Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биосинтеза резвератрола генами Ca2+ - зависимых протеинкиназ в клетках винограда амурского Vitis amurensis Rupr.

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биосинтеза резвератрола генами Ca2+ - зависимых протеинкиназ в клетках винограда амурского Vitis amurensis Rupr."

На правах рукописи

АЛЕЙНОВА ОЛЬГА АРТУРОВНА

регуляция биосинтеза резвератрола генами Са2+-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В КЛЕТКАХ ВИНОГРАДА

амурского к/т лмикЕтк нирк.

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005554456

у

ВЛАДИВОСТОК - 2014

005554456

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Киселев Константин Вадимович

Официальные оппоненты: Одинцова Нэлия Адольфовна,

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН, зав. лабораторией клеточных технологий

Максимов Игорь Владимирович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского НЦ РАН, зав. лабораторией биохимии иммунитета растений

Ведущая организация: ФГБУН Институт физиологии

растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Защита состоится «14» октября 2014 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при ФГБУН Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостока, 159. Факс: (423)2310-193, e-mail: info@biosoil.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН и на сайте www.ibss.febras.ru.

Автореферат разослан « » июля 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук —

' Музарок Т. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Виноград содержит ряд БАВ, которые благоприятно воздействуют на организм человека. Среди таких веществ самое известное - это резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен). Резвератрол обладает антиопухолевой активностью, кардиопротективными, нейропротективными и гепатопротекторными свойствами (Kawada et al., 1998: Shankar et al., 2011; Juhaz et al., 2011; Liu et al., 2011). Также этот стильбен является мощным активатором сиртуинов — белков, участвующих в процессах программированной клеточной гибели и дифференцировки (Denu, 2003). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как арахис, клюква и голубика, но наибольшее его содержание характерно для винограда, в том числе и винограда амурского Vitis amurensis Rupr.

Рынок получения и сбыта резвератрола находится в стадии формирования. Резвератрол получают из растений горца птичьего Polygonum cuspidaíum, что является длительным и затратным процессом, поскольку необходимо вырастить взрослое растение, содержание резвератрола в котором не превышает десятых долей процента от сухой массы клеток. Это объясняет довольно высокую стоимость резвератрола. Клеточные культуры имеют определенные преимущества перед традиционным растительным сырьем, так как продукт можно получать независимо от распространения растения, сезона, погодных условий и почвы. Если к тому же учесть быстрое истощение естественных сырьевых ресурсов, то преимущества использования клеточных технологий становятся очевидными. Однако содержание биологически-активных веществ (БАВ) в клеточных культурах растений обычно очень низкое, поэтому для промышленного производства БАВ необходимо увеличить биосинтез этих ценных веществ в клеточных культурах растений с помощью методов биотехнологии. Классическими методами индукции синтеза вторичных метаболитов в культурах клеток растений являются селекция и отбор наиболее продуктивных клеточных линий, варьирование состава питательных сред, добавление предшественников БАВ обработка клеток разнообразными элиситора-ми, а также создание с помощью методов генной инженерии клеток, активно продуцирующих БАВ. Для создания генно-модифицированных организмов, сверхпродуцирующих резвератрол, необходимо детально знать молекулярные механизмы регуляции биосинтеза этого стильбена в клетках растений.

В настоящее время регуляторы биосинтеза стильбенов полностью не изучены, но установлено, что некоторые вторичные мессенджеры, особенно катионы Са2+, вовлечены в регуляцию биосинтеза стильбенов (Vandelle et al., 2006). У растений основными сенсорами цитоплазматического кальция являются кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK). Показано, что геном двух таксономически далеких видов Otyza sativa и Arabidopsis thaliana включает 31 и 34 гена CDPK, соответственно. Это может свидетельствовать о наличии разнообразных функций белков семейства CDPK. Показано, что увеличение накопления фитоалексинов коррелирует с повышением активности CDPK (Ramani and Chelliah, 2007).

Цель и задачи исследования. Цель работы - проанализировать участие кальциевой сигнальной системы в регуляции биосинтеза резвератрола в клетках винограда V. amurensis.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние ингибитора Са2+-каналов плазматической мембраны (верапамил, VER), специфического ингибитора СаМ-подобных проте-инкиназ (W7) и ионофора Са2+А23187 (CI) на биосинтез резвератрола, экспрессию генов стильбен синтаз (STS) и генов CDPK в культурах клеток V. amurensis, а также на ростовые характеристики клеточных культур V. amurensis.

2. Изучить влияние сверхэкспрессии генов VaCDPKla, VaCDPKld, VaCDPKle, VaCDPK2a, VaCDPK3a и VaCDPK3c на биосинтез резвератрола и накопление биомассы клеточных культур V. amurensis.

3. Получить рекомбинантные белки полноразмерного гена VaCDPK3a и его укороченных вариантов VaCDPK3aSFl, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3, проанализировать их протеинкиназную активность.

4. Изучить влияние сверхэкспрессии укороченных вариантов транс-криптов VaCDPKle и VaCDPK3a на продукционные характеристики клеточных линий винограда амурского.

Научная новизна. Впервые изучено влияние ионофора кальция А23187 и антагониста СаМ-подобных протеинкиназ на содержание резвератрола. Показано, что сверхэкспрессия некоторых CDPK в клетках V. amurensis достоверно увеличивает продукцию резвератрола, что напрямую указывает на участие основных сенсоров кальция в биосинтезе этого ценного стильбена.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы биотехнологическими компаниями для создания генетических конструкций и методических подходов для регуляции клеточного роста и биосинтеза вторичных метаболитов растений. Также результаты диссертационной работы можно использовать для проведения теоретических и практических занятий в университете на биологических факультетах.

