Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ мутаций в гене дистрофина

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ мутаций в гене дистрофина"

Российская академия медицинских наук Медико-генетический научный центр

На правах рукописи УДК 616-056.7+575.224

ЧУХРОВА Алена Львовна

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ ДИСТРОФИНА

03.00.15-'Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Института клинической генетики МГНЦ РАМН.

Научный руководитель - д.б.н., проф. О.В.Евграфов

Официальные оппоненты - д.б.н., проф. Лимборская С.А.

д.б.н. Залетаев Д.В.

Ведущее учреждение - Российская медицинская академия

последипломного образования

Защита состоится "_"_1997 г.

в_часов на заседании Диссертационного совета Д 001.16.01

при МГНЦ РАМН по адресу: г.Москва, 115478, ул.Москворечье, Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.б.н., профессор

Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Миодистрофия Дюшенна (МДЦ) - наиболее частое Х-сцепленное рецессивное заболевание, которое встречается приблизительно у одного из 2500-4500 новорожденных мальчиков и приводит к летальному исходу, как правило, в возрасте до 20 лет. Это тяжелое прогрессирующее заболевание, не поддающееся коррекции, с высоким повторным риском в семьях. Исследование мутаций в гене дистрофина важно для проведения ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна/Беккера (МДД/МДБ), прежде всего пренатальной. Прямая пренатальная диагностика в семьях с выявленными мутациями позволяет с вероятностью, близкой к 100%, прогнозировать заболевание или его отсутствие у плода.

Ген дистрофина, мутации в котором приводят к МДЦ, — самый большой из всех известных генов в геноме человека. Он состоит из 79 экзонов, его размер около 2.5 м.п.н. Крупные делеции составляют около 6065% мутаций в гене дистрофина (Koenig et al., 1989, Abbs et al., 1991, Hodgson et al., 1989, Beggs et al., 1990), дупликации - 10% (Hu et al., 1990) и точковые мутации - 25-30% (Roberts et al., 1991). Делеции и дупликации в гене дистрофина представляют собой уникальную модель для изучения механизма возникновения мутаций этого типа, поскольку накоплено значительное количество материала для исследования из-за большого количества больных и высокой доли этих мутаций.

Целью данной работы являлся анализ крупных делеций и точковых мутаций в гене дистрофина. При этом ставились следующие задачи:

- Провести поиск делеций у больных МДД/МДБ методом мультиплексной амплификации (МПА), сравнить частоту и спектры делеций в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ.

- Провести поиск корреляции клинических симптомов у пациентов с МДЦ с характером делеций в гене дистрофина.

- Провести тонкое картирование делеционных точек разрыва (ДТР) в 7, 45, 46, 49 и 50 интронах гена дистрофина у больных МДД/МДБ.

Разработать систему мультиплексного SSCP для поиска полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина, с помощью которой исследовать образцы ДНК больных МДД/МДБ без выявленных делеций.

Научная новнзна и практическая значимость. Обнаружены достоверные различия частот и спектров делеций и ДТР в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ. Проведено тонкое картирование ДТР в "горячих" участках делеций, обнаружено, что в 7 интроне ДТР распределены равномерно и не существует их непосредственной связи с повторяющимися элементами генома.

Разработана мультиплексная SSCP-система для поиска

полиморфизмов и точковых мутаций в кэп-сайте и 19 экзонах ген дистрофина. Выявлены и охарактеризованы 1 экзонный и 2 интронны полиморфизма и ранее неизвестная мутация 7012-7015del.

Анализ мутаций в гене дистрофина позволил оптимизировать метод] прямой ДНК-диагностики МДД/МДБ в российской выборке больны? Проведен анализ образцов ДНК 357 пациентов. Данные, полученные результате работы, позволяют проводить дифференциальнук пресимптоматическую и прямую пренатальную ДНК-диагностику МДД/МД в семьях с выявленными мутациями.

Положения, выносимые на защит}'.

1. Оптимизирован метод МПА для изучения делеций в ген дистрофина.

2. Обнаружены достоверные различия в спектрах делеций и ДТР.

3. Разработана мультиплексная система для тонкого картировани ДТР в 7, 45,46, 50 интронах гена дистрофина, с помощью которой проведен тонкое картирование 100 ДТР в исследуемых областях гена дистрофина.

4. Разработана эффективная мультиплексная SSCP-система дл анализа полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина. Обнаружен 9 полиморфизмов и одна не описанная ранее мутация.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены н 4 и 5 конференциях "Геном человека" (Черноголовка, 1994, 1996), 1(2 российском съезде медицинских генетиков (Москва, 1994), 28 и 29 съезда Европейского Общества Генетики Человека (Лондон, 1996, Генуя, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введение обзора литературы, описания материалов и методов исследовани) полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списк литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текст; содержит 9 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает 132 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенные v венозной крови, ворсин хориона и клеток амниотической жидкости. Работ была выполнена на образцах ДНК больных МДД/МДБ, являющихс пациентами Guy's hospital, Института акушерства и гинекологии, г. Санк" Петербург, медико-генетической консультации МГНЦ РАМН.

ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции, описанны Lindblom and Holmlund, 1988 с небольшими изменениями.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при помош программируемого термоциклера производства г. Пущино с использование ДНК-полимеразы Termus aquaticus производства института прикладно

энзимологии "Ферментас" г. Вильнюса. В работе использовали метод мультиплексной амплификации (МПА) со специально подобранными условиями реакции.

Результаты МПА оценивали в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Скрининг образцов на наличие полиморфизмов и точковых мутаций осуществляли методом мультиплексного SSCP (Orita et al., 1989) в специально подобранных условиях.

Результаты SSCP-анализа оценивали в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием или серебром.

Определение нуклеотидной последовательности проводили с амплификатов, клонированных в плазмиду pUC18 (Маниатис и др., 1984), и прямым секвенированием амплификатов по Сенгеру (Sanger et al., 1977) с использованием флюоресцентно-меченных праймеров на приборе ALF™ DNA Sequencer (Pharmacia Biotech).

Оценку результатов "соревновательной" амплификации проводили на приборе ALF™ DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) с использованием программы Fragment manager.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ делеций в гене дистрофина.

1.1. Оптимизация метода МПА для регистрации делеций.

Регистрацию делеций у больных МДД/МДБ проводили методом МПА с использованием 20 пар праймеров: на кэп-сайт, 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53 и 60 экзоны гена дистрофина. За основу взята система, предложенная в работе Аббса (Abbs et al., 1991b), праймеры на 8, 17, 19, 44, 48 экзоны выбраны на основании работы Чамберлейна (Chamberlain et al., 1988), вместо промоторной области гена дистрофина исследовался кэп-сайт, дополнительно проверяли 32 экзон (табл.1), что позволило увеличить процент выявляемых делеций.

Реакция проводилась в двух пробирках (рис.1 и 2). Полученная нами система стабильно работает, одним из критериев чего является неразрывность делеций.

1.2. Анализ спектров делеций и ДТР у больных МДД/МДБ.

В ходе выполнения работы обследовано 357 неродственных пациентов с диагнозом МДД/МДБ. Делеции обнаружены у 149 человек, что составляет 42%. Доля найденных делеций не противоречит литературным данным.

Найденные делеции представлены на рисунке 3. Сверху обозначены

номера экзонов гена дистрофина, каждая строка соответствует выявленно! делеции. Черным цветом отмечены делетированные экзоны, белым присутствующие экзоны, серым - область локализации ДТР. 123456789

48

3

51

43

44

45 53

4

60

52

Рисунок 1. Электрофореграшш МП А]. Стрелками обозначены номера амплифицируемых экзонов. Дорожка 1 — маркер молекулярного веса рВЯ/НаеШ, 2 - отрицательный контроль, 3-8 - образцы ДНК пациентов с МДЦ/МДБ: 3 - деления 48-52 экзонов, 4 - делеция 44-48 экзонов, 7 - делеция 44 экзона, 8 — делеция 3-4 экзонов, 9 - положительный контроль.

Рисунок 2. Электрофореграмма МПА2. Стрелками обозначены номера амплифицируемых экзонов. Дорожка 1 - маркер молекулярного веса рВК/НаеШ, 2 - отрицательный контроль, 3-8 - образцы ДНК пациентов с МДД/МДБ: 4 - делеция 17-47 экзонов, 5 - делеция 8 экзона, б - делеция 19 экзона, 7-8 - делеция 17 экзона. 9 - положительный контроль.

Таблица 1. Праймеры, использованные в данной работе, которые были выбраны в нашей лаборатории.

Название праймера Последовательность праймера Применение

Рт F GGAAACCAACTTGAGAGAAGGCGGGT R GTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCCTGTAG МПА2, SSCP

32 экзон F ATGTCTCCATGAAGTTTCGATTATTCC R CACACTCTTTGTTTCCAATGCAGGC

171 F GAAGTCTGGGTACTAGTCTGTTGTGG R AGCACTGACTTCTCCCTGCTTAGAAC Картирование ДТР в 7 интроне

172 FGAACTTCCAGTCCAGTCTGTATCC RTAAGAGTATGCAACACGCTCCAC

173 F GATCCCTAGGTCTCACTCTCACG RGGAGAACGAGTACCATCAGCCTC

174 F CTAGGCAGAGGTTCCCAAACCG RGGTGTGCAGCCTAGAGACTTGGTG

175 F CAAAGGAAGCACCACTGACACTCC R TCTTGCTGGCTGCTTTCAGACTCC

176 F GAAAGGGTAAGCACCACCTTCAGG R CAGACTGTCACAGCAACTCATCTGG

179 FCTTGGCTATAAGCTGTAGTACCAC R AGTTGCACCAGGCCATCAAGAC

46 экзон F GCCATGTTTGTGTCCCAGTTTGC R CATATACTTCTTTATGCAAGCAGGC Картирование ДТР в 45 интроне

451F GAACTCCAGGATGGCATTGGGCAG

I45F1 TATACTTGTGGCTAGTTAGTGG

I45F2 GTGATAGTGTCACTTACCTCTAG

I45F3 CTTCCAGTTGTTGATGTTAATGTG

STR-45R1 AAAGAGGGAAAGAGGAGGTGG

17LF 17LR GTTCGTACGTGAATCGCGGTACGACTTTCGATG-TTGAGATTACTTTCCC GTTCGTACGTGAATCGCGGTACAAGCTTGAGAT -GCTCTCACCTTTTCC Сиквенс, competitive amplification

