Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доменная организация гена дистрофина человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быстрицкий, Андрей Александрович

Содержание.

Использованные сокращения.

Введение.В

Обзор литературы.

Ген дистрофина.

Мышечная дистрофия Дюшенна: картирование гена.

Белок и его функции.

Структура гена. Изоформы.

Мутации в гене дистрофина.

Доменная структура генома.

Методы изучения доменной структуры генома.

Экстракция при высокой ионной силе.

LIS-экстракция.:.

Электроэлюция.

Гибридизация in situ.

Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса.

Связь между функциональной активностью генома и прикреплением ДНК к ядерному матриксу.

Ассоциация транскрипции с ядерным матриксом.

Ассоциация участков начала репликации с ядерным матриксом.

Ассоциация репарации с ядерным матриксом.

Пространственная организация хроматина и апоптоз.

Ассоциация рекомбинации с ядерным матриксом.

Участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу являются горячими точками болезнетворных мутаций.

Разные типы районов прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

Функциональные особенности гена дистрофина: указания на возможную пространственную организацию.

Пространственная организация гена дистрофина: практическое значение.

Материалы и методы.

Методические подходы.

Картирование границ петельных доменов.

Экспериментальные процедуры.

Культуры клеток.

Приготовление клеток, заключенных в агарозные блоки, и обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II in vivo.

Обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II in vitro.

Обработка клеток ДНКазой 1.

Расщепление заключенной в агарозные блоки ДНК рестриктазами.

Электрофорез и гибридизация.

Полимеразная цепная реакция и очистка PCRпродуктов.

Выделение мРНК и полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.

Результаты и обсуждение.

Ген дистрофина содержит несколько протяженных зон ассоциации хроматина с ядерным матриксом.

В периферийных районах петельных доменов не наблюдается участков предпочтительного расщепления топоизомеразой II.

Участки прикрепления хроматина к ядерному матриксу сверхчувствительны к экзогенной ДНКазе 1.

Дистрофии не экспрессируется в клетках HEL 92.1.7.

Клетки HEL 92.1.7 содержат одну Х-хромосому.

Связь между участками прикрепления хроматина к ядерному матриксу и другими функциональными элементами гена.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Доменная организация гена дистрофина человека"

В последнее время все больший интерес вызывает вопрос пространственной организации генетического материала высших эука-риот в клеточном ядре. Длина молекул ДНК, образующих геном высших эукариот, многократно превосходит диаметр клеточного ядра. Очевидно, что ДНК в ядре должна быть тем или иным способом упакована. В то же время, она должна оставаться доступной для различных процессов, затрагивающих генетический материал. Принципиальные моменты выявлены уже достаточно давно. Основными уровнями конденсации являются нуклеосомы, 30 нм фибрилла и образованные прикреплением 30-нм фибриллы к скелетным структурам ядра петельные домены размером 20-300 т.п.н. (Cook and Brazell, 1975). Подобные петельные домены наблюдаются не только в интерфазных ядрах, но и в митотических хромосомах (Warren and Cook, 1978). Первые работы по изучению пространственной структуры хроматина были сделаны около тридцати лет назад. Однако более детальные сведения, особенно о высших уровнях компактизации, стали появляться только в последние годы. Это связано, прежде всего, с развитием адекватных методических подходов (конфокальная микроскопия, гибридизация in situ и т.д.). Рост интереса к высшим уровням организации хроматина был предопределен накоплением большого количества данных о возможном соответствии петель ДНК независимым функциональным единицам генома (в первую очередь - репликонам и транскриптонам), а участков прикрепления петель к скелетным структурам ядра — различным функциональным элементам (промоторам, энхансерам, участкам начала репликации, участкам с повышенной частотой хромосомных перестроек и т.п.)

К сожалению, использовавшиеся до недавнего времени методики картирования петельных доменов и их границ допускают, по-видимому, значительное количество артефактов и не могут рассматриваться как отражающие действительную ситуацию в ядре (Razin et al., 1995). Наиболее распространенные из них могут быть разделены на два класса. Одна группа методов основана на экстракции мДНК после удаления дистальных частей петель (Jackson and Cook, 1985). Другая большая группа методов опирается на выявление фракций ДНК, имеющих повышенную аффинность к скелетным структурам ядра (Cockerill and Garrard, 1986а; Mirkovitch et al., 1984). Некоторое время назад в нашей лаборатории был разработан принципиально новый метод картирования петельных доменов хроматина. Он основан на расщеплении ДНК эндогенной топои-зомеразой II, входящей в состав ядерного матрикса. С использованием предложенного метода удается выявить участки прикрепления петель хроматина к матриксу (LAR) и картировать их позиции в геноме. Это, в свою очередь, позволяет соотносить положение LAR и других функциональных элементов генома.

Весьма интересен с точки зрения пространственной организации ген дистрофина человека. Имея длину более 2500 т.п.н. (Koenig et al., 1987), он является крупнейшим из известных на данный момент генов. Поскольку петельные домены хроматина, как правило, имеют протяженность 20-200 т.п.н., дистрофии, предположительно, должен простираться на несколько таких доменов. Проверка этого предположения представляет значительный интерес в свете гипотезы об относительной функциональной независимости доменов друг от друга. Для гена дистрофина показано существование большого количества изоформ экспрессируемых белков, картировано несколько промоторов, активность которых отчасти является тка-неспецифической (см. обзор Roberts, 2001). Кроме того, ранее в нашей лаборатории были картированы участки начала репликации в гене дистрофина (Вербовая и Разин, 1996; Verbovaia and Razin, 1997), и сравнение положения этих участков и участков прикрепления петель также интересно. Ген дистрофина примечателен еще и высокой частотой делеций и рекомбинаций (Blonden et al., 1991), происходящих в нем. При этом точки разрыва при хромосомных перестройках расположены по длине гена не случайным образом, а отчетливо кластеризуются в двух «горячих зонах» (Wapenaar et al., 1988). Ранее было показано, что топоизомераза II может принимать участие в процессах незаконной рекомбинации (Charron and Hancock, 1991). Преимущественно такие события происходят именно в матрикс-ассоциированных участках хроматина (Sperry et al, 1989; Lovett et al., 2001). Поэтому изучение расположения LAR в горячих зонах рекомбинаций тоже небезынтересно.

Описанные вопросы имеют и практическое применение. Продукт данного гена, белок дистрофии, входит в состав белкового комплекса, осуществляющего связь цитоскелета и внеклеточного матрикса. Данный комплекс особенно важен для нормального функционирования мышечных и нервных клеток. Упомянутые хромосомные перестройки в гене дистрофина приводят к тяжелым наследственным заболеваниям — мышечным дистрофиям Д юшенна и Бекера. Эти заболевания часто встречаются в популяции (в среднем один из 3500 новорожденных мальчиков несет новообразованную мутацию), имеют множественные клинические проявления помимо собственно дистрофии, наблюдается также сердечная недостаточность, нарушения умственного развития и др.), а более тяжелая дистрофия Дюшенна, как правило, приводит к смерти в 3035-летнем возрасте. Дистрофии Дюшенна и Бекера в настоящее время рассматриваются как цель для генной терапии (Haecker et al., 1996;McCarter et al., 1997), и более глубокое понимание организации гена дистрофина может существенно способствовать успешной реализации этих проектов.

Основными целями данной работы являлись анализ доменной структуры гена дистрофина и изучение связи доменной структуры с известными функциональными элементами гена. В ходе исследования планировалось решение следующих экспериментальных задач:

• картирование участков прикрепления петель хроматина к ядерному матриксу с помощью метода расщепления ДНК эндогенной топоизомеразой II и экзогенными нуклеазами;

• сопоставление позиций обнаруженных LAR с известными функциональными элементами гена (промоторами, ориджинами, «горячими зонами» рекомбинации и др.);

• сравнение результатов расщепления хроматина экзогенными нуклеазами и эндогенной ядерной топоизомеразой II в живых клетках и нуклеоидах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ген дистрофина

Мышечная дистрофия Дюшенна: картирование гена.

Мышечная дистрофия Дюшенна представляет собой тяжелое наследственное заболевание человека, имеющее плейотропный эффект (поражаются скелетные и сердечная мышцы — отсюда название, развивается слабоумие). Им страдают 1 из 3500 новорожденных мальчиков, причем в трети случаев болезнь вызвана не наследованной, а новообразованной мутацией (Alcantara et al., 1999; Moser, 1984). Мутации, вызывающие это заболевание, были картированы на Х-хромосоме (Davies et al., 1983). Также Х-хромосомы больных несут различные перестройки - делении и дупликации, четко выявляющиеся цитогенетическими методами (Greenstein et al., 1980; Francke et al., 1985). В конечном счете ген, мутации в котором вызывают DMD, был картирован в Х-хромосоме человека, в районе Хр21 (Koenig et al., 1987).

Белок и его функции.

Дальнейшее исследование картированного гена показало, что его продуктом является белок, названный дистрофином. Дистрофии -крупный (427 кДа) цитоскелетный белок (Koenig et al., 1988; Rybakova et al., 1996), являющийся «хребтом» белкового комплекса (дистрофиновый гликопротеиновый комплекс, DGC), в состав ко

Current Biology торого входит еще целый ряд белков - альфа- и бетадистрогликаны (Gee et al.,

1993) и несколько членов tfirtimi , iiu&uiuii синтрофинового семейства (Ahn et al, 1996), а также ряд других белков (рис. 1). Сам дистрофии представляет собой протяженный, боль

Рис. 1. Структура DGC млекопитающих ~ i г

1/ 31 шеи частью фибриллярныи из Chamberlain and Benian, 2000). Обозначе ^ белок. Он связывается с акния: Dys - дистрофии, Dg - дистрогликаны,

AChR - адетилхолиновые рецепторы, R - ТИНОВЫМИ филаментами И рапсин., Sg - саркогликаны, Sp - саркоспан, другими членами DGC.

Syn - синтрофины, Db - дистробревии, .

Дистрогликаны соединяют

NOS - NO-синтаза. комплекс с ламинином внеклеточного матрикса. Б нейромышечных контактах DGC способствует образованию больших кластеров ацетилхолиновых рецепторов и NO-синтазы. Синтрофины взаимодействуют со многими другими белками, включая различные протеинкиназы. Помимо перечисленных, в состав DGC могут входить и другие белки.

Данный комплекс присутствует не только в мышечных клетках, но и в нейронах (Lidov et al., 1990), что объясняет нарушения умственного развития у больных DMD. В нервной системе DGC обнаруживается не только в нейронах собственно нервной системы, но и в сетчатке (Schmitz et al., 1993), причем сетчатковый R-дистрофин значительно отличается от присутствующих в мышцах М- или в нервных клетках Р- и С-изоформ. DGC осуществляет связь цито-скелета с внеклеточным матриксом (Rybakova et al., 1996). Тем самым поддерживается механическую целостность сарколеммы при сокращениях мышц (Pasternak et al., 1995). В то же время, синтро-фины, входящие в состав DGC, в основном состоят из доменов, ответственных за белок-белковые взаимодействия. За счет этих доменов происходит связывание, например, потенциал-зависимых каналов (Gee et al., 1998) или NO-синтазы (Brenman et al., 1996). Таким образом, помимо своей чисто механической функции, DGC рекрутирует упомянутые белки, и, в некотором смысле, участвует в проведении межклеточных сигналов. Косвенно это подтверждается тем фактом, что DGC часто концентрируется в районах специализированных межклеточных контактов - синапсах ЦНС (Lidov et al., 1990) или нейромышечных синапсах (Peters et al., 1998). Следует отметить, что состав DGC варьирует в зависимости от типа ткани и функций конкретного участка клеточной мембраны (Peters et al., 1998). По-видимому, значимость DGC, в том числе и с клинической точки зрения, не ограничивается перечисленными выше функциями. Так, недавно было обнаружено, что входящий в состав комплекса а-дистрогликан является одной из приоритетных мишеней возбудителя проказы (Rambukkana, 2000).

DGC является весьма изменчивой структурой. Его состав различен для разных тканей (Blake et al., 1999) и стадий эмбрионального развития. То же самое можно сказать и о белках, входящих в состав комплекса. И в первую очередь следует обратить внимание на сам дистрофии.

Структура гена. Изоформы.

Ген дистрофина по многим параметрам выделяется из генов, известных на данный момент. Его наиболее примечательной чертой этого гена является размер — расстояние между первым промотором и участком терминации транскрипции составляет около 3000 т.п.н. (Nishio et al., 1994). Даже без учета крайнего 5'-промотора, чрезвычайно удаленного от последующего экзона, протяженность гена составляет примерно 2400 т.п.н. (Koenig et al., 1987). Обнаруженная в ходе картирования мРНК дистрофина имеет размер 14 т.н., также являясь одной из крупнейших среди известных. Ген дистрофина содержит 79 экзонов, самый протяженный из них — экзон 79 длиной 2,7 т.п.н. (Roberts et al., 1993), размер остальных не превышает 300 п.н. Таким образом, подавляющая часть гена дистрофина состоит из интронов.

Табл. 1. Изоформы гена дистрофина человека. i Обозначение! Размер I белка ! Размер MPHK (n) ; Экспрессируюшие j органы i Ссылки i

I i (кДа) !

Dp4271 | i 1 427 | 13764 лимфобластоидные j клетки; Nishio etal., 1994 j ' j

Dp427c j 427 j 14069 j мозг] Nudel etaL, 1989 1 1 i Dp427m 1 427 | 13993 Monaco, 1989 j Koenig etal., 1987 j

Dp427p | 427 j 14000 j Gorecki et al., 1992 j j fetal j j j Feener et al., 1989 J

Dp260 j . . . i 260 | 9773/9916 1 сетчатка! D'Souza et al, 1995

Dp 140 | 140 1 7410 ! ЦНС и почки tidov et al., 1995 j j ! .j 7378 j почки! Lidov et al., 1995

1 .j 7339 | мозжечок и почки lidov et al., 1995

1 j 7050 ; мозжечок J Lidov et al., 1995

7048 j мозжечок и почки j lidov etaL, 1995 ]

Dpi 16 j j 116 j | 5623 шванновские клетки Byers et al., 1993

Dp71 j 71 | 1 4623 повсеместно j Lederfein et al., 1993 Austin et al., 1995 j

72 j i 4591 i повсеместно 1 Austin et al., 1995 j

69 | 4584 | повсеместно! Austin et al, 1995 j

71 j 4552 ; повсеместно 1 Austin et al, 1995 j

Dp40 | 40 | 2200 j повсеместно J Tinsley et al, 1993 j

Помимо величины гена, дистрофии отличается еще и большим количеством изоформ, экспрессия которых зачастую тканеспеци-фична. На данный момент известно более десятка изоформ (табл. 1). Такое разнообразие достигается использованием всех основных способов образования альтернативных продуктов экспрессии. Во-первых, известно 7 (!) различных промоторов — Dp4271 (Nishio et al.,

1994), Dp427c (Nudel et al., 1989), Dp427m (первый из открытых промоторов, особенно активен в мышечной ткани), Dp427p (Gorecki et al., 1992), Dp260 (D'Souza et al., 1995), Dpl40 (Lidov et al.,

1995), Dpi 16 (Byers et al., 1993), Dp71 (Lederfein et al., 1993; Austin et al., 1995). Промоторы изоформ Dp427 обеспечивают транскрипцию альтернативных первых экзонов, которые далее сплайсируются на 2-й экзон*. Экзоны, расположенные за остальными промоторами, сплайсируются, соответственно, на экзоны 30, 45, 56, 63. Во-вторых, существует альтернативный основному сигнал полиаденилирования (Tinsley et al., 1993), благодаря которому образуется укороченная фетальная изоформа, а также Dp40 (с промотора Dp71). И, в-третьих, пре-мРНК дистрофина подвергается альтернативному сплайсингу, что добавляет разнообразия белковых продуктов (Lidov et al., 1995; Austin et al., 1995). Наиболее распространенные варианты альтернативного сплайсинга — удаление либо экзона 71, либо 78, или же и 71, и 78 одновременно. Также встречаются варианты без экзонов 71-72-78 и 71-72-73-74-78, или с отсутствующим экзоном 68.

Мутации в гене дистрофина.

Как уже упоминалось, ген дистрофина характеризуется необычайно высокой частотой происходящих в нем мутаций. К их числу относятся как точечные — нуклеотидные замены (Tuffery-Giraud et al., 1999), так и протяженные — делеции и рекомбинации (Blonden et al., 1989; Blonden et al., 1991). Blonden et al., 1989Появление в организме мутантных форм белка приводит к нарушениям функций DGC и, как следствие, к нарушениям функций мышечной и нервной тканей, а также синапсов. Мутации, приводящие к сбою рамки считывания, приводят к дистрофии Дюшенна, а не нарушающие рамку — как правило, к более мягкой дистрофии Бекера (Anand et al., 1999). Интересен тот факт, что точки разрыва хромосомных пере Здесь и далее номера экзонов приводятся в соответствии с их положением в вариантах Dp427, за исключением первых экзонов различных изоформ. строек в гене дистрофина распределены весьма неравномерно (Blonden et al., 1991; Alcantara et al., 1999; Hrdlicka et al., 2001). Наиболее часто перестройки происходят в районе экзонов 44-54 — там сосредоточено до половины точек разрыва (Wapenaar et al., 1988). Этот район называют основной горячей зоной делений, в отличие от дополнительной, расположенной в 5'-части гена между экзона-ми 10-14. В последней проиходит около четверти всех точек разрыва.