Апробация работы. Результаты работы представлены на XIII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2010); X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2011); третьем международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2012); XI региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2012); XIV Всероссийской молодежной школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2012); VIII международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); V международной школе молодых ученых по молекулярной генетики «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); I Межрегиональной молодежная школе-конференции «Актуальные проблемы биологических

4

наук» (Владивосток, 2013); X международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013); региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных по естественным наукам (Владивосток, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 9 статей в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 32 рисунками и содержит 24 таблицы. Список литературы насчитывает 166 наименований.

Благодарности. Автор искренне благодарит научного руководителя к.б.н. Киселёва К.В. за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах работы, руководителя лаборатории биотехнологии академика Журавлёва Ю.Н. за помощь в подготовке диссертации и ценные консультации в работе. Автор признателен к.б.н. Козыренко М.М., к.б.н. Дубровиной А.С. и к.б.н. Тюнину А.П. за помощь в подготовке диссертации и работе с культурами клеток растений. Автор искренне благодарит коллектив лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Института физиологии растений им. Тимирязева за всестороннюю помощь и поддержку в проведении работ по белковой химии. Также автор выражает глубокую признательность Маняхину A.IO. за проведение ВЭЖХ анализов и всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН за поддержку на всех этапах работы. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (10-04-00189-а, 12-04-33069-мол_вед), РНФ (14-14-00366) и ДВО РАН (10-III-B-06-100, 12-III-B-06-053).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры и компоненты питательных сред. В работе использовали культуры клеток V. amurensis с разным содержанием резвератрола. Каллус V2 (0.004% резвератрола от сухой массы клеток) был получен в 2002 году из молодого стебля взрослого дикорастущего растения V. amurensis Rupr. (Vitaceae). Трансгенные по гену rolB клеточные линии VB1 и VB2 (до 0.5% резвератрола от сухой массы клеток) были получены в результате трансформации культуры клеток V2 штаммом Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90RK (Kiselev et al., 2007), несущим векторную конструкцию pPCV002-CaMVB (Spena et al., 1987). Для проведения экспериментов на культуре клеток винограда мы использовали WE/A агаризованную питательную среду (Kiselev et al., 2009) с добавлением 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 2.0 мг/л а-нафтилуксусной (АНУ) кислоты, либо содержащую только БАП (WB) или АНУ (WA), либо на питательную среду, не содержащую фито-ropMOHOB(Wo). Питательную среду разливали в пробирки 200x20 мм по 15 мл. Интервал субкультивирования составлял 3 5—40 дней в темноте при 24±1°С. Определение количественного содержания резвератрола проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в образцах

высушенной ткани V. amurensis (Dubrovina et al., 2010).

Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Са2+-каналов (VER), специфическим ингибитором СаМ-подобных протеинкиназ (W7) и ио-иофором Ссг24" А23187 (CI). Растворы VER, W7 и CI добавляли в культураль-ные среды, как было описано ранее (Dubrovina et al., 2009; Kiselev et al., 2010; 2012). Рабочие концентрации для VER - 0.75 мМ; для W7 - 100 цМ и для CI -1 цМ и 10 цМ.

Выделение нуклеиновых кислот и получение комплементарной ДНК. Тотальную РНК выделяли из клеточных линий винограда при помощи метода с использованием LiCl с небольшими модификациями (Kiselev et al., 2009). кДНК получали, используя 1-3 мкг тотальной РНК (предварительно обработав ДНКазой), с помощью набора для обратной транскрипции (Силекс, Россия). Реакцию проводили при +37°С в течение 1-2 часов (Kiselev et al., 2011).

Количественная оценка экспрессии эдногенных генов VaCDPK и генов STS клетках винограда. Для первых экспериментов анализировали экспрессию генов CDPK с помощью вырожденных праймеров и секвенирования полученных клонов (Киселев и др., 2008). Полученные нуклеотидные последовательности генов CDPK V. amurensis сравнивали с известными последовательностями этих генов из других организмов в программе NCBI BLAST. Номера секвенированных фрагментов CDPK, депонированных в ГенБанк: VaCDPKla (EU305622), VaCDPKlas (EU643699), VaCDPKlb (EU643694), VaCDPKlc (EU643695), VaCDPKld (EU305623), VaCDPKle (EU643696), VaCDPK2a (EU309795), VaCDPK3a (EU309796), VaCDPK3as (EU643697), VaCDPK3b (EU643693), VaCDPK3c (KC488322), VaCDPK3d (KC488323), VaCDPKl-Ll (EU327878).

Экспрессию отдельных генов CDPK оценивали количественно, основываясь на данных секвенирования о количестве клонов каждого транскрипта в исследуемых пробах и данных о суммарной экспрессии генов, полученных с помощью вырожденных праймеров (Киселев и др., 2008).

В последующих работах экспрессию наиболее часто встречаемых форм генов CDPK определяли количественно. Для количественного анализа экспрессии генов CDPK и генов STS проводили ПЦР с детекцией результатов в реальном времени (ПЦР РВ) с использованием Taq-man и SYBR® Green. Подробные условия проведения реакций описаны в работах Dubrovina et al., 2009 и Shumakova et al., 2011.

Получение полной последовательности генов VaCDPKla, VaCDPKle, VaCDPKld, VaCDPK2a, VaCDPK3c и VaCDPK3a. Получение полной последовательности генов VaCDPK подробно описано в работе Dubrovina et al., 2013. Схожим методом получения полной последовательности VaCDPK из кДНК клеток винограда получешл несколько коротких вариантов генов VaCDPKle и VaCDPK3a: VaCDPKleSFl, VaCDPKleSF2, VaCDPKleSF3; VaCDPКЗaSFl, VaCDPK3aSF2, VaCDPK3aSF3 (рис. 1).

Полученная аминокислотная последовательность VaCDPKleSFl содержа

6

ла только М-терминальный домен; УаСОРК1е8Р2 - М-концевой участок, 63% киназного домена, домен связывания с кальцием и С-концевой участок; УаСОРКЛеБРЗ - М-концевой участок, 33% киназного домена, домен связывания с кальцием и С-концевой участок (рис. 1). Выведенная аминокислотная последовательность УаСОРКЗаБР! содержала только М-концевой участок и 35% Бег/Тге-протеинкиназного домена; УаСПРКЗа8Р2 - М-концевой участок и 90% киназного домена; УаСБРКЗаЗРЗ - М-концевой участок, 65% киназного домена, 95% домена связывания с кальцием и С-концевой участок (рис. 1).

