Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые белки амниотической жидкости в пренатальной диагностике врожденных пороков и муковисцидоза плода

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые белки амниотической жидкости в пренатальной диагностике врожденных пороков и муковисцидоза плода"

Г 5 л п

на правах рукописи

ЩЕЕВА Татьяна Константиновна

НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ АШШОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ 8 ПРЕНАШЫШ ДИАГНОСТИКЕ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ й ЫУКОВКСЦИДОЗй ПЛОДЙ

Специальность - 03.00.04 - биохииия

Автореферат диссертации на соискание цченой степени кандидата биологических надк

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний Нацчно - исследовательского института акуверства и гинекологии РАМН им.Д.О.Отта

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.С.Баранов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.В.Пучкова

доктор биологических наук, профессор А.В.Арутвнян

Ведущее учревдение: Научный Медико-генетический Центр, Москва.

Завита состоится "271995 г. в " " часов на заседании Диссертационного совета СК 001.23.01) при Научно -исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12)

С диссертацией мовно ознакомиться в библиотеке НИИйГ РАМН по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3.

Автореферат разослан "26" 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

О.Г.Куликова

ВВЕДЕНИЕ

AKT'WílMIOCTJ. ТЕКИ, На дояв наследственных заболеваний и ¡¿рожденных пороков развития /ВПР/ nnwvn«»--; детской < парувения

„а.чмитчг центральной нервной системы /Щ!С/ составляют более 30% всех врожденных пороков. Одной из наиболее частых причин врожденных аномалий ЦНС является дефекты заражения нервной трубки - ДЗНТ СЛазюк и др..1989). В конце 70-ых годов в ряде стран Западной Европы, а в конце 80-х годов в отдельных регионах нажей страны был начат скрининг беременных по содержанию в сыворотке крови иатеря эаппнок-ггтсинйическогп белка альоафртелргтеана /АФП/ для определения группы высокого писка рондения ребенка с врожденными пороками развития /ВПР/ к, преаде ¡¡сего, с ДЗНТ (Гречанина, 1390).

Речас^аги!» в пренатальной диагностике ВИР и, в частности. Д.'ШТ является ультразвуковое скринирования. Однако, это исследование не всегда является информативным, и в тех случаях, когда с помодьв УЗ исследования не удается выявить причину повывения ПФП в крови беременной аенаины, на первое место выдвигается биохимические методы тестирования содержания этого фермента непосредственно в амниотической пидкости /AS/. Диагностическая ценность этого теста для выявления iTJHT существенно возрастает, если наряда с ЙФП в AS проводится измерение уровня и спектра изоформ холинзетераз /ХЭ/ и, в первую очередь, ацетилхолинэстеразн /ПХЗ/ f Sai ib ¡;t. al.. 1979: Chtibb et al. 1976 ). Динамика изменения ЙФП в амниотической жидкости, так se как и в сыворотке крови беременных, даае в норме мозет существенно варьировать в зависимости от срока беременности, состояния плода и ряда индивидуальных особенностей. Количественные характеристики изменений ЙФП в амниотической жидкости при патологии у плода в литературе отсутствуют. Поэтому изучение этих показателей является первоочередной задачей при разработке биохимических подходов в пренатальной диагностике ВПР и особенно, ДЗНТ на ранних сроках беременности.

Наряду с ЙФП и ХЗ важное диагностическое значение имеют исследования в амниотической жидкости комплекса ферментов, продуцируемых микроворсинками кимечника плода /ФМКП/. Зстановлено (Brock, 1983), что анализ этих ферментов имеет

режавщее значение для пренатальной диагностики муковисцидоза /ИВ/ - самой распространенной моногенной болезни человека (Капранов, Рачинский, 19Э5). По ориентировочным оценкам ежегодно только в России рождается около 1500-2000 детей с МБ (Капранов, 1992).

С 1383 по 1985 год анализ белков АЕ, таких как гаммаглцтамилтранспептидаза, аминопептидаза и щелочная фосфатаза, был, по сути, единственным способом пренатальной диагностики этого тяжелого, часто летального заболевания. После картирования гена муковисцидоза, его секвенирования и идентификации мутаций, основными в пренатальной диагностике стали методы ДНК-анализа. Однако, по опыту Лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней ИйГ РАКН в 802 семей высокого риска, обрачавцихся на пренатальнув диагностику, больной МБ ребенок уже умер, таким образом эти семьи является неинформативными для непрямой

ДНК-диагностики. Прямая же ДНК-диагностика путем

идентификации мутаций, согласно нажим данным, возможна только в 60-652 семей (Вагапоу е1 а!..1992). Следовательно, и в настоящее время в России биохимическая диагностика муковисцидоза продолжает оставаться весьма актуальной.

ЦЕПЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью данной работы является исследование содержания ряда белков в амниотической жидкости на разных сроках беременности в норме и при различных патологических состояниях плода; разработка на этой основе наиболее рациональных критериев пренатальной диагностики врожденных (ДЗНТ) и наследственных (муковисцидоз) пороков развития.

Б соответствии с цельи исследования в работе были поставлены следувцие задачи:

1. Исследовать динамику содержания АФП в амниотической жидкости в зависимости от срока беременности в норме и при различных патологических состояниях у плода.

2. Провести качественный и количественный анализ АХЗ в А! в норме и при врожденных пороках.

3. Изучить особенности изменения активностей ФМКП в зависимости от срока беременности и состояния плода у пациенток группы высокого риска рождения детей с КБ.

4. Разработать и внедрить автоматизированную систему оценки риска ИВ у плода на основе биохимического исследования

ферментов микроворсинок кивечника плода вс второй триместре беременности .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

- впервые получены нормальные значения дровней аяьфафетопротекна и ацетилхолинэстеразы в акниотической жидкости женчин разных сроков беременности. проживавших в Северо-Западном регионе России.

- впервые в России проведена комплексная оценка количественного содержания ЙФП и присутствия специфических изоформ ХЗ в амниотической жидкости при различных врожденных пороках плода.

- получены оценки средних значений «едкая и дисперсии активностей гаммаглутаиилтранспептидазы, аминопептидазы, обчей и киаечной «елочной фосфатазы при разных сроках беременности в акниотической жидкости женщин из группы высокого риска по рождении детей с муковисцидозом.

- изучено содержание этих же ферментов при муковисцидозе плода;

- выявлена корреляция между активность® ферментов микроворсинок кивечника в акниотической жидкости женщин из группы высокого риска по муковисцидозу и наличием мутации de1F508 в гене муковисцидоза у плода.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны количественные и качественные критерии для проведения пренатальяой диагностики врожденных пороков развития плода на основе биохимического исследования белков амниотической жидкости во Iî-м триместре беременности.

Результаты диссертационной работы учтены при составлении практических рекомендаций по организации и проведению в нааем городе скринирувзих программ по оценке содержания ЙФП в сыворотке крови беременных женщин с целью профилактики ДЗНТ у новорожденных. Программы внедрены в практику в Медико-генетическом и Городском Диагностическом Центрах Санкт-Петербурга. Схема обследования беременных с аномально высокими или низкими показателями содержания ЙФП в сыворотке крови передана в женские консультации города.

Отработаны принципы биохимической ПД муковисцидоза во втором триместре беременности. Создана и опробована компьютерная программа оценки риска наличия MB у плода на основе биохимических исследований fil. Программа содержит базу

данных к расчетную часть. База данных позволяет использовать проведенные измерения медиан для каждого срока беременности в качестве отправной точки для начала пренатальной биохимической диагностики МБ в диагностических центрах страны. Расчетная часть содервит таблицу экспертных оценок риска заболевания плода, построенную на основании пятилетнего опыта Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РйИН. Данная программа существенно повывает эффективность и надевность пренатальной диагностики МБ биохимическими методами.

Полученные результаты вовли в методические рекомендации по пренатальной диагностике MB, изданные КЗ СССР (1991).

Проведена биохимическая пренатальная диагностика муковисцидоза в 270 семьях высокого риска и предотвращено ровдение 70 больных детей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ Нй 3<ОДТН:

1. Нормальная изменчивость уровня альфафетопротеина в амниотической видкости достигает 302, что необходимо учитывать при проведении пренатальной диагностики ВПР у плода.

2. Найдены количественные различия по уровню альфафетопротеина в амниотической видкости при анэнцефалии, спинномозговой грыве и дефектах передней брювной стенки плода, что существенно для дифференциальной диагностики соответствующих пороков развития.

3. Доказана четкая корреляция ДЗНТ у плода с наличием специфической изоформы ХЗ в амниотической видкости; данный тест позволяет с высокой достоверностью дискриминировать зту патологию от ловно-половительных случаев высокого содержания ЙФП в амниотической видкости.

4. В 902 семей из группы высокого риска по муковисцидозу возмовно проведение пренатальной диагностики этого состояния на основании биохимического анализа белков fii во П-м триместре беременности. Это особенно вавно для семей, неинформативных или частично информативных в отновении ДНК-диагностики муковисцидоза.

5. Использование разработанной компьютерной программы оценки риска существенно повывает надевность и эффективность пренатальной диагностики муковисцидоза биохимическими методами.