Доменная структура генома

Открытие скелетных структур ядра (Збарский и Дебов, 1948,1951; Георгиев, 1958; Збарский и Георгиев, 1959; Георгиев с соавт., 1960) натолкнуло на мысль, что ядро является высокоструктурированным образованием, и большинство происходящих в нем процессов четко локализованы в пространстве. Впоследствии было обнаружено, что хроматин в ядре прикреплен к ядерному скелету (Георгиев и Ченцов, 1960; Збарский и Георгиев, 1962), образуя петельные домены размером 20-200 т.п.н. (Cook and Brazell, 1975). Вскоре после обнаружения этого факта было высказано предположение о том, что эти петли являются не только структурными, но и функциональными единицами эукариотического генома. Было получено множество разнообразных данных, подтверждающих эту гипотезу. Однако до недавнего времени одним из основных направлений в исследовании доменной структуры эукариотического генома* были изоляция и изучение последовательностей ДНК, заякоривающих петельные домены на ядерном матриксе. Все соответствующие методики, так или иначе, были нацелены на выделение последовательностей, расположенных в непосредственной близости от ядерного матрикса. К сожалению, данный подход имеет два серьезных недостатка: во Следует отметить, что, к сожалению, разные авторы используют различные термины в этой области. В некоторых работах петли хроматина могут быть названы доменами, а в других доменами называют только функциональные единицы (репликоны и т.п.). Далее в тексте термин «домен» будет использоваться для обозначения любого относительного самостоятельного участка хроматина, хромосомы или генетического материала, как в пространственном, так и в функциональном смысле. первых, для определения собственно доменной структуры требуется трудоемкая работа по картированию выделенных последовательностей в геноме, и, во-вторых, используемые методики, по некоторым данным, дают информацию, не соответствующую состоянию in vivo. Кроме того, изучение собственно пространственной структуры генома происходит оторванно от изучения его функциональной организации.

Методы изучения доменной структуры генома.

Экстракция при высокой ионной силе.

Первая из распространенных методик в этой области была предложена Cook and Brazell (1980). С целью определить дистанцию между некой изучаемой последовательностью и районом прикрепления к ядерному матриксу они проводили нуклеазное расщепление ДНК, и после дифференциального центрифугирования определяли, в какой фракции находится интересующий их фрагмент — во фракции свободной ДНК, или же во фракции ДНК, остававшейся связанной с ядерным матриксом (мДНК). Ясно, что по мере увеличения степени расщепления расстояние между остающимися в мДНК последовательностями и истинными районами прикрепления к матриксу будет уменьшаться. Для обеспечения равной доступности ДНК петельных доменов для нуклеаз проводилось предварительное удаление пистонов путем экстракции при высокой ионной силе (2М NaCl).

Наиболее неожиданным оказалось то, что обнаруживалась связь между транскрипционным статусом исследуемых генов и их прикреплением к матриксу: транскрипционно активные гены обычно оказывались прикреплены к матриксу, тогда как неактивные обнаруживались в теле петельных доменов (Robinson et al., 1982). Наиболее впечатляющие результаты были получены при гормональной стимуляции дифференциации клеток эмбриональной печени цыпленка: тканеспецифично экспрессирующиеся гены обнаруживались во фракции свободной ДНК до стимуляции, и в мДНК - после. Б некоторых случаях это можно объяснить тем, что, по-видимому, после нуклеазной обработки не была проведена реэкстракция в условиях высокой ионной силы. Это, в свою очередь, может привести к обратному связыванию некоторых участков ДНК с матриксом во время нуклеазной обработки. Тем не менее, следует отметить, что и при наличии стадии реэкстракции результаты получались теми же. Кроме того, было показано связывание с матриксом не только транскрибирующихся, но и реплицирующихся участков (Berezney and Coffey, 1975).

LIS-экстракция.

Как следует из приведенных данных, высокосолевая экстракция, вероятно, может приводить к артефактам, связанным с агрегацией транскрипционных и репликативных комплексов с ядерным матриксом. Для предотвращения подобных артефактов было предложено проводить экстракцию хроматина ионным детергентом LIS в низкосолевом буфере (Mirkovitch et al., 1984). Получаемые таким образом структуры были названы «ядерный скэффолд», а связанные с ними участки ДНК - scaffold attachment regions (SARs). Неожиданно, идентифицированные таким образом SARs были неотличимы от элементов, обнаруженных в экспериментах по in vitro связыванию ДНК с ядерным матриксом - matrix attachment regions, MARs. В связи с этим возникает вопрос, сохраняются ли при LIS-экстракдии нормальные петельные домены, заякоренные на ядерный скэффолд? Как это ни странно, но этот вопрос ни разу не исследовался. Не проводились даже эксперименты по титрованию LIS-экстрагированных ядер бромистым этидием (как в работе Cook and Brazell, 1975). Этот метод использовался для доказательства петельной организации хроматина. В его основе лежит, во-первых, эффект внесения положительной суперспирализации в ДНК при связывании ее с EtBr. Экстракция из ядра гистонов при сохранении скелетных структур ядра приводит к отрицательной суперспирализации ДНК. Если препараты таких ядерных гало титровать EtBr и измерять после этого константу седиментации, то оказывается, что по мере увеличения концентрации EtBr константа седиментации препаратов гало сначала понижается, а потом начинает расти. Это объясняется тем, что сначала связывание EtBr с отрицательно су-перспирализованной ДНК, образующей закрепленные на остаточных структурах ядра петли, приводит к уменьшению абсолютной величины суперспирализации. Иными словами, петели ДНК расплетаются и нуклеоид увеличивается в размере, становясь все более «рыхлым». В результате константа седиментации уменьшается. Этот процесс идет до тех пор, пока не произойдет полная потеря исходно отрицательной суперспирализации. Гало с релаксированной ДНК имеют максимальный диаметр, минимальную плотность и минимальную же скорость седиментации. Дальнейшее связывание EtBr вызывает дополнительное нагнетание положительной суперспирализации, но теперь уже абсолютная величина суперспирализации растет и процесс поворачивает вспять — гало сжимаются и уплотняются. Скорость их осаждения, напротив, увеличивается.

Помимо демонстрации самого факта петельной организации ДНК, этот метод позволяет определить и средний размер петель. Для этого достаточно знать, при каком количестве EtBr был достигнут минимум константы седиментации. Б процессе же какой-либо обработки титрование образцов бромистым этидием на разных стадиях позволяет контролировать, не происходит ли изменение среднего размера петель. А такое изменение возможно только при разрушении или образовании новых участков прикрепления к ядерному матриксу. Однако в экспериментах по LIS-экстракции такого контроля не проводилось. Поэтому нет гарантии того, что при LIS-экстракции в гипотоническом буфере сохраняются основные черты нативной топологической структуры ядра. Возможно, сначала происходит полное отсоединение ДНК от скэффолда с после-дупюим воссоединением; по-видимому, данная методика представляет собой своеобразную разновидность экспериментов по связыванию ДНК с ядерным матриксом in vitro, что и приводит к столь сильному сходству SARs и MARs.

Электроэлюния.

Для предотвращения артефактов, связанных с высоко- или низкосолевой обработкой, было предложено отделять высвободившиеся после нуклеазного расщепления фрагменты от ядерного матрикса с помощью электроэлюции при физиологической ионной силе (Jackson and Cook, 1985, 1986). При этом нет необходимости разрушать нуклеосомную структуру хроматина. Недостатком же этой методики является неодинаковая доступность разных участков ДНК для нуклеаз в силу топологической структуры самого хроматина.

Полученные с помощью этого метода результаты оказались очень схожи с результатами, полученными при высокосолевой экстракции. В частности, вновь была показана связь с матриксом транскрибирующихся (Jackson and Cook, 1985) и реплицирующихся (Jackson and Cook, 1986) участков, но в данном случае эти результаты уже не могут быть объяснены артефактной агрегацией высокомолекулярных комплексов в результате действия высокой ионной силы. Также было показано, что экстракция ядер гипотоническими буферами (в том числе и LIS-экстракция) приводят к значительным артефактам.

Гибридизация in situ.

Последние годы ознаменовались взрывным ростом количества работ с использованием методики FISH, позволяющей напрямую увидеть расположение каких-то последовательностей на препаратах клеток или ядер, интактных или подвергнутых каким-то дополнительным обработкам. Проводя гибридизацию на препаратах гало ядер или хромосом, можно определить, расположена ли проба в ассоциированном с матриксом участке хроматина или же в дисталь-ной части петли (Gerdes et al., 1994). Этот метод позволяет избавиться от большей части недостатков, присущих вышеописанным подходам. К сожалению, он весьма капризен и сложен для массового применения. Также он пока что остается самым дорогим среди всех перечисленных методов.

Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса.

Топоизомераза II является одним из основных компонентов ядерного матрикса (Berrios et al., 1985), играя важнейшую роль в процессах расхождения хромосом и снятия пространственных напряжений в ДНК. Промежуточным продуктом, образующимся в ходе катализируемой этим ферментом реакции, является ДНК с двунитевым разрывом, ковалентно связанная с молекулой фермента. На этой стадии реакция может быть остановлена с помощью таких ингибиторов, как VM-26, VP-16, m-AMSA и некоторых других (Chen et al., 1984). Так как топоизомераза II является компонентом ядерного матрикса, то логично было бы использовать этот фермент для вырезания из генома отдельных петельных доменов по местам их прикрепления к матриксу. Несколько усложняет картину наличие в ядре не только входящей в матрикс топоизомеразы, но и так называемой растворимой формы фермента, распределенной в кариоплазме. Для этой фракции топоизомеразы II мишенью служат не только участки связывания с матриксом, но и другие районы -сайты, гиперчувствительные к нуклеазам (Reitman and Felsenfeld, 1990), и даже межнуклеосомные участки (Udvardy and Schedl, 1991). Для снижения нежелательного влияния растворимой топоизомеразы пермеабилизованные клетки обрабатываются 2М NaCl, и только после этого инкубировались с VM-26. Экстракция 2М NaCl не приводит к появлению каких-либо заметных артефактов (Iarovaia et al., 1995). После топоизомеразного расщепления в присутствие VM-26 и инкубации с протеиназой К, полученные образцы петельных доменов разделяются с помощью пульс-электрофореза и подвергаются Саузерн-анализу.

Данная методика была апробирована на генах рРНК (Razin et al., 1993; Яровая с соавт., 1993). Саузерн-блот показал, что расщепление нерастворимой в 2М NaCl топоизомеразой II приводит к образованию фрагментов, размер которых кратен размеру повтора рДНК. Степень расщепления прямо зависит от концентрации VM-26 - при высоких концентрациях ингибитора наблюдается только мономер рДНК повтора. Расщепление происходит всегда в одном и том же районе, хотя размер этого района сравнительно велик — 5.10 т.п.н. Таким образом, каждый рДНК повтор организован в индивидуальный петельный домен, причем район связывания с матриксом, в котором и происходит расщепление, расположен в нетранскрибируе-мом спейсере перед геном 45S пре-рРНК.

Такие же результаты были получены при инкубации с VM-26 живых, а не пермеабилизованных клеток, хотя фон при этом был существенно сильнее. Это значит, что районы связывания с матриксом представляют предпочтительные мишени для топоизомеразы и в интактных ядрах, а значительное усиление фона объясняется действием растворимой фракции топоизомеразы II.

Наиболее важный результат этих исследований заключается в том, что предложенный метод работает так, как и предполагали его создатели, позволяя исследовать доменную организацию различных областей генома. Следует отметить, что для использования данной методики совершенно не важно, какую именно функцию выполняет топоизомераза II в составе ядерного матрикса - является ли она его структурным компонентом, входит в состав белкового комплекса, обеспечивающего заякоривание доменов на матриксе, или же выполняет еще какую-то роль.

Тот факт, что район, в котором происходит расщепление, имеет довольно большую длину, может означать, что районы связывания с ядерным матриксом на самом деле представляют собой протяженные участки, в пределах которых находится много сайтов, участвующих в сравнительно слабых взаимодействиях, обеспечивая в сумме прочное заякоривание доменов на матриксе. Последовательности, разделяющие эти сайты, хотя и расположены в матриксе, но, тем не менее, остаются доступны для нуклеаз - как эндо-, так и экзогенных, поэтому получаемые традиционными методами SAR/MAR-элементы имеют длину порядка 100-200 п.н. Это подтверждено и прямыми экспериментами по исследованию участков прикрепления петель с высоким разрешением (Gromova et al., 1995а), которые однозначно показали наличие нескольких предпочтительных точек расщепления ДНК топоизомеразой II в участке прикрепления геномных петель к матриксу.

Ранее было показано, что деградация клеточной ДНК при апоп-тозе начинается с вырезания фрагментов размером 50-300 т.п.н. (Oberhammer et al., 1993), и примерно такие же фрагменты образуются при обработке хромосом некоторыми экзогенными нуклеаза-ми (Clark et al., 1987). Сходство размеров этих фрагментов и петельных доменов натолкнуло на мысль, что эти процессы фрагментации ДНК имеют не случайный характер, а как-то связаны с ее пространственной организацией и, в частности, с укладкой в домены. Для проверки этого предположения были проведены параллельно расщепление топоизомеразой II и некоторыми нуклеазами - ДНКа-зой I, нуклеазой S1, эндогенной Са2+/М£;2+-зависимой нуклеазой. В качестве модельной системы был выбран амплифицированный с-тус локус человека (Gromova et al., 1995b). Все рассмотренные нуклеазы расщепляли ДНК преимущественно в тех же местах, что и топои-зомераза II ядерного матрикса. Подобная же картина наблюдалась при расщеплении нуклеазой S1 в пермеабилизованных клетках цыпленка (рассматривался район а-глобинового кластера) (Targa et al., 1994) и при расщеплении экзогенной нуклеазой Ва1 31 кластера генов рРНК человека (Iarovaia et al., 1995). Во всех случаях приведенные результаты не могли быть получены при нуклеазной обработке ядер, подвергшихся высокосолевой экстракции, или свободной ДНК. По-видимому, только специфическая пространственная организация ДНК в ядре обеспечивает повышенную чувствительность районов связывания с матриксом к нуклеазам.

Связь между функциональной активностью генома и прикреплением ДНК к ядерному матриксу.

Ассоциация транскрипции с ядерным матриксом.

Связь транскрибирующихся районов генома с ядерным матриксом к настоящему времени продемонстрирована неоднократно (Jost and Seldran, 1984; Разин с соавт., 1985; Wei et al., 1999). Большинство экспериментов было сделано с использованием методики, предложенной Cook and Brazell, которая основана на нуклеазном гидролизе дегистонизированной ДНК. Практически во всех экспериментах активные гены наблюдаются во фракции мДНК, а неактивные — в отщепляемой. В экспериментах по гормональной индукции клеток эмбриональной печени цыпленка наблюдалось четкое соответствие: сначала ген вителлогенина переходил из отщепляемой фракции в мДНК, а спустя короткое время в клетках резко увеличивалось количество мРНК вителлогенина (Jost and Seldran, 1984). Аналогичные результаты были получены и для ряда других объектов.

Однако при более близком рассмотрении многие результаты оказываются весьма несхожими. Так, для одних генов показана ассоциация с матриксом всей транскрибируемой области (Разин с со-авт., 1985), для других — только нетранскрибируемых участков, как в случае генов рРНК (Bolla et al., 1985). Было высказано предположение, что причиной наблюдаемой ассоциации активных генов с ядерным матриксом является не наличие такой связи in vivo, а происходящая в процессе обработки преципитация транскрипционных комплексов на ядерный матрикс (Mirkovitch et al., 1984). Однако множество данных опровергает это предположение. Обработка РНКазой не приводит к отсоединению активных генов от ядерного матрикса (Cook and Brazell, 1978). Тепловой шок, останавливающий транскрипцию, также не приводит к отсоединению активно транскрибировавшихся генов от ядерного матрикса (Small et al., 1985). Более того, выделение фракции мДНК в изотонических условиях не предотвращает ассоциацию транскрибируемых генов с ядерным матриксом (Thorburn and Knowland, 1993).

Однако, возможно, связь транскрибируемых участков с ядерным матриксом является лишь следствием процесса транскрипции, либо следствием активации транскрипции. Как было неоднократно показано, транскрипционные комплексы связаны с ядерным матриксом (Разин с соавт., 1985; Wei et al., 1999). Также было показано, что некоторые MAR-связыващие белки обладают ярко выраженным сродством к транскрипционным комплексам (Nayler et al., 1998). Эти данные могут свидетельствовать о том, что связывание с ядерным матриксом является необходимым условием для транскрипции, но не наоборот. Кроме того, местоположения границ петельных доменов в геноме фиксированно. Это невозможно, если связь с ядерным матриксом осуществляется посредством транскрипционных комплексов.

Гипотеза о соответствии петельных доменов транскрипционным единицам косвенно подтверждается данными о нуклеазной чувствительности активных и неактивных локусов. Уже давно показано, что транскрипционно активный хроматин имеет повышенную чувствительность к некоторым нуклеазам, например, ДНКазе I, причем зона повышенной чувствительности простирается далеко за пределы собственно транскрибируемой области (Alevy et al., 1984). Степень чувствительности хроматина к нуклеазному расщеплению определяется особенностями укладки хроматина на уровне нуклеосом и наднуклеосомных структур (Felsenfeld, 1992); определенную роль играют и различные модификации гистонов, например, ацетили-рование (Reeves, 1984). По-видимому, этот фактор влияет опосредованно, через изменения все той же укладки ДНК на нуклеосомах и межнуклеосомных взаимодействиях. Кроме того, транскрипционно активнее локусы отличаются наличием торзионных напряжений, вызванных движением РНК-полимеразы. Перед ферментом нагнетается «волна» положительной суперспирализации, а за ним остается «след» отрицательной (Liu and Wang, 1987).

Транскрипционно неактивные локусы, как правило, устойчивы к действию ДНКазы I по всей длине. В случае соседства нуклеазно-чувствительного и устойчивого доменов граница между ними всегда выражено очень четко, и положение этой границы фиксировано (Levy-Wilson and Fortier, 1989). Этот факт заставляет предполагать, что на границах транскриптонов расположено «нечто», препятствующее распространению того или иного типа укладки хроматина дальше определенных пределов. О том же свидетельствует и существование так называемого «эффекта положения». ЭП выражается в зависимости транскрипционной активности чужеродной последовательности, интегрированной в геном, от активности того района генома, куда произошла интеграция. ЭП может быть нейтрализован, если интегрируемая последовательность несет по краям элементы, связывающиеся с ядерным матриксом. Таким образом, образуется минидомен, на который не распространяется статус окружающих последовательностей. В качестве таких фланкирующих элементов могут быть использованы некоторые SAR/MAR-элементы (Stief et al., 1989; Kalos and Fournier, 1995). В большинстве случаев SAR/MAR просто усиливают экспрессию репортерного гена, но не изолируют его полностью от действия ЭП (Poljak et al., 1994). Тем не менее, некоторые SAR/MAR все же обеспечивают такую изоляцию (Schlake et al., 1994).