47LF 47LR GTTCGTACGTGAATCGCGGTACCGTTGTTGCAT-TTGTCTGTTTCAGTTAC GTTCGTACGTGAATCGCGGTACGTCTAACCTTT-ATCCACTGGAGATTTG

UN1QV* 5'^nroopecueHH-GTTCGTACGTGAATCGCGGTAC

Для сравнения различных выборок пациентов с МДД/МДБ чаете используют частоту делеций отдельных экзонов среди всех обнаружении; делеций (спектр делеций). Можно думать, что спектры делеций могут имет! популяционную специфичность. В связи с этим мы провели сравнена данных, полученных в ряде европейских центров, полагая, что каждый цент] имеет дело с определенными популяциями, проживающими на данно! территории. Для сравнения были взяты выборки больных, существенн<

различающиеся по национальному составу: из Голландии (den Dunnen et al., 1989, 1991), Италии (Covone et al., 1991, Danieli et al., 1993), Греции (Florentin et al., 1995), Франции (Gilgenkrantz et al., 1989), Финляндии (Lindlof et al., 1989 и наши исследования), Швейцарии (Liechti-Gallati et al., 1989), три разные выборки из Великобритании - из Лондона (Abbs et al., 1991b), Шотландии (Cooke et al., 1990) и Уэльса (Upadhyaya et al., 1991), a также две российские - из Центральной России (наши данные) и Северо-Западной России (данные Института акушерства и гинекологии г. Санкт-Петербурга).

В целом спектр обнаруженных нами делеций сходен с таковым в Западной Европе (рис.4). Его характерными чертами являются наличие двух "горячих" участков образования делеций: в 5'- (6-8 экзоны) и З'-районе (45-48 экзоны).

Н Греция

■ Италия

□ Англия

□ Уэльс

■ Голландия

□ Финляндия

■ Мэсквэ

□ С-Петербург

■ Украина

Рисунок 4. Сравнение спектров делеций в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ.

Эти закономерности ясно прослеживаются во всех исследованиях, проведенных в различных популяциях. Более тонкое сравнение делеционных спектров позволило выявить небольшие, но достоверные различия между полученными нами результатами и наблюдениями, проведенными в большинстве стран Западной Европы.

Так, в нашей выборке доля протяженных делеций (затрагивающих более 10 экзонов) составляет 15.4%, доля делеций, затрагивающих обе "горячие точки" - 4.7% по сравнению с 5.2% и 1.7% в западноевропейских выборках. В других европейских выборках также обнаружены различия в спектрах делеций, которые оказались статистически значимыми.

Однако, если и существуют различия в спектрах делеций, они прежде всего должны проявляться в месте образования делеций, то есть в точках разрыва. Можно предположить существование неких общих механизмов образования делеций в "горячих" участках, которые лучше отражают ДТР. Проведено сравнение спектров ДТР в 9 выборках, исследованных в

различных европейских центрах (из Голландии, Италии, Греции Финляндии, трех из Великобритании, а также двух из России) (рис.5).

Рисунок 5. Сравнение спектров ДТР в ряде выборок пациентов с МДЦ/МДБ.

Исследовано 438 ДТР в российских и 1060 ДТР в западноевропейски выборках пациентов с МДД/МДБ. 101 ДТР (23%) в российских выборка находятся между 1-20 экзонами, оставшиеся 337 (77%) - в дистальной част гена. Это согласуется с распределением ДТР 20:80 в западноевропейски странах (Danieli et al., 1993).

Распределение ДТР в различных выборках анализировали с помощы статистических подходов, основанных на методе X2. Все ДТР рассматривал совместно, независимо от того, относятся они к 3'- или 5'-концу делеции. Пр использовании метода X2 в каждой ячейке значение ожидаемого должн быть не меньше 5 (Rice, 1995). С другой стороны, увеличение числа груп должно более точно отражать особенности распределения. Для оптимальног соответствия этим критериям (максимальное увеличение количестЕ интервалов при соблюдении первого критерия) мы подразделил исследуемую область гена дистрофина на 11 следующих интервало] интроны до 6 экзона, интроны между экзонами 6-8, 8-19, 19-42, 42-44, 44-4: 45-47, 47-48, 48-50, 50-52 и интроны после 52 экзона. Общее количеств ячеек составило 88. При этом во всех ячейках, кроме двух, ожидаемо больше 5. В оставшихся двух значение ожидаемого составило 4. (Финляндия, 42-44 экзоны) и 4.9 (Греция, 42-44 экзоны), то есть он приближаются к рекомендованному значению.

Анализ спектров ДТР проводили тремя способами:

1) Спектры ДТР для 8 выборок были проанализированы н гомогенность. Они не являются гомогенными - значение Х2=111.2 для 7 степеней свободы (р=0.0013). Это означает, что данные из различны выборок не могут быть описаны как одно и то же распределение. Кроме топ каждая подгруппа спектров из 7 выборок также не гомогенна (р<0.0:

ю

(табл.2). То есть различия между распределениями ДТР реально существуют и не обусловлены какой-то отдельной выборкой.