6. Выявлена корреляция месду активностью ферментов

- У -

микроворсинок кивсчника плода в амниотической жидкости и наличием мутации delF508 в его генотипе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на Всесоюзных и Международных симпозиумах и конлеро?»;;:"::: нп XIX, XX. XXI и ШН пзц'пшх снспиях НИИАГ и^.й.О.Отта С1390, Н'М. 1332. 1>. на Первом (Третьей) Российском съезде медицинских генетиков (1934. Москва). на ежегодней конференции Европейского Общества генетики человека (Бельгия, 1991). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация содержит следущие разделы: введение, обзор литература, материала и методы исследований, результаты и обсуждение, вывод«, заключение, список литератдры. Работа изложена на страницах мажинописного текста и иллюстрирована 14 таблицами и В рисунками. Список литературы содержит 35 отечественных наименований, и 81 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛ« И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ,

Образцы амниотической жидкости беременных различных сроков были получены при амниоцентеэе, проводиыоы в НИИАГ РАМН по недико-генетическим показаниям. Точный срок беременности определялся по параметрам ультразвукового исследования акужерами - гинекологами М.Е.Гусевой и В.И.Лебедевым (НИИАГ РАМН) при обследовании беременных, направляемых на пренатальнув диагностику. Забор крови беременных с 15 по 20 неделю проводили в Лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ во вреня методической отработки городского скрининга для определения группы риска по рождении детей с ДЗНТ. Нами (совместно с врачом В.Г.Вахарловским (НИИАГ РАМН)) была составлена специальная анкета для сбора катамнестических данных. Диагностику пороков плода подтверждали с поиочьв ультразвукового исследования (НИИАГ) и верифицировали при

паталогоанатомическом исследовании.

Содержание альфафетопротеина в AI определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза по Лореллу (Laurell, 1966) с модификациями. Для этого использовали коммерческие антитела и стандартные сыворотки крови плода производства ИЗМ им.Гамйлея

(Диагностику* для определения первичного рака печени и тератобластом). АФП в сыворотке крови определяли методой иммуноферментного анализа, используя стандартные наборы реактивов фирмы ДИЙплюс (Москва). Количественный анализ активности ацетилхолинэстеразы проводился

спектрофотометрически по методу Зллмана (ЕПвап, 1961) с использованием ацетилтиохолинйодида (Sicsa) в качестве субстрата. Качественный анализ проводился разделением в нативном полиакриламидном геле и последующей окраской специфическими субстратами (Si два). Окравивание проводилось по следующей методике: гель 30 минут промывался при комнатной температуре в отмывочном растворе (18 г сернокислого натрия растворяли в 100 мл 70 вК малеата натрия, рН 6,5), затем ночь окравнвался при постоянном покачивании при температуре 25-30 С. Для приготовления краски к 100 мл отмывочного раствора добавляли 0,15 г глицина, 0,06 г хлористого магния, 0,1 г сернокислой меди, и 0,12 г ацетилтиохолинйодида (бромида).

Активность ГГТП, АМП, общей и кищечной форм |Ф определяли путем измерения динамических характеристик оптической плотности растворов, содержащих эти ферменты и соответствующие субстраты, йнализ проводили в 96-ячеечных платах в объеме реакционной смеси, не превыщающем 200 мкл. Изменения оптической плотности регистрировали на приборе Мультискан Плюс ("Labsysteis", Финляндия) при длине волны 405 нм. Методики анализа ферментов соответствовали применяемым в лаборатории Д.Брока (Brock D.,1983). Для определения активности ГГТП 5 мкл амниотической жидкости смешивали со 100 мкл 27,3 мМ/л гамма-глутамил-р-нитроанилида, 273 мМ/л глицил-глицина, 0,2 М 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола и инкубировали при 30 С 20 мин. При использовании набора реактивов гамма-оТР-20 ("Sie»a", CIft) активность ГГТП в Ед/л получали путем умножения разницы между значениями оптической плотности до и после инкубации на предложенный Д.Броком коэффициент 450. Для определения активности ЙМП 10 мкл амниотической жидкости смевивали со 100 мкл 4,2 мМ/л L-лейцин-р-нитроанилида в 0,1 М трис-HCl, рН 7,0 и инкубировали при 30 С 40 мин. Активность АМП в Ед/л получали путем умножения разницы между значениями оптической плотности до и поели инкубации на предловенный Д.Броком коэффициент 112,5. При определении активности общей и кивечной

- ? -

(фенилаланинингибируемой) форм щелочной фосфатазк 10 мкл амниотической жидкости смевивали со 100 икл 5 мК/л р-ннтрофенилфосфата в 0,1 К дизтаноламине (рН 9,8), содержащем 0.28 м/л NaCÎ к 0,5 мН/л MgC12. Измерения проводили в 2 параллельных пробах, в одну из которых добавляли 90 мкл фосфатного буфера, а в другую 90 мкл фосфатного буфера с 5 мМ/л фенилаланина. Смесь инкубировали при 30 С один час. Активность 1Ф в Ед/л получали путем умножения разницы между значениями оптической плотности до и после инкубации на предложенный Д.Броком коэффициент 32.