Механизм нейтрализации ЭП не совсем ясен. По-видимому, основным механизмом такой нейтрализации является образование топологических «замков» на границах минидомена. Модификация гистонов приводит к нагнетанию отрицательной суперспирализа-ции в минидомене, что, в свою очередь, стимулирует транскрипцию (Freeman and Garrard, 1992). Образование же топологических замков на границе [мини]домена препятствует «растворению» отрицательной суперспирализации за его пределы, одновременно блокируя возможное проникновение положительной суперспирализации извне.

Возможность образования топологических замков хорошо согласуется с основными свойствами не только SAR/MAR-элементов, но и других последовательностей, способных связываться с ядерным матриксом или ассоциированными с ним структурами. Эти свойства - АТ-богатый состав (Cockerill and Garrard, 1986а; BouHkas, 1992) и вырожденность (Каландадзе с соавт., 1988; Boulikas and Kong, 1993; Яровая с соавт., 1984), что обеспечивает легкоплавкость и возможность образования неканонических структур. Эти особенности первичной структуры обеспечивают связывание с различными белками, которые, в свою очередь, связываются друг другом и другими, не-ДНК-связьшающими белками. В конечном счете, все эти взаимодействия могут привести к образованию на границе доменов ДНК-белкового комплекса, который, с одной стороны, обеспечивает физическое закрепление ДНК на ядерном матриксе, а, с другой стороны, изолирует домен от действия расположенных рядом «чужих» регуляторных элементов.

Ассоциация участков начала репликации с ядерным матриксом.

Уже давно было показано, что геном эукариот реплицируется параллельно, будучи составлен из большого количества независимо реплицирующихся единиц - репликонов (Hand, 1978), число которых может достигать десятков тысяч. Исследования количества и средних размеров репликонов в разных типах клеток показало высокую корреляцию этих величин с таковыми для петельных доменов хроматина (Buongiorno-Nardelli et al., 1982; Hartwig, 1978). Это наблюдение послужило основанием для гипотезы о том, что петельные домены хроматина соответствуют репликонам. Отсюда, в свою очередь, следует логический вывод, что участки прикрепления петель к ядерному матриксу, скорее всего, несут какую-то реплика-тивнуго функцию.

Такая ассоциация ориджинов с ядерным матриксом показана уже очень давно (Berezney and Coffey, 1975). Исследования связи репликации с ядерным матриксом проводили с помощью импульсного включения меченого предшественника и дальнейшего выявления метки в мДНК и в отщепляемой фракции. По мере увеличения времени пульса или интервала межу пульсом и выделением мДНК метка начинает проникать или мигрировать, в зависимости от конкретного метода, из матрикс-связанной фракции в отщепляемую (Berezney and Coffey, 1975; Fernandes et al., 1988). Ассоциация реплицирующихся участков с матриксом была продемонстрирована и напрямую — с помощью радиоавтографии на препаратах ядерных гало (Vogelstein et al., 1980).

Было показано, что репликативные комплексы весьма прочно связаны с ядерным матриксом. Очищенные препараты ядерного матрикса оказались способны элонгироватъ инициированные последовательности in vitro (Van der Velden et al., 1984; Shioda et al., 1989). В то же время, с матриксом связана не только репликативная машинерия, но и второй компонент, необходимый для репликации — участки начала репликации (Lagarkova et al., 1998; Razin et al., 1986, 1991b; Ortega and DePamphilis, 1998). Ассоциация ориджинов с ядерным матриксом является постоянной. Она наблюдается в течение всего клеточного цикла, в любых типах клеток независимо от их транскрипционного и репликативного статуса. Этот факт был неопровержимо показан с использованием различных методов — как прямого картирования конкретных ориджинов в конкретных функциональных доменах, так и ренатурационными экспериментами с тотальными фракциями мДНК и ранореплицирующимися последовательностями (Razin et al., 1986; Ariizumi et al, 1993; Svetlova et al., 2001).

Ассоциация репарации с ядерным матриксом.

Данных о связи репарации ДНК с ядерным матриксом значительно меньше, чем о связи с ним транскрипции или репликации. Как ни удивительно, это не мешает практически всем исследователям, чьи интересы в той или иной степени касаются ядерного матрикса, быть уверенными в том, что такая связь существует. Наличие такой уверенности, в свою очередь, не стимулирует изучение этого вопроса.

Показано, что мДНК обогащена репарирующимися последовательностями (McCready et al., 1984), и что процесс репарации ассоциирован со скелетными структурами ядра (Xu et al., 1994). Также показано, что основные ферменты, участвующие в процессе репарации - PARP и ДНК-полимераза (3 - локализуются преимущественно на ядерном матриксе (Smith et al., 1984; Galande and Kohwi-Shigematsu, 1999).

Пространственная организация хроматина и апоптоз.

Одним из наиболее активно изучаемых в настоящее время на молекулярном уровне процессов является апоптоз, или запрограммированная клеточная смерть (Wyllie et al., 1980). Важным признаком апоптоза является ферментативная деградация ДНК, происходящая до нарушения целостности ядерной оболочки. Исходно было обнаружено расщепление ДНК в ходе апоптоза на олигонуклеосомные фрагменты (Cohen and Duke, 1984), и это событие оказалось весьма характерным признаком и маркером апоптоза. Впоследствии было показано, что олигонуклеосомной деградации предшествует расщепление хроматина на значительно более крупные фрагменты размером 50-300 т.п.н. (Filipski et al., 1990; Oberhammer et al., 1993). Совпадение размеров продуктов первичной апоптозной деградации со средним размером петельных доменов натолкнуло на мысль о связи этого процесса с пространственной организацией хроматина. Само по себе совпадение размеров является весьма слабым аргументом. Используя описанный выше (см. раздел «Расщепление топои-зомеразой II ядерного матрикса») метод, была выявлена специфичность ранней апоптозной фрагментации ДНК и картированы позиции, по которым производится расщепление (Lagarkova et al., 1995а; Ioudinkova et al., 1998). Наличие таких данных позволило сравнить позиции апоптозной фрагментации с границами петель, картированных с помощью топоизомеразного расщепления. Тем самым было показано, что на ранних стадиях апоптоза происходит специфическая деградация хроматина по местам прикрепления петельных доменов хроматина к ядерному матриксу. В последнее время появились данные о том, что в ранних стадиях апоптозного расщепления хроматина может принимать участие сама топоизоме-раза II (Li et al., 1999), что еще раз подтверждает связь этого процесса с ядерным матриксом.

Ассоциация рекомбинации с ядерным матриксом.

Помимо репликации и транскрипции, с ядерным матриксом, по-видимому, связаны и разнообразные перестройки генома. Ранее было показано, что точки разрыва при различных хромосомных перестройках распределены по геному не равномерно, а кластеризование. «Горячие точки» рекомбинации удалены друг от друга расстояние примерно 20-100 т.п.н., на протяжении которых перестройки происходят очень редко (Henglein et al., 1989). Эта величина совпадает с размером петельных доменов. Также известно, что двуцепо-чечные разрывы в ДНК могут приводить к хромосомным перестройкам (Windle et al., 1991), а одним из источников таких разрывов может являться топоизомераза II. Этот фермент составляет значительную часть ядерного матрикса (Berrios et al., 1985). Возможность прямого участия топоизомеразы II в рекомбинационных процессах уже обсуждалась в литературе (Blasquez et al., 1989; Sperry et al., 1989). В ядерном матриксе была обнаружена рекомбиназная активность (Pandey et al, 1991), которая пока что слабо охарактеризована. Чтобы выяснить, действительно ли районы прикрепления к матриксу представляют собой горячие точки рекомбинации и хромосомных перестроек, было проведено сравнение позиций горячих точек и районов прикрепления к матриксу в области гена с-тус человека. Была обнаружена хорошая корреляция в их расположении (И.И.Громова и С.В.Разин, неопубл.). И, более того, были прямо продемонстрированы хромосомные перестройки, возникающие при культивировании клеток в присутствии VM-26 (Charron and Hancock, 1991). Возможным механизмом такой рекомбинации является обмен концами двуцепочечных разрывов между разными молекулами топоизомеразы II, расположенными поблизости на ядерном матриксе.

Участки прикрепления АНК к ядерному матриксу являются горячими точками болезнетворных мутаций.

В последние годы было показано, что топоизомераза II непосредственно участвует в образовании ряда перестроек, приводящих к серьезным заболеваниям. Особенно интенсивно изучается в связи с этим ряд лейкемий. Интерес к ним вызван тем, что некоторые формы лейкемии возникают вследствие медикаментозного лечения опухолей препаратами, воздействующими на топоизомеразу II (Andersen et al., 2001). Особый интерес представляет тот факт, что алкилирующие агенты обычно приводят к миелодиспластическому синдрому (MDS/AML), вызванной полной или частичной делецией хромосом 5 или 7. В то же время ингибиторы топоизомеразы II, такие, как эпиподофиллотоксины (этопозид и тенипозид) и доксору-бицин, вызывают лимфоидные лейкемии (MLL и ALL; Felix, 1998). Последние практически во всех случаях являются следствием транслокаций (а не других перестроек) в гене MLL (myeloid-lymphoid leukemia или mixed lineage leukemia; Domer et al., 1993). Этот ген, расположенный в участке q23 хромосомы И, является человеческим аналогом гена tri-thorax D.melanogaster. Большинство случаев MLL/ALL связаны с транслокацией t(4;ll)-(q21;q23), приводящей к образованию химеры с протоонкогеном AF9 (Domer et al., 1993).

Причинно-следственная связь между терапевтическим применением ингибиторов топоизомеразы II и вторичными лейкемиями в настоящее время не вызывает сомнений. Ген MLL и конкретные позиции болезнетворных транслокаций в последние годы изучались весьма интенсивно. Было показано, что концевые точки этих транлокаций в гене MLL кластеризованы® кластер (bcr) длиной 8,5 т.п.н. Этот кластер содержит два SAR-элемента (Broeker et al., 1996) и кон-сенсусные сайты расщепления топоизомеразы II in vitro (Broeker et al., 1996; Lovett et al., 2001). При культивировании клеточных линий с ингибиторами топоизомеразы II было показано образование такой же перестройки t(4;ll), что и приводящая к MLL in vivo (Stanulla et al., 1997a), причем конкретная точка, по которой происходит рекомбинация, является консенсусным сайтом связывания топоизомеразы II (Lovett et al., 2001).

Вышеперечисленное не оставляет сомнений в том, что топоизо-мераза II является активным участником процесса рекомбинации. Наличие же двух SAR-элементов, фланкирующих bcr, свидетельствует в пользу того, что этот участок прикреплен к ядерному матрик-су. Логично было бы предположить, что топоизомераза II, вызывающая описанные перестройки, также является матрикс-ассоциированной. Наконец, продемонстрировано, что bcr подвергается расщеплению на ранних стадиях апоптоза (Stanulla et al., 1997b).

Разные типы районов прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

Как уже неоднократно упоминалось выше, идея о связи пространственной структуры и функциональной организации генома была высказана почти сразу по обнаружении скелетных структур ядра и петельных доменов хроматина. Подтверждений этой гипотезы получено очень много, однако наблюдаются и противоречия. Кроме того, следует отметить, что практически все процессы, в которые вовлечена геномная ДНК, так или иначе ассоциированы с ядерным матриксом, однако далеко не все места такой ассоциации являются границами геномных доменов.

Это противоречие легко разрешается, если предположить, что существуют два типа участков связывания ДНК с ядерным матриксом. Первый тип - конститутивные, которые присоединены к мат-риксу всегда, вне зависимости от функционального статуса клетки. Второй же - факультативные, которые связываются с матриксом только для выполнения каких-то задач (транскрипции, элонгации репликации, репарации и т.п.) (Разин с соавт., 1985; Jackson et al., 1992). До разработки метода топоизомеразного расщепления проверка этой гипотезы была весьма непростой задачей. Существовавшие методики позволяли лишь получать тотальные фракции SAR/MAR без привязки их к определенным позициям генома. Здесь следует отметить, что методики обнаружения SAR/MAR элементов, по-видимому, вносят значительное количество артефактов. При проведении подобных экспериментов, но при физиологических условиях — в первую очередь, ионной силе — до 70% так называемых SAR/MAR последовательностей не связываются с белковыми структурами ядра (Andreeva et al., 1992; Hancock, 2000). Тем не менее, даже и без картирования границ конкретных доменов проверка гипотезы о существовании подклассов участков связывания хроматина с матриксом возможна. Очень изящно такая проверка была проведена с использованием ренатурационных экспериментов (Razin et al., 1986). Поводилась реассоциация следовых количеств мДНК куриных эритробластов или эритроцитов в присутствии избытка мДНК, наоборот, эритроцитов или эритробластов. Ассоциированная с матриксом ДНК эритробластов в присутствии избытка мДНК эритроцитов реассоциировала лишь частично, тогда как мДНК эритроцитов в присутствии избытка мДНК эритробластов реассоциировала полностью. Таким образом, в эритроцитах с ядерным матриксом ассоциирована лишь часть последовательностей, связанных с ядерным матриксом в эритробластах. Принимая во внимание, что эритроциты являются финальными стадиями диф-ференциировки, имеют сильно компактифированный хроматин, практически не осуществляют транскрипцию и совсм не осуществляют репликацию, логично предположить, что «недостающая» по сравнению с эритробластами часть мДНК ответственна именно за обеспечение различных активностей хроматина.

Физическое картирование границ доменов позволяет соотносить участки прикрепления ДНК к скелетным структурам ядра не в общем, а на конкретных участках. В сочетании с другими подходами это позволяет решать задачу о взаиморасположении этих границ с транскрибируемыми областями и участками начала репликации. (Безусловно, и SAR/MAR последовательности давно и успешно картировались в геноме, однако это требовало значительных дополнительных усилий).

Были картированы районы прикрепления к матриксу кластера а-глобиновых генов цыпленка в эритробластах, зрелых эритроцитах и зрелых сперматозоидах (Разин с соавт., 1985; Kalandadze et al., 1990). Предполагалось, что в зрелых и транскрипционно неактивных эритроцитах и сперматозоидах районов прикрепления к матриксу в глобиновом кластере будет меньше, чем в активно транскрибирующих эритробластах. И действительно, если в эритроцитах и сперматозоидах были обнаружены только два района прикрепления к матриксу, фланкирующие кластер с обеих сторон, то в эритроб-ластах вся транскрибируемая область была связана с матриксом.

По-видимому, задачу собственно упаковки генетического материала в ядро решают участки конститутивного прикрепления ДНК к ядерному матриксу; для отличия от других последовательностей, связывающихся с матриксом на какое-то время, или потенциально способных к такому связыванию, такие участки далее будут называться LAR. Возможно, некоторые LAR несут и еще какие-то функции, например, являются участками начала репликации. Помимо LAR, в геноме присутствуют и другие элементы, способные связываться с ядерным матриксом или ассоциированными с ним структурами (такими, как транскрипционные комплексы, ферменты репарации и пр.). Возможно, сама способность взаимодействовать с теми или иными белками обуславливает в чем-то сходные характеристики этих последовательностей, наиболее характерными из которых является их АТ-богатый состав (Cockerill and Garrard, 1986a,b; Boulikas, 1992), что, в свою очередь, упрощает денатурацию.

Основное внимание большинства исследователей и ранее, и в настоящее время посвящено SAR и MAR-элементам (Cook and Brazell, 1980; Mirkovitch et al., 1984). Эти последовательности, с одной стороны, входят в состав или соседствуют с самыми разными функциональными элементами генома — энхансерами, промоторами, горячими зонами перестроек, ориджинами. В то же время SAR/MAR могут встречаться и внутри транскрибируемых районов, в том числе экзонных последовательностей (Cockerill and Garrard, 1986a,b; Beggs and Migeon, 1989). В то же время, методики выявления SAR и MAR-элементов включают в себя этапы с резко нефизиологичными условиями. При физиологических же условиях значительная часть этих последовательностей оказывается не связанной с какими-либо нерастворимыми структурами. Так, при нуклеаз-ном расщеплении в условиях физиологической ионной силы и последующей электроэлюции до 70% SAR/MAR последовательностей беспрепятственно покидает ядро (Hancock, 2000).

Приведенные данные наталкивают на мысль, что рассматривавшиеся до сих пор большинством исследователей SAR- и MAR-элементы представляют собой последовательности, способные связываться с ядерным матриксом при определенных условиях, а возможно — и не только с матриксом. Именно поэтому необходимо изучать участки прикрепления хроматина к ядерному матриксу in vivo и не зависимо от функционального статуса клетки, и сопоставлять получаемые результаты с независимо полученными данными о прочих функциональных элементах генома.

Функциональные особенности гена дистрофина: указания на возможную пространственную организацию

Учитывая описанные выше особенности гена DMD, логично предположить, что в хроматине он представлен несколькими петельными доменами. В пользу такой гипотезы говорят все его характерные особенности.

Первое, что наталкивает на предположение о многопетельной организации дистрофина - размер этого гена. 2500 т.п.н. — величина, многократно превышающая размер самых крупных из наблюдавшихся петель хроматина (Leon and Kezer, 1990; Jackson et al., 1990).

Наличие большого количества изоформ, экспрессируемых ткане-и времяспецифически, предполагает развитую регуляцию транскрипции. К настоящему моменту накоплен богатый фактический материал, свидетельствующий о связи транскрипции (и ее регуляции) с пространственной организацией генома (Robinson et al., 1982; Small et al., 1985; Jost and Seldran, 1984; Разин с соавт., 19856; Миронов с соавт., 1983). Неоднократно было показано, что регуля-торные участки — промоторы, энхансеры и т.п. - очень часто ассоциированы с ядерным матриксом, равно как с MAR/SAR последовательностями (Schubeler et al., 1996; Jackson, 1997;Tan et al., 1998; Vaucheret et al., 1998).

