Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и молекулярные аспекты пренатальной диагностики некоторых врожденных и наследственных заболеваний (дефекты заращения нервной трубки, муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и молекулярные аспекты пренатальной диагностики некоторых врожденных и наследственных заболеваний (дефекты заращения нервной трубки, муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах руиягасв

7 2 УДК. 618.2:61бЛЗЛ16-056.7-07^77.1

ГОРБУНОВА ВикторияНиколдслпа

БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НЕКОТОРЫХ ВРОЖДЕННЫХ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ДЕФЕКТЫ ЗАРАЩЕНИЯ НЕРВНОЙ ТРУБКИ, МУКОВИСЦИДОЗ, МИОДИСТРОФИЯ ДЮШЕННА, ГЕМОФИЛИЯ А).

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.

<03.00.15-такта»)

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики ■ наследственных болезней Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор В. С. Баранов

Официальные оппонента

доктор медицинских наук В.А.Бахарев •

доктор биологических наук Н.И.Гринева •

доктор биологических наук 0. В.Евграфов

Ведущее учреждение

Цитологический институт РАН

" Защита диссертации состоится " и _ 1996 г.

в час. мин. на заседании Диссертационного совета (Д. 001.16.01) Медико - генетического научного Центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра. Автореферат разослан "9" апреля 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного' совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Кури;

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Решающие успехи молекулярной биологии в познании генома человека, в картировании, идентификации и клонировании его генов, изучении их первичной структуры и продуктов экспрессии имели основополагающее значение для биологии и медицины, особенно для медицинской генетики. Действительно, согласно современным представлениям, примерно 5.5% всех новорожденных имеют те или иные наследственные нарушения (Бочков. 1995). Около 1-1.5% новорожденных страдают какой-либо моногенной болезнью, 0.5% - хромосомной болезнью, у 3-3.5% детей имеются заболевания с выраженной генетической предрасположенностью (диабет, атеросклероз, ишемия сердца) и у 1-1.5% наблюдаются нарушейм,- связанные с выраженной генетической не1 совместимостью матери и плода. Известно, что до 40% перинатальной смертности имеет наследственную этиологию и около ЗОЖ коек в детских стационарах занято детьми с наследственными нарушениями и болезнями с выраженной генетической де-терминантой (Вельтищев. Казанцева, 1994).

Благодаря прогрессу в области терапии, для многих распространенных наследственных заболеваний, таких как муко-висцидоз, гемофилия, фенилкетонурия, социальные вопросы при-, обретают все более ярко выраженный характер. Возникает необходимость решения новых проблем, связанных с реабилитацией, социальной адаптацией, а в последнее время - и с репродуктивной функцией таких больных (Баранов. Гинтер, 1995). Наря-,ЛУ с ростом мутационных процессов, обусловленных неблагоприг ятной экологической обстановкой, успехи симптоматического лечения моногенной патологии неотвратимо ведут к прогрессивному увеличению генетического груза вредных мутаций в популяциях. Вполне естественно, что уже сегодня требуются эффективные способы профилактики наследственных болезней, являющейся. по-сути, единственным реальным путем сохранения генофонда человечества.

В настоящее время хорошо обоснованы следующие подходы в профилактике наследственных болезней: 1) медико-генетическое консультирование. 2) пренатальная диагностика. 3) просеиваю-

щие скриниующие программы новорожденных, 4) диспансеризация семей высокого риска с целью выявления гетерозиготного носи-тельства вредных мутаций. 5) контроль мутагенных факторов окружающей среды (Козлова. 1987). Удельный вес каждого из этих подходов в достижении намеченной цели существенно варьирует. причем эта изменчивость определяется не только специфическими особенностями организации медико-генетической службы, но и уровнем научных разработок в той или иной области. Благодаря достигнутым в последние годы впечетляющим успехам молекулярной биологии, особенно большое место в профилактике наследственных болезней принадлежит пренатальной диагностике и выявлению гетерозиготных носителей патологических мутаций в семьях высокого риска, либо даже в целых популяциях (например, в случае талассемии, муковисцидоза. болезни Леш-Нихана).

Пренатальная диагностика - сравнительно новое направление медицинской генетики. возникшее на границе традиционной практической медицины (акушерство, оперативная гинекология, перинатология). ее новых научных направлений (патофизиология. ультразвуковая диагностика), а также . методических достижений фундаментальных наук (молекулярная биология, генетика. цитогенетика, биохимия). Целью пренатальной диагу "ностики является раннее выявление плодов с наследственой и врожденной патологцей, предупреждение их рождения, а в будущем - их лечение с помощью быстро прогрессирующих методов ,клеточной и генной терапии (Баранов, 1994). -* ■• '

Далеко не все врожденные аномалии . наследственно обусловленны, то есть имеют- в своей основе изменения в структуре хромосом или ДНК. Причиной целого ряда тяжелых пороков развития могут быть неблагоприятные условия протекания беременности, перенесенные инфекционные, а также гинекологические заболевания, неблагополучная экологическая обстановка или профессиональная вредность. При устранении таких неблагоприятных факторов риск повторного рождения больных детей в подобных семьях не превышает общепопуляционного уровня и. как правило, при последующих беременностях пренатальная диагностика плода ограничивается более тщательным гинекологи-

ческим и ультразвуковым обследованием пациентки. Своевременное выявление подобных пороков, а, следовательно, и-предотвращение рождения больных детей, является одной из основных целей ультразвукового скринирования во время беременности, а также биохимических скринингов, в первую очередь на содержание альфа-фетопротеина (АФП) в крови беременных женщин. Содержание этого плодного по происхождению белка может резко меняться при дефектах заращения нервной трубки (ДЗНТ). приводящих к развитию анэнцефалии, спинно-мозговых грын, гаст-рошизиса. а также при врожденных нефрозах, тератомах, поли-кистозе почек, кишечных атрезиях. агенезии почек и при дефектах развития, обусловленных трисомиями хромосом 21, 1В, 13 и X (Brock, Sutcllffe, 1972; Brock, Bolton, 1973; Wald, Cuckle, 1987; Vßild et al., 1988; Гречанина, 1990; Золотухина. Костюк, 1992).

Наибольшее число пренатальных диагнозов выполняется 'в связи с повышенным риском хромосомной патологии плода, самой частой из которых является болезнь Дауна - трисомия 21, что связано с особенностями формирования групп риска. Дело в том. что возраст матери является фактором, резко увеличивающим вероятность нарушения кариотипа плода. В связи с этим в группу риска попадают все беременные женщины старше определенного возраста, чаще всего старше 35 лет. Более дифференцированный подход связан с проведением ряда . скринирующих программ, в первую очередь, скрининга беременных на содержание АФП в сыворотке крови.

Обширную группу нозологий. для которых необходимо проведение пренатальной диагностики. составляют моногенные наследственные заболевания, частоты которых могут значительно варьировать в различных популяциях и этнических группах. Большая часть из 5000 известных моногенных болезней это очень редкие заболевания, для многих из которых общее число больных во всем мире не превышает нескольких десятков или составляет около сотни человек. Некоторые болезни распространены только в определенных изолятах или среди определенных этнических групп. Тем ни менее, суммарный вклад моногенных наследственных болезней в общую структуру детской заболевав-

мости и смертности довольно значителен. К особенно частым, социально значимым наследственным заболеваниям следует отнести муковисцидоз, . миодистрофию Дюшенна. гемофилию А и В, синдром ломкой Х-хромосомы. фенилкетонурию и некоторые другие. на долю которых приходится почти половина всей моногенной наследственной патологии человека.

Учитывая тяжесть многих подобнных наследственных заболеваний. а также их практическую неизлечимость, считается, что наиболее эффективной программой борьбы с этими болезнями является ранняя пренатальная диагностика в семьях повышенного риска с целью селективного прерывания беременности в случае положительного диагноза. Разработка методов дородовой диагностики. основанных на оценке клинических и биохимических нарушений у плода, требует совершенно различных подходов для разных заболеваний, часто является очень сложной, а иногда принципиально неразрешимой задачей. Действительно, основные симптомы заболевания могут просто отсутствовать в плодном периоде. ,Кроме того, для анализа доступен весьма ограниченный набор тканей и клеток плода, и многие гены, мутации в •которых приводят к заболеваниям, могут не проявляться, то-есть-не экспрессироваться, в этих типах клеток, а значит, в них будут отсутствовать соответствующие белки. Эти вопросы требуют исследования на заведомо мутантных плодах, получение которых часто оказывается весьма затруднительно. Тем ни менее. усилия многих специалистов, направление на поиск биохимических или метаболических маркеров различнах заболеваний -у' плода, оказались успешными. Это в первую очередь относится к тем болезням, для которых известен первичный биохимический дефект. В настоящее время пренатальная диагностика, основанная на анализе особенностей проявления болезни у плода, возможна для более, чем 450 нозологии. Однако, заключения, полученные в результате подобных исследований, носят вероятностный. а не детерминированный характер, что обусловлено вторичностью исследуемых признаков по отношению к основной причине заболевания - мутации в гене. Кроме того, использование очень разных и достаточно трудоемких методических подходов для диагностики различных заболеваний обусловливает

необходимость узкой специализаций центроз пренатальной диаг-- ностики'по■ отдельным■нозологиям:"""Эти недостатки в Сочетании о высокой стоимостью анализов и необходимостью использования труднодоступных реактивов и оборудования" существенным о'б'ра-зом ограничивают распространение биохимических методик для пренатальной диагностики наследственных заболеваний, особенно, в нашей стране.