2) Все спектры сравнивались попарно (28 сравнений). Выявлено 7 достоверных различий: между спектрами ДТР Центральной России и Италии, Центральной России и Голландии, Центральной Росии и Уэльса, Финляндии и Голландии, Финляндии и Уэльса, Финляндии и Лондона, (р<0.05), Центральной России и Лондона (р<0.01) (табл.2).

Таблица 2. Сравнение спектров ДТР в ряде выборок пациентов с МДД/МДБ методом X2.

* - Р<0.05 **-Р<0.01

3) Проведено попарное сравнение частот ДТР в разных выборках по отдельным интервалам. При использовании поправки Бонферрони на множественность сравнений (Rice, 1995) выявлено 6 статистически достоверных различий: между спектрами ДТР Центральной России и Лондона (интроны 48-49; р=0.019), Центральной России и Италии (интроны 8-18; р=0.024), Голландии и Лондона (интрон 44; р=0.012), Финляндии и Лондона (интроны 19-41; р=0.041), Финляндии и Уэльса (интроны 19-41; р=0.016), Финляндии и Голландии (интроны 19-41; р=0.025). Таким образом, очевидно, что обнаруженные различия не сосредоточены в каком-то одном интервале и не связаны с отдельной выборкой.

В общем виде можно выделить 3 типа причин существования подобных различий:

- различия методик. Мы провели сравнение результатов МПА, полученных в трех разных лабораториях (в Лондоне, Москве и Санкт-Петербурге) на одних и тех же образцах ДНК. Существуют небольшие расхождения (в двух экзонах из 369 проверенных), которые можно объяснить неполной гомологией праймеров, используемых для амплификации, - то есть можно считать, что различия обусловлены не этим.

- нельзя исключить факторы внешней среды — на разные популяции может воздействовать различный спектр мутагенов. Но в пользу этой гипотезы пока не обнаружено убедительных аргументов.

- генетические факторы, обусловленные популяционными различиями в структуре ДНК. Особенность мутаций в гене дистрофина в том, что они

и

относительно молоды (1/3 всех мутаций - это мутации de novo), 50% мутацк теряется в каждом поколении. Поэтому нет оснований говорить о действк эффекта основателя. Таким образом, причины обнаруженных различий моп быть обусловлены различиями на уровне полиморфизма ДНК.

Полученные данные показывают, что ДТР распределены по rei-дистрофина неравномерно. Причины этого могут быть связаны существованием определенных последовательностей ДНК, в облает которых делеции происходят с повышенной частотой, но пока остаютс неизвестными.

Проведенные исследования доказывают существование различий спектрах делеций и ДТР в гене дистрофина, которые не связаны с разнице методик и, по-видимому, отражают различия на уровне полиморфизма ДНК.

1.3. Изучение корреляции клинических симптомов у пациентов с МДД с характером делеций в гене дистрофина.

Изучение делеций является инструментом для понимания структурнс функционального значения отдельных доменов дистрофина. Существуе несколько способов поиска корреляции клинических проявлени заболевания с характером мутаций. Для этого необходимо провеет подразделение исследуемых фенотипов, например:

1) МДД и МДБ - различаются по возрасту дебюта заболевания тяжести течения. Изучение делеций при МДД и МДБ позволило выдвинут гипотезу "рамки считывания" (Monaco et al., 1988).

2) Пациенты с МДБ - клинически полиморфная группа. Подразделив е по степени проявления клинических симптомов на подгруппы, возможн провести поиск корреляции клинических проявлений с расположение! мутаций в гене дистрофина. Такая работа была выполнена для больных МД (Beggs et al., 1991, Bushby et al., 1993, Comi et al., 1994), авторами был установлена корреляция клинической симптоматики с повреждениями молекуле дистрофина.

3) Рассмотреть проявление факультативных признаков среди больны МДД. Нами было проведено исследование корреляции некоторых таки признаков с расположением и протяженностью делеций в гене дистрофина ; 25 пациентов с МДД/МДБ. В качестве клинических симптомов были взять: умственная отсталость, кардиомиопатии и ожирение, встречающиеся у 10 30% больных МДД/МДБ.

На рисунке 6 представлены полученные результаты. Очевидно, чт тяжесть клинической симптоматики не зависит напрямую от протяженност] делеций. Так, все три симптома наблюдаются у больных с делециями о одного до шести экзонов, а у пациента с делецией двадцати пяти экзонов ген дистрофина не обнаружено данных клинических симптомов.

Не обнаружено и корреляции расположения делеции с тяжестью клинической симптоматики. Так, три сходных делеции 8-19 экзонов дают разную клиническую картину: у одного пациента выявляются умственная отсталость и кардиомиопатия, у другого - только умственная отсталость, а у третьего - не обнаруживается этих клинических симптомов.

10 20 30 40 50 60 70

Рисунок 6. Корреляция расположения и протяженности делеции в гене дистрофина с некоторыми клиническими симптомами у больных МДД/МДБ. Каждая строка соответствует определенному больному. Справа изображены симптомы: 1 -умственная отсталость, 2 - кардиомиопатии, 3 - ожирение. Закрашенный квадрат обозначает наличие данного симптома у больного, белый - его отсутствие. Слева схематично изображены делеции в гене дистрофина. Черным цветом изображены присутствующие, белым - делетированные участки гена.

