Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование области генома, ответственного за атаксию Фридрейха, с целью уточнения локализации гена и разработки ДНК-диагностических процедур заболевания

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование области генома, ответственного за атаксию Фридрейха, с целью уточнения локализации гена и разработки ДНК-диагностических процедур заболевания"

РГ8 ОД

а • ? п.'! (: '

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Пугачев Владимир Владимирович

УДК 575.113.2 + 616-056.7

"ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЛАСТИ ГЕНОМА, ОТВЕТСТВЕННОЙ ЗА АТАКСИЮ

ФРИДРЕЙХА, С ЦЕЛЬЮ УТОЧНЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЕНА И РАЗРАБОТКИ ДНК-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕДУР ЗАБОЛЕВАНИЯ"

03.00.15 "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

-г.*

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель: доктор биологических наук , ( О.В.Евграфов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.К. Янковский

кандидат биологических наук Д.В. Залетаев

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН, Москва

Защита диссертации состоится " 199 У г.

часов на заседании Специализированногосовета Д 001.16.01

по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

профессор Л.Ф.КУРИЛО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Наотс-лщГ'Я ряб'.'тм посвящена коолг-дог-акий ойдлс-тн локализации гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха.

Актуальность темы. Обнаружение и исследование Генов, мута- • ции в которых приводят к возникновению наследственных заболеваний человека, позволяет не только понять молекулярно-генетические и биохимические механизмы возникновения этих заболеваний, но и разработать эффективные методики их диагностики (в том числе пренатальной и пресимтомагической), а в перспективе и подойти к проблеме лечения этих заболеваний. Обнаружение новых полиморфных маркеров, сцепленных с патологическим геном, позволяет сделать более эффективной косвенную ДНК-диагностику заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование области локализации гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха. При этом ставились следующие задачи:

- Обнаружить и исследовать новые полиморфные маркеры в области наиболее вероятной локализации гена РЯОА.

- Исследовать наличие неравновесия по сцеплению известных и вновь обнаруженных маркеров с патологическим геном в популяции России.

- Определить нуклеотидную последовательность участка ДНК вблизи Ср(3-островка в области вероятной локализации гена ПлОА и проанализировать ее на наличие возможных кодирующих последовательностей.

- На основании вновь обнаруженных полиморфных маркеров разработать процедуры косвенной ДНК-диагностики атаксии Фридрейха.

Научная новизна. В ходе данной работы обнаружены и исследованы четыре новых микросателлитных повтора. Проведена оценка по-пуляционных частот аллелей обнарул- иных микросателлитных повторов и повторов из локуса 09515 для популяции России.

Впервые определена луклеотидная последовательность участков ДНК, содержащих пять микросателлитных повторов, а также фрагмента ДНК зонда 26Р, прилежащего к Срб-островку и содержащего про-моторнуп область одного из известных генов-кандидатов.

Практическая ценность работы. Данные, полученные в ходе работы, позволяют проводить эффективную косвенную ДНК-диагностику атаксии Фридрейха.

- 4 -

Положения, выдвигаемые на завит у •

1. С^нарууг-ни и секвенированы 4 шкросателлитных повтора в области вероятной локализации гена FRDA.

2. Определены частоты .аллелей двух известных и двух новых CA-повторов в популяции России.

3. Разработаны процедуры ДНК-диагиоетики, основанные на нерадиоактивном определении аллелей СА-повторов.

4. Определона непрерывная нуклеотиднаа последовательность участка ДНК длиной 28G2 н. п. , содержащего 5'-область одного из геноь-кандидатоь.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 2-ом Воесоклном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1SS1) и на VI-ом Съезде ВОГиС (Шнек,

Г:/Ъгл\-г:лу/'л. По материалам диссертации опубликовано 7 ¡тс'-^т-кьк ра'от.

ОСъе^ и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученные результатов и их обсуждения, заключения, вкт.одов и списка лкас-^атуру. Работа изложена иа 08 страницах машинописного текста, содержат 7 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает SO работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для полумиля ДНК использовали веноеную кровь ппдиентоа и членов их семей. Работа была выполнена на сбразцах ДЕК людей, являрт,.у.ся аедимхтами кейрагенетичеекого отделения НИИ' ЛеБрСЛО-ГИИ РАЖ

ДКК и? крови выделяли методом, предложенном Липдблсмом и >1-дм.:.ун;юм (LirviMoro and Holmluno, 1980). Выход ДНК составлял 25 - 50 мкг на 1 мл крови.

Геномные зонды МСТП2 и 26Р были любовно предоставлены доктором ijr-KMS'OM,

ffiramv Е. col 1 TGI f F. coli J№3 получены ну муаея ВШ Гене-ччг** < г. J(r.f>"f . Л PS Mowrm-r-vm и'лю.пь.чогкчли офяги M13

¡»vlo a MLй t<v,i'j щльааод/гйн фирмы 'T&ehr inv.'yr'' и клавмидный вектор EUi^scr-ipt. ЗК1- производства фирмы "Stralagene".

При проведзниии блот-гибридизации для переноса фрагментов ДНК иа суарозного гелл на фильтр К/bond N использовали метод ва-

куумного Слоттинга.

Для мочения (СА)п зогдов использовали меченный по 3£ Р ciCTP производства "Amershain" или НГЮ, г. Таикект. Мечение зонда проводили стандартным Методом ник-трансляции.

Элюцию фрагментов ДНК и клонирование их ?. бактериофагах и плазмидном векторе проводили по стандартным методикам (Маниатио Т. и др. , 1984).

Приготовление компетентных клеток, трансформацию и отбор рокомбинаптных полоний проводили по методикам, описанным в (Маниатио Т. и др. , 1984).

. ДНК рекомбинантных ллазмид и бактериофагов ьщеляли в соот-вествии с (Маниатио Т. и др., 1984, Birnboim Н. С. ,

Полиморасьуги цепную реакцию »¡доводили при помощи программируемого термоциклера РНС-2 фирмы Techne с использованием термофильной ДНК-полимэразы Thymus thermophilics производства СП "Медтех", г. Москва. ПОР проводили по стандартной схсме (Erlich H.A. ot al. , 1991) при подобранных специально для каждой пары праймеров параметрах реакции. Результаты амплификации оценивали в б - 12 % ПААГ. При ПЦР с включением в ДНК радиоактивной метки, концентрация меченного праймера была в 7 раз меньше, чем немеченного, а количество циклов увеличивали в 1,5 раза. Результаты оценивали г. тонком денатурирующем ПААГ с последующей радиоавтографией (Sarig-er F. et al. , 1977).