Внедрение в медицину методов молекулярной генетики, т?-ееть методсз анализа молекул ДНК. отдельных 'генов и их фрагментов, открыло, практически, неограниченные'возможности для идентификации мутаций и мутантных хромосом в семьях, отягощенных наследственной патологией. Появилась возможность более точной оценки популяционных частот мутаций, а также поиска гетерозиготных носителей и диагностики заболеваний на основе идентификации первичного генетического дефекта. Этому предшествовала целая серия технологических разработок и открытий, сделанных в последние годы. В результате конструирования большого числа разнообразных геномных и тканеспецифи-ческих библиотек генов, на базе изоляции и клонирования (1) перекрывающихся последовательностей ДНК, локализованных в определенных районах генома, или (2) кодирующих последовательностей генов, экспрессирующихся в определенных типах дифференцированных клеток, были созданы предпосылки дня идентификации отдельных генов человека. Был .разработан комп- ■ леке высокоэффективных специальных методов для идентификации точечных мутаций в генах. Одновременно в геноме человека бы-.jij обнаружено большое число высокополиморфных.локусов и разработаны эффективные методы молекулярного анализа этой, изменчивости, основанные на блот-гибрйдизации и.' что особенно важно, на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфные ло-кусы были использованы в качестве своеобразных генетических индексных молекулярных маркеров определенных участков хромосом. с- помощью которых были построены детальные карты генов человека.

К настоящему времени на хромосомах человека картировано более 800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболева-

ний,, для которых известна локализация контролирующего гена, еще . больше и приближается к 1000 за счет существования ал-лельных серий, .то есть групп болезней, клинически сильно отличающихся друг от друга, но обусловленных мутациями в- одном и,том"!же гене" (McKusick: 1994: Romeo. McKusick: 1994). Для всех этих заболеваний принципиально возможна- пренатальная диагностика с использованием методов молекулярного анализа.. Более половины картированных генов клонировано и ■ секвениро-вано, причем для каждого'из них описаны различные мутантные аллели.' Молекулярное генотипирование мутаций позволяет проводить _прямую диагностику соответствующего наследственного заболевания в семьях.высокого риска. Более того, в настоящее время .есть все основания предполагать, что в ближайшие 2-3 года.будут картированы если не fece, то подавляющее большинство генов.человека, общее число которых по предварительным оценкам составляет около 70 - 30 тысяч. При этом откроются .. широкие перспективы для молекулярной диагностики не только всех моногенных, но и многих мультифакториальных заболеваний.. ' ."'

. Важно подчеркнуть, что используемые для молекулярной .диагностики, подходы и методы одинаковы и не зависят тэт- типа заболевания, так как основаны на анализе самих" генов. Вместе 'с".' тем. реальные возможности диагностики очень различны для разных болезней, что. в первую очередь. 'определяется 'различной степенью их Генетической изученности. Кроме того, большое. значение имеют такие факторы как молекулярная структура' генов,. популяционные 'частоты и характер экспрессии различных мутаций, .а также информативность полиморфных маркеров, используемых "для "идент'ификфции%мутантных хромосом. Поэтому для различных нозологий отрабатывается сбоя стратегия молекулярной диагностики," свой алгоритм их'профилактики, который начинается" с обследования конкретной семьи высокого риска на ее, информативность, то есть пригодность для ДНК-диагностики и завершается пренатальной диагностикой и выявлением -гетерозиготного- носительства. Тем ни менее, единообразие методических подходов' позволяет, в принципе, проводить молекулярную диагностику любого наследственного заболевания в одном

специализированном центре.

Приведенная вше информация касается современного- состояния пренатальной диагностики наследственных болезней. Следует, однако, подчеркнуть, что к 1985г., когда были начаты наш исследования, пренатальная диагностика только делала первые шаги. В передовых западных центрах активно налаживался скрининг беременных на содержание АФП, отрабатывались методы инвазивного забора плодного материала и хромосомного анализа кариотипа плода, были проведены первые опыты молекулярной диагностики некоторых моногенных болезней (Kunkel et al., 1985а; 1985b). Однако, гены подавляющего большинства наиболее частых наследственных болезней (муковисцидоза. фё-. нилкетонурии. синдрома ломкой x-хромосомы) еще не были идентифицированы. ъ

В России к этому времени пренатальная диагностика, по-сути, была ограничена ультразвуковыми исследованиями плода, а также сравнительно немогочисленными попытками изучения АФП в сыворотке крови беременных женщин (Кулиев. 1987). Ин-вазивные метода забора плодного материала были весьма несовершенны, рискованны для плода и применялись в единичных случаях и только в отдельных центрах Москвы и Ленинграда (Бочков, 1987). ни для одного моногенного заболевания не была разработана пренатальная диагностика на основе молекулярных методов исследования (Баранов. 1987). Разработке научных основ биохимической и молекулярной диагностики наиболее частых наследственных и врожденных болезней и их внедрению в „практику пренатальной диагностики и была посвщена данная работа. '

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Разработать и внедрить в клиническую практику биохими-- ческие и молекулярно-генетические методы пренатальной диагностики трех распространенных моногенных наследственных заболеваний - муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна и гемофилии А: разработать биохимические методы пренатальной диагностики ДЗНТ и хромосомных болезней путем скринирования беременных

женщин на содержание АФП в сыворотке крови и определения АФП и ацетилхолинэстеразы в амниотической , жидкости -женщин-из группы высокого риска.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ.

1. Методами иммуноэлектрофореза изучить динамику содержания ряда сывороточных белков - альбумина, трансферрина, альфа-1-антитрипсина. альфа-фетопротеина и церулоплазмина, в крови и в амниотической жидкости плодов разных сроков развития в норме и при некоторых патологических состояниях.

. 2. Разработать- комплексный биохимический подход к'пре-натальной диагностике ДЗНТ на основе иммунологического тестирования содержания АФП и наличия . двух электрофорети-чески различимых изоформ ацетилхолинэстеразы в амниотической . жидкости.

3. Методами спектрофотометр®! проанализировать изменения активности ряда ферментов микроворсинок кишечника плода - гамма-глутамилтранспептидазы. аминопептидазы, кишечной _формы щелочной фосфатазы,. и четырех типов дисахаридаз - са-харазы. лактазы.. мальтазы и трегалазы. на разных сроках беременности в норме и при муковисцидозе у плода; разработать "на этой основе биохимические критерии прёнатальной'" диагностики муковисцидо,за; "разработать биохимические методы верификации диагноза у абортированного плода.

' 4. Методом ПДРФ-анализа изучить особенности распределе-" ния частот аллелей маркерных полиморфных локусов. сцепленных с генами муковисцидоза. миопатии Дюшенна и гемофилии А. в некоторых отечественных популяциях, а также в семьях высокого риска по этим заболеваниям; проанализировать информативность семей и провести-отбор.молекулярных маркеров, наиболее пригодных для пренатальной диагностики этих заболеваний.

5. Провести генотипирование в семьях высокого риска по муковисцидозу и миодистрофии Дюшенна наиболее распространенных мутаций (сЗе1Р508 - ген муковисцидоза. внутригенных протяженных делеций - ген дистрофина); изучить частоты этих мутаций у больных из различных регионов страны.

6. На-основе полученных результатов разработать оптимальный алгоритм для проведения пренатальной диагностики му-ковисцидоза,. миопатш Дюшенна и гемофилии А. . -

НАУЧНАЯ НСВИЗНА.

1. Определены средние значения и пределы нормальной изменчивости концентрации иммунореакззных форм пяти снворо-точных белков - альбумина, трансферрина, альфа-1-антитрипси-на, альфа-фетопротеина и церулоплазмина, в крови и в амнио-тической жидкости плодсн на сроках от 16 до 22 недель беременности.

2. Разработан и внедрен в клиническую практику Санкт-Петербурга комплексный подход для профилактики тяжелых врожденных пороков развития путем скрининга беременных на АФП'с последующим УЗИ и биохимическим исследованием амниотической жидкости на АФП и изозимы ацетилхолинэстеразы у беоеменных женщин с повышенным риском ДЗКТ у плода.

3. Исследована динамика изменчивости активности ряда ферментов микроворсинок кишечника плода (гамма-глутамилт-ранспептидазы, аминопептидазы, кишечной формы щелочной фосфатазы) и четырех типов дисахаридаз (сахаразы, мальтазы, лактазы и трегалазы) в амниотической жидкости при нормальной беременности и при муковисцидозе у плода; разработан и внедрен в клиническую практику биохимический метод пренатальной диагностики муковисцидоза.

4. Впервые для отечественных популяций получены оценки чдстот аллелей ряда полиморфных локусов, тесно сцепленнных с генами муковисцидоза (МеШ/МБр1. MetH/Taqi, J3.ll/Mspl. J3.ll/Taql, ХУ2с/Тад1, С37/Н1П61, КМ19/Рзи. МР6<19/1(зр1); миодистрофии Дюшенна (ХЛ.1Л^1. рЕИШ. 15/Тач1, рЕ1?Т87.15/ВатН1. рЕ11Т87.8Л^1, p754/Pзtl) И гемофилии А

р1.8/Вд11. р51.61/Н1псШ1); определены полиморфные сайты рестрикции, наиболее информативные для молекулярной диагностики этих болезней и выявления гетерозиготных носителей мутаций в семьях высокого риска.

5. Впервые проведены скринирующие исследования с целью молекулярного генотипирования наиболее частых мутаций в генах муковисцидоза и дистр&фина среди больных, проживающих в Северо-Западном регионе страны. Получены первые ориентировочные оценки частот некоторых мажорных мутаций гена СЕТ1Ь и гена дистрофина в славянских популяциях.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Концентрация всех 5 изученных белков в амниотической жидкости и в сыворотке-крови женщины с 16 по 22 недели беременности достаточно- стабильна; некоторые патологические состояния - пиэлонефрит, перенесенная в период беременности краснуха или угрожающий выкидыш, сопровождаются достоверными отклонениями этих показателей от нормы. Повышенный уровень АФП в сочетании с появлением необычной формы холинэстеразы в амниотической жидкости свидетельствуют о наличии открытых ДЗНТ у плода; комплексный анализ АФП и ацетилхолинэстеразы в амниотической жидкости являются надежными биохимическими критериями пренатальной диагностики ДЗНТ.

