 25

АСТСТСТАСТ АвТбАвАТВО АТТАГАТТСТ АСТСААСТСС ССАТСАСААС САСА6СЛАТТ 25

%хоп ----

тссттсаайс аттсатсасс атсссаатаа саааизаоат сагггг«заа сгаосааотс 26

САСАТТСААЗ САбААЗТАТС АТСТСТТССС САТТСТТТЙА ТббАТССАСС ССТСАСТбАТ 27

тстсбстава асааласаат сассштгас аазабатбаа саатстттат тссттсбста 27

СТТЗАСАТАА СТСССАСТТС АТАСАААТТА САСССААССТ СТТТТ6АААА АТТТТббЗСТ 28

ССТСССАТТА АСТССТбАвА АСАССОАСТа ТбСАСТААСТ АТ 28

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность секвенированного фрагмента ДНК зонда 26Р. Показаны предсказанные с помощью компьютерного анализа сигнальные последовательности и участки белок- кодирующей последовательности.

- il -

oTjnira праймеров показаны на рисунке 5).

В конечном итоге реконогг-упрощали непрерьзйум иуклестидную последовательность длиной ;?8бй н. п. , которая лрпт едена на р/еун-ке 5.

Участок ДНК, прглемыаий к ВДI-концу БапШ-FstI ¿рагмеита. содержит ппе.^ксйатёлъкс-сть, характерную для Cue островка.

Полученную куклеотидну» последовательность подвергли анализу при помо-ди компьтоериых программ, в ток числе обработанной в лаборатории. Предсказанные сигнальные пссдедоватедьнооти (ТА7А-боксы, GC-боко и САР-с-айт) и предполагаемые участки бело::--кодирующей последовательности показана на рисунке 5.

Мы провели сравнительный анализ полученной нуклостияьой последовательности с посдедовательносптю гена, обкарух-гансго ъ исследуемой области группой к?; Страсбурга (F. Duole« et al. , ICôà). Полученная нами последовательность участка ДйК длиной 564 н. п. , прилегшего к еейту Fsti, совпала с началом найденного гена за исключением четырех одног'-'клеотидних вален.

Таким образом, впервые определена нукле-отиднал г.оеледсьа-тельноеть участк* ДНК, прилелащого к 5' -области найденного г<*^а. По всей видимости, этот уч-^егоч содержа/ прсмоторную область данного гена п представляет интерес длт д-*«ль!г-?й1»*-го и с этой течки Зр-.-НИЯ.

VI. Ислсльзоза::пе i-A-nanopoa ¿тля ДЖ-диагностики А. ч>.

Атаксия чркдрейха - 'гялгло* наследственное ¡-.аболеванке, и. разработка зф£?к?кнной ДНК-диагностики этого заболевания является актуальной задачей молекулярной медицины. В настоящее время ген, ответственный за возникновение ¡заболевания, неизвестен, огсутсчвуч.т также какие-либо достоверные биохимические маркеры этого заболевания, поэтому до настоящего времени диагноз А. 3. остается клиническим и, следовательно, вездохна лишь косвеняая диагностика.

В данной работе разработаны (.'олекуяярно-генетические процедуры для пресииптоиатического и нреиагзльного ДНК-тестирования А. Ф. в отягощенных семьях с использованием ¡.«кросателлитных повторов, тесно сцепленных с мутацией, вызывающей это заболевание.

Нами проведен мо.чекулярло-гепе-гиц'еский акали? 3 семей с: Л. О. . полос.)!ог."-тые которых и результат н Днк-тестироваяйя показам KS Рис. 6.

семья П.

семья Л.

семья П.

0■ 1

II

МСТ112 Ой 2 СА2 САЗ

5 1

42

II

МСТ112 ОБ 2 САЗ САЗ

- 5 Ц 5 с

4 : 4 '

з 5 д 5 3 А

2 2 а 4 4 с

Рис.6.

Родословные проанализированных семей и ре зрыаты ДНК-тестпрованля

Использование тесно сцепленных с геном FRDA высокополиморф-нкх маркеров í какова',ш являктся СЛ-пон-торь^ по. : боля от поднять рор.мохнссти ранней диагностика FRDA п установления гетерозиготного носительства на качественно новый уровень. Нами представлен первый в Госсии и странах ОНГ опыт такой работы s семьях, отягощенных А. Ф.

Следует отметить, что в семьях 1 и 2 методы 7ÍHK-диагностики лишь подтвердили клинически несомненней факт о?еуаствид заболевания у старших-сестер лроб.чндов,. так как они намного перешли типичный возраст начала болезни. В то ле время у обеих женщин с покоит,« ДНК-диагностики било доказано гетерозиготное носительет-130 гена FRDA. чего не удалось установить другими доступными методами исследования. Особ«'* мчт-»р^с гь&ывак? ре&ультагы молеку-лярчо-генетического исследования . -:-мьь гд* к.чляичгеки здоровая младпкя сестра пробанда, находящаяся в детском возрасте, имела весьма высокий теоретический риск заболевании, близкий к 25%. Результаты ДНК-диагностики позволили с вероятностью 99« исключить такую во&моаносрь (определяется вероятностью ^комбинаций меуду повреждением в гене и используемом;: маркерами).