Таким образом, при одинаковых симптомах показано наличие неперекрывающихся делеций и при одинаковых делециях обнаруживается как различное сочетание симптомов, так и их отсутствие.

То есть не существует определенного участка гена дистрофина, повреждения в котором приводят к развитию умственной отсталости, ожирения или кардиомиопатии. Можно предположить, что мутации в гене дистрофина являются фактором, предрасполагающим к развитию данных симптомов, но для их проявления необходимы дополнительные факторы (генетические или не генетические).

1.4. Практическое применение анализа делеций.

Выявленные делеции можно использовать для дифференциально пресимптоматической и пренатальной диагностики. Дородов, диагностика в семьях с обнаруженной делецией позволяет с вероятносты близкой к 100%, прогнозировать заболевание или его отсутствие у плода.

Необходимым условием проведения такой диагностики являет обнаружение делеции у больного члена семьи. Затем на 8-11 неде; беременности женщины производится биопсия ворсин хориона плода (важ! избегать загрязнения биоптата клетками матери), либо на 16-24 неделе амниоцентез, из взятого материала выделяется ДНК и проводится прям; ДНК-диагностика. Если определяется делеция, характерная для данной сем! (такая же, как у больного), то прогноз является неблагоприятным (родит! больной мальчик). Если же данная делеция не обнаружена, про™ благоприятен (родится девочка или здоровый мальчик).

В ходе выполения работы проведено 17 прямых пренатальнь диагностик. В 14 случаях прогноз благоприятный, в 3 случаях неблагоприятный.

2. Тонкое картирование ДТР в гене дистрофина.

В геноме человека встречается несколько основных типе повторяющихся элементов ДНК: Alu-повторы, LINEs (long intersperst elements), LTR (long terminal repeats) и другие. Особое место cpei повторяющихся элементов занимают транспозон-подобные элементы, THE-(transposon-like human repeat elements). Все они распределены по гено\ неравномерно. Обнаружена кластеризация ТНЕ-1 и изолированных LTR средней части 7 интрона гена дистрофина: в 32 т.п.н. фрагменте найдено ТНЕ-1 последовательности и 3 LTR (McNaughton et al., 1993).

Существует гипотеза о связи "горячих" участков делеций повторяющимися элементами генома, среди которых немаловажная ро; отводится ТНЕ-1. Для проверки этой гипотезы особый интерес представлж 7 интрон, поскольку он является одним из "горячих" участков делеций и, в i же время, содержит целый ряд повторяющихся последовательносте! Поэтому в нашей работе мы сосредоточились на тонком картировании ДТР 7 интроне.

2.1. Использование метода МПА для проведения тонкого картирования ДТР в гене дистрофина.

Для картирования ДТР в 7 интроне использовался метод МПА. Был выбраны праймеры, лежащие в пределах 32 т.п.н. известно

последовательности 7 интрона: 171,172, 173, 174,175, 176,179 (табл.1). Схема расположение праймеров представлена на рисунке 8. Для контроля использовали праймеры на 6 и 8 экзоны гена дистрофина.

Для картирования ДТР в 45, 46, 49, 50 интронах гена дистрофина использовались выбранные нами праймеры на 46 экзон и внутригенные маркеры STR-45, STR-49, STR-50 (Clemens et al., 1991). Для более тонкого картирования в 45 интроне были выбраны праймеры 45IF, I45F1, I45F2, I45F3, STR-45R1 (табл.1).

2.2. Тонкое картирование ДТР.

Для картирования в 7 интроне была отобрана ДНК пациентов с локализацией ДТР между 6 и 8 экзонами из нашей выборки, а также из Guy's hospital, Финляндии и Института акушерства и гинекологии г. Санкт-Петербурга.

Делецию участка 7 интрона определяли по отсутствию соответствующей ему полосы на электрофореграмме (рис.7).

Рисунок 7. Электрофореграмма МПА в 7 интроне гена дистрофина. Стрелками обозначены названия праймеров. Дорожка 1 - маркер молекулярного веса р\]С/М$р1, 2 -отрицательный контроль, 3 - положительный контроль, 4-10 - образцы ДНК больных МДД/МДБ с делецияш фрагментов 7 интрона.

Было обследовано 33 неродственных пациента (34 ДТР). Спектр обнаруженных делеций представлен на рисунке 8. Сверху обозначены повторяющиеся элементы, расположенные в середине 7 интрона, под ними -схема расположения праймеров. Каждая строка соответствует определенному образцу ДНК, номера образцов приведены справа. Черным цветом отмечены делетированные участки ДНК, белым — присутствующие, серым -локализация ДТР.

При сравнении плотности ДТР в 7 интроне не наблюдается какой-либо кластеризации ДТР, если отнести их к единице длины. Полученные результаты показывают, что ДТР распределены равномерно как во всем 7 интроне, так и в средней его части. Не обнаружено прямой связи ДТР с мобильными элементами генома, в частности с ТНЕ-1.

Для картирования ДТР в 45-50 интронах отбор образцов ДНК проводили аналогично. У этих больных было проведено исследование на наличие 46 экзона гена дистрофина и внутригенных маркеров STR-45, STR-49 и STR-50.

В исследуемых интронах ДТР, если отнести их к единице длины, также распределены равномерно.