Мече кие олигонуклеотида "Т?Р по 5'- концу проводили при помощи Т4 - Полинуклеотидкиназы производства НПО "Ферментао".

Секвенирование участков ДНК, клонированных в бактериофагах и плазмидном векторе, проводили по методу <>кгера ( Sancv-r F. et

•3). .О ООС'ТР^ТОТПуН'П'НМ') (!РДМ(1,ИГ.".Г!И''МИ.

Получение направленных делений ДНК проводили с использованием нуклеаз Exo III и SI проиьводства НПО "Фгрментас" в соответствии с (Smith А., 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Клиь'нко-ген-этичеекий подбор пациентов.

В настоящее время ген, покрелдсьин в котором выбывают А. Ф. , не найден и отсутствуют прямее генетические метиды диагностик! заболевания. Необходимым материалом для молекулярно-генетических исследований района предполагаемой локализации гена является ДНК больных А. Ф. и членов их семей, причем необходима максимально возможная точность поставленного диагноза А. Ф.

- - б -

Проблема диагностики А. <1>. в настоящее время рожается путем разработки единой равверкутой системы крптеркеь, с помощью которой каждый больно" с первичным дилгиогом А.Ф. подвергается дательному тестированию, в результате чего определяется степень ссотьэтстьия его диагноза А. Ф.

Сотрудниками карего института совместно с НИИ Иььрологии РАМН на основе сарубе*;н1.х данных и накопленного в напей стране опыта описания больных А. Ф. раьработан Еа].>иант карты обследования больных А. Ф., пог велящей оценивать степень соответствия симптомов больных классическим критериям для А. Ф. vi таким обра--гом оае-нкь&ть достоверность диагноза А. Ф. у пациентов.

Больных А. Ф. обследовали в НИИ Неврологии в соответствии с разработанной картой. Е ре&ультате было отобрано 10 больных, ди-ы-ноа которых полностью соответствовал критериям карты обследования больного А. I'. , их семьи кспользовались в дальнейшем в ге-кетичгских исследованиях.

II. Пои?к Küpr.'íPocaHite СА-позторог, ь районе гена, ответственного за ъозкккнотл-нпй атаками йридр^йха.

Пер?ь;м этапом при использовании наиболее распространенных подходов к тонгюму генетическому картированию является поиск по-ллиорФ:'^. мэокерсв, которые должны удовлетворять следующим условиям:

Г» он;; долян»: располагаться внутри минимального определенного района предполагаемой локальоации патологического гена, Z": эти ыаркеры должны быть лысокополимсрфными, •i) эти полжорфпые маркеры ло должны обнаруживать значительного иерачноз*еия' по оцеплению друг с другом, иначе они фактически. нч.- дохт дополнительной иифг-рмации для генетического анализа.

• Ланг.ые по нераьновесию по сцеллепим гена с МСГИ,-? к S5P позсс'лили пге-дгюлокигь, что ген расположен в непосредственной близости от зтих тркероз, а анализ oOnai.уженных р-'-комОинацион-соб^ггий позьолил «сличить маркер МСТИЙ и» области зозмож-ного расположения гена и ¡цмдположь, что 26Р та;ж находится вне атой области. Таки;.! обраьом, наиболее вероятно расположение г"на, ответственного возникновение А. Ф., в районе между мар-керамп .kCTjlíí и 26Р. Первым атааом работы был поиск полиморфных маркеров г, укцр.ниной области. Р ^пчеотв^ иаиболео удобного типа

полиморфных маркеров были выбраны С.А-повторы.

Доктор Кенкг любезно предоставил нам дгок-;екке клоны YAC 4 и YAC 5, содержащие данную область, н космидную клонотеку геномной встапки клона YAC 4. насчитывающую SS кленов.

В качество зонда для гибридизации использовали синтетический двуточечный СА-гювтор со средней длиной 12 т.н.л. , радиоактивно меченный методом ник-трансляции.

Первоначально методом дот-гибридизации был проведен отбор космидных клонов, содержащих хотя бы один СА-повтор. При этом кссмидная ДНК была гидролизована рестриктазой Bam HI и. нанесена на фильтр е количестве 0.5 мкг. В качестве положительного контроля использовали ДНК зонда МСТ112, внутри которого имеется СА-поетор (Fujita et al. , 1990). В результате двукратно проведенной гибридизации было отобрано 8 космидных клонов, содержащих ОА-посторы: 18, 23, 29, 52, 121, 124 и 127 (Рис. 1).

Клон 29 ь дальнейшем не анализировали, поскольку он содержал вставку ДНК, не принадлежащую девятой хромосоме человека. Далее проводили идентификацию обнаруженных микросателлитных лов-

радиоактивно меченным синтетическим СА-повтсром. Номера анализируемых клонов представлены в правой части рисунка.

дизация ДНК семи из ранее выбранных клонов с синтетическим СА-повтором. ДНК космидных клонов была гидролизована рестрпкта-

sort Taq I. На этом .этапе длй дальнейшего исследования оыло отобрано Г.ять клокой (23, 4.Г-, 52, 121, 124), ь ДНК которих имелись фрагменты различной дли.-;:«;, еодерши^е OA-повторы. Дал окончательной иг.енти$якуцйи обкаруяекнкх микросагеллитыых повторен была проведена еце одна блэт-гибридизац/я с синтет.ччеек/м СА-лоь-торои. Г^ред ироьчд^ниек гибридизации ДНК пяти клемидных клонов была обработана рестржтазами Hir.d ¡11, Hind III + Taq I, Taq I. Было обнаружено 4 4рагмен?а ДИК, содержащих СА-повторы, в каздой группе рестрикции (Рис. 2).

ной, гадродигопанаой рестриктазгмк Hindill к Ta.il, с меченным керадисактивно ОА-повтором. В каадой группе рост-

лрисутсгву;./? 4 фрагмента ДНК различной дл^.ны, содержание СА-повтори.

Анализ этих Фрагментов позволил идентифицировать 4 р-аэличных СА-г.свторп y. построить карту их взаи:<чого расположяия Д-алкые повторы были пас-чаны намл СА1, CAO, САЪ и 0А4. результате ДГИ'СДНЭТаЛЬНОЙ - Г ИЗрОКйЦИИ ЛГкС KJÎOHOB 4т, 121, '124, гидроли&ованной Eco Ri, Снли выиекеыг размеры EcoRl фрагментов, содержащих обнарулэнь'ые повторы. От французских коллег нами была получена карта космидиоА библиотеки по рестриктазе Eco RI, которая совпадала с ранее Сиотазлсккой картой сцепления клоков, со-дерледих СА-повторы.