До настоящего времени ?($фь-к?;шные методы лечения А. Ф. отсутствуют. Б связи с утим ос-обенко важна профилактика этого заболевания, основанная на пренчтальной диагностике гемозигот-кости по гену FRDA. Разработанные методы ДНК-диагностики сог-дают принципиальную возможность проведения пренаталъной диагностики FRDA в отягощенных семьях.

Таким образом, методы ДКК-диагностики FRDA позволяет осуществлять высокодоетоверную диагностику заболевания (в том числе раннюю и пренатальну») и устанавливать факт гетерозиготного носительстеа гена-FRDA.

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружены и картированы четыре микросателлитных повтора в наиболее вероятной области локализации гена, ответственного за возникновение•атаксии Фридрейха. Один из них - повтор CAI - совпал с найденным G. Si rugo (Страсбург, Франция) повтором GS2.

2. Исследован полиморфизм обнаруженных СА-повторов в популяции России. Повтор СА4 не является полиморфным, для повторов CAI, СА2 и САЗ значение PIC составляет 0.59, 0.44 и 0.59 соответственно.

3. Неравновесие по сцеплению между патологическим геном FEDA и аллелями локусов CAI, СА2, САЗ и МСТ112, а также их ган-лотипами в русской популяции не обнаружено.

Микросателлитные повторы СА2 и САЗ наряду с GS2 (CAI) и МСТ112 могут эффективно применяться для гаплотипирования и анализа неравновесия по сцеплению, а также для картирования известных рекомбинаций п ияуякжгм районе 9-й хромосомы в популяциях с эффектом основателя.

4. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК длиной 2862 н. п. в составе зонда 26Р (локус D9S5), находящегося в непосредственной близости от CpG-островка. Секвенированный Фрагмент ДНК содержит GC-богатый участок, нуклеотидная последовательность которого характерна для CpG-островка. Анализ последовательности с помощью компьютерных программ выявил возможное расположение регуляторных участков ДНК и первых экзонов гена.

5. Участок секвенированного фрагмента ДНК зонда 26Р длиной 564 н. п. совпадает с началом гена, найденного в области локализации гена FRDA группой исследователей в Страсбурге. Таким образом, впервые секвенирован участок ДНК, содержащий промоторную область гена-кандидата.

6. Разработаны молекулярно-генетические процедуры ДНК-диагностики А. Ф. В лаборатории проведено 2 пресимптоматических ДНК-тестирования атаксии Фридрейха. I

Список работ, опублхковаянщ по теме диссертации.

L О. В. Евграфов, В. В. Пугачез, JL Б. Стрельченко. "Обнаружение полиморфного маркера в области гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха. " // 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Самарканд. - 1991.- тезисы дом. - С. 68.

2. В. Б. Пугачев, А. В. Поляков, О. В. Евграфов. " Поиск и изучение микросателлитных повторов з области предполагаемой локализации гена FRDA". // 6-ой Сьеэд ВОГИС, Минск, - 1S92. - тезисы докл. - ч. 1 - С. 124.

3. В. В. Пугачев, С. Н. Иллагиошкии, Л. В. Прокутша, Б. Д. Маркова, 0. В. Евграфов, И. А. Ишнова-Омоленская " ДКК-диагностика атаксии Фридрейха с клинико-генетически;-* анализом. " // Сборник "Молекулярная диагностик наследственных заболеваний и медико-генетическое консультирование. "- М - MOlIHKll - 1QS3.

4. о. в. Рвграфов, Б. в. Пугачев, Н. А. Малыгина, Е Ситников, Е. Л. Дадали, К. А. Шагина, О. П. Сидорова, A. Ii Петриа "Пренатальная диагностика спииальных амкотрофий." // Сборник "Молекулярная диагностика наследственных заболевший и медико-генетическое консультирование. " - М. - МОНИКИ. - 1993.

Ti. V, Pugachev, A. Polvakov, 0. Evgrrafov. "Mierosatellites from region of possible legalization of FRDA lccus." // 24 Ann. Nfeeting of Europe ал Soc. Hum. Genet. Abstr. - 1991. - P. 128.

6. V. Pugacnev, A. Polyokov. V. Sitnikov, N. Malygina, E. Dadali, I. Ivanova-Srrolenskaya. "Russian prograins of DNA -diagnosis of spinal muscular atrophies and Friedreich ataxia."// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and child upgrading, Beijing, eds Jieping, Y. Rnying. - 1992.- P. 331.

V. V. Pugachev, A. Polvakov, !.. Prokunina, 0. Evgrafov. "Two dinuoleotide repeat polymorphisms in the Friedreich's ataxia region on chromoscira 9ql3-q21.1." // Mole:. Них Genet., 1993, .submitted.