2. Активность трех ферментов микроворсин'ок кишечника плода и четырех типов дисахаридаз прогрессивно снижается в амниотической жидкости с 16 по 23 недели беременности; пре-натальная диагностика муковисцидоза биохимическими методами возможна в 90% семей высокого риска;' оптимальный срок диагностики 17-19 недель беременности; исследование активности' дисахаридаз не повышает точности биохимической диагностики муковисцидоза.

3. Уровни полиморфизма по сайтам рестрикции, сцепленным с генами муковисцидоза, дистрофина и фактора.УШ свертывания крови, в популяциях Северо-западного региона России не отличаются от таковых для популяций Западной Европы и Северной Америки;- исследованные полиморфные сайты могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для пренатальной ДНК-диагностики и определения гетерозиготного носи-тельства мутаций в семьях высокого риска в России. Частота делении Е508 в СЕТЯ-гене среди русских составляет 50%, что.

достоверно ниже, чем в сранах Северной Америки и Северо-Запада Европы: при сочетании биохимического и молекулярного подходов пренатальная диагностика муковисцидоза- может быть обьективно осуществлена более,. чем в 95% семей высокого риска с точностью, превышающей 99%.

4. Использованная система анализа экзонов дистрофиново-го гена методами мультиплексной ПЦР позволяет идентифицировать делеции гена дистрофина у 45% больных с миодистрофией Дюшенна Северо-Западного региона страны; при сочетании прямых и косвенных методов ДНК-анализа, основанных на использовании сцепленных с геном дистрофина полиморфных сайтов рестрикции, дифференциальная пренатальная диагностика миодистро-фии Дюшенна возможна более, чем в 65% российских семей высокого риска. ф

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Внедрена в практику Медико-Генетического Центра и Городского Центра пренатальной диагностики Санкт- Петербурга скринирущая программа по анализу АФП в сыворотке крови беременных с целью отбора женщин высокого риска по рождению плодов с ДЗНТ и с хромосомными болезнями; проведена пренатальная биохимическая диагностика ДЗНТ в 25 семьях.

2. Впервые в России проведена пренатальной диагностика муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна и гемофилии А в ; 195 семьях высокого риска, и предотвращено рождение 47 больных"'

. детей.

3. Установлено гетерозиготное носительство мутаций генов дистрофина и фактора УШ свертывания крови у 71 родственницы больных миодистрофией Дюшенна и гемофилии А в 55 семьях высокого риска.

4. Все разработанные биохимические и молекулярные методы пренатальной диагностики активно используются в клинической практике лаборатории пренатальной диагностики ИАГ им. Д. 0. Отта РАМН, а также переданы для внедрения в ряд других диагностических центров России и стран СНГ.

5. Подготовлены и изданы методические указания : "Биохи-

мическая и молекулярная диагностика муковисцидоза". а также подготовлена к изданию монография "Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний", предназначенная для врачей, медицинских генетиков, ординаторов, аспирантов и студентов медицинских ВУЗов и биологических факультетов Университетов,

Анализ белков амниотической жидкости.

Белковый состав амниотической жидкости плода в процессе развития контролируется, главным образом, его генетической системой. Однако, это не исключает полностью возможность проникновения в 'амниотическую- полость через фетоплацентарный барьер, ■ по крайней мере, некоторых белков материнского происхождения. Нарушения в спектре и содержании белков амниотической жидкости обнаружены при многих аномалиях беременности (Эмери, 1977; Holton. 1985). До настоящего времени сведения о содержании индивидуальных белков в амниотической жидкости и в сыворотке плода на разных сроках беременности все еще остаются достаточно ограниченными и фрагментарными. В нашу задачу .входило изучение содержания ряда мажорных сывороточных белков - альбумина, трансферрина, альфа-фетопротеина и двух белков острой фазы - альфа-1-антитрипсина и церуллоплазмина в амниотической жидкости женщин второго триместра беременности на тех сроках, когда обычно производится диагностический амнио-центез в норме и при некоторых патологических"состояниях. Полученные. данные могут быть использованы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний, связанных с патологией изучаемых нами белков.

Работа выполнена на 120 образцах амниотической жидкости, полученных в сроки беременности от 15 до 40 недель от женщин, не входящих в группу риска по врожденной или наследственной патологии. В -60 наблюдениях одновременно с амниотической жидкостью исследовали' образцы фетальной сыворотки и сыворотки крови беременных. В качестве контроля использовали 30 образцов сыворотки крови небеременных женщин доноров.

Содержание общего белка определяли стандартным методом

по-биуретовой реакщотг Концентращш^ишунореактивных форм сывороточных белков определяли методом ракетного иммуноэлектро-фореза в 1%-ой агарозе. используя в случае альбумина, трансферрина и церулоплазмина моновалентные антисыворотки кролика, приготовленные в лаборатории биохимической генетики ИЭМ АМН. Для определения альфа-1-антитрипсина использовали коммерческие антитела и антигены производства "Беуас", Чехословакия. АФП определяли'.с помощью антител и стандартных сывороток крови плода, произведенных в ИЭМ им. Гамалея -(Диагностику для определения первичного рака1 печени и тератоб-ластом). Специфичность и титр антисывороток оценивали в реакг ции Оухтерлони при соответствующих разведениях антигенов. ■ О моновалентности антисывороток судили по наличию единичного пика преципитации5 в перекрестном иммуноэлектрофорезе образцов сыворотки крови доноров.

Содержание каждого из исследованных белков по отношению к общему белку, в целом, на протяжении всего изученного срока беременности сохраняется постоянным, за исключением альфа-фе-топротеина, концетрация которого по отношению к общему белку в конце беременности снижается более, чем в 10 раз. Более половины от общего белка амниотической жидкости приходится на альбумин, тогда как доля остальных изученных белков составляет около 10%. из них основная часть - альфа-1-антитрипсин (до 7л). вдвое меньше - трансферрин и только 0.1-0.4$.- альфа-фе-топротеин и церулоплазмин. Весьма сходные соотношения'альфа-1 -антитрипсина. альбумина, трансферрина и церулоплазмина • ррислеживаются в сыворотке крови доноров (контроль), хотя концентрация этих белков в амниотической жидкости примерно в 16 раз меньше.

Содержание общего белка, а также альфа-1-антитрипсина, альбумина, трансферрина и альфафетопртеина в фетальной сыворотке в 7-Ю раз выше, чем в амниотической жидкости, хотя в 2-5 раз меньше, чем в сыворотке крови беременных женщин и доноров. Концентрация альфа-фетопртеина в сыворотке плода в десятки тысяч раз выше, чем в сыворотке крови беременных женщин. В крови доноров этот белок, практически не обнарукжива-ется. Содержание церулоплазмина в амниотической жидкости и в

фетальной сыворотке было одинаково низким. Характерным для сыворотки беременных женщин является повышенный уровень альфа-1-антитрипсина и церулоплазмина.

В 8-и образцах амниотической жидкости наблюдали достоверные отличия от средних показателей по концентрации или активности разных ферментов. При оценке нормальных значений концентраций исследуемых ферментов в амниотической жидкости женщин разного срока беременности эти данные были исключены из анализа., В число этих образцов включены также случаи достоверного повышения в амниотической жидкости одного из ферментов микроворсинок -кишечника плода - гаммаглутамилт-ранспептидазы, изучение которого производилось в связи с разработкой биохимической пренатальной диагностикой муковисцидо-за. -

В 2-х случаях одновременно было повышено более, чем в два раза содержание общего белка и всех сывороточных ферментов. Наиболее вероятным обьяснением такого повышения может быть нарушение проницаемости фетоплацентарного барьера.- Интересно, что оба эти образца амниотической жидкости были получены в результате искусственного прерывания беременности в следствие реактивного состояния пациенток. В трех наблюдениях отклонения от средних показателей носили очень специфический характер. Было обнаружено одновременное повышение в 2.5 раза концентрации белков острой фазы - альфа-1-антитрипсина и церулоплазмина и в 10 раз и более - активности гамма-глутамилт-рансПептидазы. При этом причиной прерывания -"беременности в ' 2-х случаях был угрожающий выкидыш, а в одном обострение хронического пиэлонефрита, что в свою очередь также может сопровождаться угрозой прерывания беременности. В трех случаях у женщин, перенесших краснуху в первой половине беременности, также наблюдали аномальное распределение исследуемых ферментов в амниотической жидкости. Однако, определенной специфики в характере этих аномалий выявить не удалось. Данные наблюдения подтверждают необходимость изучения распределения сывороточных белков в амниотической жидкости при разных патологиях беременности, так как не исключено, что подобная изменчивость связана с аномалиями развития или болезнью плода.

Дефекты заращения нервной трубки.

Нарушения развития центральной нервной системы составляют более 30% всех врожденных пороков. Одной из наиболее частых причин подобных врожденных аномалий являются дефекты заращения нервной трубки - ДЗНТ. Решающащим в пренатальной диагностике ДЗНТ является ультразвуковое скринирование. Однако, это исследование не всегда является информативным и в тех случаях, кагда с помощью УЗИ не удается выявить причину повышения АФП в крови беременной женщины, на первое место выдвигаются биохимические методы тестирования содержания этого фермента непосредственно в амниотической жидкости. Диагностическая ценность з^ого теста для выявления ДЗНТ существенно возрастает, если, наряду с АФП в амниотической жидкости проводится измерение спектра изоформ холинэстераз и, в первую очередь. ацетилхолинэстеразы.