Te'TiMобоазем, натронные T-V повторы удовлетворяют перьому

поставленному условию, а именно расположены внутри заданной области ДНК.

Фрагменты ДНК, содержащие все обнаруженные нами CA-повторы, были клонированы в бактериофаге М13 для определения нуклеотидной последовательности. При этом Eco RI - Eco RI фрагмент ДНК длиной 650 н.п., содержащий повтор СА4, был элюирован из Q. 8Z ЛПА геля, на дорожки которого была нанесена ДНК космидного клона 121, обработанная рестриктазой Eco RI. Аналогично был элюирован Hind III - Hind III фрагмент ДНК длиной 1.9 т. н. п., содержащей повтор САЗ и Hind III - Taq I фрагмент ДНК длиной 0.95 т. п. н., содержащий повтор СА2. Для элюции использовали ДНК клона 124, гидролизованную соответствующими ферментами рестрикции.

Выделение фрагмента ДНК, содержащего повтор CAI, проводили в два этапа. Первоначально из геля, на который была нанесена обработанная Taq I ДНК клона 52, был элюирован фрагмент длиной 5.1 т. н.п., содержащий данный повтор. Затем был идентифицирован и элюирован из геля Sau3Al-Sau3AI фрагмент ДНК длиной 250 н.п., содержащий СА-повтор. Элюированные фрагменты ДНК клонировали в фаге М13тр18. Фрагмент длиной 950 н. п. был дополнительно клонирован в фаге Ml3mpl9 для получении другой ориентации фрагмента относительно универсального праймера. При помощи рестрикционного анализа отобрали рекомбинантние клоны, содержащие требуемые фрагменты, в том числе фрагменты длиной 650 н.п. , 950 н.п. и 1,9 т. н.п. в обеих ориентациях относительно универсального праймера.

По методу Сенгера определили нуклеотидную последовательность клонированных фрагментов, содержащих повторы CAI, СА2, СА4 и части клонированного фрагмента, содержащего повтор САЗ.

Нуклеотидная последовательность ДНК ибллзи повтора CAI содержит праймеры, . выбранные Г. Сируджо (группа доктора Кенига, Страсбург) для найденного и описанного им независимо от нас повтора GS2 (G. Sirugo et al. , 1992). Повторы СА2, САЗ и СА4 ранее-описаны не были.

III. Исследование полиморфизма обнаруженных микросателлит-ных повторов.

Вторым требованием, предъявляемым к маркерам для возможности использования их в тонком генетическом картировании, является высокая степень полиморфности. Для исследования полиморфизма СА-повторов по числу повторений звена CA использовали ампли-

фикада» участка ДНИ, содернашего повтор и различающегося по длине для различных аллелей.

Ключевым элементом отработки методики амплификацж определенного Фрагмента льлнетея выбор оптимальных драйверов, для которых затем подбираются оптимальные условия реакции.

Маркер Праймеры Длина Фрагм. п. к. Условия амплификации

CMg] i °C _ ___„ ' _ _ сек.

CAI 5'GATCTTTAACCCTTCTGÏCAGACAAG 5*CATCCCGAATGCTGATAÏTGTGCAAG 193 ! 94 2. 5пМ Í 55 I 72 1 45 45 60

СА? ' Б'TGCAATGCTCACTGAAGAAAGAAGTC 5'Т ААС AIGGAG AT Т Т GCCACAGT СТ АС 105 --- — j--- — ! 94 Z. ñmM ! 55 S 72 ______i____ 45 45 60

САЗ 5' AOTCTGTTATAGC'AAOACTGAATGGAC Я'СТТПАСТСТСТТбТТТАТОЛТО :сттс 118 1 : 94 2. 5mM ! 55 i 72 45 45 60

СА4 5' ССЛАТТССТТСАГзСТАААТСААССАЗ 5'CACCAGAGAAACAGAACCAACAG3 152 ! 94 1. 5iM ¡ 55 ! 72 — « _ ' _ ___ 45 45 60

Ш S'TCTCCCTCAGGTCTATTGAAGAAG ■5 ' Т GGAG3TC7 AATGGT AGAACATGG 205 ! 94 2 uM ! 55 ! 72 f i 45 4b 60

Табл. 1. Праймеры и условия амплификации фрагментов ДНК, соде ркадих иикрссателлитные повторы CAI, CA2, О A3, CA4 и МЗ из ЮТИ 2.

Особое внимание нами уделялось подбору температуры плавления праймероз. Мы разработали компьютерную программу, обобщавшую литературные данные и наши наблюдения, позволяющую. с достаточной

- il -

7C'!î:oo?f-.x> бы->к?лять тж-рслуру ряшя/ная on.::г'ону^лхсor ия-~в с? длиной !:'D - il О 8B<íH*«*i¡ ¡¡с ослопе их дл'.ны у. AT "ОС состава.

íídh лсмоаи этой лрогракмн для всех четырех найденных OA-noüTor.oj с'чли выбрани пары праймов. ^здкируидах область повтора. Так как рекомендуемое R. Fuji ta примерь? для амплификации С А-повтора г.нутри МОТП? не поврол:гь:/г "рсзодпть неразноак-тпкпую ре/'ис-грации аллелей мч'огс ш сек^ннропали

участок ДНК зскда МСТ112 и шОрали ноьке праЛ-еры для лмядЯика-цли данного лэдкроснтеллпта. иснолььсв&нн" юторих по?долило надежно ьдантмйицароъ^гь аллели этого лог гора как с использованием радиоактивного меченкя, так и без него.

Рукоьодеть.ясь разработанной в шдаой лаборатории стратегией, мы подобрали условия проведения ТИР гесх иоаользусных пар прайм-ров, при "гок пкход амплифи'дировакн-гго фрагмента ДНК составлял, ;<ак правило, больше одного микрегрсчмма.

При г^нтг "м;»;и fv«íf»HKv р *тт.-.f^i> микрооателлитногс лсятора, обм-íiio ^жм^хоим-д по ^инг. h-i 2 нуклеетида, в геле чаг/ч.- иаЗ-.wturrcsi дмюдшнчядьныг пило./ы сходной 1!нтен,.'!ьн0':т:!, что значительно экгрудол*? пч;-.:;;.:4 гг-ноти::оэ. В ^астисста, такое разнсоб-раоле полос характерно для регистрации алл-мей практически всех искользуемч'х ы<*ми м^кросателлитичх поморов при применяя."« методик с г.кл^'^'лкем p.-uu;oî!K.Tm-Horo ¡r.crcna.