3. Поиск полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина.

3.1. Разработка системы мультиплексных SSCP.

Точковые мутации в гене дистрофина являются вторыми по частоте после делеций и составляют около 30% (Roberts et al., 1991). Они до сих пор остаются малоизученными. Это связано с большим размером гена дистрофина (2.5 м.п.н.) и большим количеством экзонов в нем (79 экзонов), отсутствием мажорных мутаций или "горячих" участков мутаций, что делает процесс их поиска весьма трудоемким и требует больших затрат времени.

Для поиска точковых мутаций применяют различные методы, которые основаны на исследовании либо мРНК, либо геномной ДНК. Наиболее популярным из всех подходов является SSCP-анализ, так как он совмещает высокую чувствительность с относительной простотой методики.

Но продуктивность обычного SSCP недостаточна для анализа сложных генов, состоящих из большого количества экзонов. Применение мультиплексного SSCP позволяет значительно снизить трудоемкость и время, необходимое для исследования, а также повысить эффективность поиска точковых мутаций в гене дистрофина.

Разработаны 4 мультиплексные SSCP-системы для скрининга кэп-:айта и 19 экзонов гена дистрофина с фланкирующими интронными юследовательностями. Одна из них приведена на рисунке 9.

Кроме того, разработана упрощенная диплексная система SSCP для анализа 17 и 47 экзонов (рис.10).

3.2. Применение мультиплексной SSCP-системы для поиска полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина.

С использованием разработанной мультиплексной SSCP-системы троведено исследование 20 образцов ДНК пациентов с МДД/МДБ, у которых ie были обнаружены делеции. Дополнительно образцы ДНК 153 пациентов

исследованы с помощью диплексной ББСР-системы.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

I ОН51

^ ОН45

ОН53 ДН51 ОН47

ДН45

• ДН53

] ОНбО

■ ДН47 - ДН60

Рисунок 9. Электрофорегралша ЗБСРЗ. Дорожка 1 - маркер молекулярного вес риС18/АЫ, 2 - неденатурированный образец, 3 - положительный контроль, 4-12 образцы ДНК пациентов с МДД/МДБ. ОН - однонитевая, ДН - двунитевая ДНК, цифрал обозначены номера экзонов. Дорожки б и 9- выявляется изменение подвилсности ОН в : экзоне.

ОН17

Рисунок 10. Электрофореграмма дитексного БЯСР. Дорожка 1 - маркер молекулярно веса риС18/А1и1, 2 - неденатурированный образец, 3 - положительный контроль, 4-13 образцы ДНК пациентов с МДД/МДБ. ОН - однонитевая, ДН - двунитевая ДНК. Дорож, 7 - изменение подвижности ОН в 47 экзоне, дорожки б и 8-13 - изменение подвижносг, ОН в 17 экзоне.

Обнаружено 58 случаев изменения подвижности однонитевой ДН (табл.3).

Определена нуклеотидная последовательность некоторых образце ДНК с измененной подвижностью фрагментов, выявленной при проведет ВБСР.

Таблица 3. Случаи изменения элеетрофоретнческой подвижности, выявленные методом мультиплексного SSCP.

Номер экзона Изменение последовательности Изменение на уровне белка Частота встречаемости

13 (-68 п.н.) А/Г ИП 10% (2 из 20)

13 н/о н/о 5% (1 из 20)

17 (-37 п.н.) T/G ИП 27% (46 из 173)

17 н/о н/о 0,6% (1 из 173)

17 н/о н/о 0,6% (1 из 173)

47 del4 Стоп 0,6% (1 из 173)

47 С->Т Pro-Pro 0,6% (1 из 173)

51 н/о н/о 10% (2 из 20)

53 н/о н/о 10% (2 из 20)

53 н/о н/о 5%(1 из 20)

Н/о - первичная последовательность не определена

ИП - интронный полиморфизм

ЭП - экзонный полиморфизм

Стоп - образование стоп-кодона после делении

ATT СТС ААТ ТАА ATG AAA CTG GAG GAC CCG TGC TT 7012-7015del

I L N Stop M К L E D P С

ATT CTC AAA CAA TTA AAT GAA ACT GGA GGA CCC GTG CTT контроль

ILKQLNETGGPVL

ATT CTC AAA CAA TTA AAT GAA ACT GGA GGA CCTGTG CTT 70360T ILKQLNETGGPVL

Рисунок 11. Последовательность участка 47 экзона с выявленными мутацией и полиморфизмом.

Выявлены А/Т и ТАЗ полиморфизмы в 12 интроне (2 случая) и 16 интроне (46 случаев) соответственно. Т->С замена в 16 интроне приводит к исчезновению сайта рестрикции для эндонуклеазы Тад1, что, в совокупности с относительно высокой гетерозиготностью, позволяет использовать данный полиморфизм в качестве маркера для косвенной диагностики.

В двух случаях изменения подвижности однонитевой ДНК в 47 экзоне определены нуклеотидные последовательности мутаций. В первом случае это делеция 4-х п.н. - 7012-7015с1е1, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона непосредственно за ней (рис.11). Эта мутация ранее не была описана. Мать больного не является носительницей делеции -

то есть это мутация de novo.