Определение параметров изменчивости содержания АФП в амниотической жидкости в процессе нормальной беременности является основой проведения биохимческой пренатальной диагностики ДЗНТ у' плода. Однако, проведению такой диагностики должно предшествовать формирование группы риска, прежде всего, на базе скринирования содержания АФП в сыворотке крови беременных женщин на сроках 16-20 недель. В нашу задачу входило определение нормальных параметров изменчивости АФП в сыворотке крови беременных женщин г.Санкт Петербурга, разработка тактики" поведения врачей женских консультаций в зависимости от результатов анализа, внедрение скринирующей программы в Диагностические Центры города, и в частности, в Медико-Генетический Центр и разработка условий проведения биохимической пренатальной диагностики ДЗНТ у плода.

По результатам иммуноферментного анализа АФП в крови 1630 женщин на сроках беременности от 13 до 25 недель, не имеющих ДЗНТ у плода, определены пределы нормальной изменчивости этого показателя, выраженные в единицах, кратных медиане (МоМ). Концентрация АФП в организме матери постоянно нарастает в процессе беременности от десятка до сотни нг/мл в этот период

развития плода. При этом индивидуальные колебания уровня АФП могут в 5-6 раз превышать медиану, особенно на более поздних сроках беременности.

Характеристика выявляемости анэнцефалий и Spina bifida по АФП-тесту в сыворотке крови беременных, составлена по результатам обследования 23 женщин с дефектами нервной трубки плода, диагностированными в процессе УЗИ-скрининга. Получены оценки частоты ложно-положительных результатов для различных пределов допустимой изменчивости, при превышении которых женщина может попасть в группу риска по ДЗНТ у плода. Так, если мы будем рассматривать 2 - 2.5- кратное превышение медианы, как фактор риска по ДЗНТ, мы со 100-%-ой вероятностью сможем выявить все случаи анэнцефалий и значительное число случаев открытых спино-мозговых грыж. Однако, при этом в группу риска может попасть от 25 до 40% женщин, не имеющих патологии плода. Повышение этого предела до 3 Мом сокращает эту группу до 10%. однако возрастает шанс пропустить случаи ДЗНТ. особенно Spina bifida.

С учетом этих обстоятельств мы разработали оптимальную схему обследования тех беременных женщин, у которых наблюда-•ются отклонения в ту или иную сторону от контрольных значений. Эта схема включает следующие действия: повторное прове^ Дение анализа на АФП в крови беременной,, направление на УЗИ. консультацию врача-пенетика и направление на пренатальную биохимическую диагностику ДЗНТ у плода. Выбор последовательности этих действий зависит от срока беременнбсти. на котором проводится обследование, конкретных значений АФП, результатов УЗИ и общего гинекологического обследования женщины. Эти рекомендации вместе с контрольными кривыми были переданы в соответствующие клинические учереждения города.

Нами была проведена биохимическая пренатальная диагностика ДЗНТ в 25 семьях с повышенным уровнем содержания АФП в сыворотке крови беременной. С этой целью женщин направляли на процедуру амниоцёнтеза и в амниотической жидкости определяли содержание АФП и наличие изоформ ацетилхолинэстеразы. Пренатальная диагностика проводилась только в тех случаях, когда наблюдали стойкое повышение АФП в сыворотке крови мате-

ри-и были исключены другие возможные причины этого повышения, такие как вес женщины, наличие двухяйцовой беременности, угрожающий выкидыш. В 15 случаях содержание АФП .в амниотической жидкости было в пределах нормы и не наблюдали ацетилхоли-нэстеразной полосы при электрофорезе. УЗИ также не выявило никаких аномалий плода у этих женщин. Во всех 15 случаях женщины родили здоровых детей в срок и мы не знаем причин повышения АФП в сыворотке крови этих женщин.

В 10 случаях было обнаружено значительное превышение содержания АФП в амниотической жидкости, причем в 9 из них наблюдали появление дополнительной быстро мигрирующей полосы ацетилхолинэстеразы в исследуемом материале. Параллельно про. веденное УЗИ подтвердило налиие анэнцефалии плода у шести женщин и Spina bifida - у трех. В одном случае при многократном провведенном УЗИ никаких аномалий плода обнаружить не удалось. Однако, трехкратно проведенная биохимическая диагностика указывала на наличие открытого врожденного порка развития. При рождении ребенка был поставлен диагноз гастроши-зис.

Ни в одном из 25 образцов амниотической жидкости, полученных для проведения пренатальной диагностики ДЗНТ у плода, не наблюдали каких-либо отклонений в содержании других сывороточных ферментов, таких как альбумин, альфа-фетопротеин, трансферрин и церулоплазмин. или ферментов кишечного происхождения - ферментов микроворсинок кишечника плода и даса-харидаз.

. " Представленные результаты свидетельствуют о высокой, эффективности выявления ДЗНТ у плода при сочетании УЗИ-скринин-га. скрининга беременных женщин на АФП на сроке 16 -20 недель для формирования группы риска по ДЗНТ, и биохимической пренатальной диагностики, основанной на определении АФП и ацетилхолинэстеразы в амниотической жидкости женщин. Последние 2 теста, проведенные в комплексе, обладают достаточно высокой дискриминирующей способностью и специфичностью в отношении дефектов нервной трубки плода.

Муковисцидоз.

Основу патогенетических механизмов муковисцидоза составляют нарушения транспорта ионов хлора через апикальные мембраны эндокринных желез эпителия. Изменения электролитического баланса слизи и накопление вязкого секрета ведет к закупорке бронхов, кистозному фиброзу поджелудочной железы, циррозу печени, различным нарушениям желудочно-кишечногб тракта, в том числе к мекониальному илеусу. Клинические симптомы выраженной кишечной непроходимости выявляются у 10-15% новорожденных с муковисцидозом.-_ Именно это обстоятельство навело на мысль, что и у плодов с муковисцидозом могут наблюдаться нарушения по типу транзиторного или персистирующего мекониального иле-уса. следствием чего могут явиться изменения активности ферментов -кишечного происхождения, поступающих с мекониальными массами в амниотическую жидкость на определенных стадиях развития зародыша.

Действительно, при муковисцидозе у плода в спектре белков амниотической жидкости были обнаружены характерные изменения активности ряда ферментов, синтезируемых микроворсинками кишечника плода, в частности, гамма-глутамилтранспептйдазы •(ГГТП), аминопептидазы (АМН) и кишечной (фенилаланинингибиру-емой) формы щелочной фосфатазы (ЩФ), а также четырех типов дисахаридаз - сахаразы. мальтазы, лактазы и трегалазы. Установлено. что, этит^енения выявляются в образцах амниотической жидкости в течение сравнительно короткого периода с. 16 цо 20 недели беременности и. по-видимому,-являются-результа-' том нарушения проходимости кишечника.-

В связи с этим нами проведено исследование активности ферментов микроворсинок кишечника плода и дисахсридаз в амниотической жидкости у женщин отечественных популяций (Санкт Петербург, Северо-Западный регион страны) на разных сроках беременности, полученные значения сопоставлены с литературными данными и на этой основе разработаны контрольные параметры, позволяющие проводить биохимическую пренатальную диагностику муковисцидоза во втором триместре беременности.

Для построения стандартных кривых изменения в процессе беременности активности кишечных ферментов амниотической жид-

кости в норме и. при. муковисцидозе были использованы образцы амниотической жидкости от 100 зсеншин, беременность'" которых завершилась рождением нормального ребенка, и 44 женщин, беременных плодом с муковисшшозом. Диагноз муковисцидсза у плода был верифицирован биохимическими,, патоморфологическими. а в дальнейшем и молекулярными методами.

Активность ГГТП, АМП, общей и кишечной форм ЩФ определяли путем измерения динамических характеристик оптической плотности растворов, содержащих эти ферменты и -соответствующие субстраты. Анализы проводили в 96-ячеечных платах в обь-еме реакционной смеси, не превышающем 200 мкл. Измерения оптической плотности проводили на приборе Титертек Мультискан ("Flow", Англия) при длине волны 405 и 420 нм. .■ . .-

На сроке беременности от 16 до 23 недель наблюдали прогрессивное снижение в амниотической жидкости концентрации всех кишечных Ферментов. Так. активность ГГТП падает от 460 Ед/л на 16-17 неделях беременности до 80 Ед/л к 22-23 неделям. Аналогичная зависимость отмечена и для АМП, где перепад концентраций особенно велик между 19 и 23 неделями. Активность обшей и кишечной форм ЩФ сохранялась примерно на одном уровне до 21 недели, а затем быстро падала. Содержание дисахаридаз составляет к 23 неделе от 20 до 30% того количества, которое наблюдалось на 16 неделе. На этом сроке беременности в более, чем 95% случаев индивидуальные показатели каждого из ферментов были выше половины медианы (0.5 Me). Поэтому в качестве критического значения для оценки достоверного понижения исследуемых показателей мы выбрали именно 0.5 Me.- Во всех" 7 контрольных образцах амниотической жидкости при беременноти плодом с мукоЕисцидозом содержание всех кишечных ферментов было значительно ниже этого уровня.

Проведение соответствующих биоимических исследований р группе женщин повышенного риска показало, что обьективное заключение в отношении муковисцидоза у плода могло быть получено только в 90% семей. В 10 % семей (5 из 44) диагноз не был поставлен. При этом добавление анализа дисахаридаз в амниотической жидкости не повышает разрешающей способности пре-натальной диагностики. Поэтому, был сделан вывод о том, что

биохимическую пренатальнук диагностику муковисцидоза следует ограничить измерением активности трех типов ферментов микроворсинок кишечника плода - ГГТП. АМП и кЩФ.