Лаотоку особо« вЯ/шачь.- иг ля ли разработке .\>:голк.< нс-ра-диои'гт.яого си Р'-'л-- Ji«-fííts аил г лей кикроеателж гьых r.'U-торо». В настлпнее время этот голх:д недостаточно зирокс распространен ио-sa олошост'-'й с подбором уолсоиЛ амллндикацки. Крем--, того, суг^ствуюг ограничения на деление блиакор&ополояеьммх аллелей (для микросатоллитсв С-А они различается на 2 нуклестида) г. неде-натурирухлкм поллакрилаындиом геле. Проведенное на»«« эксперименты показалл, что'определянке аллелей не ль;з.чвает слоляоо сьй при глине р.-г^'у-ляемчу гёРягквчтос ТНК более : ВО и. п. к гиткмя.гьнл лрл длила/ фрагмептоь ь ¡¡рек лах ICO - 13(i н. г..

Так как при использовании зиОранных коми длл повторов 'JAI и MS из Í.ÍC71 i2 праймеров длины амилифициру»; мых Фрагментов ЛЕК составляли еоответстг.?нно около 100 и 29с. н. п.. то перед электрофорезом анялифдцироБаинке Фрагменты ЛКК подвергав»' с£работ*е рестриктаза.чи HooRV и соответственно. Рестряктазы Сыли выбраны исходя у.ъ ан&лига рестриктиой карты нуккогцччой последовательности ашлифицмруемых фрагменте*!.; iiHK. В результат* длины

рээдел^екч* электрофорезом фрагментов ДНК. содержащих СА-повтори CAÍ и из МСТИ2, были соответственно уменьшены до 110 и 105 И-П.

Рис. За. Результат амплификации фрагмента ДКК, содержащего мжросателлит кБ из МСТ112, с использованием 5'-меченного праймег>а. Электрофорез проводили в тонком денатурирущем ПААГ.

Рис. 36. Результат амплификации фрагмента ДНК, содержащего «икросателлиг CAI с последующей обработкой рестриктазой EcoRV. "Электрофорез проводили в 8Z ПААГ.

В данной работе наш бьиш получены удовлетворительны? результаты для перечисленных выше прайме ров при использовании обо-

их методов регистрации аллелей микросателлитных повторов: как с использованием радиоактивного печения, так и без него (Рис. 3).

При этом преимущества нерадиоактивного определения .аллелей существенны. Таким образом часто удается избавиться от большого количества дополнительных полос, наблюдаемых при использовании радиоактивного мечения. Кроме того, методически нерадиоактнвная регистрация значительно проще, дешевле и быстрее. Наконец, как свидетельствует наш опыт, часто гетерозиготность можно подтвердить наличием гетеродуплексов, и, кроме того, поскольку различные гетеродуплексы имеют различную подвижность, зто значительно облегчает прокед^ние ДНК-диагностики.

Мы исследовали полиморфизм найденных нами новых микроеател-литных повторов (СА2, САЗ и СА4). Повтор СА4 не обнаружил полиморфизма при исследовании 26 неродственных хромосом, и, следовательно, непригоден для генетического картирования и ДНК-диагностики.

Обнаруженные повторы СА2 и САЗ оказались полиморфными. Были определены частоты аллелей двух известных (МСТ 112 и 6S2 - CAD и двух новых микросателлитннх повторов (СА2 и САЗ) в популяции России. Для этого было исследовано около 50 независимых "нормальных" хромосом .шд*><», ЛНК которых имелась в лаборатории. Для определения длины амшгифицируемых фрагментов ДНК, соответствующих различным аллелям, амплифицировали с включением радиоактивной метки соответствующий участок ДНК, клонированный в бактериофаге М13 (его длина определена непосредственно секвенирозаякем) и наносили на высокоразрепающий денатурирующий. ПААГ рядом с

ИССЛ^ДуеМЫй! i OC'p.-i3ucuVbí.

На основании частот аллелей исследуемых СА-повторов определено значение PIC для них в популяции России. Для MS из МСТ112 получено значение PIC 0.70 (в других популяциях до 0.79). Для CAI значение PIC составляет 0.59, для впервые обнаруженных СА2 и САЗ - 0. 44 и 0. 59 соответственно.

Для анализа возможного неравновесия по оцеплению найденных полиморфных маркеров между собой, а тагске с МОИ 12, были проанализированы гаплотипы, сцепленные с неповрежденными хромосомами. Для этого были определены аллели поетооов СА2, САЗ, CAI (GS2) и МСТИ2 для родителей и детей в семьях, не отягощенных Л. Ф. Кроме того, такие гаплотипы, сцепленные с неповрежденным геном, были получены при анализе аллелей у гетерозиготных носителей, дети

которых больны А. Ф. Всего было получено 20 полных (по всем четырем ¡-¡аркерам) ггплотичо?, не сцепленных с кут&данш, еьпые.-.«г;<;/и

liecM'.-rcíi на небольшие количество проанализированных гапло-тиясв, наличие значительного неравновесия по сцеплен?:» между лю-6bjffi двумя иь обнаруженных СА-повторов ьевду собой и любым из к;:х с МСТ112 .можно исключать. Таким образом, найденные нами маркеры осствстствуг/г еа;е одному необходимому требования, предъявляемому к полиморфны).: маркерам длл их использования при тонком гок"?тиибгско>* картировании интересующей нас области.

Гак как значительного неравновесия по сцеплении меэду аллелями /споль^.уомал лолусов Не наблюдается, то, следовательно, эти поли.'/орС'Ние локусы ;.-.огут быть з&Е^к-гИВНо использованы для анализа неравновесия по сцеплению о локуеом FR'jA.

ví-j провел:: сравнительный анализ частот аллелей микропател-литов УСТ i. 12 и CAÍ длл популяций России и трех других

сран, для которых имелись такие данные, - Ксг^нии (Monroз et al., «рачцки (Fujita er, ai., 1390}, Англии (V/allis et

al. , ' WO;.

Приведенное на;/и сравнение частот- обнаружило сходство распределения частот аллелей в "нормальных" хромосомах в различных популяциях. Но полученным на настоящее время данным наиболее близкой к популяции России по критерию сходства распределений частот »икле-л-.-й мил.лоагеллнта КС ив k'UTii2 льлкс-тся популяция ^-•ан!x"i;i, >е.тем Англии, и наименее близкой - популяция Испании (с преобладанием выходцев из иго-восточных областей).

IV. Чсследсьакие неравновесия по сцеплению меаду патологическим геном FRüA и азлгляш! CAI-, САЗ, САЗ и МСТИ" в популяции России.