Результаты обрабатывались с помощью стандартных математических методов, достоверность определяли при помощи критерия Стъвдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Содержание АФП в амниотической жидкости в норме.

Всего исследовано 220 образцов AI, полученных путем аиниоцентеза на 17 - 26 неделях неосложненных беременностей. Для настоящего исследования использовали образцы AI женщин, родивжих в дальнейвем здоровых детей в срок, при этом роды протекали без отклонений от нормы. Для каждой недели беременности была определена медиана распределения содержания белка, максимальное и минимальное значение, среднее арифметическое и среднеквадратичное отклонение. Полученные результаты суммированы в таблице 1.

Средний уровень АФП в амниотической жидкости беременных с высоким риском рождения детей с моногенными заболеваниями и направленных на амниоцентез с целью кариотипирования плода (92 человека) практически не отличался от нормы. Содержание же данного белка в других группах беременных, родивщих нормальных детей, варьировало (см. таблицу 2).

Повышение уровня ЙФП в амниотической жидкости беременных, ранее родивжих детей с дефектами заращения невральной трубки (3? человек), на 17-18 неделях беременности достигает 33 7., Число повторных выявлений плодов с ДЗНТ составило 3.5 У. (2 случая), что соответствует данным других авторов fCzeisel, 1984). Достоверное отклонение содержания ЙФП в AI этой группы беременных от нормы в нажих исследованиях подтверждает мнение о том, что у женщин, уже родивщих детей с ДЗНТ, имеются

какие-то скрытые нарушения обмена веществ, по-видимому, связанные с метаболизмом фолиевой кислоты. Известно, что одной из причин возникновения ДЗНТ является нарушение обмена

Таблица 1

СОДЕРЖАНИЕ АФП В 220 ОБРАЗЦАХ АМНИ0ТИЧЕСК0И ЖИДКОСТИ НА РАЗНЫХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ.

Срок Кол-во Медиана Среднее Миним Макс

(нед) обслед. (мкг/мл) (мкг/мл) откл откл

17 22 9,0 9.7+0,81 4.5 17,5

18 42 8.0 8,9+0,58 2.5 20,0

19 41 6,0 7,0+0,55 1.0 15,3

20 37 6,0 7.4+0.76 2.0 25,0

21 15 5,5 6.0+0.53 3.8 11,0

22 12 5,5 5,3+0.62 2.0 10,0

23 6 5.5 6.3+0.72 5,0 10,0

24 10 4.8 5,5+0.85 3,0 12,0

25 14 4.0 3,6+0.24 2,0 5,0

26 21 4,0 4,3+0,41 2,0 10,0

фолатов (Сге15е1 , 1984). Следующая группа женщин (68 человек) была направлена на амниоцентез в связи с повыжением уровня АФП в сыворотке крови в 2 - 2,5 раза . В данном случае можно предположить, что увеличение нормального содержания белка в амниотической жидкости на 10-12 !'(. было вызвано нарушениями фетоплацентарного барьера. При исследовании зависимости содержания белка в АЖ от возраста матери сравнивались показатели трех групп женщин на тождественных сроках: младшей группы - 124 пациентки (до 25 лет), средней -52 пациентки (от 25 до 35 лет) и старшей - 38 женщин (более 35 лет). Содержание АФП всех трех возрастных групп имело небольшие различия в пределах статистической ошибки. При изучении зависимости уровня белка в АЖ от пола плода было исследовано 62 образца от беременных плодом женского пола и 57 образцов АЖ эквивалентных сроков беременности - плодом мужского пола. Средние показатели содержания ЙФП равнялись 7,2+0,52 и 7,2+0,54 мкг/мл соответственно и статистически не отличались (р>0,05). Зги данные хорошо согласуются с

исследованиями других акторов (ВгиеПеН е1 а].,1987 >.