У 9 из 44 женщин группы высокого риска активность всех трех ферментов была значительно понижена по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. Значения этих ферментов были ниже 0.5 Ме, а ингибирование щелочной фосфатазы достоверно выше контрольных значений. Полученные величины хорошо коррелировали с содержанием этих же ферментов в амниоти-ческой жидкости женщин, родивших детей с муковисцидозом. У всех женщин этой группы значения дискриминантной функции были достоверно ниже критического уровня 2.6. -Все это позволило предпологать муковисцидоз у плода и рекомендовать прерывание беременности. У 8-и женщин беременность прервана на 22-24 неделях. При патологоанатомическом обследовании абортусов в одном случае отмечалось выпадение прямой кишки, а в другом -тяжелый порок сердца. Как правило, типичных признаков мекони-ального илеуса обнаружить не удавалось. У 7 абортусов содержание альбумина в меконии варьировало от 101 до 280 мг/г, что во много раз превосхоило норму (21+6 мг/г); Достоверных отли-. чий в содержании трансферрина, альфа-1-антитрипсина и аль-фа-фетопротеина ни в меконии, ни в сыворотке крови, ни в ам-ниотической жидкости абортусов не найдено. В одном случае содержание альбумина ^ мёконии оказалось очень низким (0.3 мг/г). Однако, ~ и в сыворотке крови этого плода концентрация альбумина была аномально низкой (7 мг/г-при 23+0; 9 в контро- -ле). Более того, в меконии этого плода обнаружены также достоверно более низкие концентрации трансферрина (0,06 мг/г, в контроле 0.65 мг/г) и альфа-фетопротеина (0,001 мкг/г, в контроле 0,06 мкг/г). Мы не могли однозначно интерпретировать эти результаты. Одна—из женщина этой группы отказалась от прерывания беременности. У нее родилась девочка, у которой в возрасте 0.5.года был поставлен диагноз муковисцидоза. позднее подтвержденный в Институте педиатрии РАМН (Москва).

Результаты работы свидетельствуют о том. что срок беременности играет критическую роль в биохимической пренатальной диагностике муковисцидоза. Слишком высокие и быстро меняющи-

еся показатели активности ферментов микроворсинок кишечника плода в амниотической жидкости на 16-17-ой неделях' беременности и очень низкие значения после 21-й недели являются серьезным препятствием для пренатальной диагностики муковисцидоза. Особенно большие трудности возникают при анализе, ферментов амниотической жидкости после 20-й недели, когда практически все тесты становятся малоинформативными и диагноз/ может быть установлен лишь ориентировочно по одному ферменту. Поэтому точная информация о сроках беременности - важнейшая предпосылка успеха в пренатальной диагностике муковисцидоза биохимическими методами. Оптимальными по нашим наблюдениям являются 18 - 19 недели беременности, что хорошо согласуется с данными других авторов. Реальна и более ранняя диагностика (16-17 недель), б этом случае при получении неоднозначных результатов сохраняется возможность повторного амниоцентоза-с анализом амниотической жидкости на 19-20 неделях беременности. Такой подход позволяет повысить эффективность биохимической пренатальной диагностики муковисцидоза до 95%.

Идентификация большого числа полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном муковисцидоза, позволила надежно картировать ген муковисцидоза в области 7о31.1 и начать молекулярную диагностику этого заболевания. Тесное сцепление клонированных последовательностей ДНК этих локусов и. соответствующих полиморфных сайтов рестрикции с геном муковисцидоза позволяло использовать их в качестве молекулярных маркеров-" для идентификации мутантдах хромосом в семьях высокого .рйска. Благодаря этим маркерам удается проследить передачу мутации в семьях с муковисцидозом. На этой основе были разработаны косвенные молекулярно-генетические методы пренатальной диагностики муковисцидоза.

На выборке из 156 доноров, 37% из которых были жители Ленинграда, 20% - жители Москвы 15% .жители Киева и остальные представители нерусских национальностей - литовцы, азербайджанцы. буряты, определили частоты популяционного полиморфизма по 8 сайтам рестрикции, сцепленным с геном муковисцидоза -МеС-Н/Мэр 1, Ме^нлад. рЛ. Н/Мэр 1, р^. 11/Та«1, ХУ-2с/Тач 1. СБ-7/Н1п6 I. КМ-19/Рзг 1 и рМРбйЭ/Мэр 1. Семейный анализ

выполнен на образцах ДНК членов 45 семей из европейской части страны, имеющих в анамнезе случаи рождения детей с муковисцидозом, включая 70 родителей и сибсов и 26.больных муковисци-дозом. Использованные методы анализа - блот-гибридизация и полимеразная цепная реакция.

" Соотношение аллелей различных генотипов в группе доноров, больных муковисцидозом и их ближайших родственников по трем системам локусов D7S23 (КМ-19. CS-7) и IRP (XV-2C) носит неслучайный характер и свидетельствует о выраженной неравновесности по сцеплению между локусами D7S23, IRP и геном муковисцидоза. Так, ' в группе доноров явно преобладают аллели с отсутствием сайтов'рестрикции по зондам CS-7 и КМ-19. Они могут • быть представлены как в гетерозиготном (С1/С2; К1/К2), так и в гомозиготном (Cl/Cl; Kl/Kl) состояниях. На долю этих генотипов приходится свыше 85% всей выборки из ленинградской пбпуляцйи, причем чаще всего среди, доноров встречаются гомозиготы по этим аллелям. В случае полиморфного сайта, диагностируемого зондом XV-2C, преобладающим в популяции является аллель с наличием сайта рестрикции - генотипы 12/12 и Х1/Х2. Таким образом, ' наиболее частыми аллелями' среди доноров по. 3 •полиморфным сайтам IRP и D7S23 локусов являются аллели_К1,_С1 и 12. ■

В отличие от доноров, в семьях с муковисцидозом преобладают 'генотипы.К2/К2 и С2/С2 и вдвое возрастает частота ал-леля XI. У больных муковисцидозом генотипы К2/К2; С2/С2 и XÏ/X1 составляют 10%.. Уровень полиморфизма -по ПДРФ-аллелям' изученных локусов в отечественчых популяциях соответствует тому, что наблюдается в популяциях Северо-Западной Европы. Италии и Северной Америки. Это также справедливо и для частот ПДРФ-аллелей среди больных муковисцидозом. Поэтому исследованные полиморфные сайты рестрикции могут использоваться в качестве молекулярных маркеров при проведении косвенной молекулярной диагностики муковисцидоза в отечественных популяциях.

Все изученные полиморфные сайты рестрикции обнаруживают неслучайную ассоциацию с мутациями гена муковисцидоза, однако, в различных популяциях и этнических группах степень этого

неравновесия по сцеплению различна. что. по-видимому, обусловлено гетерогенностью мутантных аллелей структурного ^ гена муковисцидоза, связанной с генетическим дрйфом и специфическими особенностями процесса рекомбинации в области локализации гена (ЕэИуЩ е1 а1.. 1989а). Неравновесие по сцеплению выражено тем сильнее, чем ближе расположен полиморфный сайт к структурному гену; высокодостоверное сцепление определенных гаплотипов по локусам ГИР, В7Б23 и 073399 с мутантными аллелями гена муковисцидоза указывает на'возможность • существования однотипной, широкораспространенной в различных популяциях мажорной мутации в гене муковисцидоза. Как оказалось впоследствии, такой гаплотип характерен для мутации йе1Е508. . Открытие гена муковисцидоза в участке д31 хромосомы 7, ограниченном локусам^ МЕТ и В7Б8, выполненное 1989 году совместными усилиями трех групп американских и канадских исследователей, и точная молекулярная идентификация преобладающей' в большинстве изученных популяций мутации (1е1Р508 среди больных создало предпосылки для проведения прямой молекулярной диагностики, основанной на детекции мутаций в гене муковисцидоза.

По результатам исследования 189 пациентов, большая часть'которых проживает в Северо-Западном регионе России, преимущественно в Санкт Петербурге (127 образцов). 30 - на Украине. 10 - в Москве. 14 - в Молдавии и 8 - в Литве, было определено, что средняя частота <Эе1Р508 в отечественных-попу- ■ ляциях составляет 57%. Более детальный анализ выявил значимую межпопуляционную и клиническую гетерогенность. Наивысшая • - .частота с1е1Р508-обнаружена среди украинской выборки больных (77.4^)7 "" Значительно более низкие значения найдены в российских популяциях (в московской - 55% и в петербургской -57%). И с гораздо меньшей частотой <Зе1Е508 встречается среди больных Литвы (25%) и Молдавии (33%). Делеция значительно чаще обнаруживается у больных с тяжелой Р1-формой заболевания -61.3%, чем с более легкой РБ-формой -17.7%.

Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между этой мутацией в гене муковисцидоза и использованными для анализа полиморфными маркерами, так как <1е1Е508 обнаружена исключительно в хромосомах с гаплотипом 2.2.2 по сайтам СБ7/Н1пГ6.1.

ШЭ/РэМ и МР6с1-9/Мзр1 и на 91% ассоциирована с аллелем 1 полиморфного локуса ХУ2сЛ^1. При одновременном анализе маркеров КШЭ/РэП и ХУ2с/Тад1 наиболее вероятно присутствие мутации в гене муковисцидоза у пациентов с гаплотипом В (совокупность аллелей 2 и 1 по двум локусам, соответственно).

Всего молекулярное обследование была проведено в 261 семье высокого риска, в значительной своей части славянского происхождения (русские, украинцы, белорусы). Пренатальная диагностика муковисцидоза была проведена в 161 семье, причем в _ 88 семьях только на основе биохимического анализа кишечных ферментов во втором триместре беременности, в 21 семье только по данным ДНК-диагностики в"первом триместре беременности и в остальных 52 семьях проводилось комплексная молекулярная и биохимическая диагностика. Прямыми методами, основанными на специфической амплификации ДНК с последующим электрофорети-ческим разделением фрагментов и рестрикционным анализом, диагностировали наряду с йе1Г508 мутации С55Ю, И553Х. Н334И и 1677с1е1ТА.