Б исследованиях французской и испанской групп было зарегистрировано неравновесие по сцепления между FRDA и полиморфными локусами МСТИ2', £6Р и FD1 ь ряде популяций (Fujita et ai., IGéO, Monro:- et al., 1992a, Sirugo et al. , 1992.), но не было зарегистрировано в английской популяции (Wallis et al. , 1990).

3S4 расположенный примерно в 80 т. н. п. от МСТИ", по-видимому, -значительно слабее сцеплен с FRCA, чем МСГП2 (Sirugo et al., 19G2). Таким образом, область )[FK между МСТИ 2 и FP1 - наиболее вероятны/, район локализации локуса FRDA. Анализ обнаружь-

локуо

ШТ 1П

алло-ль

::орм. (частота)

0.123 С. 38? 0. 00. 0.123 0. £76 0. 085

А. С-. хромосомы

час-гота

\*>. 16'Г 0. 278 О. 111 0. til 0. 333 0. 00

к-?.с- хр-м

18

CAI

0. 392 0.175 0. 392 С. 040

0. 250 0.100 О J50

п. reo

CA2

0. 01Э 0. 077 0. 712 0. 057 0. 135

Q0

с! оо

0. 667 0.111

18

:аз

0. оно о. зео 0. 260 0. 440

О. 00 0. 300 0. 100 0. 600

Таблица 2. Часто ш лл.се.кеЛ локусов UCT112 (MS), САг, CAL' и ПАЗ в поврежденных (FKPA) и "нормальных" хромосомах в популяции России.

аллель

г-ранцил

\í

FRDA

англия

FF2ÜA

Испания

М

РкОЛ

Россия

7RDA !•■

0

1 9

3 •1

-т.

5 о

0. 00 О ОЛ* ó; 379 0.070 0. 169 Р 333

б! оо'"'

0. 00 п o°r, 0. 590 0.013 0.1-205 0.126 0. 038

0. СМ

0. 2R л ¡P

о! 20

0. 27 0. 03

п ол 0. 09 0. 34 О i_lt! (}. 23 0. 21 0. 06

0. ОС. 0. 022 0. 289 О. 022 0. 289 Г333 0. 044

0. 00 0. Ос; 0. 609 0. ОП О 1пс 0. 196 0. 067

0. 00 0. i 28 0. 383 О. ОС 0. 123 0. 276 0. 035

0.00 !'. 0. 1671. 0. 278! 0. 111,' 0. lili 0. 333! • 0.00 !

О

Таблица 3. Частоты аллелей микросателлигногс. повтора ЬБ'из MCT112 в популяциях Франции, Англии, Испанки к России в поврежденных (FRDA; и "ноомальных" хроусссмах.

ных рс-комбинационных событий еще более сузил эту область до интервала от GS2 до FD1 (наиболее вероятно от GS2 до 26Р). Полиморфные CA - повторы, изученные нашей группой, расположены именно в зтой области, и в связи с этим особенно привлекательны для тонкого генетического картирования FRDA с помощью исследования неразновескя по сцеплению этих локусов с FRDA. В табл. 2 приведены результаты на выборке пациентов, для которых надежно подтвержден диагноз А. Ф.

На исследованном материале не удалось обнаружить неравновесия по сцеплению ни одного из анализируемых локусов с FRDA в российской популяции. Расширение выборки может выявить такое неравновесие, но сильное неразновесие по сцеплению практически исключено.

Анализ полученных гаплотипов также не позволил обнаружить какого-либо специфического гаплотипа, сцепленного с геном FRDA, хотя количество проанализированных гаплотипов, сцепленных с мутацией в гене FRDA, недостаточно для того, чтобы утверждать отсутствие 'неравновесия по сцеплению.-

В табл. 3 приведены частоты аллелей микросателлита МЗ из МСТ112 для "нормальных" и FRDA-хромосом, полученные в 4 различных странах - Испании (Monros et al., 1992b), России, Франции (Fujita et al., 1990), Англии (Wallis et al., 1990).

По уже имеющимся данным можно полагать, что российская популяция, так же как и английская, не имеет ярко выраженного эффекта основателя.

Обнаруженные и описанные нами повторы могут быть использованы для анализа неравновесия по сцеплению в популяциях, в которых ¿■pfcxv основателя уж установлен. Особенно эффективным может быть использование данных повторов для анализа гаплотипов.

Найденные нами микросателлитные повторы СА2 и САЗ могут эффективно использоваться для картирования рекомбинаций, обнару-.- женных-нашими коллегами.

i i

V. Определение нуклоотидной последовательности фрагментов ДНК зонда 26Р.

В настоящее время вся область возможной локализации гена FRDA клонирована в YAC, и в зтой области обнаружено 5 CpG-ост-ровкоЕ (Fujita et al., 1992), которые часто предшествуют генам. Один из.таких островков расположен в непосредственной близости

от маркера 26Р, и, на наш взгляд, является наиболее реальным претендентом на соседство с геном FRDA. Поэтому мы решили определить нуклеотидную последовательность ДНК зонда 25Р, примыкающего к GC-богатой области.

Схема клонирования участков ДНК для секвенирования показана на рисунке 4.

Нуклеотидную последовательность участков ДНК клонированных фрагментов, прилежащих к областям отжига универсальных прямого и обратного праймеров в Bluescript SK+, определяли согласно стандартного протокола секвенирования ДНК методом Сенгера.

Затем провели субклонирование фрагментов ДНК BamHI - Xbal длиной 700 и 500 н. п. в векторе Bluescript SK+ и определили нуклеотидную последовательность участков ДНК, прилежащих к сайту узнавания Xbal, в результате чего восстановили последовательность всего фрагмента ВапШ - BamHI длиной 1,2 т. н. п.

Для определения полной последовательности фрагмента BainHI-• Pstl длиной 1,5 т. н. п. при помощи обработки экзонуклеазой ExoIII получили набор клонов, содержащих направленные делеции различной протяженности со стороны универсального праймера.

Необходимо отметить, что е результате направленного делети-•рования былу получены две группы клонов' по протяженности делеции. Часть клонов слабо отличалась от исходного (делеции ь пределах 50 н. п.), другие клоны имели вставку до 500 н. п. (делеции протяженностью свыше 1 т.н.п.). По-видимому, это вызвано неравномерностью гидролиза ДНК различного AT/GC-состава экзонуклеазой ExoIII.

Секвенирование ДНК первой группы клонов с использованием универсального праймера позволило, получить последовательность фрагмента ДНК длиной 300 н.п., (секвенирование .сильно затруднено высоким содержанием G-C пар в последовательности), прилежащего к "Pstl-концу BamHI-Pstl фрагмента длиной 1,5 т. н. п. ДНК зонда 26Р.