VaCPKIe

65% 95%

Рис. 1. Схематическое изображение структуры полноразмериых белков УаСЭРКЗа, УаСОРК1е и их укороченных вариантов: УаСОРКЗаЗР), УаС1)РКЗа8Р2, УаСОРКЗаЭРЗ, УаСОРК1е8Р1, УаСОРК1е8Р2, УаСОРК1е8РЗ.

Получение трансгенных клеток V. amurensis, сверхэкспрессирующих гены VaCDPK, с помощью агробактериалъной трансформации. Бинарные векторы, несущие в своей последовательности полноразмерные транскрипты VaCDPKla, VaCDPKld, VaCDPK2a, VaCDPK3c VaCDPKle, VaCDPK3a и укороченные варианты двух последних транскриптов были получены по методике описанной в работе Aleynova-Shumakova et al., 2014. Культуру клеток V. amurensis трансформировали полученными штаммами агробактерий, несущими тот или иной бинарный вектор, по методике описанной ранее (Kise-lev et al., 2007). После трансформации каллусы культивировали в течение 5 месяцев в присутствии 250 мг/л цефотаксима для подавления роста агробактерий. Отбор трансгенных клеток проводили при помощи селекции на кана-мицине (15-20 мг/л) в течение 3 месяцев.

Проверка трансгениости полученных клеточных линий винограда. Трансген-ность полученных линий была доказана по наличию вставки гена nptll с помощью праймеров 5'-GAG OCT ATT CGG СТА TGA CTG и 5'-АТС GGG AG С GGC GAT АСС GTA по условиям описанным ранее (Kiselev et al., 2007). Отсутствие сигнала после ПЦР на ген virB2 служило доказательством того, что агробактерий не было в анализируемых пробах. ПЦР на ген virB2 проводили с использованием праймеров 5'-ААТ GCG CGT GAT АТС GAG CTG CG и 5'-ATA СТА CCG CCA GTG AGC GTT TGG. Для количественного анализа экспрессии генов

7

VaCDPK проводили метод ПЦР РВ с использованием SYBR® Green (Giulietti et al., 2001). Тотальную экспрессию VaCDPK (суммарную экспрессию внутриклеточного и дополнительной вставки гена) определяли с помощью пары праймеров, подобранных к последовательности киназного домена VaCDPK. Эндогенную или внутриклеточную экспрессию определяли используя пару праймеров, комплементарных к концу последовательности киназного домена и к последовательности 3' нетранскрибируемой области (3'UTR) известной кДНК гена. Экспрессию дополнительной вставки гена VaCDPK определяли используя пару праймеров, подобранных к концу белок кодирующей последовательности гена VaCDPK и к последовательности CaMV 35S терминатора, находящейся в бинарной конструкции pZP-RCS2-nptll-VaCDPK.

Получение рекомбинантных белков и анализ их протеинкиназной активности. В качестве плазмиды для получения рекомбинантного белка VaCDPK3a и его укороченных вариантов VaCDPK3aSFl, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 использовали рЕТ-28а(+) (Novagene). Клонирование полученных ПЦР-продуктов полноразмерного гена VaCDPK3a и его укороченных вариантов в рЕТ-28а(+) производили последовательно по специфическим сайтам рестрикции ВашН I и SacI (СибЭнзим, Новосибирск, Россия). Реком-бинантные белки получали с помощью штамма бактерий Rosetta (Novagene). Конструкции плазмид рЕТ-28а(+) со вставками VaCDPK3a, VaCDPK3aSFl, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 перенесли используя метод трансформации с применением хлористого кальция в Rosetta (Маниатис и др., 1984). Вертикальный белковый электрофорез проводили согласно рекомендациям фирмы Bio-Rad (Sambrook and Russell, 2001). Протеинкиназную активность рекомбинантных белков CDPK определяли по их способности фосфорилировать гис-тон HI (Сигма, США) in vitro (Shi el al., 1999). В работе использовали [гамма-32Р] АТФ, удельная активность 148 ПБк/моль (Россия).

Статистическая обработка полученных результатов. Результаты были обработаны при помощи программы Statistica, версия 10.0. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка. Полученные данные проверены по спаренному критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние VER и W7 на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis. Ранее было показано, что несколько вторичных мессенджеров, особенно Са2+, активно вовлечены в регуляцию биосинтеза стильбенов (Aziz et al., 2003; Vandelle et al., 2006).

Мы предположили, что Са2+-сигнальная система вовлечена в регуляцию биосинтеза резвератрола. Для того чтобы подтвердить данное предположение, необходимо проанализировать влияние изменения [Са2+]цнт в клетке на биосинтез резвератрола и экспрессию генов CDPK в культуре клеток винограда амурского. Нами показано, что при добавлении ингибиторов

8

Са2+ -каналов VER или при добавлении W7 в питательные среды культуры клеток растений наблюдается тенденция на снижение продукции резвератро-ла клеточными линиями V. amurensis. Так при добавлении блокатора потен-циалзависимых Са2+-каналов плазматической мембраны VER продукция рез-вератрола в ro/Я-трансгенных линиях VB1 и VB2 достоверно ингибировалась в 5.3 и 9.8 раз, соответственно (табл. 1).