Наибольший вклад как в полную, так и в частичную информативность семей с муковисцидозом вносит йе1Р508 (28% и •44%, соответственно). Общая частота с1е1Р508 в этой выборке хромосом близка к 50% (259 из 522). Участие других известных Мутаций в генетическом контроле муковисцидоза в отечественных популяциях больных крайне мал. Исключение составляет мутация 1677с1е1ТА, обнаруженная одновременно у обоих родителей, происходящих из одного грузинского изолята. 74% исследованных' семей оказались частично или полностью информативны по прямому мутационному тесту. При комбинировании результатов ПДРФ-анализа с исследованием с1е1Р508 все семьи оказались полностью или частично информативными. В проведенном исследовании еще раз было подтверждено неслучайное распределение полиморфных аллелей по всем исследованным сайтам в семьях с муковисцидозом с• очевидным преобладанием гаплотипа В (аллель 2 -присутствие сайта рестрикции в локусе КМ-19/РзН и аллель 1 -отсутствие сайта рестрикции в локусе ХУ-2СЛ^1). Сильное неравновесие по сцеплению между гаплотипом В и геном муковисцидоза учитывали также при составлении заключения по поводу

состояния плода" при проведении биохимической пренатальной диагностики.

В 82% из общего числа проанализированных семей (то есть в 215 из 261) пренатальная диагностика могла быть проведена молекулярными методами. В оставшихся 46 семьях пренатальная диагностика муковисцидоза могла быть осуществлена только во втором триместре с привлечением методов биохимического тестирования.

Во всех 88 семьях, подвергшихся биохимической пренатальной диагностике муковисцидоза, был проведен ретроспективный ДНК-анализ. Диагноз муковисцидоза был подтвержден либо прямым тестированием delF598, либо с помощью косвенных методов молекулярного анализа в 16 из 18 семей, которым было рекомендовано прерывание беременности. 2 семьи из этой группы оказались неинформативными в отношении delF508 и использованных для ПДРФ-анализа полиморфных сайтов рестрикции. Наибольший интерес представляет ДНК-анализ семей, для которых была невозможна однозначная интерпретация результатов тестирования активности кишечных ферментов в амниотической жидкости. В 30% этих случаев (4 из 13) ребенок был болен и это значение не отличается достоверно от начальной 25% вероятности риска муковисцидоза в обследуемых семьях. Никакой закономерности между конкретными значениями показателей активности кишечных ферментов и болезнью плода выявить не удается. Это означает, что при расхождениях в показаниях кишечных ферментов, либо при позднем обращении семей в центр (после 19 недели беременности) * .биохимическая пренатальная диагностика муковисцидоза невозможна.

По результатам пренатальной диагностики муковисцидоза. выполненной в нашем центре в 161 семье с 25% риском повторного рождения больного ребенка можно сделать следующие выводы. В 11% случаев мы не могли дать определенных рекомендаций по поводу прерывания или продолжения беременности на момент проведения диагностики, так как не могли составить однозначного заключения по поводу состояния плода по результатам биохимического анализа. Именно в этих семьях были выполнены ложно-положительные прерывания беременности, частота которых

составила 5.6+2.855 (9 из 161). С разработкой методов ДНК-диагностики подобные ошибки могли быть исключены, практически, во всех случаях. Частота ложно-отрицательных диагнозов в нашем центре составила 1.2+0.6% (2 из 161). причем мы также могли бы их исключить при привлечении методов молекулярного анализа.

Таким образом, ^прямая идентификация мутаций в гене муковисцидоза в сочетании с ПДРФ-анализом может обеспечить информацией для проведения пренатальной диагностики., практически, во всех полных семьях. Однозначная ДНК-диагностика возможна только в 60% тех семей,- где больной ребенок не доступен для анализа. Всего было- предотвращено рождение 37 детей с муковисцидозом. Доля больных детей среди 161 тестировавшихся плодов составила 24.2%.

Миодистрофия Дюшенна.

Проведено молекулярное обследование 126 семей с миодист-рофией Дюшенна, большинство из которых (71) состояло на учете в Медико-Генетиическом Центре Санкт Петербурга, а остальные .были из центральной части России (Московская группа). С помощью трех мультиплексных полимеразных цепных реакций опредег ляли наличие делеций в промоторной области и в 14 различных экзонах дистрофиново,го гена, а именно Рш+1. 6. 8, 12, 17, 19, 42, 43. 44. 45. 47. 48. 50. 52. Экзоны 8. 17, 19. 44. 45. . 48 тестировали одновременно в одной мультиплексной реакции; Рш+1' и экзоны 43. 47, 50. 52 - во второй и экзоны 6, 12, 42, 47 -в третьей реакции. При отсутствии делеций диагностику осуществляли путем анализа 7 внутригенных и фланкирующих полиморфных сайтов рестрикции.

У 49 пациентов с миодистрофией Дюшенна из 119 обследованных (41%) были обнаружены делеции в гене дистрофина различной протяженности и локализации. 29 этих пациентов были из петербургской группы и 20 - из московской. Длина и положение каждой делеции по отношению к кДНК дистрофина схематически изображено на рис. 3. Делеции одного специфического экзона были зарегестрированы в 21 случае, у 23 пациентов были делетирова-

ны более протяженные участки гена, захватывающие от 2 до 14 экзонов и у 5 больных идентифицированы очень крупные"делеции, в которые были вовлечены от 30 до 40 экзонов, -18 делеций, преимущественно крупных (свыше 10 экзонов в длину), сконцентрированы в 5' конце БМО-гена (экзоны 6-20). 36 делеций длиной от 1 до 6 экзонов занимают дистальную часть гена (экзоны 43-52). Делеции. включающие экзоны 17 и/или 19 зарегистрированы в 18.3% всех идентифицированных делеций (9 из 49) и они составляют мажорную группу мутаций 5' конца гена."

У 70 ВШ-пациентов делеций в исследуемых районах гена не обнаружено и в диагностических целях в этих семьях был проведен ПДРФ-анализ. Такой же анализ выполнен в 24 семьях с делё-- циями в тех случаях, когда необходимо было провести диагностику гетероз^отяого носительства мутации. у ближайших родственниц больного. 76 семей из 94 обследованных, то есть 80%, оказались полностью информативными хотя бы в отношении одного из использованных полиморфных маркеров. И в этих семьях могла быть проведена дифференциальная пренатальная диагностика миодистрофии Дюшенна с использованием косвенных методов молекулярного анализа. В 18 семьях такая диагностика не могла 'быть осуществлена с теми маркерами, .которые были использованы в данном исследовании. Для идентификации мутант-ной Х-хромосомы в этих семьях необходимо привлечение других более информативных полиморфных маркеров и, прежде всего, внутригенных вариабеильных микросателлитных последовательностей.

. "В 42 из 48 семей, нуждающихся в определении гетерозиготного носительства мутаций в гене диетрофина у родственниц больного миодистрофией Дюшенна, такой анализ удалость провести, так как использованные полиморфные маркеры оказались в этих семьях информативными. С вероятностями от 90 до 95% носи-тельство мутации было подтверждено у 20 членов.этих семей и . отвергнуто у 32.

Пренатальная диагностика миодистрофии Дюшенна проведена в 22 семьях. При проведении пренатальной диагностики молекулярный анализ сопровождали обычным анализом кариотипа плода на препаратах, приготовленных непосредственно из биоптатов хори-

GHa без предварительного культивирования клеток. Только в одной семье не удалось поставить диагноз у плода мужского пала. В этой семье делений у больного пробанда не обнаружено, а позднее обращение семьи в диагностический центр не. позволило провести косвенную молекулярную диагностику состояния плода с использованием всех имеющихся в нашем распоряжении полиморфных мыркеров. По "желанию родителей эта беременность была прервана. Диагноз миодистрофии Дюшенна у этого плода был доказан в последствии при паталогоморфологическом обследовании абортуса. В 18 семьях методы молекулярного анализа позволили поставить" дифференциальный диагноз у мальчиков и быяеить гетерозиготное носительство мутации у будущих девочек. У 3 де-Еочек носительство мутации не установлено, так как семьи оказались неинформативны в отношении использованных ПДРФ-марке-ров.

У 18% ' пациентов с делециями в нашей выборке отсутствуют экзоны 17 и/или 19 С даже без учета группы крупных делеций. включающих эти экзоны). Эта цифра в 4.5 раза выше той частоты (4%). которая зарегистрирована для делеций этих экзонов в известных объединенных исследованиях громадной выборки ' из 400 . пациентов, страдающих миодистрофией Дюшенна. Присутствие бол-шой доли (около 10%) относительно крупных делеций, захватывающих два района локализации "горячих точек" делеций, также отличает наши популяции от других исследованных выборок больных. в которых доля подобных мутаций не превышает 1-22. Эта делеции выявлены у пациентов с наиболее тяжелыми "формами за-' болевания.

Гемофилия А.

Впервые на выборке-популяции Санкт Петербурга проведен ПДРФ-анализ по двум сайтам p5l.61/HindIII и pi.8/BglI, локализованным внутри гена F8C, мутации в котором вызывают гемофилию А. а также- по одному внегенному полиморфному сайту рестрикции, сцепленному с этим геном. - St-14/Taql. Работа выполнена на 30 донорах, и 30 семьях, включая 35 больных гемофилией А и 24 матери больных и 51 других родственников

больного пробанда. Всего обследовано 140 человек.