Таблица С

СОДЕРЖАНИЕ ЙФП В АЙЙИОТКЧЕСКОЙ 1ИДК0СТК НА РАЗНЫХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ У ЕЕН5ИН РАЗЛИЧНЫХ ГРИПП ВЫСОКОГО РИСКА

1енвины с дзнт Еенцины с повышением

Срок 9 плода в анамнезе ЙФП в сыворотке крови

(нед)

Кол-во Медиана Среднее Кол-во Медиана Среднее

С мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл)

1? 11 12 10,8+5,84 _ _

18 10 10 9,8+4.28 4 1С 12.0+4,69

19 13 8 7,7+3.22 3 7 8,313,40

20 13 6 9.5+6,28 6 И 10,5+2,43

21 - - - 5 6 5,2+0,98

22 - - - 9 6 7.3+5,33

23 - - - 4 5 5,210,43

24 - - - 8 5 5.0+1.80

25 - - - И 4 4,1+1.59

26 - - - 18 4 4,3+1,11

Таблица 2(продол«ение)

Женщины с моногенными Женщины старее 35 лет

Срок заб-яии у плода в анамнезе и с нарувенияки кариотипа

(нед)

Кол-во Медиана Среднее Кол-во Медиана Среднее

(мкг/мл) Смкг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл)

17 15 9 9,9+3.62 _ _ -

18 16 9 9.4+2,89 12 6 7,3±2,55

19 16 7 7,6+3,37 8 5 4,6+2.06

20 9 6 7,1+2,33 8 4 4,5+2,40

21 1 6 - 4 4 3.5+0.87

22 - - - 3 3 3,3±0,47

Содержание АФП в А! плодов с пороками развития.

Исследовано 44 образца Й1 плодов с различной патологией. При НЗИ у 20 из них была обнаружена анэнцефалия или анэнцефалия в сочетании со спинномозговой грыжей. Результаты представлены в таблице 3.

Как следует из приведенных данных, практически все случаи дефектов нервной трубки , а также других внутренних органов сопровождались значительным, как правило, многократным повышением уровня АФП в амниотической жидкости.

Таблица 3

СОДЕРЖАНИЕ ЙЛЬФАФЕТОПРОТЕИНЙ И НАЛИЧИЕ И30Ф0РМН

ХОЛИНЗСТЕРАЗН ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ ПЛОДОМ С АНЭНЦЕФАЛИЕЙ

пп АФПСмкг/мл) АФП(Мом) ЙХЗ Срок бер-ти

1 210 35,0 + 19

2 260 47,2 + 21/22

3 18 3,3 + 22

4 600 109,0 + 22

5 140 25,5 + 22/23

6 90 16,4 + 23

7 45 8.2 + 23

8 146 30,4 + 23/24

9 52 13,0 4 25

10 65 16,3 + 25/26

11 16 4.0 + 26

12 67 16.8 + 26

13 80 20,0 + 26

14 50 12.5 + 26

15 30 7,5 + 26/27

16 50 12,5 + 26/27

17 50 12,5 + 27/28

18 65 16,3 + 30/31

19 105 21,0 + 31

20 10 4.0 + 33

Мом - (миШр1е5 оГ жесНап), означает кратность по отношению к норме.

+ - наличие дополнительной полосы АХЗ при электрофорезе.

- 11 -

Среднее значение ЙФП при анэнцефалии у плода составило 105,Ц30,62 мкг/мл, что в 18 раз превыжает показатели нормы на соответствующих сроках беременности. Средний уровень ЙФП в 10 случаях изолированной спинномозговой грыжи, либо спинномозговой грыжи в сочетании с гидроцефалией составил 40,1 Ci16,!2 мкг/мл, что выше нормы в 8,8 раза. Несмотря на небольжую выборку патологических случаев, средние значения хороио согласуются с данными межлабораторного исследования в Англии (Second Report of Collaboration Study, 1979).

Следует отметить, что во всех случаях открытых дефектов заражения нервной трубки, при проведении электрофореза образцов AI в нативном акриламиднои геле било обнаружено наличие характерной полосы одной из изоформ холинэстеразы. При дефектах закрытого типа и гидроцефалии g плода данная полоса отсутствовала. Этот факт доказывает высокую специфичность теста на наличие дополнительной полосы ЙХЗ при повышенном содержании ЙФП в амниотической жидкости. В одном образце fil от плода с анэнцефалией обнаружена необычная по электрофоретической подвижности изоформа ЙХЗ. Природа данного явления неясна.

Проведено исследование активности АХЭ в 25 образцах пациенток с нормально протекаикей беременностью ив 18 образцах fil при беременности плодом с анэнцефалией при сроке беременности от 19 до 26 недель . Среднее значение активности в норме составило (2,2*0,27) 10! С —3 > мМ/мл мин , при анэнцефалии - (3.1*0,31) 10!(-3) мМ/мл мин. Эти отличия являются достоверными (р<0,05).