Размер гена дистрофина предполагает наличие в этом участке хроматина нескольких петельных доменов не только прямо, но и опосредованно. Как правило, размер репликонов у человека значительно меньше, чем протяженность гена дистрофина (Соловьева с соавт., 1997). Поэтому, скорее всего, ген дистрофина содержит в себе несколько репликонов, что и было показано ранее в нашей лаборатории (Вербовая и Разин, 1996; Verbovaia and Razin, 1997). В то же время, неоднократно было показано, что петельные домены соответствуют единицам репликации генома (Buongiorno-Nardelli et al., 1982; Sparvoli et al., 1994). Рассмотренные в комплексе, эти факты являются косвенным свидетельством того, что ген дистрофина организован в несколько петельных доменов.

Высокая частота хромосомных перестроек и кластеризация их точек разрыва в гене дистрофина также указывают на то, что рассматриваемый ген может быть организован в несколько петельных доменов. Если точнее, то эти факты указывают на возможное наличие в гене дистрофина участков прикрепления хроматина к ядерному матриксу. Как было показано ранее, такие участки могут быть горячими точками рекомбинаций (Sperry et al., 1989), в том числе и в результате активности топоизомеразы II (Charron and Hancock, 1991; Lovett et al., 2001). Из существования же нескольких участков прикрепления (как минимум, двух — по количеству горячих зон рекомбинации) в гене дистрофина автоматически следует организация этого гена в несколько доменов.

Пространственная организация гена дистрофина: практическое значение

Выше уже отмечалось, что важной особенностью гена дистрофина является крайне высокая частота de novo мутаций, происходящих в нем. При этом вызываемые этими мутациями заболевания крайне тяжелы. Дистрофия Дюшенна, как правило, приводит к смерти больного в возрасте до 30 лет. Даже если принять во внимание, что не все мутационные события приводят к развитию настолько тяжелых патологий, локус DMD остается одним из самых важных в клиническом плане. В то же время огромный размер гена делает весьма проблематичным применение «классических» методов генотерапии. Возможно, более глубокие знания о строении и функционировании гена дистрофина помогут в предупреждении, а может быть, и лечении тяжелых мышечных дистрофий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методические подходы

Картирование границ петельных доменов методом непрямого мечения концов после расщепления хроматина по участкам прикрепления к ядерному матриксу.

Картирование участков прикрепления хроматина к ядерному матриксу проводили с использованием разработанного в нашей лаборатории метода расщепления хроматина по участкам прикрепления хроматина к ядерному матриксу (Лагарькова и Разин, 1993; Razin et al., 1991а; Gromova et al., 1995b) - т.е. по границам петельных доменов. Расщепление хроматина проводится эндогенной то-поизомеразой II. В основу метода положены два свойства топоизо-меразы II: во-первых, значительная часть всей популяции фермента сосредоточена в ядерном матриксе (Berrios et al., 1985) и является его неотъемлемой частью. Следует отметить, что фермент присутствует и в кариоплазме. Растворенную форму фермента удается легко экстрагировать из ядра растворами с физиологической и высокой ионной силой. При этом фермент, остающийся в составе скелетных структур ядра, не теряет своей активности. В норме то-поизомераза II осуществляет релаксацию, декатенацию и расплетание ДНК (Osheroff et al., 1991). Во всех случаях фермент катализирует одну и ту же химическую реакцию, а именно вносит в одну из цепей ДНК двуцепочечный разрыв и, оставаясь ковалентно связанным с концами разрыва, «протаскивает» через него другую цепь, после чего религирует концы разрыва. Для описываемого метода наиболее важным является то, что целый ряд соединений ингибируют топоизомеразу II, препятствуя религированию разрыва. К таким веществам относятся тенипозид, этопозид, амсакрин, терпентицин и ряд других (Osheroff, 1989; Fernandes et al., 1988; Han et al., 1993; Kawada et al., 1995); многие из этих веществ применяются в качестве противоопухолевых средств или антибиотиков. Одним из наиболее эффективных среди этих топоизомеразных ядов является тенипозид (другие названия — VM-26, Vumon®*). Дальнейшая депротеини-зация ДНК-белковых комплексов ведет к появлению двухцепочеч-ных разрывов в молекуле ДНК (рис. 2).

Анализ препаратов ДНК из клеток, подвергшихся обработке ингибитором топоизомеразы II, позволяет выявить фрагменты ДНК, соответствующие отдельным петельным доменам и их олигомерам (рис. 2.) Полученные таким образом препараты-продукты топоизо-меразного расщепления затем обрабатывают рестриктазами, разделяют электрофорезом и гибридизуют с зондами, прилежащими к сайтам рестрикции (метод непрямого мечения концов). В результате гибридизации выявляются как полноразмерные рестриктные фрагменты, так и продукты двойного расщепления - топоизомеразой и рестриктазой. Длины продуктов двойного расщепления позволяют определить местоположение участков расщепления топоизомеразой (рис. 3). Торговая марка производимого компанией Bristol Myers Squibb препарата для инъекций на основе тенипозида.

Так как данная работа была нацелена на изучение фрагментов ДНК размером десятки и сотни т.п.н., то для их разделения использовался электрофорез в пульсирующем поле. Кроме того, такие размеры фрагментов исключают возможность работы с растворами ДНК, поскольку неизбежно возникающие гидродинамические силы приводят к разрушению ДНК. Поэтому манипуляции прово

Рис. 2. Схема расщепления хроматина топоизомеразой II под действием ингибитора. дят с ДНК, заключенной в гель, в подавляющем большинстве случаев из легкоплавкой агарозы. Б нашем случае мы фиксировали в агарозных блочках живые клетки и все последующие процедуры экстракции, обработки антибиотиками, ферментами и депротеини-зацию проводили с ДНК, фиксированной в геле. Эта процедура является достаточно мягкой и не влияет на жизнеспособность клеток. Агарозный гель, с одной стороны, исключает возможность гидродинамической деградации ДНК, с другой стороны, не затрудняет доступа к ДНК антибиотиков, ферментов и солевых растворов. Кроме того, использование запаянных в блочки препаратов ДНК позволяет значительно повысить по сравнению с растворами эффективную концентрацию ДНК для деления в пульсирующем поле. обработка ингибитором топоизомеразы II приготовление препаратов ДНК высокая интенсивность расщепления низкая интенсивность расщепления

V -- -5 -*=3-т- /

-^ - / .V

N1/ :.-V \ *— рестрикция, гибридизация низкая высокая интенсивность интенсивность расщепления расщепления полноразмерный рестриктный фрагмент продукт двойного расщепления

- ДНК ф сайты рестрикции mm гибридизационные пробы район исследуемого расщепления ДНК

Рис. 3. Схема метода непрямого мечения концов.

Использование различных режимов разделения ДНК в пульсирующем поле позволяет эффективно проанализировать молекулярно-весовое распределение фрагментов ДНК в широком диапазоне молекулярных весов - от 2 до 1000 т.п.н. При этом, как правило, образуется зона компрессии, соответствующая верхней границе области эффективного разделения. Поэтому для исключения артефактного появления гибридизующих-ся фрагментов в каждом случае подбирали индивидуальный режим разделения.

Экспериментальные процедуры

Культуры клеток.

Линию клеток эритролейкемии человека HEL 92.1.7 культивировали в среде RPMI 1640 (АТСС) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco BRL) 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивирование вели при 37°С в атмосфере, содержащей 5,5% углекислоты. Плотность клеточной суспензии поддерживали в пределах 0,3.1,5x106 кл/мл.

Линию миобластов человека PSI2 культивировали в среде DMEM (Gibco BRL) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco BRL) 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. После достижения монослоя клетки рассевали, для чего их обрабатывали стандартным раствором трипсина 1 минуту, трипсин сливали и клетки инкубировали в растворе Версена 10-20 мин. при 37°С. После этого материал собирали центрифугированием, промывали lx PBS и высевали в культуральные флаконы.

Приготовление клеток, заключенных в агарозные блоки, и обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II in vivo.

Клетки, находящиеся в фазе экспоненциального роста, центрифугировали, ресуспендировали в прогретой до 39°С культивационной среде (без сыворотки) до концентрации «2x107 клеток/мл, смешивали с равным объемом расплавленной и охлажденной до 40°С легкоплавкой агарозы (2,2%, марки LM-MP, Roche Molecular Biochemicals). Смесь интенсивно перемешивали и заливали в формы (Bio-Rad). Полученные блоки имели объем 100 мкл и содержали «1x106 клеток.

Застывшие блоки агарозы с живыми клетками помещали в нагретую до 37°С культивационную среду (без сыворотки), содержащую ингибитор топоизомеразы II, из расчета 0,5 мл среды на блок. Инкубацию осуществляли в течение 50 мин при 37°С, затем агарозные блоки переносили в стоп-буфер (0,1 М EDTA рН 8,0, 1% SDS, 1 мг/мл протеиназы К (Sigma)) и депротеинизировали 24-72 ч при 55°С.

Агарозные блоки с депротеинизированной ДНК хранили в 0,5 М EDTA рН 8,0 при 4°С, или же сразу использовали для PFGE.

Использовался ингибитор топоизомеразы II VM-26 (Bristol Myers Squibb) в виде чистого вещества (хранившегося в виде 10 мг/мл раствора в ДМСО) или в виде готового препарата для инъекций (Vuч топ ).

Обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II in vitro.

Агарозные блоки с клетками делали, как описано выше. Готовые блоки инкубировали 2 раза по 30 мин на льду в буфере HS (0,4% Nonidet Р-40, 2 М NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 20 мМ трис-НС1 рН 7,5), 3 раза по 30 мин на льду в буфере Т2 (20 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 0,1 мМ EDTA, 1мМ АТФ), 15 мин на льду в буфере Т2 с необходимой концентрацией ингибитора то-поизомеразы II, и 35 мин при 37°С в буфере Т2 с ингибитором. После этого блоки деггротеинизировали и хранили, как описано выше.

Обработка клеток ДНКазой I.

Агарозные блоки с клетками инкубировали 30 мин на льду в буфере DN (20 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ СаСу с добавлением 0,4% NP-40, 2 раза по 30 мин на льду в буфере DN (без детергента) и 30 мин при комнатной температуре в буфере DN с добавлением ДНКазы I (Amersham Pharmacia Biotech). Затем блоки подвергали стандартной процедуре депротеинизации.

Расщепление заключенной в агарозные блоки ДНК рестриктазами.

После депротеинизации агарозные блоки отмывали 10. 12 раз при комнатной температуре в ТЕ, и 2 раза в инкубационном буфере соответствующей рестриктазы (использовался состав буфера, рекомендованный поставщиком фермента - New England Biolabs, Amersham Pharmacia Biotech, Gibco BRL, MBI Fermentas). Рестрикцию проводили 12-30 ч при рекомендованной температуре и концентрации фермента 150 ед./мл, объем реакции составлял 0,5 мл на каждый агарозный блок.

Электрофорез и гибридизация.

ДНК после расщепления топоизомеразой II и/или редкощепя-щими рестриктазами разделялась электрофорезом в пульсирующем поле (использовали аппараты CHEF DR-II и III, Bio-Rad). Электрофорез вели в 1% агарозе (марки MP, Roche Molecular Biochemi-cals), 0,5x TBE (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 1 мМ EDTA, рН 8,3) при 14°С и напряженности поля 6 В/см. Время пульса и продолжительность электрофореза подбиралась в зависимости от рассматриваемого диапазона размеров фрагментов ДНК.

После электрофореза гель переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Nytran SuPerCharge, Schleicher & Schuell) методом вакуумного переноса согласно методике, предлагаемой производителем.

Пробы для гибридизации готовили с помощью набора Megaprime (Amersham Pharmacia Biotech). Мембрану предгибриди-зовывали 2 ч при 66° в 0,69М NaH2P04, 0,28М Na2HP04, 5% SDS, 0,7мМ EDTA, после чего добавляли пробу до концентрации 2x106 cpm/мл и проводили гибридизацию в течение 14-16 ч. Затем мембрану отмывали 15 мин при комнатной температуре в 1х растворе для отмывки (8 мМ NaH2P04, 32 мМ Na2HP04, 1% SDS) и 2-4 раза по 15 мин в 0,5х растворе при 65°. Гибридизованную мембрану экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak X-Omat 20-80 ч при -70°.

Полимеразыая цепная реакция и очистка PCR-продуктов.

Пробы для гибридизации готовили с помощью PCR. В реакцию брали 2,5 нг/мкл матричной ДНК (ДНК из плаценты человека, Sigma), 0,25 пмоль каждого праймера (синтез праймеров — Gibco BRL Custom primers; последовательности праймеров приведены в табл. 2) и 1 ед. Taq полимеразы (MBI Fermentas) с прилагающимися буферами и нуклеотидами. Реакцию вели 32 цикла (30 сек 94°, 1 мин - рассчитанная температура отжига праймеров, 45 сек 72°), перед циклами матрицу денатурировали 4 мин при 94°, после окончания реакции проводили окончательную достройки в течение 4 мин при 72°. После PCR реакционную смесь разделяли электрофорезом, и PCR-продукты выделяли из агарозного геля с помощью набора QIAquick (Qiagen).

Выделение мРНК и полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.

Матричную РНК выделяли из клеток с помощью набора Oligotex direct mRNA kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией изготовителя. Данная процедура позволяет получить препарат мРНК, не загрязненной первичными транскриптами, частично процессирован-ной РНК, рРНК и т.п. Выделенная таким образом РНК служила матрицей для RT-PCR с использованием набора Titan One-tube RT-PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Состав реакционной смеси подбирали в соответствии с рекомендациями производителя. Праймеры для RT-PCR приведены в табл. 2.

Табл. 2. Праймеры для PCR и RT-PCR. (в качестве источника приведены последовательности GenBank, использованные для подбора праймеров)

Проба Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта, п.н. Температура отжига, °С Источник

АВ GGAATATAAAGAAAGGGCTA TATAATTGCTAAGATGTGAGG 1432 59 NT011757

ВС ACTTTAATGTTGCCTCGGATA CCTCCACAATAAACTTCGAGA 1183 59 NT011757

CD ATGTGTGAGGGAGTTAGATT CATAGTCAGATAGAGCCAAA 1398 59 NT011757

DE' TTCATTAACACCAACGCAGT AATAAGCCATAGAGCAACCAG 1761 59 NT011757

EF TGTAAGTTTCTGAGCAGTTGAGTGG TCGTCATA'1'i'l'lGGGAAGGTGAA 2167 59 NT011757

FG TGACAGG ATGGCA' 1"1Ч" 1'САСТТТ GAGGGA'lTmTAGTATCTGGGAGC 1106 59 NT011757

GH ACCCCGTAGGGAAACCTGATA GGCTCCTGATACTCTTGTCTGCTAT 1516 59 NT011757 актин GGTGGGCATGGGTCAGAAGG CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG 670 60 X00351 дистофин GAGACTCAAACAACTTGCTGGGACC CAACTGTCTTGGAATTTGGATAGAATCAT 516 60 Ml 8533 проурокиназа CGTGAGCGACTCCAAAGGCA GGTGAGCAAGCGTGTCAGCG 776 60 X02760

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ген дистрофина содержит несколько протяженных зон ассоциации хроматина с ядерным матриксом.

Описанный подход был использован для картирования LAR в гене дистрофина человека. В качестве источника генетического материала была выбрана культивируемая линия клеток эритролейке-мии человека HEL 92.1.7. Основания для выбора именно этой линии были следующие: во-первых, простота культивирования, во-вторых, мужской генотип. Если первое в специальных разъяснениях не нуждается, то на втором моменте следует остановиться. Ген дистрофина расположен в Х-хромосоме. Как известно, при наличии в клетках нескольких Х-хромосом только одна из них активна, остальные же находятся в предельно компактизованном виде, образуя так называемые тельца Барра. Активная и неактивные Х-хромосомы ведут себя совершенно по-разному, в том числе реплицируются в разные моменты клеточного цикла (Visser et al., 1998). Как было показано ранее (Iarovaia et al., 1995; Яровая с соавт., 1995), петельная организация хроматина зависит от его репликативного статуса. Поэтому можно было ожидать, что наличие в клетках и активной, и неактивной хромосом может запутать ситуацию, сделав интерпретацию результатов весьма сложной. По предварительным данным (О.В.Яровая, личное сообщение), в клеточной линии К562 происходит именно такая интерференция между разными X-хромосомами. К562 — линия, очень похожая на HEL 92.1.7, основное отличие — женский генотип с двумя Х-хромосомами.

Рис. 4. А - PFGE продуктов топоизомеразного расщепления ДНК, окрашивание бромистым этидием, Б - PFGE продуктов двойного расщепления, окрашивание бромистым этидием, В — непрямое мечение концов, гибридизация с пробой FG (см. рис. 5). Я - маркеры молекулярных весов (конкатемеры фага л, и X/Hindlll фрагмент 20 т.п.н.), звездочка - 100 т.п.н.; К- контрольные образцы; над панелями показано увеличение концентрации VM-26 в образцах.

Характерный пример топоизомеразного расщепления хроматина приведен на рис. 4А. Можно видеть, что материал распределяется в диапазоне от 30 до 700 т.п.н. при минимальной концентрации те-нипозида. По мере увеличения концентрации YM-26 происходит постепенное снижение среднего молекулярного веса выщепляемых фрагментов. В контроле (т.е. в отсутствие антибиотика) расщепления ДНК почти не происходит и большая часть материала остается на старте и в области верхней компрессии.