Секвенирование второй группы клонов с использованием универсального праймера позволило реконструировать ну^еотиднуо последовательность общей длиной 500 • н.п., прилежащую к BamHI - концу фрагмента ДНК длиной 1,5 т. н. п.

Для того, чтобы определись 'полную нуклеотидную последовательность фрагмента BamHI - Pstl длиной 1,5 т.н. п., дополнительно синтезировали два олигонуклеотидных праймера: . . Seq 26 F: TGGA6GCCGCCGTAG И Seq 25 R: GCTTCTCTCCTAGCCG (области

/

V

ВатН1 _[. ХЬа1

' V

^вшш

26Р

1.5

/

Вигг.К! !

.У

__^ • Г«1

рост ртзии Ги шШ РШ

Вн-иН1 Ра И И.рт. —г—/ Г.рг. / \ В5К+ )

, I / рг СГрПКЦЛУ

Вшг.НТ

ВатШ РИ1 —г-Л Крг.

li.SK

£

л пл.

V рссурлкипя ВатШ

ЭЛ»ЮиЛЗХГИроЕиЗ-С1в

Х1>а1 ЬлтШ

ХЬа! К.^г _' Г. р_1\

В5к:

-)

ХЬа!

0.7 ^

Ч'

bnnil.ll

0.5 V-

ПитН!

1.5 ч

I \ Мрг.

/

V

ч

рсс-трикцмя ХЬэ1

: распри I >С!)аХ

ЛГТАГ

•¿ЛЮ11И.Ч

Т лятироза:мэ | "на с соя"

?>'Ьч1

БапШ!

^ В ЯК+0.5

ХЬа1

о>ч ХЬи1

/ >\Н.рг.

| ВБК -+-0.7

V Ч

Риа 4. Т^ма еубклонирования фрагментов ДНК зонда 26Р в В1и«эзспр1 СК+ для секвенирования.

's" I

GÇAGCCCG GGGCTGTCG3 GGCGACCCCC GGCCG3GG7A GGGGGACGCT CCAGGTCC7G 60

CGGCCTCA еССАТЗТПЛ CGSC7GCCT7 GTCG4G3CTC TGCGAGCTCA TGCTCTGCTT 120

.CCTCG3CC ACTATCTGGT CGATGTCCTC CTCCTGCTCG TAGCT6TCCA TGCGCGGGTA ISO

¡GCGCGAAC TCGGCCTCCT TCTC63GGCT GTCGGACTCG CCGTCG3AGC GCTCGTC3TA 240

GGTGCAGC CGCGCGCCCA GGGCCTCCTG GCG3TACSCG 6CCGCC7CG7 CGCGCTCCTG 3C0

CGTAGAGC CGCAGGCCGT CGCGTGCGTC CAGCTCGGGC GCGTCCCCTA TCTCCTCG7A 350 pr irrer Sêq26F'

CGTG07CC TGGAGGCCGC CGTAGTCGGC ATAGGGCTCG 3AÔTAG5GCT C3TCCTCACC 420

'GGTGGAAG AGCCGG7GCG TGTAGACGTA 6CCTGAGTAG GCCGCATTCA Т6-ЭЛТССТС 480

GCTCCAGC GAGTGGAAGT GOAGGTGGTT GGGOAGCGCG CG-3CGGTGCG 1CGCCTCG3C 540 '

GCTCGGCC TCTGCCTGCT CCG7GTACÏC CTŒGCCTCG GCGTACTGCA CAGCATAQGC 600 .

I7C7CG7CC TCGGGTCCTG CGCGCG07CC G0A7CGTAGC CGTC3CGGGC CGCGCGATCA 55C

ÍÍCGCCCTC GGCGGTGTCC Gl GTGGTTGT GGAAGCCGCr CTOCOIGJTG G3TGAGCGCÜ 720

¡AGGCATTC OCGCGCTCCT СТТ0СТССГЗ GCC05AGCTGG GCGCGGAGGT CCTCGAÜGGO 730

IGCCCGCGC TG3TGGCGGC CGACATAGTG C'ÏGCTGCTGC G3CGGCTGCT GCTGTICCTC 340

CCACCTCG GGGTGCTOCA GGTCGGCCTC CACCGAUTCG ТТОАССГССС CACCTGWGC 900

CGTCGGTC ACCTCCACCT CCGOAGACOC СТОСД AGAGG TTCATGGTGG GAGTCuGAAC 950 iruifer

ЮТAGGAGA GAAGOTGGGC CCGGC70A0T GCGCÏOTCAT TTT3CTCCAC TGGGCTuAAA 1020

iACAAGAAG GGGAGAGGCT G7CACGTGGT GOAAA^AGTC GT7ATGAGCT GAG7ATT0AG 1030

i

AACCATAA AAACAAC7GC TATTGATTCC ÏTT7AGTTCT GGGTCAATTA AAAAAAGAC7 1140 ;

lAAATTTAA GTTCAATCTG AGAGCACATA CATAGCACGC ATCATAATTT GTAATTACAT 1200 ;

CTA07TGT 77AATTGC7T 7uTGCC°i'TT0 ÏCC7TTC03A CCCCÏCACAC TGAGCGCCTC 1260 ;

¡GAAOGTTT TGTTCTCCAC CACGCATAC'i ATTC'.îGGTCC CATTTC'TGAT GCATCTGAAT 1320

.AGAGTACT AOTAAATTGA A7GGGCCAAC TGACACATTT TCCATCTcCT AACAGATAAA 1330

ITCTCCAAA T T AAACTAGG^AVCCTАСAАС ТТТАЗДАА7С ACTCTTTAAA TCAATTTCAA 1440

iAAACATAA CTTGAACACC TTTTGAAGCO AT7CTGAGAG AGGC7ATCAG CCAGCAG7GT . 15C0

GGTCCCGCCC CGGTTCTGTC ATTACTGACT TTGTGACCTC AGGCAAGTGG CTTAATTTTC 15

TGGACCTCCA CGGTGTGACT GGACTCATTT CCTACATGCA GGATGTTAAC AGCTATTATA 16

TAGGGTAAAA AAGACTCGGT GGTCAAGTAA GTTTGGAAAA TGCTGAGTTA CAGTTGACTT 16

TTCATTGTTA ATATCCAGAA GGAGGAAGAT GCAGGACACA GGGTTTCCCT AACTTGTTTG 17

s i gnal

ACCAGGAGAC ACTTTTTCCT AGAGGCCAAT GTTACATAGC AGCTGGTTTC TAATAGTTAG 18'