Спектр аллельного полиморфизма по локусу Б^и/Тач! отличается особенно большим .разнообразием. В нашей-выборке нормальных хромосом выявлено 10 различных аллелей и 5 аллелей обнаружено среди мутантных хромосом. Такая вариабельность сайтов рестрикции дает при блот анализе весьма характерный паттерн аллелей с молекулярной массой от 3.4 до 6.6 тысяч пар оснований, нередко уникальный для каждого индивидуума. Наличие большого количества достаточно частых аллелей, сходство их спектров среди нормальных и мутантных хромосом, а также отсутствие достоверных различий по частотам аллелей между этими.классами хромосом позволяет предпологать высокую инфбр-мативность этого сайта для диагностики гемофилии А. Частоты различных типов 2ь-14 аллелей в отечественной популяций, в целом, хорошо коррелирует с аналогичными показателями в популяциях Западной Европы и Северной Америки. Вместе с тем в наших исследованиях были обнаружены два дополнительных, ранее не описанных аллеля размером 4.32 и 4.2 тысячи пар оснований, частота которых, однако, достаточно низка (1.7 и 0.8%, соответственно). В отличие от Б^и оба внутригенных зонда выявляли полиморфизм лишь по одному сайту рестрикции, причем информативная ценность этих локусов относительно невелика. В обоих случаях соотношение аллелей в петербургской популяции не отличалось от известных литературных данных. ;

При обследовании 30 семей с гемофилией А оказалось, что в 25 из них матери гетерозиготны хотя бы по одному из тестировавшихся молекулярных маркеров, чаще всего по сайту 51-14Л^1. Таким образом, при возможности обследования больного пробанда эти семьи становятся информативными в отношении проведения пренатальной диагностики гемофилии А, причем подобная диагностика может бать осуществлена уже в первом триместре беременности. В данном исследовании доступными для анализа оказались больные лишь в 21 семье. По частотам исследуемых аллелей пациенты с гемофилией А не отличались от здоровых доноров.

Анализ родословных семей с использованием метода молекулярной маркировки мутантных хромосои с помощью зонда

позволил подтвердить.гетерозиготное носительство гемофилии А у 11 и отвергнуть у 2 женщин из группы высокого риска с вероятностью. около 95%. При помощи внутригенных зондов наличие мутации в одной копии гена Г8С установлено у 5 из 6 обследовавшихся родственниц больного, причем точность заключения в случае использования внутригенных зондов превышает 99%.

Полученные результаты доказывают несомненную перспективность молекулярного подхода для выявления гетерозиготного носительства и пренатальной диагностики гемофилии А. Вместе с тем. они показывают, что эффективность молекулярной диагностики в значительной мере предопределяются полнотой и качеством предшествующего медико-генетического анализа и гематологического обследования семей высокого риска. Большие родословные. доступность образцов крови для выделения ДНК в сочетании с точными результатами коагулограмм и иммунофермент-ными данными об уровне фактора УШ у потенциальных гетерозиготных носителей, особенно у матерей пробандов. - непременные условия рациональной организации ДНК-диагностики.

Заключение.

Результаты проведенных исследований явились основой организации в Санкт Петербурге биохимической и молекулярно-ге-нетической пренатальной диагностики и профилактики тяжелых врожденных пороков развития, обусловленных открытыми дефектами йервной трубки плода, и трех моногенных наследственных заболеваний - муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна и гемофилии А. Пренатальная диагностика этих состояний впервые была осуществлена в Институте Акушерства, и Гинекологии Санкт Петер-берга в лаборатории, возглавляемой профессором В. С. Барановым.

Представленная работа, экспериментальная часть которой была завершена в 1992 году, является коллективным творчеством многих сотрудников этой-лаборатории, работавших в руководимой диссертантом группе по молекулярной генетике. За это время в группе были подготовлены квалифицированные специалисты, способные к самостоятельным разработкам и исследованиям в области молекулярной медицины. Б последующие годы представляв-

мые к защите исследования были не только продолжены, но и дополнены и расширены, практически, пс всем направлениям, затронутым в диссертации. Так, по молекулярной генетике муко-висцидоза в лаборатории подготовлены и защищены две кандидатские диссертации Т.З.Иващенко и К. Агбанглы. Подготовлены к защите диссертации М.В.Асеева по генетике и молекулярной диагностике коагулопатий, в том числе гемофилии А, и О.В.Артемьевой - по миодистрофии Люшенна. Проведен углублений" анализ биохимических аспектов пренатальной диагностики ДЗНТ и муковисцидоза в принятой к защите кандидатской диссертации Т. К. Кащеевой.

В последние годы в соавторстве с В.С.Барановым подготовлена к печати монография, рассчитаная на достаточно широкую аудиторию медиков и биологов "Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний." Эта книга вполне может рассматриваться в качестве учебного пособия по молекулярным основам медицинской генетики и служить справочным пособием для большинства из уже состоявшихся в этой области специалистов.

ВЫВОДЫ.

1. Определены средние значения и пределы нормальной изменчивости иммунореактивных форм пяти мажорных сывороточных белков - альбумина, трансферрина, альфа-1-антитрипсина, ал-фа-фетопротеина (АФП) и церулоплазмина. в амниотической жидкости женщин второго триместра беременности! а также в крови плода; концентрации сывороточных белков амниотической жидкости и крови плода в период с 16 по 22 недели беременности характеризуются определенной стабильностью; при некоторых патологических состояниях (пиэлонефрит, краснуха, угрожающий выкидыш) наблюдаются достоверные отклонения изучаемых показателей от нормы.

2. Разработан и внедрен в клиническую практику' Санкт Петербурга комплексный подход для профилактики тяжелых врожденных пороков развития, связанных с дефектами заращения нервной трубки (ДЗНТ) плода, включающий скрининг беременных на АФП, УЗЯ и биохимическую пренатальную диагностику ДЗНТ у беременнх женщин из группы высокого риска; повышенный уровень АФП в сочетании с появлением необычной формы холинэсте,-•разы в амниотической жидкости являются надежными критериями наличия открытых ДЗНТ у плода.

3. Изучена динамика активности трех ферментов' микроворсинок кишечника плода и четырех -типов дисахаридаз в амниотической жидкости женщин второго триместра беременности в норме при муковисцидозе у плода;% активности гамма-глутамилт-ранспептидазы, амйнопептидазы, кишечной формы щелочной фосфатазы, сахаразы, -мальтазы, лактазы и трегалазы в амниотической жидкости прогрессивно снижаются с 16 по 23 недели; при муковисцидозе у плода наблюдаются достоверно более низкие показатели активности всех трех ферментов микроворсинок кишечника плода; по этим критериям биохимическая пренаталь-ная диагностика муковисцидоза на сроках 17-19 недель беременности возможна в 90% отечественных семей, высокого риска с

точностью, превышающей 95%; дополнительное исследование активности дисахаридаз в амниотической жидкости не" повышает разрешающей способности биохимической пренатальной диагностики муковисцидоза.

4. Впервые в отечественных популяциях исследован аллельный полиморфизм маркерных локусов, ассоциированных с генами му-ковисшлоза (Мегн/Мэр!. МеШ/Тая1, J3.ll/Mspl, J3.ll/Taql, ХУ2с/Тач1, С37/Н1п61, КМ19/Рзи. MP6d9/Mspl);' миодистрофии Дюшенна (ХЛ.1/Тая1, рЕИТ87.15/Тач1, рЕИТ87.15/ВалШ, рЕКТ87.8/Тад1, p754/Pstl) и гемофилии. А (ЗШ/Тасз1, р1.в/ВиИ, р51.б1/Н1п<Ш1); частоты полиморфизма изученных сайтов рестрикции в отечественных популяциях не отличаются от показателей,д характерных для популяций Западной Европы и Северной Америки; эти полиморфные локусы могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров при проведении дородовой ДНК-диагностики и определения гетерозиготного носи-тельства мутаций в соответствующих семьях высокого риска в России.

5.'Впервые проведены скринирующие исследования по геноти-пированию мутации <Зе1Г508 в СПй гене у больных муковисцидо-зом Северо-Западного региона страны; частота делеции Г508 составила 50% и оказалась достоверно ниже, чем в сранах Северной Америки и Северо-Запада Европы; при сочетании биохимического и молекулярного подходов пренатальная диагностика*

, йуковисцидоза может быть осуществлена более, чем в 95%.отечественных семой высокого риска с точностью, превышающей 99?.

6. Методами мультиплексной.ПЦР впервые в России проведена молекулярная идентификация делеций в гене дистрофина у больных с миопатией Дюшенна; внутригенные делеции обнаружены у 45% отечественных больных; при сочетании прямых и косвенных методов ДНК-анализа, основанных на использовании сцепленных с геном дистрофина полиморфных сайтов рестрикции, дифференциальная диагностика миодистрофии Дюшенна возможна более,

чем в 65% российских семей высокого риска.

7. В соавторстве с профессором В.С.Барановым подготовлена к изданию монография "Введение в молекулярную диагностику и генотерага® наследственных заболеваний", предназначенная для врачей, медицинских генетиков, ординаторов, аспирантов и студентов медицинских ВУЗов и биологических факультетов Университетов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. baranov, V..S.. Gorbunova. V. N.. Ivaschenko. Т.Е.. Voronina, 0.7., Gaitskhcki. V.S., Romanenko, O.f.. Kaboev. O.K., Goiczov. A.A., ana Shwartz. E.I. .(1989). Biocntmical and molecular studies of cystic fibrosis in pre-.and, postnatal ctages of human development. 16 ANN MEETING OF THE "Ш0Г WORK GR FOR CF 158.

2. Baranov. V.S., Ivaschenko, Т.Е., Gorbunova. V. N.. Voronina, 0.V., Livshltz. L.A., Venozinskls, M.T.. Romanenko. O.P.. Goltzov. A.A.. Shwartz, E.I., and Kalinin. V.N. (1990). Allelic polymorphism of DNA loci.closly. linked to CFrgene In

affected and non-affected persons from different populations of the USSR. Pedlatr. Pulmonology Suppl.5.

199. ■\Ьзtract)

2. Baranov, V.S.. Ivaschenko, Т.Е., Gorbunova. V.N.. Livshltz. L.A.. Venozinskls. M.T., Gembovskaya. S.A., Kalinin, V. N.. Romanenko. O.P.. Gembltzkaya, Т.Е., Orlov, A.V., Kapranov. N. I., Lebedev. v.M.. Mlhailov. A.V.. Plglna. T.V.. and

"hwed, N.Y. (1991a). Frequency of the F508 deletion In cystic fybrosls patients from the European part of the USSR. Hum Genet 87. 61-64. . .