Ранее некоторыми исследователями сообщалось о существовании двух максимумов длин фрагментов при крупномасштабном расщеплении хроматина эндогенными нуклеазами или в ходе апоптоза. Один из них, как и в наших экспериментах, находился около 50-100 т.п.н., тогда как второй — примерно 300-500 т.п.н. (Filipski et al., 1990). Последний, как предполагается, соответствует состоящим из нескольких петель розеткоподобным структурам хроматина (Глазков, 1999; Prnsov et al., 1983; Glazkov, 1989; Munkel et al., 1999), которые, как считают, образуют следующий за петлями уровень укладки. В ходе данной работы пик 300 т.п.н. не наблюдался ни в одном из экспериментов. Следует отметить, что в предыдущих работах с использованием электрофореза в инверсном поле (FIGE) вместо пульсирующего для разделения продуктов топоизомеразного расщепления такая полоса наблюдалась (Razin et al., 1991а; О.В .Яровая, личное сообщение). Это позволяет предположить, что наличие такого пика является артефактом электрофореза в инверсном поле. Однако, 300 т.п.н.-максимум наблюдался неоднократно разными группами. Более того, он наблюдается и при использовании PFGE, если разделяемые фрагменты являются продуктами нук-леазного (например, Ва1 31) или апоптозного расщепления (Iarovaia et al., 1995; Lagarkova et al., 1995b). По-видимому, розеткоподобные структуры действительно существуют в ядре, однако метод расщепления хроматина топоизомеразой II не позволяет различить межпетельные (в пределах одной розетки) и межрозетковые линкеры. Если межрозетковые линкеры более чувствительны к какому-то виду расщепления, чем межпетельные, то при таком расщеплении можно подобрать условия, при которых разрывы будут вноситься преимущественно в межрозетковые линкеры. В таком случае можно наблюдать популяцию фагментов размером 300-500 т.п.н., соответствующую розеткам, возможно - вместе с популяцией 50-100 т.п.н. фрагментов (петель). Однако, если для какой-то обработки чувствительность межпетельных линкеров внутри розеток такая же или выше, чем чувствительность межрозетковых, то накопления фракции розеток произойти не может. По всей видимости, топоизоме-разное расщепление относится именно к последнему типу, в то время как расщепление нуклеазами или в ходе апоптоза — к первому.

Причина такого различия, возможно, заключается в том, что то-поизомераза II все время находится в контакте с хроматином как межпетельных, так и межрозетковых линкеров. С другой стороны, нуклеазы для содержимого ядра являются экзогенным агентом и, возможно, межрозетковые линкеры для них стерически более доступны.

А В

С DE' Е

F G НП J

CEN

500

1000 I

1500

2000 L

2500

TEL

-4 А 4

•4 ►

Рис. 5. Схема гена дистрофина. Буквами над схемой обозначены рестриктньге сайты Sfil согласно принятой номенклатуре, под схемой указаны пробы, использованные для непрямого мечения концов соответствующих рестриктных фрагментов. Расстояния обозначены в т.п.н.

В связи с большой протяженностью гена (2500 т.п.н.) для непрямого мечения концов второе расщепление ДНК проводили редко-щепящей рестриктазой Sfil, а полученные фрагменты также разделяли электрофорезом в пульсирующем поле. Рестриктаза SJK стала основным инструментом для изучения различных «дальнедистан-ционных» свойств гена дистрофина, так как сайты рестрикции этим ферментом почти равномерно распределены по длине гена, образуя фрагменты приемлемой (30-600 т.п.н.) длины. Для сайтов рестрикции SJR в гене дистрофина существует общепринятая номенклатура (Den Dunnen et al., 1989; Nobile et al., 1997). На рис. 4Б показана типичная картина распределения продуктов двойного (топоизо-меразой II и рестриктазой SfiI) расщепления. Обработка рестриктазой приводит к расщеплению оставшейся недеградированной ДНК, в том числе и в контрольных образцах, что приводит к значительному «выравниванию» распределения материала по дорожкам.

В качестве зондов для гибридизаций использовали PCR-продукты. Использовать фрагменты клонированных последовательностей не представлялось возможным, так как к настоящему времени только небольшая 5'-концевая часть гена доступна в виде космидных или Х-клонов (Wood and Whittaker, 1994). Субклонирование из YAC-клонов только для получения проб, прилежащих к рестриктным сайтам, было признано нецелесообразным. Подбор праймеров для PCR проводили по опубликованным в GenBank последовательностям гена дистрофина, полученным в рамках программы «Геном человека». Основным параметром при выборе праймеров, помимо общих для PCR вообще и PCR-продуктов, используемых в качестве зондов, являлось минимальное удаление от сайта рестрикции SfiI, с целью максимально исключить возможность неверной интерпретации результатов гибридизации.

К сожалению, на данный момент секвенирование этой части генома не завершено, поэтому для рестриктного фрагмента I-J (3'-концевая часть гена) подобрать зонды не удалось. Еще для некоторых районов доступны только черновые варианты последовательностей. Подобранные по таким последовательностям зонды содержали повторы и не могли быть использованы в проводившейся работе. Таким образом, оказалось возможным провести картирование LAR только на участке между ^)Я-рестриктными сайтами А-Н (рис. 5).

АВ

X к

CD х к

Ф щ- <

EF

X К

GH

DE

X к

FG

X К

Рис. 6. Результаты гибридизации продуктов топоизомеразного расщепления ДНК живых клеток. Слева вверху каждой панели обозначены рестриктнъге фрагменты (см. рис. 5). Незакрашенными треугольниками обозначены полноразмерные рестриктнъге фрагменты, закрашенными — дискретные и скобками — протяженные участки чувствительности к топоизомеразе II. Остальные обозначения как на рис. 4. А

Рис. 7. Подтверждение картирования протяженной зоны чувствительности к топоизомеразе II «встречным» непрямым мечением концов. А - схема расположения проб и рестриктных сайтов, Б и В — результаты гибридизации продуктов топоизомеразного расщепления с пробами 1 и 2, соответственно. Обозначения как на рис. 4 и 6.

Результаты картирования LAR представлены на рис. 6. Во всех случаях, когда обнаруживались продукты специфического топоизомеразного расщепления, их распределение указывало на наличие протяженных зон чувствительности хроматина к топоизомеразе II; кроме того, в некоторых случаях наблюдаются и дискретные позиции предпочтительного расщепления. низкая концентрация тенипозида высокая концентрация тенипозида непрямое мечение концов

ЛшЛ рестриктные сайты гибридизационные пробы протяженная зона чувствительности к топоизомеразе II ^ события расщепления топоизомеразой II

Рис. 8. Схематическая иллюстрация результатов эксперимента по подтверждению картирования протяженной зоны, чувствительной к топоизомеразе II, с помощью «встречного» непрямого мечения концов.

Может возникнуть вопрос, а не являются ли наблюдаемые протяженные гибридизующиеся участки следствием неспецифической гибридизации. На этот вопрос может ответить сравнение распределений по длинам тотальной ДНК при электрофорезе и гибриди-зующегося материала на мембране. Характерный пример такого сравнения приведен на рис. 4 (Б и В). Можно видеть, что картина гибридизации заметно отличается от выявляемого бромистым этиднем распределения ДНК по дорожкам геля. Это отличие позволяет сделать вывод о специфичности гибридизации. Таким образом, наблюдаемые протяженные зоны действительно являются следствием специфической гибридизации и отражают истинное состояние соответствующих участков гена.

Более строгим подтверждением истинности полученных результатов является «встречное» непрямое мечение концов. В случае использования для непрямого мечения проб к разным концам какого-либо рестриктного фрагмента, длины продуктов двойного расщепления должны быть «комплементарны». Такая проверка была проведена. На рис. 7 показаны результаты «встречных» гибридизаций для фрагмента DE'. После расщепления топоизомеразой II рестрикт-ный фрагмент длиной 155 т.п.н. образует субфрагменты длиной 55 — 105 т.п.н. со стороны SJil сайта D и 50 — 100 т.п.н. — со стороны сайта Е'. Как видно из рис. 8, в случае существования протяженной зоны чувствительности к топоизомеразе II анализ кинетических точек максимальной концентрации ингибитора малоинформативен. При максимальной интенсивности расщепления в протяженной зоне происходит множество событий внесения разрывов в ДНК, и выявляемые концевой пробой фрагменты, как правило, простираются только от сайта рестрикции до ближайшего края зоны. Значительно больше информации дает анализ кинетических точек, соответствующих небольшой концентрации ингибитора, когда на протяжении зоны происходит в среднем только один разрыв. В таком случае длины наиболее длинных продуктов двойного расщепления, выявляемых пробой к одному концу рестриктного фрагмента и наиболее коротких, выявляемых пробой к одному концу, должны в сумме давать длину всего рестриктного фрагмента.

Помимо диффузных зон, во фрагменте EF наблюдаются и дискретные продукты, свидетельствующие о наличии в этих участках гиперчувствительных к расщеплению топоизомеразой II районов. Суммируя данные по всем рассмотренным фрагментам гена дистрофина, протяженные районы повышенной чувствительности к расщеплению топоизомеразой II расположены на расстоянии 60110, 580-730, 1000-1050, 1100-1350 и 1550-1650 т.п.н. от Jf/Я-сайта А (рис. 9). Дискретные позиции расщепления хроматина топоизомеразой II расположены на удалении 1400 и 1450 т.п.н. от А-сайта на окраине зоны 1100-1350. Кроме того, по предварительным данным, в этой же зоне в ряде случаев выявляется еще несколько дискретных фрагментов, расположенных ближе к 5' (центромерному) концу гена.

Следует заметить, что в предыдущих работах с использованием этого же метода, но на других участках генома, такая картина - пре

500

Ю00

1500

2000

2500

Рис. 9. Схема расположения участков прикрепления хроматина к ядерному матриксу. Над схемой показаны крайние SJK сайты гена, под схемой — картированные LAR. Чертами показаны протяженные зоны прикрепления, стрелками — дискретные позиции. валирование диффузных зон над дискретными фрагментами - не наблюдалась. Напротив, как правило, выявлялись дискретные фрагменты (Лагарькова и Разин, 1993; Razin et al., 1991а; Яровая с соавт., 1993, 1994; Gromova et al., 1995а; Gromova et al., 1995b). Тем не менее, в последних работах (Svetlova et al., 2001) также наблюдалась широкая (30 т.п.н.) зона прикрепления к ядерному матриксу,

64 выявленная, как и в данной работе, с помощью топоизомеразного расщепления хроматина. Следует также отметить, что первые работы, использующие этот метод, проводились на повторяющихся (гены рРНК, Яровая с соавт., 1993; Iarovaia et al., 1995) или амплифи-цированных (с-тус, Razin et al., 1993;Gromova et al., 1995b) последовательностях в геноме млекопитающих, или же на уникальных последовательностях генома дрозофилы (Iarovaia et al., 1996). Нельзя исключить, что уникальные гены млекопитающих имеют иную пространственную организацию. Данные, подтверждающие это прредположения, были получены методом FISH (Gerdes et al., 1994). Авторы проводили пермеабилизацию и последующую экстракцию интерфазных ядер. Б результате образовывалось «гало» де-гистонизированных петель ДНК, остающихся закрепленными на ядерном матриксе. С этими гало проводили флуоресцентную in situ гибиридизацию с различными пробами. Пробы к транскрипцион-но активному уникальному гену выявлялась в остаточных структурах ядра, тогда как проба к гену 5S рРНК, так же транскрипционно активному, но представленному тандемным повтором, обнаруживалась в одной из петель гало. Таким образом продемонстрировано различие в организации уникальных и повторяющихся последовательностей. К сожалению, на данный момент количество накопленного фактического материала не позволяет сделать однозначных выводов. Возможно, причиной столь необычной организации гена дистрофина является тот факт, что он расположен в АТ-богатом участке генома (Bettecken et al., 1992), в отличие от всех ранее рассматривавшихся районов генома. Ранее было показано, что AT- и GC-богатые изохоры соответствуют G- и R-сегментам хромосом, соответственно (Saccone et al., 1993), а бэндинг, как давно известно, отражает серьезные различия в укладке соответствующих районов хромосом. Это было подтверждено на молекулярном уровне работой Saitoh and Laemmli (1994). Ими исследовался флуоресцентный сигнал от связывающегося с АТ-богатыми последовательностями соединения дауномицина. Показано, что Q- и R-сегментты дают кардинально разные уровни сигнала.

Позднее группой Кремера было продемонстрировано, что в пределах хромосомных территорий AT- и GC-богатые послеодватель-ности отделены друг от друга и образуют самостоятельные пространственные домены (Tajbakhsh et al., 2000). В этой работе проводилась флуоресцентная in situ гибридизация с использованием двух проб. Одна проба представляла собой тотальную ДНК какой-либо хромосомы, окрашивая в интерфазном ядре соответствующую хромосомную территорию. Другая же проба представляла собой наиболее GC-богатую фракцию тотальной ДНК, известную как НЗ (Saccone et al., 1993). Трехмерная реконструкция полученных конфокальным микроскопом изображений показала, что распределение GC-богатых участков в пределах хромосомной территории напоминает размещение самих хромосомных территорий в ядре: каждый непрерывный участок занимал свой собственный объем внутри хромосомной территории, не образующий пустот и имеющий четкие границы. Сам по себе этот результат ничего не говорит о сходствах или различиях в пространственной организации AT- и GC-богатых участков хроматина, однако их четкое разграничение позволяет преположить, что эти «субтерритории» могут быть организованы совершенно по-разному. Кроме того, анализ окрестностей гена HPRT человека (Fajkus et al., 1998), расположенного в GC-богатом изохоре, выявил «классические» дискретные участки прикрепления хроматина к ядерному матриксу.

В любом случае, участки прикрепления к ядерному матриксу представляют собой более или менее протяженные тракты ДНК. Этим они коренным образом отличаются от SAR и MAR элементов, длина которых редко превышает 200 п.н. Даже в тех случаях, когда мы говорим о «дискретных» позициях расщепления топоизомеразой II, следует помнить, что они имеют протяженность около 5-10 т.п.н. и обладают собственной тонкой структурой (Gromova et al., 1995b). При анализе одного из участков прикрепления, выявленного топоизомеразным расщеплением и PFGE, с помощью того же метода, но уже с использованием обычного электрофореза, было показано, что внутри LAR кластеризовано несколько позиций расщепления хроматина топоизомеразой II. Другими исследователями был рассмотрен кластер концевых точек незаконных рекомбинаций в гене MLL (Domer et al., 1995). Было показано, что по краям этого участка длиной 8,5 т.п.н. расположены SAR-элементы (Rowley, 1993;Broeker et al., 1996). По-видимому, как уже говорилось в обзоре литературы, SAR/MAR-элементы представляют собой последовательности, непосредственно участвующие в ДНК-белковых и других взаимодействиях. В составе каждого LAR таких последовательностей может быть (и даже, скорее всего) несколько, что обеспечивает прочную связь с матриксом и/или какие-то функциональные взаимодействия. Таким образом, можно сказать, по-видимому, что всякий LAR содержит в себе хотя бы один SAR/MAR, но далеко не всякий SAR/MAR входит в состав LAR. Эти данные подтверждаются и другими работами. Так, при картировании LAR в протяженном фрагменте генома D.melanogaster (Iarovaia et al., 1996; Яровая и Разин, 1996) было показано, что практически все обнаруживаемые LAR колокализуются с ранее известными MAR, однако, колокализация наблюдалась далеко не со всеми MAR, присутствующими в исследуемом регионе.

В периферийных районах петельных доменов не наблюдается участков предпочтительного расщепления топоизомеразой II.

Картирование LAR в ходе данной работы, как правило, проводили на живых клетках. Как отмечалось выше, значительная часть топоизомеразы II сосредоточена в ядерном матриксе (Berrios et al., 1985). Однако в кариоплазме также находятся заметные количества этого фермента. Теоретически, активность «растворимой» топоизомеразы II может привести к ухудшению результатов экспериментов, а в некоторых случаев (наличия в периферийных частях петельных доменов районов, по тем или иным причинам предпочтительных для топоизомеразы II) - и к появлению артефактов. Для проверки того, не происходит ли по каким-либо причинам расщепления интересующих нас фрагментов генома за пределами районов прикрепления к матриксу, результаты экспериментов проверяли, подвергая топоизомеразному расщеплению нуклео-иды. Перед обработкой тенипозидом клетки пермеабилизовали неионным де

Рис. 10. Топоизомераз- тергентом и экстрагировали раствором ное расщепление ДНК - - т-r г

1 высокой ионнои силы. 1 юсле такой обработки из остаточных ядер вымывается растворимая топоизомераза II, и разрушаются структуры хроматина, обеспечи

X К нуклеоидов, окрашивание бромистым этидием. Обозначения как на рис. 4. вающие наличие гиперчувствительных к топоизомеразе II участков, не входящих в состав районовм прикрепленных к ядерному матриксу. Ранее было показано, что такая предварительная обработка не изменяет общей картины расщепления хроматина (Razin et al., 1995;Gromova et al., 1995a).

Характерный пример результатов топоизомеразного расщепления, полученных на нуклеоидах, приведен на рис. 10 (ср. рис 4А), а на рис. 11 показано сравнение гибиридизационных картин, полученных на препаратах живых клеток и нуклеоидов.

Никаких принципиальных отличий как в распределении ДНК, так и в картине гибридизации препаратов, полученных из живых клеток и из нуклеоидов, не наблюдается. Видно, что в целом характер расщепления ДНК топоизомеразой II не изменился по сравнению с обработкой живых клеток. Наиболее важным отличием является то, что незначи-нуклеоиАы тельное расщепление хроматина наблюдается и в контрольном образце. Этот препарат подвергался всем тем же обработкам, что и остальные, за исключением того, что инкубация велась без добавления тенипо-зида. Причина этого неясна; подобная ситуация наблюдалась неоднократно и в предыдущих работах с использованиклетки *

Рис. 11. Сравнение результатов непрямого мечения концов с пробой к рестриктному фрагменту EF (рис. 5) препаратов из живых клеток и нуклеоидов. Обозначения как на рис. 4 и 6, звездочки показывают положения маркеров 100, 200, 300 и 400 т.п.н. ем метода топоизомеразного расщепления хроматина (О.В.Яровая, личное сообщение).

Таким образом, описанные ранее участки преимущественной чувствительности к топоизомеразе II являются участками чувствительности именно к матриксной популяции фермента и могут с уверенностью считаться районами ассоциации хроматина с ядерным матриксом.

Участки прикрепления хроматина к ядерному матриксу сверхчувствительны к экзогенной ДНКазе I.

При разработке метода картирования границ петельных доменов в нашей лаборатории было показано, что эти позиции в хроматине обладают повышенной чувствительностью не только к топоизомеразе II, но и к различным нуклеазам, включая ДНКазу I (Лагарькова и соавт., 1995; Gromova et al., 1995а). Поэтому, помимо картирования LAR с помощью топоизомеразного расщепления, было также решено провести аналогичные эксперименты с использованием этого фермента. Данная нуклеаза специфично расщепляет преимущественно одноцепочечную ДНК. Расплетенные участки ДНК присутствуют в большинстве ДНК-белковых комплексов. Как отмечалось ранее (см. обзор литературы), наличие таких комплексов, по-видимому, свойственно LAR.