GC-box

GCTTCCCTAT TGCACACTCA GCATCCAGGA TACAAOCACC ACGGAAGACA ATATTAGGGA 18'

AAAAAATCCA ACACAATACA ACAATAAAAA ATAATGCAAG TAAAAATACA GTATAACAAC 191

TATA-box caD-site

AATTTATATA GCATTTATAT TGTATTAGGT ATTATGAGAA ATCTAGAAGA GATGATTTAC 19¡

AGTATATGGG AGGATGTGCA TAGATCATAT GUAAATAÜTA TAÜOATTTTA TAATffiATTT 2Q.

exon

TTATATCCAC TGGGGTCCTG AAACCAACCC CCATGGATAC CAAGGGCGGA CTATATTCAC 21 (

TTTCCCCATG TAACCTGAAT CTAAAATTCT AAGATTTTAT GAGTTGCCAT TATAGCTAGA 211

ACTGGATAAC AGGTGTAATT TTTTAAAATA TGGGTAGGTC TCTTTCTÁTT TTCAGAGAAA 22¡

CTTGTAGCTC GAGAGAAAGA TTTGGTTTCA GTCTCTTTCA ATTCTTCTTA TCACAAAATA 22!

GCTTTATGGT ATAATCTGTG CAGTATATAG AAATAGACAC AAAGAATGTA AACAACCACA 23-

ACAAACAGGC AGGGACCCCT ATGATTTTGA GATCCCTATG GTAAATAGGC TCAACAGTAT 24(

GTGTAAACTT GCTATTATGT TCTTTTGGAG AGCCTTTCTT ACAAATGGAC ACAATGGATG 24f

GGAAGTGAAC TCTTAAATAT AATAACAGAC AACCCCAGGA GGACCAGGGA CATCTGATGG 25!

ACTCTCTAGT AGTGAGATGC ATTATATTCT ACTCAACTCC CCATCACAAC CACAGCAATT 25*

exon ----

TCCTTCAAGC ATTGATGACC ATCCCAATAA CAAAGGAGAT CATTTTGGAG CTACCAAGTC 26<

CACATTCAAG CAGAAGTATC ATGTCTTCCC CATTCTTTGA TGGATCCACC CCTGACTGAT 27(

TCTCGCTAGA AGAAAAGAAT CACGGTTTAC AAGAGATGAA CAATCTTTAT TGCTTCGCTA 27í

CTTGACATAA GTCCCACTTG ATACAAATTA GACCCAACCT CTTTTGAAAA ATTTTGGGCT 28Í

CCTCCCATTA ACTCCTGAGA ACAGCGACTG TGGACTAAGT AT 28C

I

Рис.5. Нуклеотидная последовательность секвенированного фрагмента ДНК зонда 26Р. Показаны предсказанные о помощью компьютерного анализа сигнальные последовательности и участки белок- кодирующей последовательности.

- 21 -

отжига поаймеров показаны на рисунке 5).

В ¡•:о.т?')1;см итоге р.«;-ко:*:тгуирх,а.я;5 и-прерывнуя нукяеотпдлую длиной ;-58<"Г и. • . , которая лркзедена на РИСУНКА б.

Участок цКК, прилеяаго» к Pot Г--кон^' Bai.-tfi-Psi I Фрагмента, ООДерж;^' ях ЛЕНОСТЬ, X.iiv'KT .t"HvY, длл •.-ОТр'Г-КД.

Шлуч-?ьнух» нуклеоткд^ум поелелогагельность подвергли анализу при по.чеши кош1Ь!Ртерикк программ, в тем числе разработанной в лаборатории. Предсказанные сигяалькн^ псс.содовательностп (TAIA-. бсксы, GO-бокс и САР-сайт) я предполагаем» участки белок-ксди-рул-а^й "оо.р^-дор.отелыюот'л яояэаеда на рисутг.х ?.

Ум провали срч\?,идаеда>Н1и?. аналиа получеьней нуклеотидкой пселедс/г.ате.пг-.посги с послйдо?ате лмюотья 1ч-ка; обнаруженного в исследуемой области грушей из Страсбурга (F. Puelos <?:. al. , 15C3). Полум-нка>: нами ,vH»^c»-;m\r.®noevi- у-иютк-т. ДГ1К длиной 654 и. п. , прилех^цего к сайту Fs* I, соыа>:з с началом найденного гена за исключением четырех однонуилрг.тидом с.-а%ен.

Таким образом, впервые определена иу;слеотиднлл последовательность участка ДНК, прилежащего к Ь'-области найденного гона. По всей видимости, это? учгютск содержит промоторпуу область данного Г"НГ! а ,:р>ле?ж7Я«.'? литер.-: тт дчлг сейпуто исел-дог-м»^

И С о ТОЙ ТОЧКИ ЗреННЯ.

V!. Использование CA-i'.obtoiоз длл ДТП:-диагностики А. Ф.

Атаксия Фридрейха - >г:<сл». дет-:екное забсд^геАНке, и

prKjpbtCo-jSA :»5Ф?ктивкоЯ ДнХ-дг.атмог'Гккк &тогс габолеран^я является усгуанг.ьой задачей молек.улгрнлй медицины. В чйстоя.иее в ре sm ответственный за рсеник.поб<-1.и« ¿'.абол^вания, 'i-'KC-ac-CiVK, отсутствуй? таюке кжце-лпбо достоверные биохимические маркеры птого габол^шнли, цомтому д.". нн.гговд*го х.(рем'--;,к диагноз А. Ф. остается клинич^елкм и. с-ледс"..-1Т-'-/;--но, зогможнз .вшь косвенная диагностика.

В дачной р.пооге Г'ппр. i'loraiui молекул.-.оно-гинетмчеокне процедуры длг/ nKcKU.ivoM.vi'K'jPCii.vro a > ДаК-тостпрогания А.Ф. в ■.-■".,иго:,>.'Ькмл семьях с ясиолъ^пачл.'м еллитных повторов, го'.-ас оцепленных «/ташк-й. зызкЕзадрй это заболевание.

Нам;: ;;)ог>?,к-н мол^кулнрно-гене'Гг^еклй пнали.%. 3 семей с .5 г,-;:.лг. ..л'-ций >д р^.удьтг'Ш ЛКК-^'---стирогапяя покш»ау.ы

i-r-i ! ..е. О.

семья П.

семья Л.

семья П.