Табл. 1. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола клеточными линиями V. amurensis, обработанными 0.75 мМ VER._

Клеточная Л1111НЯ Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Резвератрол, % от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

V2 170.Ш0.7 6.9±0.9 0.004±0.002 0.28±0.14

V2+VER 134.7±3.4 5.1±1.1 0.006±0.001 0.32±0.05

VB1 163.4±30.1 7.9±0.8 0.037±0.022* 2.95±1.74*

VB1+VER 158.8±29.4 8.0±1.2 0.007±0.001 0.56±0.08

VB2 40.7±10.7 4.5±0.5 0.243±0.038** 10.95±1.71*

VB2+VER 51.4±31.4 4.8±0.6 0.023±0.009 1.12±0.43

* - р < 0.05, ** - р < 0.01, сравнивали с приростом сырой биомассы и содержанием резвератрола в культуре клеток V2 без добавления VER

Так как содержание резвератрола в культуре клеток винограда V2 довольно низкое, мы решили индуцировать его при помощи классических биотехнологических приемов, таких как добавление предшественников резвератрола фенилаланина (Phe) и кумаровой кислоты (СА), а также добавлением стрессовой молекулы салициловой кислоты (SA). Добавление ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ W7 в питательные среды достоверно ингибиро-вало продукцию резвератрола и снимало эффект активации фенилпропаноид-ного пути в культуре клеток винограда (табл. 2). Так, продукция резвератрола в клетках винограда V. amurensis обработанных СА при добавлении W7 достоверно уменьшалась в 4.4 раза (табл. 2).

Табл. 2. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола клеточной культурой V. amurensis V2, обработанной W7 в комбинации с Phe, СА и SA.

Клеточная линия Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Резвератрол,% от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

V2 228±17 83±0.7 0.007±0.001 0.581±0.142

V2+W7 207±15 7.7±0.6 0.010±0.002 0.771±0.161

V2+SA 185±20 7.4±0.8 0.047±0.012** 3.478±0.871*

V2+SA+W7 190±14 7.1±0.5 0.029±0.013** 2.059±0.925*

V2+Phe 212±20 8.б±0.8 0.014±0.002* 1.204±0.175*

V2+Phe+W7 210±11 7.1±0.4 0.009±0.001 0.639±0.091

V2+CA 103±24* 43±0.9* 0.033±0.011* 1.419±0.473*

V2+CA+W7 67±21** 3.6±1.0** 0.009±0.003 0324±0.112

V2 - калусс V2, растущий WE/A; V2+W7 - калусс V2, растущий WB/A с добавлением 100 цМ W7; V2+Phe - калусс V2, растущий WE/A с добавлением 100 цМ Phe; V2+ Phe+W7 - калусс V2, растущий WB/A с добавлением 100 цМ Phe и 100 рМ W7; V2+CA - калусс V2, растущий Wr>/A с добавлением 100 цМ СА; V2+CA+W7 - калусс V2, растущий WE/A с добавлением 100 цМ СА и 100 рМ W7; V2+SA - калусс V2, растущий WE/A с добавлением 100 цМ SA; V2+SA+W7 - калусс V2, растущий WE/A с добавлением 100 ^М SA и 100 цМ W7. * - р < 0.05, ** - р < 0.01, сравнивали с приростом сырой биомассы и содержанием резвератрола в культуре клеток растущей на стандартной среде.

При анализе экспрессии CDPK в клеточных линиях V. amurensis, мы обратили внимание на то, что в клеточных линиях винограда со средним и высоким содержанием резвератрола экспрессируются дополнительные формы генов CDPK. Так, в норме в контрольной культуре клеток V2 встречается только пять форм VaCDPK, в то время как в VB1 и VB2 культурах экспресси-руется девять и десять форм. При добавлении в питательные среды VER или при добавлении W7 экспрессия генов VaCDPKla, VaCDPKld, VaCDPKle, VaCDPK2a и VaCDPK3a была постоянной во всех клеточных линиях V. amurensis с разным содержанием резвератрола. Частота встречаемости транскриптов VaCDPKla и VaCDPK3a в клеточной линии VB2 или в клеточной линии, где фенилпропаноидный путь был активирован, была ниже, чем в контрольной культуре клеток.

Также показано, что в контрольной культуре клеток V2 при добавлении W7 наблюдается достоверное увеличение экспрессии STS10 в 3.7 раза, экспрессия STS1 достоверно ингибировалась в 2 раза, экспрессия STS2-STS9 достоверно не изменялась. Добавление SA, Phe или СА достоверно увеличивало экспрессию STS2-STS4, STS6, STS7 и STS10. Добавление W7 к клеткам обработанными индукторами фенилпропаноидного пути в большинстве случаев снимало эффект увеличения экспрессии генов STS (Kiselev et al., 2013).

Влияние CI на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis. Нами показано, что добавление в питательные среды ионофора Са2+ А23187 в концентрации 1 цМ достоверно увеличивает продукцшо резвератрола в контрольной культуре клеток V. amurensis в 2.7 раз. В то время как добавление 10 цМ CI достоверно снижает продукцшо резвератрола во всех клеточных линиях винограда амурского V2, VB1 и VB2 в 0.3-0.5 раз. Уменьшение продукции резвератрола при добавлении в питательные среды 10 цМ CI связано с тем, что выбранная концентрация ингибировала клеточный рост (табл. 3). В контрольной культуре клеток при добавлении А23187 увеличивается экспрессия шести из десяти генов STS и экспрессия всех анализированных генов CDPK, за исключением генов VaCDPKla и VaCDPK3a.

Табл. 3. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола

Клеточная линия Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Резвератрол, % от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

\2 251.8±19.8 0.828 0.009±0.001 0.7±0.1

У2+1 (1М С1 214.1*24.8 0.677 0.025±0.005* 1.9±0.4*

У2+10 цМ С1 10.8±1.7** 0.172 0.017±0.006 03±0.1*

УВ1 197.3±26.1 0.263 0.151±0.005 3.3*1.1

УВ1+1 цМ С1 59.0±8.1** 0.226 0.096±0.004 2.4±0.1

УВ1+10 цМ С1 14.8±1.1** 0.165 0.071±0.021* 1.59±0.5*

УВ2 64.2±8.3 0.460 0.409±0.059 15.8±2.3

УВ2+1 цМ С1 44.1±3.6* 0.374 0.347±0.137 12.3±4.8

УВ2+10 цМ С! 14.6±2.0** 0.237 0.201±0.051* 4.6±1.2*

* — р < 0.05, ** — р < 0.01, сравнивали с приростом сырой биомассы и содержанием резвератрола без добавления С1 внутри каждой клеточной линии винограда амурского.