1. 'F*ranov. V.S., Gorbunova, V. N., Ivaschenko, Т.Е., Shwed, Osinovskaya. N.. Kascheeva. Т.К., Lebedev, V.M., Mi-naiiov, a.v., Vakharlovsky. V.G.. and Kuznetzova. Т.Е. • IWife'. Five years experience in prenatal diagnosis of cystic fibrosis in the USSR. Prenat Dlagn 12. 127-135.

5. Baranov, V.S., Gorbunova. V.N.. Ivaschenko. Т.Е.. Shwed, N.Y.. Malisheva. O.V.. Aseev. M.V., Kascheeva. Т.К.. Lebedev. V.M.. Mlhailov, A. V., Vakharlovsky, V.G., and Kuznetzova. Т.Е. (1991c). Five years experience In prenatal dlag-, nosis (PD) of inherited diseases In north-european part of

the USSR. Ann Meet Euorop Soc Hum Genet 162.

6. Baraflov, V.S.. Gorbunova. V.N., Ivaschenko, Т.Е..• Stored. N.Y., Oslnovskaya. N.. Kascheeva, Т.К.. Lebedev. V.M.. Ml-hallov. A.V.„ Vakharlovsky. V.G., and Kuznetzova, Т.Е. (1991d). Diagnostic prenatal de la mucovlscldose en Russle. LePedlatre.120, 20-27.

7. Baranov. V.S.. Ivaschenko, Т.Е., Gorbunova, V.N.. Oslnovskaya, N.. and Gembovskaya, S.A. (I991e). Five years explrl-ence in molecular analysis of cystic fibrosis in the USSR. Pediatry Pulmonology Suppl.6, 244.

8.. Gorbunova. * V.N., Maiisheva. O.V., Krasilnlkov, V.V.. Ayla-mazyan, Е.К./ and Baranov. V.S. (1990). Deletion screening, heterozygote detection and prenatal diagnosis (PD) in Duchenne muscular dystrophy. 5th INTERN CONGR ON EARLY FETAL DIAGN 83.

9. Gorbunova. V.N., Ivaschenko. Т.Е.. and Baranov. V.S. (1991), Molecular markers and CFTR gene analysis in prenatal diagnosis of cystic fibrosis. Proceed 8th. Intern Congr • Hum Genet 173: . •• ' •

10. Ivaschenko, Т.Е., Gorbunova, V.N., and Baranov, V.S. (1990a). Deletion F508 of cystic fibrosis -<CF) gene in car-' rier detection., and prenatal diagnosis of CF. 5th INTERN CONGR ON EARLY FETAL DIAGN 117.

11. Ivaschenko. Т.Е., Baranov. V.S., Gorbunova, V.N.. Lebedev, V.M., Mihailov, A.V., and Plgina, T.V. (1990b). Molecular analysis of T508 deletion in CF-patlents and in foetuses at CF-rlskin the USSR. Pedlatr. Pulmonology Suppl.5.-201.

12. Асеев,. M.B.. йващенко, -Т.Э.. Горбунова, В.Н., Андреева, Т. А., Хролова, П.В., Папаян, Л.П.. Кузменко, Е.Л.," Баранов. B.C. (1989). Выявление гетерозиготного носительства и пре-

натальная диагностика гемофилии А при помощи ДНК-зондов. Гематология и трансфузиология 11, 10-13.

13. Асеев. М.В.. Иващенко, Т.3., Горбунова. В.Н., Баранов. B.C. (1990). ПДРФ-анализ и диагностика гемофилии А при помощи * ДНК-зондов. Биополимеры и клетка 6, 45-51. -

14. Баранов. B.C., Горбунова, В.Н.. Эльгарт, И.Я., Пигина,'Т.В. (1988). Комплексный.ультразвуковой, биохимический и цитоге-нетический подход в пренатальной диагностике наследственных,, болезней. Ультрозвуковая диагн. в перин, и педиатрии, -30-31.

15. Баранов, В. С.,"^Попова, М.В., Новикова, Л.Н.. Эльгарт. И.Я., Харченко, Т.В., Михайлова. Е.П., Горбунова, В.Н., Пигина, Т.В., Цуладзе, Л.Н., Юров, Ю.Б., Александров, И.А. (1990). Цитогенетическое исследование хориона человека с целью пренатальной диагностики наследственных болезней. Цитология 32. 74-78.

16. Барсов, B.C., Иващенко. Т.Э., Горбунова, В.Н., Дин, М. (1990b). Частота делеции F 508 гена муковисцидоза у больных и в семьях высокого риска отечественных популячий. Докл. АН СССР 313. 446-448. :

17. Баранов. B.C., Горбунова, В.Н., Иващенко. Т.Э. (1991). Пре-'

. "натальная диагностика, медико-генетическое консультирование и профилактика муковисцидоза (кистозного фиброза). (Москва: Миниздрав СССР).

18. Вахарловский В.Г., Горбунова В.Н., Кащеева Т.К. (1995). Исследование содержания альфафетопротеина в сыворотке крови беременных как критерий наличия врожденных пороков развития у плода. Акушерство и гинекология 4. стр. 22-24.

19. Горбунова, В.Н., Баранов, B.C. (1996). Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболева-

ний. Санкт Петербург: из-во "Специальная литература" (в печати). * . •

20. Горбунова В.Н., Вахарловский В.Г.. Баранов B.C. Содержание некоторых сывороточных белков в крови женщин на разных сроках беременности, у плода и в амниотической жидкости. Материалы XX научной сессии НИИАГ им. Д. 0.Отта АМН СССР.- апрель 1991 г.- Ленинград.- стр.40-41.

.21. Горбунова В.Н.., Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К.. М.И.Шумилина. Н. Г.Финберг. О скринировании беременных по содержанию альфа-фетопротеина' в крови.-' Материалы XX научной сессии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.0.Отта АМН СССР.- апрель. 1991,- Ленинград.- стр. 42- 45.

22. Горбунова. В.Н.. Вахарловский. В.Г.. [Павловский, М.М.. Мар-тыншин, М.Я., Баранов, B.C. (1988). Содержание некоторых белков в амниотической жидкости в разные сроки беременности. Вопросы охраны материнства и детства 3. 52-55.

23. Горбунова. В.Н.. Иващенко. Т.Э.. Баранов. В.с:" (1990). Пре-натальная диагностика муковисцидоза. Комплексный биохимиг ческий и молекулярно-генетический подход. Материалы 11 Все-союзн. Сьезда Мед.,' Генетиков. 106.

24. Гбрбунова, В.Н., Красильников, В.В., Асеев;'М. В.. .Санцевич, ' Н.В., Баранов, B.C. (1990). ПДРФ-анализ гена миодистрофии Дюшенна в Ленинградской популяции и в семьях высокого риска. Биополимеры и клетка 6. 52^55.

I

25. Горбунова. В.Н., Романенко, О.П., Вахарловский, В.Г., Питана, Т.В., Калашникова, Е.П., Моисеенко, M.М., Эльгарт, И.Я., Баранов. B.C. (1989). Исследование активности ферментов амниотической' жидкости в пренатальной диагностике муковисцидоза. Генетика 25. 1664-1672.

26. Горбунова, В.Н., Эльгарт, И.Я.. Баранов. B.C. (1988). О

ферментативном методе дородовой диагностики муковисцидоза. Биохимия медицине 70, 36. . '

27. Иващенко. Т.Э., Вахарловский, В.Г.. Горбунова. В.Н., Джоло-хаваС.С., Баранов, B.C. (1996). Генеалогическое и молеку-лярно-генетическое исследование муковисцидоза в Грузии. Материалы генеалогической конференции 1992 г. стр 18-19.

28. Иващенко, Т.3., Горбунова, В.Н., Асеев. М!В.. Баранов. B.C.. Виноградов. C.B.. Берлин. D.A.. Гольцов, В.А.. Кабо-ев. O.K. Шварц. Е.И. (1990). Анализ рестрикционного полиморфизма ДНК-локуса D7S23 при помощи зонда КМ-19 методом цепной реакции синтеза ДНК в популяциях и в семьях больных муковисцидозом^ Биополимеры и клетка 6. 55-60.

29. Иващенко. Т.Э., Горбунова, В.Н., Баранов, B.C. (1990). Новые молекулярные подходы в пренатальной диагностике муковисцидоза. Материалы 1 Всесоюзн. конф. "Геном человека". 158.

30. ИваЩенко. Т.Э., Лившиц, Л.А., Гембицкая, Т.Е., Амоаший, Д.С.. Веножинскис, М.Т., Горбунова. В.Н.. Баранов. B.C..

(1991). Сравнительный анализ частоты делеции F508 у больных муковисцидозом. Билполимеры и клетка 7. 49-52..

31. Кащеева Т.К., Горбунова В. Н.. Иващенко Т. И.. Бакай М.А. '

, "(1994). Анализ соответствия фенотипа и генотипа у плодов с муковисцидозом. Материалы XXIII научной сессии НИИАГ им-.Д. О.Отта РАМН. - октябрь 1994 г. - СПб. стр. 102-103.

32. Малышева, О.В., Горбунова. В.Н.. Красильников. В.В., Баранов, B.C. (1991). ПДРФ-анализ и скрининг делеций в семьях больных миодистрофией Дюшенна (МДЦ). Биополимеры и клетка 7, 98-102.

г

33. Шварц. Е.И., Иващенко. Т.Э., Гольцов, В.А., Кабоев. О.К, Горбунова. В.Н.. Баранов. B.C. (1989). Использование мето-

дов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. для анализа частоты рестрикционного полиморфизма ДНК-локуса еэ-7 в популяции и в семьях больных муковисцидозом. Докл. АН СССР 307. 467-469.

3. 172-100. 02.04.96. Тип. АО "Светлана".