Пример ДНКазного расщепления хроматина показан на рис. 12. Видно, что, как и в случае топоизомеразной обработки нуклеоидов, наблюдается незначительная деградация материала в контрольном образце. По-видимому, причиной этого является то незначительное нарушение нативной структуры ядра, которое неизбежно даже при самой мягкой обработке. Как было показано ранее, деградация хроматина при вступлении клетки в апоптоз на фрагменты высокой молекулярной массы происходит очень быстро (см. обзор Ioudinkova et al., 1998). Появление же фрагментов массой ок. 300 т.п.н., соответсвующих розеткообразным структурам, происходит столь скоротечно, что далеко не во всех случаях эту фракцию удается наблюдать. Возможно, в данном случае мы наблюдаем именно деградацию по межрозеточным линкерам.

Эксперимент по сравнительному картированию участка расщепления показал, что характер расщепления хроматина экзогенной ДНКазой I сходен с таковым эндогенной топоизомера-зой II (рис. 13; аналогичные данные были получены и для других рестриктных фрагментов). Это наблюдение находится в полном соответствии с ранее полученными результатами для других объектов (Gromova et al., 1995a;Lagarkova et al., 1995b). Данный факт может быть объяснен по-разному. С одной стороны, весьма вероятно,

Рис. 12. Расщепление хроматина экзогенной ДНКазой I, окрашивание бромистым эти-дием. Обозначения как на рис. 4. что в местах прикрепления к ядерному матриксу ДНК участвует в образовании комплексов со специфическими белками, образуя более или менее протяженные одноцепочечные участки, расщепляемые ДНКазой I. С другой стороны, можно предложить и другое объяснение, учитывая, что в экспериментах использовался экзогенный фермент. Возможно, полученные результаты означают, что пространственная организация ядра, ядерного скелета и прикрепленного к нему хроматина такова, что LAR - наиболее доступные участки хроматина для любых агентов, проникающих в ядро (Razin and Gromova, 1995). Отдать предпочтение тому или другому варианту только на основании полученных экспериментальных данных пока не представляется возможным. Вероятно, оба этих момента в той или иной степени ответственны за наблюдаемый эффект.

Дистрофии не экспрессируется в клетках HEL 92.1.7.

Согласно некоторым из существующих гипотез, функциональные элементы генома находятся в контакте с ядерным матриксом только в активном состоянии. Например, предполагается, что толь

Рис. 13. Сравнение результатов непрямого мече-ния концов с пробой к рестриктному фрагменту FG (рис. 5) препаратов живых клеток, расщепленных эндогенной топоизомеразой II и экзогенной ДНКазой I. Обозначения как на рис. 4. ко те из промоторов, с которых идет транскрипция, ассоциированы с матриксом (Small et al., 1985). Поэтому был проведен анализ экспрессии дистрофина в клетках HEL 92.1.7. Анализ проводился с помощью RT-PCR. Праймеры для RT-PCR подбирались, исходя из нуклеотидных последовательностей транскриптов изоформ дистрофина в базе данных NCBI. Были использованы как праймеры к уникальным районам каждого транскрипта, так и праймеры к общему для всех транскриптов 3'-концевому участку (экзоны 64-69). Для контроля активности праймеров к мРНК дистрофина были поставлены RT-PCR реакции на препаратах мРНК клеток культуры миобластов человека PSI2, активно экспресси-рующих дистрофии (Klamut et al., 1989). Контроль экспериментальной процедуры проводили RT-PCR с праймерами к повсеместно экспрес-сируемому гену (актину). Поставленные эксперименты показали, что в клетках HEL 92.1.7 не экспрессирует-ся ни одна из изоформ дистрофина (рис. 14.)

Рис. 14. Электрофоретиче-ский анализ продуктов RT-PCR. Реакции проводили на препаратах мРНК клеток эритролей-кемии (ЭЛ, культура HEL 92.1.7) и миобластов (МБ, культура PSI2) человека с праймерами к актину (а), дистрофину (д) и проурокиназе {у).

Клетки HEL 92.1.7 содержат одну Х-хромосому.

Ген дистрофина расположен в Х-хромосоме. Так как при наличии в клетке более одной Х-хромосомы все они, кроме одной, находятся в неактивном конденсированном состоянии в виде телец Барра, есть вероятность, что доменные структуры активной и неактивных Х-хромосом будут различными. Это, в свою очередь, может привести к усложнению интерпретации результатов использованного для картирования LAR метода. Как уже отмечалось, ранее в нашей лаборатории были получены результаты, свидетельствующие об актуальности такой проблемы. С целью исключить подобные неоднозначности для работы была выбрана «мужская» клеточная линия HEL 92.1.7, содержащая только одну Х-хромосому. Однако в культивируемых клетках очень высока частота анеуплоидизации. Для проверки истинного кариотипа клеток, с которыми велась работа, была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ядер клеток HEL 92.1.7 с пробой к центромере Х-хромосомы человека (рис. 15). Клетки HEL 92.1.7 действительно содержат только одну Х-хромосому, что позволяет исключить влияние различия организации и функционирования активной и неактивной Х-хромосом на результаты картирования LAR.

Рис. 15. Флуоресцентная in situ гибридизация ядер клеток HEL 92.1.7. Верхняя панель - тотальная ДНК интерфазных ядер, нижняя — результат гибридизации этих же ядер с пробой к центромере Х-хромосомьг.

Связь между участками прикрепления хроматина к ядерному матриксу и другими функциональными элементами гена.

Ген дистрофина, несмотря на свою значительную протяженность, весьма хорошо изучен. Известны все экзоны (Nobile et al., 1997) и промоторы (Nudel et al., 1989; Gorecki et al., 1992; Lidov et al., 1995; Byers et al., 1993; Monaco, 1989) гена, изучен характер незаконных рекомбинаций (Blonden et al., 1991; Wapenaar et al., 1988), приводящих к наследственным заболеваниям. В нашей лаборатории было проведено картирование участков начала репликации на большей части гена (Вербовая и Разин, 1996; Verbovaia and Razin, 1997). В свете различных моделей пространственной организации хроматина и связи пространственной и структурной организации большой интерес вызывает взаимное расположение картированных в ходе данной работы LAR и упомянутых функциональных элементов (рис. 16).

Большинство из картированных LAR перекрываются или находятся в непосредственной окрестности от различных регуляторных элементов изучаемого гена. Зоны 60-110, 1000-1050 и 1100-1350 включают в себя различные тканеспецифические промоторы, причем ни один из этих промоторов не активен в исследовавшихся клетках. Этот факт опровергает одну из гипотез организации хроматина, согласно которой участками прикрепления к матриксу служат транскрипционно активные в данный момент участки.

Возможно, причиной своеобразной доменной организации гена дистрофина является именно большое количество изоформ, экс-прессируемых этим геном. Кроме того, экспрессию дистрофина отличает развиитая регуляция: многие изоформы синтезируются тка-неспецифически, а экспрессия некоторых приурочена к определенным стадиям эмбрионального развития. Есть данные, что доменная организация одних и тех же участков генома в различных терминально дифференциированных клетках может различаться. Как уже неоднократно упоминалось, многие SAR/MAR элементы не связаны с матриксом. Возможно, это связано, в том числе, именно с

500

1000

1500

CEN

2000

2500

TEL

Dp427c Dp427m cl ml

Dp260 Dp 140

II

10

44

Dpll6 Dp71

52

64 79

Рис. 16. Схема расположения LAR и других функциональных элементов в гене дистрофина человека. Над схемой показаны обнаруженные участки прикрепления к хроматину: чертами показаны протяженные зоны прикрепления, стрелками - дискретные позиции. Под схемой указаны: горизонтальными чертами - "горячие зоны" рекомбинаций; подписанными стрелками — промоторы; вертикальными чертами — экзоны и порядковые номера некоторых из них; направления репликации соответствующих экзонов. их избыточностью, допускающей реализацию различных вариантов петельной организации. По-видимому, при дифференцировке выбирается одна из возможных петельных конфигураций, фиксируя характерный для данного типа клеток профиль экспрессии. Косвенным свидетельством в пользу такого предположения является тот факт, что большинство (хотя и не все) промоторов дистрофина, расположенных в исследовавшейся области, обнаружены связанными с ядерным матриксом (см. рис. 16). Можно предположить, что при дифференцировке происходит открепление всех промоторов, кроме активных в данном типе клеток. Активный же промотор остается прикреплен к матриксу, возможно, образуя вместе с дополнительными регуляторными элементами так называемую энхансеросому.

К сожалению, использованный в ходе данной работы метод не может быть использован для проверки этого предположения. Терминально дифференциированные клетки не размножаются, и то-поизомераза II ими утрачивается за ненадобностью (Adachi et al., 1991). Более того, в них не наблюдается и нуклеазно-чувсгвительных сайтов.

Кроме промоторов, наблюдается ассоциация LAR и с участками начала репликации: зоны 580-730 и 1100-1350 перекрываются, а позиция 1400 — находится в непосредственной близости от другого ориджина. Эти данные хорошо согласуются с предыдущими наблюдениями. Ранее было показано, что ориджины ассоциированы с ядерным матриксом в локусе AMPD2 китайского хомячка (Svetlova et al., 2001), в протяженном районе генома дрозофилы (Miassod et al., 1997), в окрестностях человеческого гена ламина В2 (Lagarkova et al., 1998). Еще раньше ассоциация ориджинов с ядерным матриксом была продемонстрирована и альтернативными методами (Berezney and Coffey, 1975; Fernandes et al., 1988; Berezney and Coffey, 1975;Ortega and DePamphilis, 1998;Demeret et al., 2001).

С участками прикрепления к ядерному матриксу ассоциированы и горячие зоны рекомбинаций. Так называемая «дополнительная» горячая зона сильно перекрывается с зоной 580-730, а «основная» перекрывается с пограничными частями зон 1100-1350 и 1550-1650; кроме того, именно в основной горячей зоне расположены позиции 1400 и 1450. На первый взгляд, ассоциация столь протяженных участков ДНК с ядерным матриксом кажется маловероятной. Однако данные о связи рекомбинации с ядерным матриксом и топоизомеразой II независимо получены многими группами исследователей (Sperry et al., 1989;Charron and Hancock, 1991;Svedova et al., 2001). В последнее время неопровержимо доказано участие топоизомеразы II в образовании хромосомных перестроек. Лечение опухолей ингибиторами топоизомеразы II вызывает лейкемии MLL и ALL (Felix, 1998), являющиеся следствием транслокаций в гене MLL. У пациентов, проходивших лечение противоопухолевыми препаратами — ингибиторами топоизомеразы II, через небольшое время (15-30 мес) с большой вероятностью обнаруживаются перестройки, которые, как правило, затрагивают ген MLL (человеческий гомолог гена trithorax), расположений в участке q23 хромосомы И. Наиболее часто встречается перестройка t(4;ll)-(q21;q23). В результате образуется экспрессирующаяся химера между геном MLL и протоонкогеном AF9. Концевые точки этих транслокаций сконцентрированы в сравнительно протяженный кластер (bcr) (Stanulla et al., 1997b; Felix et al., 1995), хотя и значительно меньшей длины, чем в случае дистрофина (8,5 т.п.н. в MLL против многих десятков т.п.н. в DMD). Этот кластер содержит по краям два SAR-элемента (Broeker et al., 1996) и консенсусные сайты расщепления топоизомеразы II. Также четко показано, что bcr ассоциирован с ядерным матриксом (Stanulla et al., 1997b) и подвергается расщеплению в начале апоптоза.

Таким образом, сама по себе ассоциация горячих зон рекомбинаций в гене дистрофина с ядерным матриксом не вызывает удивления. Однако протяженность этих зон чрезвычайно велика. Причина этого неясна. Если исходить из предположения, что подверженность перестройкам является причиной ассоциации с ядерным матриксом, то это объясняет прикрепление столь протяженных участков. Тем не менее, все имеющиеся данные (см. раздел «Ассоциация рекомбинации с ядерным матриксом» обзора литературы) свидетельствуют о том, что, напротив, именно связь с ядерным матриксом и доступность топоизомеразе II являются причиной подверженности некоторых участков ДНК рекомбинации, а не наоборот.

Необычность полученных результатов подтолкнула к их проверке альтернативными методами. В качестве такого альтернативного метода нами была избрана флуоресцентная in situ гибридизация. FISH проводится на препаратах ядерных гало — пер-меабилизованных интерфазных ядрах, подвергнутых высокосолевой экстракции. После такой обработки дегистонизированные петли хроматина, вытягиваясь, образуют «гало» вокруг так называемых остаточных структур — ядерного матрикса с закрепленными на нем LAR. В самое последнее время нами были получены первые результаты этого исследования. В первых экспериментах сигнал от гибридизации проб из основной горячей зоны рекомбинации всегда наблюдался в остаточных структурах. Тем самым подтверждаются данные о прикреплении всей основной горячей зоны рекомбинаций гена дистрофина к ядерному матриксу.

К сожалению, описанные результаты являются предварительными и не могут не только являться надежным доказательством, но и быть приведены в настоящей работе.

По-видимому, основной причиной такой необычно большой длины районов прикрепления к ядерному матриксу является его АТбогатый состав (Bettecken et al., 1992) или подобные характеристики. Как уже говорилось, существуют независимо полученные данные о том, что организация АТ-богатых участков хроматина коренным образом отличается от организации GC-богатых (Saitoh and Laemmli, 1994). Полученные в ходе данной работы результаты не позволяют однозначно склониться к этой гипотезе, нисколько, тем не менее, ей не противореча.

Следует также отметить, что существует вероятность того, что некоторые участки прикрепления хроматина к ядерному матриксу в гене дистрофина не были обнаружены в ходе данной работы. LAR может остаться незамеченным, если расстояние между ним и сайтом рестрикции (SfiI в случае данной работы) мало по сравнению с длиной соответствующего рестриктного фрагмента. Для выяснения этого вопроса планируется провести аналогичное картирование с использованием других редкощепящих рестриктаз (таких, как Sacll или Not!) и новым набором гибридизационных проб. выводы

1. Впервые построена карта доменной организации большей части гена дистрофина человека (за исключением 3'-концевого участка).

2. Впервые показано, что ДНК АТ-богатого изохора имеет необычную пространственную организацию по сравнению с наблюдавшейся в предыдущих работах для GC-богатых изохоров.

3. Выявлена повышенная чувствительность участков прикрепления хроматина к ядерному матриксу к экзогенной ДНКазе I.

4. Продемонстрировано, что промоторы Dp427c, Dp260 и Dp 140 гена дистрофина прикреплены к ядерному матриксу вне зависимости от их активности; впервые показана ассоциация «молчащих» промоторов с ядерным матриксом.

5. Обнаружено, что обе горячие зоны рекомбинаций гена дистрофина прикреплены к ядерному матриксу.

6. Показано, что некоторые участки начала репликации гена дистрофина прикреплены к ядерному матриксу.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вербовая Л.В., Разин С.В. (1996). Ген мышечной дистрофии

Дюшенна организован в несколько репликонов. Моя. Виол. 30 (6), 1334-8.

2. Георгиев Г.П. (1958). Гистохимическое исследование нуклеопротеидных фракций клеточных ядер. Биохимия 23, 700-706.

3. Георгиев Г.П., Ченцов Ю.С. (1960). О структуре клеточного ядра. Экспериментальное электронно-микроскопическое исследование изолированных ядер. Аокя. АН СССР 132,199-202.

4. Георгиев Г.П., Ермолаева Л.П., Збарский И.Б.(1960). Количественное соотношение белковых и нуклеопротеид-ных фракций в клеточных ядрах, выделенных из разных тканей. Биохимия 25, 318-322.

5. Глазков М.В. (1999). Взгляд на структурно-функциональную организацию эукариотических хромосом: снова о хромомерах. Генетика 35 (И), 1470-9.

6. Збарский И.Б., Георгиев Г.П. (1959). Новые данные о белковых фракциях клеточных ядер печени крысы и химическом составе ядерных структур. Биохимия 24. 192-199.

7. Збарский И.Б., Георгиев Г.П. (1962). Структура клеточного ядра. Сопоставление данных цитохимии и электронной микроскопии. Цитология 4, 604-616.

8. Збарский И.Б., Дебов С.С. (1948). О белках клеточных ядер.

Аокл. АН СССР 62, 795-798.

9. Збарский И.Б., Дебов С.С. (1951). Белковые фракции клеточных ядер. Биохимия 16, 390-395.

10. Каландадзе А.Г., Разин С.В., Георгиев Г.П. (1988). Клонирование и анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, постоянно прикрепленных к ядерному матриксу. Аокл. Акад. Наук СССР 300 (4), 1001-5.

11. Лагарькова М.А., Разин С.В. (1993). Расщепление генома на структурно-функциональные домены in vivo топоизомеразой типа II. Аокл. Акад. Наук 330 (3), 3835.

12. Лагарькова М.А., Яровая О.В., Гнучев Н.В., Разин С.В. (1995). Обработка пермеабилизированных клеток нук-леазой Ва1 31 ведет к вырезанию петель ДНК из генома. А ока. Акад. Наук 345 (5), 690-3.

13. Миронов Н.М., Лобаненков В.В., Куприянова Е.И., Шапот B.C. (1983). Распределение активно транскрибируемого и нетранскрибируемого генов по фракциям хроматина с различным характером ассоциации с ядерными скелетными структурами. В: Ядерные белки и экспрессия генома. Киев: Изд-во Киев, ун-та. 98-99.

14. Разин С.В., Яровая О.В., Георгиев Г.П. (1985а) Связанная с эндогенной матрицей РНК-полимераза II сконцентрирована во фракции ДНК, прилежащей к ядерному скелету, и сохраняет способность к элонгации цепей РНК в препаратах ядерного матрикса Докл. Акад. Наук СССР 281 (1), 220-3.