И

II

мет ш "7 б 4 3 * л 7 МСТ112 • — п - , 5 МСТ112 5 5 5 4

с 1 3 4 « * з С$2 1 1 . 3 0^2 4 з 4 3

САЗ с 2 4 5 ; 4 с СА2 3 ; 4 4 СА2 5 з 5 ^

САЗ 2 1 2 Л 1 1 САЗ < 2 1 4 1 3 СЛЗ 2 2 2 4

а

б

в

РИС.Родословные проанализированных семей II результаты ДН[С-тестирования

^пользование тесно сцепленных с геном ,-ША высокополнмсрф-пык маркеров чкаковыми являются СА-яовтсры) позволяет поднять возможности р-днн-й диагностики РРРА и установления гетерозиготного аосительсгза на качествечно ¡-югый уровень. Нами представлен первый в России и странах СЫТ опит такой работа в семьях, отягощенных А. Ф.

Следует отметить, что в семьях 1 и 2 методы ДКК-диагностики лишь подтвердили клгл.ч'-ч'ски несомненный Факт отеутотгия яаб■: ле-ванш у старта сестер пробчндов,. так как они намного мер?мили типичный возраст начала болезни. В тс ме время у обеих яршцкн с помощью ДЯК-диагностики было доказало гетерозиготное носитчльст-во гена ГКОА, чего ке удааось устанозить другими доступными методами исследования. Особью п«г«р<»с вьзювазиг результаты молеку-

ЛуП/г.о-^н^тич^ского псоЛ'/Дог^икп е.- м;>и о, гд<-" кл^нчч-ски обрезая младшая сестра аробанда, кэходяеияез б детском возрасте, имела весьма вь:со!сий теоретический писк заболевания, близкий к 25%. Результаты диагностики позволили с вероятностью 39% исключить такую гозможность (определяется вероятностью рекомбинаций между поьрелздоьчем з гене и испольгуекьыя маркерами).

До настоящего времени зффекгигкые методы лечения А. Ф. отсутствуют. 3 связи с чтим особенно важна профилактика этого заболевания, основанная на изначальной диагностике гомозигот-нос-ги по гену ПЖА. Разработанные методы ДЖ-диагностики создают принципиальную возможность лронодепия пр.-ната1ЬНОй диагностики РЖА б отягощенных семьях.

Тагам образом, метода ДЖ-диагностики РЕПА позволяют осуществлять выоокодоесоверную диагностику заболевания (в том ч;.сл>э раннюю и пренаталъкую) и уотакавяиг-ать факт гетерозиготного иоеитольства гена- гизл.

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружены и картированы четыре микросателлитпых повтора в наиболее вероятной области локализации гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха. Один из них - повтор CAI - совпал с найденным G. Si rugo (Страсбург, Франция) повтором GS2.

2. Исследован полиморфизм обнаруженных СА-повторов в популяции России. Повтор СА4 не ямяется полиморфным, для повторов CAI, 0А2 и САЗ значение Р 1С составляет 0.59, 0.44 и 0.09 соответственно.

3. Неравновесие по сцеплению между патологическим геном FRDA и аллелями локусов CAI, CA?, САЗ и МСТ112, а также их гаи-. лотипами в русской популяции не обнаружено.

Микросателлитные повторы СА2 и САЗ наряду е GS2 (CAI) и ЮН2 могут эффективно применяться для гаплотигшрования и анализа неравновесия по сцеплению, а также для картирования иввест-нчх рекомбинаций г ипуис.^м район'.* 9-й хромосомы в популяциях с ъ¡cío м основат еля.

4. Определена нуклеогидная последовательность фрагмента ДНК длиной 2862 н. п. б составе зонда 26Р (локус U9S5), находящегося в непосредственной близости от CpG-островка. Секвонированный Фрагмент ДНК содержит GC-богатый участок, нуклчотидная последовательность которого характерна для CpG-островка. Анализ последовательности с помощью компьютерных программ выявил возможное расположение регуляторных участков ДНК и первых экэоноь гена.

5. Участок секвенированного фрагмента ДНК зонда 26Р длиной 564 н.п. совпадает с началом гена, найденного в области локализации гена FRDA группой исследователей в Страсбурге. Таким образом, впервые секвестрован участок ДНК, содержащий промоторкую область гена-кандидата.

6. Разработаны молекулярно-генетические процедуры ДНК-диагностики А.Ф. В лаборатории проведено 2 пресимптоматических ДНК-тестирования атаксии Фридрейха. i

Слисок работ, спублжоЕшшых по темэ диссертации.

1. 0. В. Евграфов, 3. 3. Пугачев, .1 В. Стрельченко. "Обнаружение полиморфного маркера в области гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха. " // 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии".. Самарканд. - 1991.- тезисы докл. - С. 68.

2. В. В. Пугачев, А. В. Поляков, 0. В. Евграфов. " Поиск и изучение микросателлитных повторов в области предполагаемой локализации гена FRDA". // 6-ой Съезд БОГИС, Минск, - 3992. - тезисы докл. •■ ч. 1 - С. 124.

3. В. В. Пугачев, С. Е Кллариошкин, Л. В. Прокунина, S. Д. Маркова, 0. В. Евграфов, И. А. Иванова-Смоленская " ДКК-диагностика атаксии Фридрейха с клиники-генетическим анализом." // Сборник "Молекулярная диагностика наследственных заболеваний и медико-генетическое консультирование. "- М. - МГ'НйКИ. - 1993.

4. О. В. В. Ь. нуг&чев, Н. А. Калыгина, В. 1. Ситников, Е. Д. Ладали, И. А. Шагпна. О. П. Сидорога. А. Н. Петрин "Прешггальиая диагностика сгопкш-них амистроф^й." •'/' Сборник "Молекулярная диагностика наследственных заболеваний к медико-генетическое консультирование." - М - КРШШ. - 1993.

й. V. Fuyachev, A. Polyakov, 0. Evprrafov. "Microsar^llites from region of possible ]oka!isat5on of FPOA locus." // Г4 Ann. Meeting of European Зое. Huia Genet. Afcetr. - 199;. - P. 123.

6. V. Pugaehev, A. Polyakov, V. Sitnikov, N. Malygina, E. Daciali, I. Ivanova-S;ixoierv3kaya. "Russian prog-rains of LW'A -diagnosis of spinal muscular atrophies and Friedreich ataxia "// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and child upgrading, Beijing:, eds V. J i oping, Y. Rnyir.;?. - 1992.- P. 331.

7. V, Pujaehev, A. Polyakov, L. prokun:na, 0. Evgrafov. "Two dinucleotide repeat polymorphisms in the Friedreich's ataxia region on ciiromosojau 9ql3-q21.3." // МЯес. Hum. 3enet. , 1993, submitted.