Вторая мутация в 47 экзоне - это С->Т замена - 70360Т (рис.11) Однако она не приводит к замене аминокислоты. Возможно, это проявление экзонного полиморфизма.

Группа Прайора (Prior et al., 1995) проверила около 80% кодирующе? последовательности гена дистрофина на наличие малых мутаций у 15i пациентов с МДД/МДБ без делеций и дупликаций и нашла 29 точковы) мутаций. Предположительно большинство малых мутаций, приводящих i МДД/МДБ, лежит в некодирующих областях гена. Интронные точковьк мутации довольно редки. Они могут приводить к образованию сайто) сплайсинга, а в данном случае вероятность этого повышается из-за большой размера интронов гена дистрофина (до 170 т.п.н.).

Мы проанализировали примерно 28% кодирующе! последовательности гена дистрофина у 20 больных МДД/МДБ без делеций Исходя из данных Прайора (Prior et al., 1995), можно было ожидать, что Hai удастся выявить по крайней мере 1 точковую мутацию. Полученные результаты соответствуют ожидаемым и являются косвенны» подтверждением предположения Прайора.

Таким образом, разработана SSCP-система, позволяющая с меньшим! затратами времени и труда эффективно исследовать сложные гены дл выявления точковых мутаций. Обнаружено несколько полиморфизмов ДНК по крайней мере один из которых может быть использован в качеств маркера для косвенной диагностики. Найдена ранее неизвестная делеция 4-п.н. в 47 экзоне.

4. Роль ошибок репликации в образовании делеций в гене дистрофина

Механизм образования делеций в гене дистрофина остаетс неизвестным. Детальное изучение основной "горячей" точки делеций - 4 интрона (Blonden et al., 1991) - не выявило какой-либо кластеризации ДТР. ] данной работе при исследовании второй "горячей" точки - 7 интрона - так» не обнаружилось кластеризации ДТР или их связи с мобильными элементам генома.

В статье (Baldrich et al., 1992) авторы предполагают, что возникновении перестроек в гене дистрофина могут играть роль ошибк репликации.

При определении нуклеотидной последовательности мутаций в 4 экзоне гена дистрофина было замечено, что в одном и том же участке этог экзона возникает неспецифическая терминация ДНК-полимеразы. Эт повторялось при исследовании разных образцов ДНК наколькими методам секвенирования с разными полимеразами.

Для проверки существования сайта неспецифической терминации в 47 экзоне нами была проведена одновременная амплификация 17 и 47 экзонов гена дистрофина в специальных условиях, обеспечивающих строго одинаковую динамику амплификации обоих фрагментов - competitive ("соревновательная") амплификация. Более того, поскольку эффективность амплификации может зависеть от длины фрагмента, для сравнения с 47 экзоном (225 п.н.) был выбран фрагмент заведомо большей длины (460 п.н.). Тем не менее, лучше амплифицировался длинный фрагмент 17 экзона, чем заметно более короткий фрагмент 47 экзона.

Это может являться косвенным подтверждением того, что в последовательности 47 экзона есть специфический участок, где происходит сбой работы ДНК-полимеразы. Более того, можно полагать, что подобные участки неспецифической терминации ДНК-полимеразы задействованы в механизме образования делеций в гене дистрофина.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью оптимизированного метода мультиплексной амплификации обследовано 357 неродственных пациентов с диагнозом миодистрофия Дюшенна/Беккера. Делеции обнаружены у 149 человек, что составляет 42%. В 17 семьях с выявленными делециями проведена прямая пренатальная диагностика миодистрофии Дюшенна/Беккера.

2. Проведено сравнение спектров делеций и делеционных точек разрыва в двух российских и семи западноевропейских выборках пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера. Обнаружены достоверные различия, которые могут быть объяснены полиморфизмом на уровне ДНК.

3. Показано, что факультативные клинические признаки (умственная отсталость, кардиомиопатии и ожирение) у больных миодистрофией Дюшенна не коррелируют с размером и расположением делеций в гене дистрофина.

4. С помощью разработанной мультиплексной системы проведено тонкое картирование 100 ДТР в 7, 45, 46, 49 и 50 нитронах гена дистрофина. Обнаружено, что делеционные точки разрыва в 7 интроне распределены равномерно и не существует их прямой связи с повторяющимися элементами генома, в частности с ТНЕ-1.

5. Разработана мультиплексная SSCP-система для анализа образцов ДНК больных миодистрофией Дюшенна/Беккера, у которых не выявлено крупных делеций. Проанализировано 173 образца ДНК. Обнаружено 10 полиморфизмов и точковых мутаций. Определена нуклеотидная последовательность одного экзонного и двух интронных полиморфизмов и ранее неизвестной мутации. T/G полиморфизм в 16 интроне можно использовать в качестве маркера для косвенной ДНК-диагностики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малыгина H.A., Бадалян Л.О., Темин П.А., Каменных Л.Н., Заваденко H.H., Чухрова А.Л., Поляков A.B., Евграфов О.В. "Делеции гена дистрофина у больных миодистрофией Дюшенна и Беккера: корреляция клинических проявлений с типом делеций."// Тез. докл. VI съезда ВОГИС, Минск. - 1992. — С.124.