Суммарный результат анализа частоты встречаемости клонов и результаты ПЦР РВ свидетельствуют о том, что экспрессия УаСБРКЫ, УаСБРК1е, VaCDPK.lL и УаСйРК2а достоверно увеличивается при добавлении С1 в контрольной культуре клеток винограда амурского У2. В то время как экспрессия УаСБРК] а и УаСОРКЗа достоверно уменьшается в У2 при добавлении А23187. Экспрессия шести генов СИРК достоверно не изменялась при добавлении С1 в го/В-трансгенных клеточных линиях винограда (Клзе1еу е1 а1., 2012).

Характеристики УаСБРК-трансгениых клеточных линий винограда. Показано, что Са2+-сигнальная система вовлечена в регуляцию биосинтеза резвератрола, поэтому далее необходимо узнать корреляцию между продукцией резвератрола и экспрессией генов СБРК в клеточных линиях винограда. Одним из методов изучения функций белковых продуктов генов является сверхэкспрессия изучаемых генов в клетках. Поэтому для изучения функций СйРК нами были получены ГаСБРЮа-, УаСйРК1е-, УаСйРКЫ-, УаСйРК2а-, УаСОРКЗа- и УаСБРКЗс-трансгенные клеточные линии У. атигеп$1$. Также были получены клеточные линии винограда амурского сверхэкспрессирую-щие укороченные варианты транскриптов УаСйРК! УаСОРК!е$Р2,

УаСБРК!еБРЗ, УаСОРКЗа.ЧП, УаСОРКЗаБР2 и УаСБРКЗаБРЗ. Также в ходе агробактериальной трансформации бинарным вектором, несущем в своей последовательности только ген устойчивости к канамицину прШ, была получена векторная клеточная линия винограда КА-0. Отмечено, что КА-0 по внешним признакам, ростовым и биосинтетическим характеристикам не отличается от культуры клеток У2.

Показано, что все полученные клеточные линии несут ген устойчивости к канамицину пр1Н, что свидетельствует о факте вставки генетической конструкции, содержащей тот или иной ген УаСБРК в клетки винограда амурского. Показано, что во всех полученных клеточных линиях отсутствует сигнал на ген У1гВ2, что говорит о том, что образцах нет примеси клеток агробакте-рий, а сигнал на прШ получен именно с ДНК клеточных линий винограда. С помощью метода ПЦР РВ и разных комбинаций праймеров мы оценили эндогенную, трансгенную и суммарную экспрессии того или иного гена УаСБРК во всех полученных ИаСДР/Г-трансгенных клеточных линиях У. атигетгъ. Показано, что все УаСБРК-трансгенные клеточные линии экспрессировали дополнительную вставку того или иного гена УаСБРК, что, в свою очередь, влияло на эндогенную и тотальную экспрессию того или иного гена УаСОРК в клеточных линиях винограда амурского.

Также мы провели ряд экспериментов по анализу продукционных характеристик всех полученных УаСОРК-трансгенных клеточных линий V. атигепя^я на питательных средах с разным составом фитогормонов \\^Б/Л, Ч^л и питательные среды без добавления фитогормонов \У0. Все эксперименты на полученных КаСЛРЛТ-трансгенных клеточных линиях ставили на второй месяц после снятия с канамицина.

Показано, что практически все КаС£>Р/^-трансгенные клеточные линии винограда V. атжепз'ю имели схожий фенотип с векторной клеточной линией КА-0. Прирост сырой и сухой биомассы, а таюке содержание и продукция резвератрола практически всех УаСБРК-трансгенных клеточных линиях при культивировании на питательных средах и Wo достоверно снижались.

Прирост сырой биомассы в УаСйРК1а- и УаСБРКЗа-трансгенных клеточных линиях винограда У. атигепз18 достоверно увеличивался в 1.2—1.5 раза, за счет чего продукция резвератрола увеличивалась в 1.4-1.9 раза, относительно векторной клеточной линии КА-0 (табл. 4). Продукция резвератрола в клеточных линиях винограда трансгенных по генам УаСОРКЫ, УаСВРК1е и УаСИРК2а увеличивалась в 1.2-4.8 раза за счет увеличения прироста сырой биомассы и содержания резвератрола (табл. 4). Содержание резвератрола в полученных УаСБРКЗс-трансгенных клеточных линиях винограда КА-09 было достоверно выше в 5.6-52.3 раза относительно КА-0 (табл. 4). Соответственно продукция резвератрола УаСБРКЗ с-трансгенных клеточных линий была достоверно в 8.8-67.8 раза выше, чем в векторной клеточной линии винограда КА-0 (табл. 4). Максимальная продукция была в клеточной линии КА-09-1 и составляла 33.9±8.4 мг/л.

Табл. 4. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола в культуре клеток КА-0 и в трансгенных клеточных линиях V. amurensis по генам VaCDPKla (ICA-10), VaCDPKld (КЛ-07), VaCDPKle (ICA-08), VaCDPK2a (KA-15), VaCDPK3a (ICA-04), VaCDPK3c (KA-09), растущих на средах Wb/a. * - p < 0.05; ** - p < 0.01 от значений векторной клеточной линии КА-0.