15. Разин С.В., Ржешовска-Вольны Й., Моро Ж., Шеррер К. (19856). Локализация участков прикрепления ДНК к ядерному скелету в генах альфа-глобина цыпленка в функционально активных и функционально неактивных ядрах. Моя. Биоя. 19 (2), 456-66.

16. Соловьева Л.В., Светлова М.П., Крутилина Р.И., Розанов Ю.М. и пр. (1997) Единицы репликации ДНК в S-фазе клеток человека. Цитология 39 (2-3), 138-49.

17. Яровая О.В., Разин С.В. (1996). Сравнение положения участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу, MAR-элементов и автономно реплицирующихся последовательностей в протяженном районе X-хромосомы Drosophila melanogaster. Моя. биоя. 30 (5), 1184-92.

18. Яровая О.В., Рысков А.П., Ульянов Н.Б., Журкин В.Б., Разин С.В. (1984). Sequence specificity of two types of DNA fragments remaining associated with nuclear skeleton after limit digestion of Ehrlich ascites carcinoma cells nuclei with staphilococcal nuclease. Тезисы докладов и стендовых сообщ. 16 конгресса ФЕБО.Москва. 271.

19. Яровая О.Б., Хенкок Р., Разин С.Б. (1993) Доменная организация кластера рибосомных генов млекопитающих. Дока. Акад. Наук 330 (1), 120-2.

20. Яровая О.В., Хенкок Р., Разин С.В. (1994) Анализ характера крупномасштабной фрагментации геномной ДНК Drosophila melanogaster топоизомеразой II in vivo. Aokji. Акад. Наук 335 (5), 653-5.

21. Adachi Y., Luke M., Laemmli U.K. (1991). Chromosome assembly in vitro: topoisomerase II is required for condensation. Cell64 (1), 137-48.

22. Ahn A.H., Freener C.A., Gussoni E., Yoshida M., Ozawa E., Kunkel L.M. (1996). The three human syntrophin genes are expressed in diverse tissues, have distinct chromosomal locations, and each bind to dystrophin and its relatives. J Biol Chem 271 (5), 2724-30.

23. Alcantara M.A., Villarreal M.T., Del Castillo V., Gutierrez G., Saldana Y., Maulen I., Lee R., Macias M., Orozco L. (1999). High frequency of de novo deletions in Mexican Duchenne and Becker muscular dystrophy patients. Implications for genetic counseling. Clin Genet 55 (5), 37680.

24. Alevy M.C., Tsai M.J., O'Malley B.W. (1984). DNase I sensitive domain of the gene coding for the glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry 23 (10), 2309-14.

25. Anand A., Prabhakar S., Kaul D. (1999). Genetic polymorphism in muscle biopsies of Duchenne and Becker muscular dystrophy patients. Neurol India 47 (3), 218-23.

26. Andersen M.K., Christiansen D.H., Jensen B.A., Ernst P., Hauge G., Pedersen-Bjergaard J. (2001). Therapy-related acute lymphoblastic leukaemia with MLL rearrangements following DNA topoisomerase II inhibitors, an increasing problem: report on two new cases and review of the literature since 1992. Br] Haematol 114 (3), 539-543.

27. Andreeva M., Markova D., Loidl P., Djondjurov L. (1992). Intranuclear compartmentalization of transcribed and nontranscribed c- myc sequences in Namalva-S cells. Eur J Biochem 207 (3), 887-94.

28. Ariizumi K., Wang Z., Tucker P.W. (1993). Immunoglobulin heavy chain enhancer is located near or in an initiation zone of chromosomal DNA replication. Proc Natl Acad Sti U SA 90 (8), 3695-9.

29. Austin R.C., Howard P.L., D'Souza V.N., Klamut H.J., Ray P.N. (1995). Cloning and characterization of alternatively spliced isoforms of Dp71. Нш Mol Genet A (9), 1475-83.

30. Beggs A.H., Migeon B.R. (1989). Chromatin loop structure of the human X chromosome: relevance to X inacti-vation and CpG clusters. Mol Cell Biol 9 (6), 2322-31.

31. Berezney R., Coffey D.S. (1975). Nuclear protein matrix: association with newly synthesized DNA. Science 189 (4199), 291-3.

32. Berrios M., Osheroff N., Fisher P.A. (1985). In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide component of the Drosophila nuclear matrix fraction. Proc Natl Acad Set USA 82 (12), 4142-6.

33. Bettecken Т., Aissani В., Muller C.R., Bernardi G. (1992). Compositional mapping of the human dystrophin-encoding gene. Gene 122 (2), 329-35.

34. Blake D.J., Hawkes R., Benson M.A., Beesley P.W. (1999). Different dystrophin-like complexes are expressed in neurons and glia. J Cell Biol 147 (3), 645-58.

35. Blasquez V.C., Sperry A.O., Cockerill P.N., Garrard W.T. (1989). Protein:DNA interactions at chromosomal loop attachment sites. Genome 31 (2), 503-9.

36. Blonden L.A., den Dunnen J.T., van Paassen H.M., Wapenaar M.C., Grootscholten P.M., Ginjaar H.B., Bak-ker E., Pearson P.L., van Ommen G.J. (1989). High resolution deletion breakpoint mapping in the DMD gene by whole cosmid hybridization. Nucleic Acids Res 17 (14), 5611-21.

37. Blonden L.A., Grootscholten P.M., den Dunnen J.T., Bakker E., Abbs S., Bobrow M., Boehm C., van Broeck-hoven C., Baumbach L., Chamberlain J. and others (1991).

242 breakpoints in the 200-kb deletion-prone P20 region of the DMD gene are widely spread. Genomics 10 (3), 6319.

Bolla R.I., Braaten D.C., Shiomi Y., Hebert M.B., Schless-inger D. (1985). Localization of specific rDNA spacer sequences to the mouse L-cell nucleolar matrix. MoI Cell Biol 5 (6), 1287-94.

Boulikas T. (1992). Homeotic protein binding sites, origins of replication, and nuclear matrix anchorage sites share the ATTA and ATTTA motifs. J CellBiochem 50 (2), 111-23.

Boulikas Т., Kong C.F. (1993). Multitude of inverted repeats characterizes a class of anchorage sites of chromatin loops to the nuclear matrix. J CellBiochem 53 (1), 1-12.

Brenman J.E., Chao D.S., Gee S.H., McGee A.W., Craven S.E., Santillano D.R., Wu Z., Huang F., Xia H., Peters M.F., Froehner S.C., Bredt D.S. (1996). Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95 and alphal-syntrophin mediated by PDZ domains. Cell 84 (5), 757-67.

Broeker P.L., Super H.G., Thirman M.J., Pomykala H., Yonebayashi Y., Tanabe S., Zeleznik-Le N., Rowley J.D. (1996). Distribution of llq23 breakpoints within the MLL breakpoint cluster region in de novo acute leukemia and in treatment-related acute myeloid leukemia: correlation with scaffold attachment regions and topoisomerase II consensus binding sites. BioodSl (5), 1912-22.

43. Buongiorno-Nardelli M., Micheli G., Cam M.T., Marilley M. (1982). A relationship between replicon size and super-coiled loop domains in the eukaryotic genome. Nature 298 (5869), 100-2.

44. Byers T.J., Lidov H.G., Kunkel L.M. (1993). An alternative dystrophin transcript specific to peripheral nerve. Nat Genet 4 (1), 77-81.

45. Charron M., Hancock R. (1991). Chromosome recombination and defective genome segregation induced in Chinese hamster cells by the topoisomerase II inhibitor VM-26. Chromosoma 100 (2), 97-102.

46. Chen G.L., Yang L., Rowe T.C., Halligan B.D., Tewey K.M., Liu L.F. (1984). Nonintercalative antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II. J Biol Chem 259 (21), 13560-6.

47. Clark R.W., Tseng P.O., Lechuga J.M. (1987). A nuclease-derived fragment of metaphase DNA and its relationship to the replicon. Exp Cell Res 169 (2), 296-310.

48. Cockerill P.N., Garrard W.T. (1986a). Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites. Cell44 (2), 273-82.

49. Cockerill P.N., Garrard W.T. (1986b). Chromosomal loop anchorage sites appear to be evolutionarily conserved. FEBS Lett 204 (1), 5-7.

50. Cohen J.J., Duke R.C. (1984). Glucocorticoid activation of a calcium-dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death. ] Immunol 132 (1), 38-42.

51. Cook P.R., Brazell I.A. (1975). Supercoils in human DNA. J Cell Sci 19 (2), 261-79.

52. Cook P.R., Brazell I.A. (1978). Spectrafluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei. EurJBiochem 84 (2), 465-77.

53. Cook P.R., Brazell I.A. (1980). Mapping sequences in loops of nuclear DNA by their progressive detachment from the nuclear cage. Nucleic Acids Res 8 (13), 2895-906.

54. D'Souza V.N., Nguyen T.M., Morris G.E., Karges W., Pillers D.A., Ray P.N. (1995). A novel dystrophin isoform is required for normal retinal electrophysiology. Hum Mol Genet A (5), 837-42.

55. Davies ICE., Pearson P.L., Harper P.S., Murray J.M., O'Brien Т., Sarfarazi M., Williamson R. (1983). Linkage analysis of two cloned DNA sequences flanking the Duchenne muscular dystrophy locus on the short arm of the human X chromosome. Nucleic Acids Res 11 (8), 230312.

56. Demeret C., Vassetzky Y., Mechali M. (2001). Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene 20 (24), 3086-93.

57. Den Dunnen J.T., Grootscholten P.M., Bakker E., Blonden L.A., Ginjaar H.B., Wapenaar M.C., van Paassen H.M., van Broeckhoven C., Pearson P.L., van Ommen G.J. (1989). Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet A5 (6), 835-47.

58. Domer P.H., Fakharzadeh S.S., Chen C.S., Jockel J., Johansen L., Silverman G.A., Kersey J.H., Korsmeyer S.J. (1993). Acute mixed-lineage leukemia t(4;ll)(q21;q23) generates an MLL-AF4 fusion product. Proc Natl Acad Sci USA 90 (16), 7884-8.

59. Domer P.H., Head D.R., Renganathan N., Raimondi S.C., Yang E., Atlas M. (1995). Molecular analysis of 13 cases of MLL/llq23 secondary acute leukemia and identification of topoisomerase II consensus-binding sequences near the chromosomal breakpoint of a secondary leukemia with the t(4;ll). ~Lsukemia 9 (8), 1305-12.

60. Fajkus J., Nicklas J.A., Hancock R. (1998). DNA loop domains in a 1.4-Mb region around the human hprt gene mapped by cleavage mediated by nuclear matrix-associated topoisomerase II. Mol Gen Genet 260 (5), 410-6.

61. Feener C.A., Koenig M., Kunkel L.M. (1989). Alternative splicing of human dystrophin mRNA generates isoforms at the carboxy terminus. Nature 338 (6215), 509-11.

62. Felix С.A. (1998). Secondary leukemias induced by topoi-somerase-targeted drugs. Biochim Biophjs Acta 1400 (1-3), 233-55.

63. Felix C.A., Hosier M.R., Winick N.J., Masterson M., Wilson A.E., Lange B.J. (1995). ALL-1 gene rearrangements in DNA topoisomerase II inhibitor-related leukemia in children. Blood SS (11), 3250-6.

64. Felsenfeld G. (1992). Chromatin as an essential part of the transcriptional mechanism. Nature 355 (6357), 219-24.

65. Fernandes D.J., Smith-Nanni C., Paff M.T., Neff T.A. (1988). Effects of antileukemia agents on nuclear matrix-bound DNA replication in CCRF-CEM leukemia cells. Cancer Res 48 (7), 1850-5.

66. Filipski J., Leblanc J., Youdale Т., Sikorska M., Walker P.R. (1990). Periodicity of DNA folding in higher order chromatin structures. EMBO J 9 (4), 1319-27.

67. Francke U., Ochs H.D., de Martinville В., Giacalone J., Lindgren V., Disteche C., Pagon R.A., Hofker M.H., van Ommen G.J., Pearson P.L., et a.l. (1985). Minor Xp21 chromosome deletion in a male associated with expression of Duchenne muscular dystrophy, chronic granulomatous disease, retinitis pigmentosa, and McLeod syndrome. Am J Hum Genet 37 (2), 250-67.

68. Freeman L.A., Garrard W.T. (1992). DNA supercoiling in chromatin structure and gene expression. Crit Rep Eukaryot GeneExprl (2), 165-209.

69. Galande S., Kohwi-Shigematsu T. (1999). Poly(ADP-ribose) polymerase and Ku autoantigen form a complex and synergistically bind to matrix attachment sequences. J Biol Chem 274 (29), 20521-8.

70. Gee S.H., Blacher R.W., Douville P.J., Provost P.R., Yurchenco P.D., Carbonetto S. (1993). Laminin-binding protein 120 from brain is closely related to the dystrophin-associated glycoprotein, dystroglycan, and binds with high affinity to the major heparin binding domain of laminin. J Biol Chem 268 (20), 14972-80.

71. Gee S.H., Madhavan R., Levinson S.R., Caldwell J.H., Sealock R., Froehner S.C. (1998). Interaction of muscle and brain sodium channels with multiple members of the syntrophin family of dystrophin-associated proteins. J Neurosci 18 (1), 128-37.

72. Gerdes M.G., Carter КС., Moen P.T. Jr, Lawrence J.B. (1994). Dynamic changes in the higher-level chromatin organization of specific sequences revealed by in situ hybridization to nuclear halos./ Cell Biol 126 (2), 289-304.

73. Glazkov M.V. (1989). Ultrastructure of somatic and mei-otic nucleoids. Electron Microsc Rev 2 (2), 197-229.

74. Gorecki D.C., Monaco A.P., Derry J.M., Walker A.P., Barnard E.A., Barnard P.J. (1992). Expression of four alternative dystrophin transcripts in brain regions regulated by different promoters. Hum Mol Genet 1 (7), 505-10.

75. Greenstein R.M., Reardon M.P., Chan T.S., Middleton A.B., Mulivor R.A., Greene A.E., CorieU L.L. (1980). An (X; 11) translocation in a girl with Duchenne muscular dystrophy. Repository identification No. GM1695. Cjtogenet Cell Genet 21 (4), 268.

76. Gromova I.I., Nielsen O.F., Razin S.V. (1995a). Long-range fragmentation of the eukaryotic genome by exogenous and endogenous nucleases proceeds in a specific fashion via preferential DNA cleavage at matrix attachment sites. J Biol Chem 270 (31), 18685-90.

77. Gromova I.I., Thomsen В., Razin S.V. (1995b). Different topoisomerase II antitumor drugs direct similar specific long- range fragmentation of an amplified c-MYC gene locus in living cells and in high-salt-extracted nuclei. Proc Natl Acad Sci USA 92 (1), 102-6.

78. Haecker S.E., Stedman H.H., Balice-Gordon R.J., Smith D.B., Greelish J.P., Mitchell M.A., Wells A., Sweeney H.L., Wilson J.M. (1996). In vivo expression of full-length human dystrophin from adenoviral vectors deleted of all viral genes. Hum Gene Tberl (15), 1907-14.

79. Han Y.H., Austin M.J., Pommier Y., Povirk L.F. (1993). Small deletion and insertion mutations induced by the topoisomerase II inhibitor teniposide in CHO cells and comparison with sites of drug- stimulated DNA cleavage in vitro. J MolBiol229 (1), 52-66.

80. Hancock R. (2000). A new look at the nuclear matrix. Chromosoma 109 (4), 219-25.

81. Hand R. (1978). Eucaryotic DNA: organization of the genome for replication. Celllb (2), 317-25.

82. Hartwig M. (1978). Organization of mammalian chromosomal DNA: supercoiled and folded circular DNA sub-units from interphase cell nuclei. Acta Biol Med GerY! (3), 421-32.

83. Henglein В., Synovzik H., Groitl P., Bornkamm G.W., Hard P., Lipp M. (1989). Three breakpoints of variant t(2;8) translocations in Burkitt's lymphoma cells fall within a region 140 kilobases distal from c-myc. Mol Cell Biol 9 (5), 2105-13.

84. Hrdlicka I., Zadina J., Krejci R., Srbova A., Kucerova M. (2001). Patterns of deletions and the distribution of breakpoints in the dystrophin gene in Czech patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy (statistical comparison with results from several other countries). Folia Biol (Praha) 47 (3), 81-7.

85. Iarovaia O., Hancock R., Lagarkova M., Miassod R., Razin S.V. (1996). Mapping of genomic DNA loop organization in a 500-kilobase region of the Drosophila X chromosome by the topoisomerase II-mediated DNA loop excision protocol. Mol Cell Biol 16 (1), 302-8.

86. Iarovaia O.V., Lagarkova M.A., Razin S.V. (1995). The specificity of human lymphocyte nucleolar DNA long-range fragmentation by endogenous topoisomerase II and exogenous Bal 31 nuclease depends on cell proliferation status. Biochemistry 34 (12), 4133-8.

87. Ioudinkova E., Bystritsky A., Razin S. (1998). Does the apoptotic fragmentation of DNA starts by excision of chromosomal DNA loop domains? Cell Mol. Biol. Lett. 3, 103-109.

88. Jackson D.A. (1997). Chromatin domains and nuclear compartments: establishing sites of gene expression in eu-karyotic nuclei. Mol Biol Rep 24 (3), 209-20.

89. Jackson D.A., Cook P.R. (1985). Transcription occurs at a nucleoskeleton. EMBOJ 4 (4), 919-25.

90. Jackson D.A., Cook P.R. (1986). Replication occurs at a nucleoskeleton. EMBO J 5 (6), 1403-10.

91. Jackson D.A., Dickinson P., Cook P.R. (1990). The size of chromatin loops in HeLa cells. EMBO J 9 (2), 567-71.

92. Jackson D.A., Dolle A., Robertson G., Cook P.R. (1992). The attachments of chromatin loops to the nucleoskeleton. Cell Biol Int Rep 16 (8), 687-96.

93. JostJ.P., Seldran M. (1984). Association of transcriptionally active vitellogenin II gene with the nuclear matrix of chicken liver. EMBO J 3 (9), 2005-8.