Таким образом, в результате выполнения данного раздела работы нами были исследованы образцы амниотических жидкостей 220 беременных, родивжих здоровых детей; были установлены базовые уровни ЙФП в амниотической жидкости на разных сроках беременности, в разных возрастных группах женщин, при беременностях плодами разного пола. Все эти данные явились необходимой основой для разработки четких критериев пренатальной диагностики врожденных пороков развития плода.

Исследование активности СФМКП) в амниотической жидкости.

Всего проанализировано 270 образцов fil на сроках беременности от 16 до 21 недели. Беременности 200 пациенток

- 12 -

завершились срочными родами и рождением здоровых детей.

Полученные результаты представлены в таблице 4. Б ней приведены медианы активности гаммаглутамилтранспептидазы (ГГТП). аминопептидазы (АИП) и общей щелочной фосфатазы (|Ф) на разных сроках беременности в норме и при муковисцидозе.

Таблица 4

АКТИВНОСТЬ ФМКП Б АМНИОТИЧЕСКОИ ЖИДКОСТИ В НОРНЕ И ПРИ МаКОВИСЦИДОЗЕ

срок ГГТП (ед/л) АМП Сед/л) |Ф(ед/л)

(нед) норма MB норма MB норка MB

16 493 142 91 46 14 2

1? 421 110 91 21 13 3

18 296 77 67 16 10 2

19 317 70 68 17 11 3

20 214 83 54 32 7 2

21 183 51 48 8 5 1

22 62 55 28 9 3 1

Активность всех трех изученных ФМКП максимальна на ранних сроках (16-17 недели). Она монотонно снижается при увеличении срока беременности. Эти результаты хорошо согласуются с ранее полученными данными об активности ФМКП в AI. послужившими основой для осуществления первых в стране пренатальных диагностик муковисцидоза биохимическими методами (Горбунова и др..1983, Baranov et al.,1992). Наши данные свидетельствуют о ток. что наиболее репрезентативными для исследования активности ФМКП являются 18-19 недели беременности. Тестирование на более ранних сроках затрцднено в связи с резким снижением активности. что вносит значительные погревности при малых неточностях определения срока беременности . на более поздних - показатели активности ФМКП в норме слишком малы по абсолютной величине .

Содержание ФМКП в AI плодов с муковисцидозом.

Нами изучена активность трех ФМКП в AI у 70 плодов с

MB, в то« числе у 24 плодов, диагноз MB у которых был независимо установлен молекулярными методами , у 36 плодов диагноз MB был верифицирован биохимическими методами после прерывания беременности , диагноз у всех плодоп после прерывания беременности бил подтвержден на вскрнтии.

Как следует из полученных результатов , у всех плодов с MB активность ФМКП оказалась достоверно сниженной. На» опыт показывает, что в случае достоверного снижения всех показателей вероятность MB плода превышает 95Z. В 902 случаев биохимической пренатальной диагностики во втором триместре при патологии у плода активность всех ферментов снижена. Такие случаи не вызывают затруднений в интерпретации результатов диагностики. Сложности возникают при пограничных значениях всех ферментов, либо при несинхронном поведении трех показателей. Ранее было показано (Brock, 198?; Горбунова и др., 1989), что самым чувствительным ферментом является ГГТП. Поэтому, если активность остальных ферментов находилась в пределах допустимых значений нормы, а ГГТП была достоверно снижена относительно нормы, мы рекомендовали прервать такую беременность (3 случая). В подобных случаях диагноз подтверждался при паталогоанатомическом исследовании. 9 14 пациенток с пограничными значениями активностей с помощью молекулярных методов (ПДРФ-анализа или прямого определения мутаций) была получена дополнительная информация, позволившая поставить правильный пренатальный диагноз.

Таким образом, приходится признать ограниченность возможностей биохимической диагностики, о чем говорит и вероятностный характер прогноза для плода. Несмотря на это ограничение, биохимическая методика пренатальной диагностики MB занимает свое место в общей пренатальной диагностике этого заболевания. Последнее обусловлено тем, что у 80% отечественных семей, нуждающихся в пренатальной диагностике, отсутствует больной ребенок, при этом у 60Z из них не определяется основных мутаций гена MB, т.е. они неинформативны для молекулярной диагностики.

В нашей лаборатории был разработан комплексный подход к пренатальной диагностике MB в семьях высокого риска, который постоянно соверженствуется. Этот подход был изложен в ряде работ (Иващенко, 1992; Baranov et al.,1992). Схема обследования таких семей приведена на рис.1.

ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗ^ Е СЕМЬЯХ ВЫСОКОГО РИСКА

СЕМЬИ ВЫСОКОГО РИСКА

Г К

РОДИТЕЛИ К БОЛЬНО* РЕБЕНОК I ТОЛЬКО РОДИТЕЛИ

. I_______________________________I_______

АНАЛИЗ МАЖОРНЫХ МУТАЦИЙ ГЕНА МГКОВИСЦИДОЗА |

Рис.1 СХЕМА ОБСЛЕДОВАНИЯ СЕМЕЙ ВЫСОКОГО РИСКА ПО РОЖДЕНИЮ ДЕТЕЙ С МУКОВИСЦИДОЗОМ

- 1? -

Другой существенный вывод заключается в том, что уже при

анализе нормальных кривых активности ФМКП становится

очевидным, насколько важно очень точно датировать срок беременности. Ошибка в сроках даже на одну неделе существенно

влияет на величину показателей активности ФМКП и серьезно затрудняет интерпретации результатов.

Автоматизированная программа оценки результатов

тестирования ФМКП в А1 для диагностики муковисцидоза.

Проблема точности диагностики МБ биохимическими методами осложняется необходимостью наличия большого количества эмпирических данных как для нормальных плодов, так и для плодов с иуковисцидозом для каждого срока беременности (с 1? по 20 недели).

Для автоматизированного определения медиан, их ежегодной коррекции и проверки устойчивости норм была разработана программа. включающая базу данных и расчетную часть, определяющую вероятность МБ плода у конкретной пациентки по результатам биохимического анализа ФМКП в А1. Медианы рассчитываются для каждого срока беременности. Решение принимается на основе экспертных оценок активности ФМКП.

Мы предложили алгоритм. в котором использованы эмпирические экспертные оценки вероятности МБ у плода на основе опыта как нашей лаборатории, так и с учетом опубликованных в литературе результатов. С помощью специалистов вычислительного центра "Биомедкибернетика для детей" А.Е.Йориша, И.Ф.Рожанской и й.И.Гордина была разработана компьютерная программа для оценки вероятности риска заболевания на основе теоремы Байеса. Результаты, полученные для различных значений активности ФМКП, практически совпадают как при экспертной оценке, так и при расчете . При этом расчет по теореме Байеса иногда дает на 5-10% меньеув вероятность заболевания, чем экспертная оценка. По-видимому, это связано с тем. что в данный алгоритм введен априорный коэффициент 252 возможности рождения больного ребенка в данной семье. В программе предусмотрен подсчет центильных рядов для каждого из ФМКП, вывод кратких статистических данных .

- 1£ -

Изучение корреляции между активностью ФМКП и генотипом плода.

С целью исследования корреляции между биохимическими параметрами акинетической жидкости и наличием или отсутствием определенных мутаций у 88 плодов был проведен комплексный анализ активности ферментов мнкроворсинок кисечника и молекулярно-генетического обследования семьи, а именно, наличия мутации ёе1Р508.

Результаты сравнения активности ФМКП у плодов с известным генотипом представлены в таблице 5. Молекулярно генетический анализ обследуемых семей проводился в Лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ с.н.с. к.б.н. Т.З.Иващенко, врачом-лаборантом К.С.Осиновской и м.н.с. М.А. Бакай.

Таблица 5

АКТИВНОСТЬ ФМКП В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНОТИПА ПЛОДА

Генотип ГГТП(ед/л) АКП (ед/л) Ï® (ед/л) колич

+/+ 261+32.8 63+6,9 11+2.2 18

+А 281+36.4 81+7,0 14+2,3 24

CF/CF 104+13,0 30+5.6 6+1,7 21

CFA 89+11,? 22+3,5 7+2,9 20

а/А 87+21,7 16+1.4 2+0,5 5

à - наличие мутации de 1F508

При сопоставлении особенностей генотипа и биохимических характеристик была выявлена корреляция между активностью ФМКП и наличием мутации de1F508 в гене муковисцидоза. Как и ожидалось, активность ФМКП в AI здоровых плодов,не имеющих мутаций МБ (или гетерозиготных носителей deIF508), достоверно отличалась по всем параметрам от активности ФМКП в АЕ больных плодов. При этом наблюдалась тенденция к увеличению активности ФМИП в AI гетерозиготных носителей данной мутации, 9 больных плодов активность ФМКП существенно зависит от наличия данной мутации. При гетерозиготном состоянии этой делеции наблюдается некоторое снижение показателей активности ФМКП. а у плодов, гомозигетных по этой делеции, активность

всех ферментоп снижена достоверно по сравнениг с плодами, несущими другие нутации гена ИВ.