Клеточная линия Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Резвератрол. % от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

КА-0 165.8±7.7 7.2±0.3 0.007±0.001 0.62±0.06

ICA-04-I 157.5±13.0 10.0±1.4 0.013±0.004 1.3±0.40

KA-04-II 255.0±18.6* 10.0±0.5* 0.013±0.004 1.3±0.42

KA-04-III 232.5±17.б* 8.8±1.0 0.011±0.005 0.97±0.54

ICA-07-I 215.5±14.6* 5.1±0.7 0.008±0.002 0.41±0.0б

KA-07-II 226.7±23.6* 9.8±0.7* 0.007±0.002 0.69±0.23

KA-07-III 125.2±19.3 8.2±0.7 0.007±0.001 0.58±0.09

KA-08-I 233.8±14.0* 8.8±0.4 0.029±0.016* 2.56±1.41*

KA-08-II 201.3±15.9 8.8±0.4 0.009±0.002 0.79±0.05

KA-08-III 165.0±19.3 7.5±0.4 0.007±0.001 0.53±0.08

KA-08-1V 15б.3±13.0 7.5±0.5 0.009±0.001 0.68±0.08

KA-09-I 190.1±19.3 8.1±0.9 0.418±0.086** 33.9±8.4**

1CA-09-II 185.1±30.3 7.1±0.5 0.061±0.021* 4.3±1.5*

КА-09-Ш 230.2±20.1* 8.7±0.6 0.103±0.029** 8.9±2.7**

KA-09-IV 155.8±22.5 7.5±0.5 0.059±0.023* 4.4±2.1*

ICA-09-V 252.5±12.8* 10J±0.4* 0.045±0.011* 4.6±1.1*

КА-10-1 253.5±20.2* 8.0±0.7 0.013±0.004 1.04±0.35

KA-10-II 206.8±25.3 7J±0.4 0.019±0.003* 1.39±0.23*

KA-10-III 179.4±17.3 6.0±0.5 0.017±0.003* 1.02±0Д9

KA-10-IV 204.1±11.0 6.8±0.4 0.015±0.004 1.03±0.26

КА-15-1 171.б±11.0 7.5±0.4 0.011±0.003 0.83±0.25

КА-15-11 154.0±9.4 6.5±0.3 0.010±0.002 0.65±0.17

1CA-15-III 157J±13.1 7.6±0.9 0.012±0.003 0.91±0.24

KA-15-1V 134.6±11.4 5J±0.4 0.009±0.002 0.48±0.15

Показано, что в УаСйРКЗс-трансгенных клеточных линиях V. атигет'ш экспрессия генов УаБТБ значительно не изменялась, кроме экспрессии УаЗТБ1, которая достоверно уменьшалась и кроме экспрессии генов УаБТБ2 и Ка£Т57, которые достоверно увеличивались. Для того чтобы доказать, что продукция резвератрола в клетках винограда амурского увеличивалась за счет сверхэкспрессии гена УаСБРКЗс, мы провели эксперимент по добавлению специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ \У7 в питательные

13

среды, на которые был осуществлен пассаж клеточных линий КА-0 и КА-09-I. Показано, что при добавлении 100 рМ \У7 эффект сверхпродукции резве-ратрола КаСЛРЮс-трансгенными клетками исчезает (табл. 5).

Табл. 5. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола в клеточных линиях винограда КА-0 и КА-09-1, растущих на средах с добавлением \>/7. ^б/а - в клетках винограда, культивируемых на питательных средах содержащих фи-тогормоны БАП 0.5 мг/л и АНУ 2 мг/л; % от сух. веса. * р < 0.05; ** р < 0.01 от значе-

Клеточная линия Код среды Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Рсзвератрол. % от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

КА-0 162.5±14.9 6.1±0.4 0.008±0.004 0.5±0.3

106.25±18.25 5.0±0.86 0.007±0.001 0.77±0.16

КА-09-1 \Увм 190,1±19.3 8.1±0.9 0.418±0.086 33.9±8.4

WБ/A+w7 121.4±12.1* 6.2±0.3* 0.018±0.006** 1.1±0.4**

Также нами были получены клеточные линии винограда амурского трансгенные по коротким вариантам транскриптов УаСБРКЗа и УаСОРК1е. Показано, что прирост сырой и сухой биомассы УаСИРКЗаБП-трансгенными клеточными линиями У. атигет 'к значительно не отличался от векторной линии КА-0 (табл. 6). В то время как прирост сырой и сухой биомассы УаСОРКЗа§Р2- и КаС/ЗРЮя^Л-трансгенными клеточными линиями был достоверно выше 1.3 раза, чем в клеточной линии КА-0 (табл. 6). Показано, что сверхэкспрессия всех коротких вариантов транскриптов УаСБРК1е приводит к достоверному увеличению прироста сырой и сухой биомассы клеток в 1.1-1.9 раза относительно векторной и трансгенной по полной форме гена УаСОРК]е клеточных линий винограда У. атигет'ш (табл. 6).

Табл. 6. Прирост сырой и сухой биомассы, содержание и продукция резвератрола в культуре клеток КА-0 и в клеточных линиях V. amurensis трансгенных по коротким транскриптам VaCDPK3aSFl (КА-02), VaCDPK3aSF2 (КА-05), VaCDPK3aSF3 (КА-06), VaCDPKleSFl (КА-11), VaCDPKleSF2 (КА-12), VaCDPKleSF3 (КА-13), культивируемых на средах WE/a- * - Р < 0.05; ** - р < 0.01 от значений векторной клеточной линии КА-0.