2. Чухрова А.Л., Малыгина H.A., Поляков A.B., Зайцева С.П., Ситников

B.Ф., Дадали Е.Л., Каменных Л.Н., Хренников В.Ю., Бадалян Л.О., Евграфов О.В. "Скрининг делеций у больных миодистрофией Дюшенна методом мультиплексной амплификации."// "Цитология и генетика". - 1994. — 28. -

C.80-83.

3. Чухрова А.Л., Поляков A.B., Малыгина H.A., Дадали Е.Л., Евграфоь О.В. "Картирование делеций в гене дистрофина."// Тез. докл. 4-й конференции "Геном человека-94", Черноголовка. - 1994.

4. Дадали Е.Л., Чухрова А.Л., Ситников В.Ф., Окунева Е.Г., Евграфо! О.В. "Анализ взаимосвязи некоторых клинических признаков миодистрофот Дюшенна и делетированных участков гена дистрофина."// Тез. докл. 1(3 российский съезд медицинских генетиков, Москва. - 1994. - С. 19.

5. Комарова Н.В., Чухрова А.Л., Дадали Е.Л., Ситников В.Ф., Евграфо! О.В. "ДНК-диагностика миодистрофии Дюшенна."// Тез. докл. 1(3 российский съезд медицинских генетиков, Москва. - 1994. - С.31.

6. Чухрова А.Л., Поляков A.B., Евграфов О.В. "Новый подход i изучению районов разрывов ДНК при делециях."// Тез. докл. 1(3) российски! съезд медицинских генетиков, Москва. - 1994. - С.67.

7. Комарова Н.В., Чухрова А.Л., Дадали Е.Л., Ситников В.Ф., Евграфо! О.В. "Применение ДНК-диагностики для профилактики миодистрофи) Дюшенна/Беккера."// Тез. докл. симпозиума "Профилактик неинфекционных заболеваний", Москва. - 1995.

8. Чухрова А.Л., Дадали Е.Л., Ситников В.Ф., Вассерман H.H., Евграфо О.В. "Изучение распределения точек разрыва при делециях в ген дистрофина."// Тез. докл. 5-й конференции "Геном человека-96' Черноголовка. - 1996. - С.72.

9. Артемьева О.В., Чухрова А.Л., Крапивская Е.Е., Малашенко А.М Пахомова Е.А., Вассерман H.H., Дадали Е.Л., Баранов B.C., Евграфов О.Е "Подходы к генотерапии миодистрофии Дюшенна."// Тез. докл. 5-конференции "Геном человека-96", Черноголовка. - 1996. - С.83.

10. Evgrafov О.V., Baranov V.S., Polyakov A.V., Malysheva О.V., Chuhro1 A.L., Artem'eva O.V., Malygina N.A., Gorbunova V.N., Makarov V.B. "Deletic screening of Duchenne muscular dystrophy patients in Russia: unusual hi

quency of deletions of 17 or 19 exons."// 4 Meeting of the Society of Human netics, Mains. Abstracts. - 1992. - P.280.

11. O.V.Evgrafov, A.V.Polyakov, S.P.Zaytseva, N.A.Malygina, ..Chuhrova, L.O.Badalyan "DNA diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in iscow."// Proceedings Int. Conf. On improving birth quality and child upgrading, jing, eds W.Jieping, Y.Rnying. - 1992. -P.331.

12. Evgrafov O.V., Baranov V.S., Polyakov A.V., Malysheva O.V., Chuhrova Artem'eva O.V., Malygina N.A., Gorbunova V.N. "Deletion screening of

:henne muscular dystrophy patients in Russia: unusual high frequency of stions of 17-19 exons."// 24 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet, »tracts. - 1992.-P.69.

13. Chuhrova A.L., Polyakov A.V., Evgrafov O.V. "A new approach to estigation of deletion breakpoints."// 26th Ann. Meeting of European Soc. of n. Genet., Paris, France. - 1994.

14. A.A.Petrukhin, I.A.Shagina, I.V.Mersijanova, A.L.Chuhrova, A.N.Petrin, i.Petrukhin, N.N.Zavadenko, O.V.Evgrafov. "DNA analysis in early diagnosis prevention of hereditary neuromuscular diseases."// The Mediterranean meeting :hild neurology. Abstracts, Portoroz, Slovenia. - 1995. -P.77.

15. Chuhrova A.L., Evgrafov O.V. "Deletion pattern of Moscow's patients i Duchenne/Bekker muscular dystrophy reveals some population specificity."// ¡1 Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstracts., London, UK, -1996. -1.

16. O.V.Evgrafov, S.M.Tverskaya, A.V.Polyakov, A.L.Chuhrova, Mersiyanova, G.R.Osipova. "View from Russia on improvement of prenatal A diagnostics: new methods and approaches."// 2nd PECO-EUCROMIC lgress Abstracts, Budapest, Hungary. - 1997. - 033.

17. Chuhrova A.L., Vasserman N.N., Evgrafov O.V. "A multiplex SSCP em for detection of dystrophin gene mutations and polymorphisms."// 29th Ann. :ting of European Soc. Hum. Genet. Abstracts., Genoa, Italy. -1997. - P.148.

i.VH-

(дписано в печать 29.10.97 Заказ № 125 Тираж 100 экз.

Участок множительной техники ЗАО "Де-Скор"