2 S Б G f. й

1. Исследована динамика содержания АФГ! в 220 образцах амниотической жидкости на сроках с 17 по 26 недели беременности у женщин Санкт-Петербурга и области; получены средние значения содержания альфафетопротеина и активности ацетилхолинэстеразы в норме.

2. С использованием разработанных норм исследованы изучаемые показатели в 20 образцах плодов с анэнцефалией, 10 плодов с открытой спинномозговой грыяей, А плодов с дефектами передней ОрвЕной стенки, и б 2-х образцах AI после внутриутробной г.ыерти плода. Получены количественные характеристики отклонений содержания альфафетопротеина в случае каждого типа пороков плода.

3. На 34 плодах с ДЗНТ открытого типа доказана четкая корреляция этой патологии с наличием специфической дополнительной полосы АХЗ; все образцы А1. полученные при диагностическом амниоцентезе, содержащие даннуг изоформу ХЗ, принадлежали плодам с указанной патологией.

4. Изучена динамика активности ферментов микроворсинок кишечника плода; гаммаглутамилтранспептидазы, аминопептидазы. общей и кишечной формы щелочной фосфатазы в 200 образцах AI; получены медианы активности данных ферментов с 16 по 22 неделе.

5. Изучены особенности активности этих ферментов в 70 образцах амниотических жидкостей у плодов, больных муковисцидозом.

6. С учетом полученных данных создана компьютерная программа оценки риска рождения больного ребенка в семьях высокого риска по муковисцидозу.

7. В результате комплексного молекулярного и биохимического исследования 88 образцов амниотической жидкости плодов группы высокого риска выявлена определенная корреляция между активностью ФККП в амниотической жидкости с наличием мутации delF508 в гене КВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Биохимические методы пренатальной диагностики дефектов невральной трубки плода //Тезисы докладов XIX научной сессии НИИАГ РАМН им.Д.О.Отта /Под ред. З.К.Айламазяна.- СПб.,1990. - с.52-53 Ссоавт. Б.ОебедеЕ ).

2. О скринировании беременных по содержанию альфафетопротеина в крови //Тезисы докладов XX научной сессии НИЙАГ РАМН им.Д.О.Отта /Под ред. З.К.Айламазяна.- СПб.,1991. - с.41-43 (соавт. В.Н.Горбунова, В.Г.Вахарловский).

3. Анализ соответствия фенотипа и генотипа у плодов с муковисцидозом //Тезисы докладов XXIII научной сессии НИИАГ РАМН им.Д.О.Отта /Под ред. З.К.Айламазяна.- СПб.,1994. -с.102-103 (соавт. В.Н.Горбунова, Т.З.Ивашенко).

4. Возможные маркеры нарушения развития ЦНС в антенатальный период при анэнцефалии.// Тезисы XXIII научной сессии НИИАГ РАМН им.Д.О.Отта /Под ред. З.К.Айламазяна.- СПб.,1994.- с. 32-35 (соавт. А.В.Арутюнян, Н.Г.Павлова и др.).

5. Исследование содержания альфафетопротеина в сыворотке крови беременных как критерия наличия врожденных пороков развития у плода // Акушерство и гинекология,- 1995,- N 4.-с.22-24 (соавт. В.Г.Вахарловский, В.Н.Горбунова).

6. Некоторые белки амниотической жидкости в пренатальной диагностике врожденных пороков и муковисцидоза плода //Тезисы докладов Первого (третьего) Российского съезда медицинских генетиков. - М.,1994,- с. 29-30 (соавт. В.С.Баранов, В.Н.Горбунова).

7. 0 ранней (пренатальной диагностике) заболеваний нервной системы у детей //Организация и клинические проблемы детской неврологии /Тезисы докл. - М.,1994. - изд. АО "Руссомед".-с.46-48 (соавт. В.С.Баранов, В.Г.Вахарловский и др.).

8. Diagnostic prenatal de la íucoviscidose en Russie //Le Pediatre. - 1991,- К 12.- p.20-27 (соавт.U.S.Baranov et al.).

9. Five years experience in prenatal diagnosis of cystic fibrosis in the forier USSR //Prenat. Diagnosis.- 1992.-v. 12.- p.127-135 (U.S.Baranov et al.).

10. Five years experience in prenatal diagnosis (PD) of inherited diseases in the north-european part of the USSR // European Society of Hunan Genetics. Annual neeting Abstr.-Leuven, Belgiui.- 1991,- p.162 (соавт.U.S.Baranov et al).