Клеточная линия Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Резвератрол. % от сух. веса Продукция резвератрола, мг/л

КЛ-0 165.8±7.7 7.2±0.3 0.007±0.001 0.62±0.06

KA-02-I 212.5±13.3* 10.0±0.6 0.014±0.005 1.4±0.5

KA-02-II 195.0±18.1 8.8±0.5 о.оп±о.ооз 0.97±0.27

KA-05-I 192.5±10.5 10.0±0.4* 0.009±0.002 0.9±0.14

KA-05-II 187.5±22.1 8.8±0.6 0.008±0.002 0.71±0.19

KA-05-III 163.8±48.4 63±1.5 0.008±0.002 0.51±0.16

KA-05-IV 285.0±10.3* 12.5±0.5* 0.008±0.002 1±0.27

KA-06-I 225.0±14.5* 10.0±0.5* 0.017±0.003* 1.7±0.33*

KA-06-II 228.8±23.8* 10.0±0.6 0.011±0.002 1.1±0.11

KA-11-I 250.0±9.1 * 7.5±0.8 0.009±0.002 0.68±0.17

KA-11-II 312.5±8.5* 11.3±0.4* 0.008±0.003 0.91±0.41

KA-11-III 362.5±21.4** 12.5±0.5** 0.014±0.006 1.75±0.77*

КА-12-1 240.0±23.3* 10.0±0.4* 0.007±0.003 0.70±0.31

КЛ-12-II 362.5±21.4** 12.5±0.6* 0.006±0.003 0.75±0.39

КА-13-1 258.8±19.9* 11.3±0.8* 0.006±0.002 0.68±0.26

КА-13-И 365.0±5.6** 12.5±0.5* 0.005±0.003 0.63±0.39

KA-13-III 223.8±12.4* 10.0±0.8 0.005±0.003 0.50±0.31

Протеинкиназная активность полноразмериого белка УаСОРКЗа и его укороченных вариантов. Показано, что биотехнологические характеристики полученных УаСОРКЗаБР1-клеточшлх линий значительно не отличаются от векторной клеточной линии КА-0 (табл. 6). В то время как в УаСОРКЗаБР2- и У а СОР КЗ аБ173 -тр а 11 с ге ных клеточных линиях прирост сырой и сухой биомассы был 1.4-1.6 раза выше, чем прирост КА-0 (табл. 6). В связи с этим возник вопрос, обладают ли подобные короткие варианты УаСОРКЗа белковой активностью и чувствительностью к ионам Са2+.Для решения этого вопроса, нами были получены бактериальные штаммы КоБсИа, способные экспресси-ровать полноразмерный белок УаСОРКЗа и его укороченные варианты. Полноразмерный белок УаСОРКЗа имеет молекулярный вес 55 кДа, укороченные варианты УаСОРКЗа8Р1, УаСОРКЗа8Р2, УаСОРКЗа5РЗ - 18 , 36 и 44 кДа.

15

Установлено, что в присутствии катионов Са + полноразмерный белок УаСОРКЗа и его варианты УаСОРКЗа81;2 и УаСБРКЗаБРЗ фосфорилируют гистон Н1 (рис.2а,г). Белок УаСОРКЗаБП, содержащий 35% киназного белка, не проявлял протеинкиназной активности (рис. 2а,г). В отсутствие ионов Са2+ энзиматическая активность полноразмерного рекомбинантного белка УаСОРКЗа значительно уменьшалась, тогда как протеинкиназная активность белков УаСОРКЗа8Р2 и УаСОРКЗаБРЗ сохранялась на высоком уровне (рис. 26,г). При добавлении в реакционную смесь специфического ингибитора Са2+ -зависимых протеинкиназ W7 фосфорилирование гистона Н1 изучаемыми белками не происходило (рис. 2в,г).

а) с,"

EGTA

нптг

W7

* »/// ■* »/// » »/W

пптг + -+ + + + + * +. + + +

Рис. 2. Фосфорилирование гистона HI белковыми фракциями содержащих: 1 -полноразмерный белок VaCDPK3a индуцируемый ИПТГ при +37°С; 2 - полноразмерный белок VaCDPK3a без индукции ИПТГ при +37°С; 3 - белок VaCDPK3aSFl индуцируемый ИПТГ при +37°С; 4 - белок VaCDPIC3aSF2 индуцируемый ИПТГ при +37°С; 5 - белок VaCDPK3aSF3 индуцируемый ИПТГ при +37°С. а) реакционные смеси protein kinase assay in vitro в присутствие ионов Ca2H; б) реакционные смеси protein kinase assay in vitro в отсутствие ионов Са2+; в) реакционные смеси protein kinase assay in vitro в присутствие специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ W7; г) уровень фосфорилирования гистона HI изоформами VaCDPK3a в присутствие ионов Са2+, в отсутствие ионов Са2+ и в присутствие специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ W7, измеренный денситометрически.

ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что уменьшение продукции резвератрола при добавлении ингибитора Са2+-каналов VER или антагониста CDPK W7, и увеличение продукции резвератрола при добавлении CI в питательные среды культур клеток V. amurensis свидетельствует о том, что Са2+-сигнальная система участвует в регуляции биосинтеза этого ценного стильбена (Kiselev et al., 2012; Kiselev et al., 2013; Шумакова и др., 2013). Поскольку именно CDPK играют ключевую роль в кальциевой сигнальной системе растений, интересно узнать, какие именно формы CDPK участвуют в регуляции биосинтеза резвератрола. При анализе экспрессии CDPK в клеточных линиях винограда V. amurensis, мы обратили внимание на то, что в клеточных линиях винограда со средним и высоким содержанием резвератрола появляются новые транскрипты генов CDPK. Для изучения функций CDPK нами были получены VaCDPKla, VaCDPKle, VaCDPKld, VaCDPK2a, VaCDPK3a и KaCDPjüc-трансгенные клеточные линии V. amurensis. Гены VaCDPKla и VaCDPK3a были выбраны, так как они в норме сильно экспрессируются в тканях винограда амурского, гены VaCDPKld и VaCDPK2a — являются представителями среднеэкспресси-рующейся группы VaCDPK винограда, гены VaCDPKle и VaCDPK3c - их экспрессия значительно увеличивалась в клетках винограда амурского V. amurensis, которые отличались повышенной продукцией резвератрола.

Показано, что постоянная экспрессия VaCDPKla, VaCDPKld, VaCDPKle, VaCDPK2a и VaCDPK3a во всех клеточных линиях V. amurensis при добавлении в питательные среды VER или при добавлении W7, может свидетельствовать о том, что белки данных генов вовлечены в такие биохимические процессы, без которых существование клетки невозможно. Также отмечено, что в контрольной культуре клеток при добавлении А23187 увеличивается экспрессия всех анализированных генов CDPK, за исключением генов VaCDPKla и VaCDPK3a. Вероятно, VaCDPKla и VaCDPK3a на прямую не вовлечены в процесс регуляции биосинтеза резвератрола.