94. Kalandadze A.G., Bushara S.A., Vassetzky Y.S. Jr , Razin S.V. (1990). Characterization of DNA pattern in the site of permanent attachment to the nuclear matrix located in the vicinity of replication origin. Biochem Biophjs Res Commun 168 (1), 9-15.

95. Kalos M., Fournier R.E. (1995). Position-independent transgene expression mediated by boundary elements from the apolipoprotein В chromatin domain. Mol Cell Biol 15 (1), 198-207.

96. Kawada S., Yamashita Y., Ochiai K., Ando K., Iwasaki Т., Takiguchi Т., Nakano H. (1995). Terpentecin and ECT4B, new family of topoisomerase II targeting antitumor antibiotics produced by Streptomyces: producing organism, fermentation and large scale purification. ] Antibiot (Tokyo) 48(3), 211-6.

97. Klamut H.J., Zubrzycka-Gaarn E.E., Bulman D.E., Mal-hotra S.B., Bodrug S.E., Worton R.G., Ray P.N. (1989). Myogenic regulation of dystrophin gene expression. Br Med Bull 4b (3), 681-702.

98. Koenig M., Hoffman E.P., Bertelson C.J., Monaco A.P., Feener C., Kunkel L.M. (1987). Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell50 (3), 509-17.

99. Koenig M., Monaco A.P., Kunkel L.M. (1988). The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cy-toskeletal protein. Off 53 (2), 219-26.

100. Lagarkova M.A., Iarovaia O.V., Razin S.V. (1995a). Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chromosomal DNA loops and their oligomers. J Biol Chem 270 (35), 20239-41.

101. Lagarkova M.A., Iarovaia O.V., Razin S.V. (1995b). Excision of chromosomal DNA loops by treatment of perme-abilised cells with Bal 31 nuclease. Mol Gen Genet 249 (2), 253-6.

102. Lagarkova M.A., Svetlova E., Giacca M., Falaschi A., Razin S.V. (1998). DNA loop anchorage region colocalizes with the replication origin located downstream to the human gene encoding lamin B2. J CellBiochem 69 (1), 13-8.

103. Lederfein D., Yaffe D., Nudel U. (1993). A housekeeping type promoter, located in the 3' region of the Duchenne muscular dystrophy gene, controls the expression of Dp71, a major product of the gene. Hum Mol Genet 2 (11), 1883-8.

104. Leon P., Kezer J. (1990). Loop size in newt lampbrush chromosomes. Chromosoma 99 (1), 83-6.

105. Levy-Wilson В., Fortier С. (1989). The limits of the DNase I-sensitive domain of the human apolipoprotein В gene coincide with the locations of chromosomal anchorage loops and define the 5' and 3' boundaries of the gene. J Biol Chew 264 (35), 21196-204.

106. Li Т.К., Chen A.Y., Yu С., Mao Y., Wang H., Liu L.F. (1999). Activation of topoisomerase II-mediated excision of chromosomal DNA loops during oxidative stress. Genes Dev\3 (12), 1553-60.

107. Lidov H.G., Byers T.J., Watkins S.C., Kunkel L.M. (1990). Localization of dystrophin to postsynaptic regions of central nervous system cortical neurons. Nature 348 (6303), 725-8.

108. Lidov H.G., Selig S., Kunkel L.M. (1995). Dpl40: a novel 140 kDa CNS transcript from the dystrophin locus. Hum Mol Genet A (3), 329-35.

109. Liu L.F., Wang J.C. (1987). Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc Natl Acad SciU S A 84 (20), 7024-7.

110. Lovett B.D., Lo Nigro L., Rappaport E.F., Blair I.A., Osheroff N., Zheng N. Megonigal M.D., Williams W.R., Nowell P.C., Felix C.A. (2001). Near-precise interchromo-somal recombination and functional DNA topoisomerase II cleavage sites at MLL and AF-4 genomic breakpoints in treatment-related acute lymphoblastic leukemia with t(4;ll) translocation. Proc Natl Acad SciU S A 98 (17), 9802-7.

111. McCarter G.C., Denetclaw W.F. Jr, Reddy P., Steinhardt R.A. (1997). Lipofection of a cDNA plasmid containing the dystrophin gene lowers intracellular free calcium and calcium leak channel activity in mdx myotubes. Gene TberA (5), 483-7.

112. Miassod R., Razin S.V., Hancock R. (1997). Distribution of topoisomerase II-mediated cleavage sites and relation to structural and functional landmarks in 830 kb of Dro-sophila DNA. Nucleic Acids Res 25 (11), 2041-6.

113. Mirkovitch J., Mirault M.E., Laemmli U.K. (1984). Organization of the higher-order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. Cell39 (1), 223-32.

114. Monaco A.P. (1989). Dystrophin, the protein product of the Duchenne/Becker muscular dystrophy gene. Trends Biochem Set 14 (10), 412-5.

115. Moser H. (1984). Duchenne muscular dystrophy: pathogenetic aspects and genetic prevention. Hum Genet 66 (1), 17-40.

116. Munkel C., Eils R., Dietzel S., Zink D., Mehring C., Wedemann G., Cremer Т., LangowskiJ. (1999). Com-partmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment./ Mol Biol 285 (3), 1053-65.

117. Nayler О., Stratling W., Bourquin J.P., Stagljar I., Linde-mann L., Jasper H., Hartmann A.M., Fackelmayer F.O., Ullrich A., Stamm S. (1998). SAF-B protein couples transcription and pre-mRNA splicing to SAR/MAR elements. Nucleic Acids Res 26 (15), 3542-9.

118. Nishio H., Takeshima Y., Narita N., Yanagawa H., Suzuki Y., Ishikawa Y., Ishikawa Y., Minami R., Nakamura H., Matsuo M. (1994). Identification of a novel first exon in the human dystrophin gene and of a new promoter located more than 500 kb upstream of the nearest known promoter. J Clin Invest 94 (3), 1037-42.

119. Nobile C., Marchi J., Nigro V., Roberts R.G., Danieli G.A. (1997). Exon-intron organization of the human dystrophin gene. Genomics 45 (2), 421-4.

120. Nudel U., Zuk D., Einat P., Zeelon E., Levy Z., Neuman S., Yaffe D. (1989). Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature 337 (6202), 76-8.

121. Oberhammer F., Wilson J.W., Dive C., Morris I.D., Hickman J.A., Wakeling A.E., Walker P.R., Sikorska M. (1993). Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J12 (9), 3679-84.

122. Ortega J.M., DePamphilis M.L. (1998). Nucleoskeleton and initiation of DNA replication in metazoan cells. J Cell Set 111 (Pt 24) 3663-73.

123. Osheroff N. (1989). Effect of antineoplastic agents on the DNA cleavage/religation reaction of eukaryotic topoisomerase II: inhibition of DNA religation by etoposide. Biochemistry 28 (15), 6157-60.

124. Osheroff N., Zechiedrich E.L., Gale ICC. (1991). Catalytic function of DNA topoisomerase II. Bioessays 13 (6), 26973.

125. Pandey V.N., Dave V.P., Amrute S.B., Rosenbach K., Modak M.J. (1991). Thymic nuclear matrix associated activity is not V(D)J recombinase. Biochem Biophys Res Com-mun 181 (1), 95-9.

126. Pasternak C., Wong S., Elson E.L. (1995). Mechanical function of dystrophin in muscle cells. J Cell Biol 128 (3), 355-61.

127. Peters M.F., Sadoulet-Puccio H.M., Grady M.R., Kramarcy N.R, Kunkel L.M., Sanes J.R., Sealock R., Froehner S.C. (1998). Differential membrane localization and intermolecular associations of alpha-dystrobrevin iso-forms in skeletal muscle. / Cell Biol 142 (5), 1269-78.

128. Poljak L., Seum C., Mattioni Т., Laemmli U.K. (1994). SARs stimulate but do not confer position independent gene expression. Nucleic Acids Res 22 (21), 4386-94.

129. Prusov A.N., Polyakov V.Y.u., Zatsepina O.V., Chentsov Y.U.S., Fais D. (1983). Rosette-like structures from nuclei with condensed (chromomeric) chromatin but not from nuclei with diffuse (nucleomeric or nucleosomic) chromatin. Cell Biol Int Rep 1 (10), 849-58.

130. Rambukkana I. (2000). How does Mycobacterium leprae target the peripheral nervous system? Trends Microbiol 8 (1), 23-8.

131. Razin S.V., Gromova I.I. (1995). The channels model of nuclear matrix structure. Bioessays Yl (5), 443-50.

132. Razin S.V., Gromova I.I., Iarovaia O.V. (1995). Specificity and functional significance of DNA interaction with the nuclear matrix: new approaches to clarify the old questions. Int Rev Cytol 162B 405-48.

133. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O., Gromova I., Georgiev G.P. (1993). Structural-functional organization of chromosomal DNA domains. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58 25-35.

134. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K., Georgiev G.P. (1986). Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucleic Acids Res 14 (20), 8189-207.

135. Razin S.V., Petrov P., Hancock R. (1991a). Precise localization of the alpha-globin gene cluster within one of the 20- to 300-kilobase DNA fragments released by cleavage of chicken chromosomal DNA at topoisomerase II sites in vivo: evidence that the fragments are DNA loops or domains. ProcNatlAcad Sci U S A 88 (19), 8515-9.

136. Razin S.V., Vassetzky Y.S., Hancock R. (1991b). Nuclear matrix attachment regions and topoisomerase II binding and reaction sites in the vicinity of a chicken DNA replication origin. Biochem Biophjs Res Commun 111 (1), 265-70.

137. Reeves R. (1984). Transcriptionally active chromatin. Bio-chim Biophjs Acta 782 (4), 343-93.

138. Reitman M., Felsenfeld G. (1990). Developmental regulation of topoisomerase II sites and DNase I- hypersensitive sites in the chicken beta-globin locus. Mo I Cell Biol 10 (6), 2774-86.

139. Roberts R.G. (2001). Dystrophins and dystrobrevins. Genome Biol 2 (4), REVIEWS3006.

140. Roberts R.G., Coffey A.J., Bobrow M., Bentley D.R. (1993). Exon structure of the human dystrophin gene. Genomics 16 (2), 536-8.

141. Robinson S.I., Nelkin B.D., Vogelstein B. (1982). The ovalbumin gene is associated with the nuclear matrix of chicken oviduct cells. Cell 2% (1), 99-106.

142. Rowley J.D. (1993). Rearrangements involving chromosome band 11Q23 in acute leukaemia. Semin Cancer Biol 4 (6), 377-85.

143. Rybakova I.N., Amann К.J., Ervasti J.M. (1996). A new model for the interaction of dystrophin with F-actin. J Cell Bio/135 (3), 661-72.

144. Saccone S., De Sario A., Wiegant J., Raap A.K., Delia Valle G., Bernardi G. (1993). Correlations between iso-chores and chromosomal bands in the human genome. Proc Natl Acad Sci USA90 (24), 11929-33.

145. Saitoh Y., Laemmli U.K. (1994). Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold. Cell 76 (4), 609-22.

146. Sakkers R.J., BrunstingJ.F., Filon A.R., Kampinga H.H., Konings A.W., Mullenders L.H. (1999). Altered association of transcriptionally active DNA with the nuclear- matrix after heat shock. IntJ RadiatBioll5 (7), 875-83.

147. Schlake Т., Klehr-Wirth D., Yoshida M., Beppu Т., Bode J. (1994). Gene expression within a chromatin domain: the role of core histone hyperacetylation. Biochemistry 33 (14), 4197-206.

148. Schmitz F., Holbach M., Drenckhahn D. (1993). Colocali-zation of retinal dystrophin and actin in postsynaptic dendrites of rod and cone photoreceptor synapses. Histochemistry 100 (6), 473-9.

149. Schubeler D., Mielke C., Maass K, Bode J. (1996). Scaffold/ matrix-attached regions act upon transcription in a context- dependent manner. Biochemistry 35 (34), 11160-9.

150. Shioda M., Matsuzawa Y., Murakami-Murofushi K., Ohta J. (1989). DNA synthesis by the isolated nuclear matrix from synchronized plasmodia of Physarum polycephalum. Biochim BiophjsActa 1007 (3), 254-63.

151. Small D., Nelkin В., Vogelstein В. (1985). The association of transcribed genes with the nuclear matrix of Drosophila cells during heat shock. Nucleic Acids Res 13 (7), 2413-31.

152. Smith H.C., Puvion E., Buchholtz L.A., Berezney R. (1984). Spatial distribution of DNA loop attachment and replicational sites in the nuclear matrix. J Cell Biol 99 (5), 1794-802.

153. Sparvoli E., Levi M., Rossi E. (1994). Replicon clusters may form structurally stable complexes of chromatin and chromosomes. J CellSci 107 ( Pt 11) 3097-103.

154. Sperry A.O., Blasquez V.C., Garrard W.T. (1989). Dysfunction of chromosomal loop attachment sites: illegitimate recombination linked to matrix association regions and topoisomerase II. Proc Natl Acad SciUSA 86 (14), 5497-501.

155. Stanulla M., Wang J., Chervinsky D.S., Apian P.D. (1997a). Topoisomerase II inhibitors induce DNA double-strand breaks at a specific site within the AML1 locus. Leukemia 11 (4), 490-6.

156. Stanulla M., Wang J., Chervinsky D.S., Thandla S., Apian P.D. (1997b). DNA cleavage within the MLL breakpoint cluster region is a specific event which occurs as part of higher-order chromatin fragmentation during the initial stages of apoptosis. Mol CellBiol17 (7), 4070-9.

157. Stief A., Winter D.M., Stratiing W.H., Sippel A.E. (1989). A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position- independent gene activity. Nature 341 (6240), 343-5.

158. Svetlova E.Y., Razin S.V., Debatisse M. (2001). Mammalian recombination hot spot in a DNA loop anchorage region: A model for the study of common fragile sites. / Cell Biochem Suppl 36 170-8.

159. Tajbakhsh J., Luz H., Bornfleth H., Lampel S., Cremer C., Lichter P. (2000). Spatial distribution of GC- and AT-rich DNA sequences within human chromosome territories. Exp Cell Res 255 (2), 229-37.

160. Tan S.H., Bartsch D., Schwarz E., Bernard H.U. (1998). Nuclear matrix attachment regions of human papillomavirus type 16 point toward conservation of these genomic elements in all genital papillomaviruses. J Virolll (5), 3610-22.

161. Targa F.R., Razin S.V., de Moura Gallo C.V., Scherrer K. (1994). Excision close to matrix attachment regions of the entire chicken alpha- globin gene domain by nuclease SI and characterization of the framing structures. ProcNatl AcadSciUSA 91 (10), 4422-6.

162. Thorburn A., Knowland J. (1993). Attachment of vitellogenin genes to the nucleoskeleton accompanies their activation. Biochem Biophjs Res Commun 191 (1), 308-13.

163. Tinsley J.M., Blake D.J., Davies K.E. (1993). Apo-dystrophin-3: a 2.2kb transcript from the DMD locus encoding the dystrophin glycoprotein binding site. Hum Mol Genet 1 (5), 521-4.

164. Tuffery-Giraud S., Chambert S., Demaille J., Claustres M. (1999). Point mutations in the dystrophin gene: evidence for frequent use of cryptic splice sites as a result of splicing defects. Hum Mutat 14 (5), 359-68.

165. Udvardy A., Schedl P. (1991). Chromatin structure, not DNA sequence specificity, is the primary determinant of topoisomerase II sites of action in vivo. Mol Cell Biol 11 (10), 4973-84.

166. Van der Velden H.M., Poot M., Wanka F. (1984). In vitro DNA replication in association with the nuclear matrix of permeable mammalian cells. Biochim Biophjs Acta 782 (4), 429-36.

167. Vaucheret H., Elmayan Т., Thierry D., van der Geest A., Hall Т., Conner A.J., Mynarova L., Nap J.P. (1998). Flank matrix attachment regions (MARs) from chicken, bean, yeast or tobacco do not prevent homology-dependent trans-silencing in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet 259 (4), 388-92.

Verbovaia L.V., Razin S.V. (1997). Mapping of replication origins and termination sites in the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 45 (1), 24-30.

169. Visser A.E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P.J., Cre-mer Т., Aten J.A. (1998). Spatial distributions of early and late replicating chromatin in interphase chromosome territories. Exp Cell Res 243 (2), 398-407.

170. Vogelstein В., Pardoll D.M., Coffey D.S. (1980). Super-coiled loops and eucaryotic DNA replicaton. Cell22 (1 Pt 1), 79-85.

171. Wapenaar M.C., Kievits Т., Hart K.A., Abbs S., Blonden L.A., den Dunnen J.T., Grootscholten P.M., Bakker E., Verellen-Dumoulin C., Bobrow M. and others (1988). A deletion hot spot in the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 2 (2), 101-8.

172. Warren A.C., Cook P.R. (1978). Supercoiling of DNA and nuclear conformation during the cell-cycle. J Cell Sci 30 211-26.

173. Wei X., Somanathan S., Samarabandu J., Berezney R. (1999). Three-dimensional visualization of transcription sites and their association with splicing factor-rich nuclear speckles. J Cell Biol 146 (3), 543-58.

174. Whittaker P.A., Wood L., Mathrubutham M., Anand R. (1993). Generation of ordered phage sublibraries of YAC clones: construction of a 400-kb phage contig in the human dystrophin gene. Genomics 15 (2), 453-6.

175. Windle В., Draper B.W., Yin Y.X., O'Gorman S., Wahl G.M. (1991). A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes Dev 5 (2), 160-74.

176. Wood L., Whittaker P.A. (1994). Mapping of 386 kb of genomic DNA in the human dystrophin-encoding gene (DYS) using an ordered phage lambda sublibrary of a YAC clone containing the DYS region. Gene 138 (1-2), 233-7.

177. Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R. (1980). Cell death: the significance of apoptosis. Intlfjsv Cjtol 68 251-306.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям. Хочу выразить глубокую признательность профессору Рональду Хэнкоку (Университет Лаваль, г. Квебек, Канада) за предоставленную возможность работать в лаборатории Онкологического исследовательского центра Университета Лаваль и за ценные советы. Я хотел бы поблагодарить всех коллег — как московских, так и канадских - за оказанную поддержку.