Мы предполагаем, что гены VaCDPKla и VaCDPK3a являются позитивными регуляторами роста, поскольку в клетках винограда амурского сверх-экспрессирующие VaCDPKla и VaCDPK3a прирост сырой биомассы был значительно выше относительно других клеточных линий (табл. 4). Ранее было показано, что ген VaCDPKla сильно экспрессируется в молодых, активно растущих побегах винограда, по сравнению с взрослыми стеблями и другими органами V. amurensis (Dubrovina et al., 2013). Также было показано, что экспрессия гена VaCDPKla значительно увеличивается при водном дефиците винограда амурского (Dubrovina et al., 2013). Вероятно, белковые продукты гена VaCDPKla могут стимулировать активный рост молодых побегов и, возможно, участвовать в регуляции водного обмена V. amurensis. Также известно, что ген VaCDPK3a экспрессируется наиболее сильно в листьях, соцветиях и ягодах винограда амурского (Kiselev et al., 2013). Показано, что последовательность полноразмерного гена VaCDPK3a наиболее

гомологична гену VCPK1 из Vitis vinifera. Ранее группа китайских ученых (Yu et al., 2007) показала, что экспрессия гена VCPK1 увеличивает клеточный рост и играет ключевую роль в прорастании семени V. vinifera. Приведенные выше сведения, могут свидетельствовать о том, что белковые продукты гена VaCDPK3a могут участвовать в росте листьев и репродуктивных тканей винограда V. amurensis.

Нами было отмечено, что прирост сырой биомассы клеток и содержание резвератрола в клеточных линиях, сверхэкспрессирующих гены VaCDPKld, VaCDPK2a и VaCDPKle, либо значительно не изменялись, либо были немного выше, чем в клеточной линии КА-0, поэтому продукция резвератрола в клеточных линиях КА-07, КА-15 и КА-08 увеличилась в 1.2-4.8 раза (табл.4). Известно, что последовательности полноразмерных генов VaCDPKld, VaCDPK2a и VaCDPKle наиболее гомологичны последовательностям генов VvCDPK12, VvCDPK13 и VvCDPK17 из V. vinifera соответственно. Было показано, что VvCDPK17 экспрессируются во всех органах и тканях, a VvCDPK12 и VvCDPK13 также экспрессируются во всех органах и тканях, кроме пыльцы (Chen et al., 2013). Также известно, что VaCDPKld и VvCDPK12 участвуют в ответе V. amurensis и V. vinifera на стресс вызванный засолением почвы, а экспрессия форм VaCDPK2a и VvCDPK13 увеличивается при водном дефиците (Dubrovina et al., 2013; Chen et al., 2013). Экспрессия гена VaCDPKle и VvCDPKl 7 увеличивается в растениях V. amurensis и V. vinifera как в случае водного дефицита, так и засухи (Dubrovina et al., 2013; Chen et al., 2013). Также показано, что близкие гомологи OsCPK3, OsCPKló и OsCPK27 гена VaCDPK2a сильно экспрессируются в соцветиях (Ye et al., 2009). Для VaCDPKld и VaCDPK2a характерен высокий уровень экспрессии в семенах винограда амурского, что коррелирует с ранее полученными данными об экспрессии гомологичных генов риса О. sativa, которые активно экспрессируются в молодой метелке и эндосперме семян риса (Ye et al., 2009). Вероятно, белковые продукты генов VaCDPKld и VaCDPK2a участвуют в регуляции ответа растений на стресс, вызванный засухой и водным дефицитом, кроме того, гены VaCDPK2a и VaCDPKld также могут участвовать в процессе развития семян (Dubrovina et al., 2013), и напрямую не участвуют в биосинтезе резвератрола.

Сравнительный анализ выведенной аминокислотной последовательности гена VaCDPK3c с известными аминокислотными последовательностями CDPK A. thaliana показал высокий уровень гомологии с AtCPKl (73% гомологии), AtCPK2 (78%) и AtCPK20 (75%) (Coca and Segundo 2010). Ранее было показано, что обработка растений A. thaliana патогенами грибковой природы приводит к увеличению экспрессии гена AtCPKl. Также ранее было показано, что фермент PAL является одним из возможных субстратов для фосфорили-рования AtCPKl, близкого гомолога VaCDPK3c (Cheng et al., 2002). Как известно, PAL - это первый фермент фенилпропаноидного пути биосинтеза вторичных метаболитов растений. Таким образом, сведения о фосфорилиро-

18

вании PAL посредством CDPK обеспечивают прямую связь между CDPK и вторичным метаболизмом растений (Cheng et al., 2002).

Показано, в полученных VaCDPK3c-трансгенных клеточных линиях винограда амурского содержание резвератрола достигало 0.42% от сухой биомассы клеток (табл. 4). Такая величина содержания резвератрола в клетках V. amurensis намного выше, чем в культурах клеток содержащих резвератрол описанных ранее (Ku et al., 2005; Tassoni et al., 2005), но ниже чем в rolB-трансгенных клеточных линиях (Kiselev et al., 2009).

Нами было показано, что сверхэкспрессия гена VaCDPK3c в культуре клеток винограда увеличивает продукцию резвератрола посредством активации только некоторых форм генов STS (табл. 5). Полученные данные об увеличении выборочной экспрессии генов STS в VaCDPK3c-трансгенных клеточных линиях винограда амурского кореллируют с ранее полученными данными об экспрессии генов STS в клетках V. amurensis. Показано, что экспрессия гена STS7 достоверно увеличивается в клетках винограда амурского, растущих на питательной среде с добавлением СА и ло/Д-трансгенных клетках V. amurensis (Kiselev et al., 2009; 2013) кореллирует с увеличением продукции резвератрола в этих клетках. Вероятно, ген STS7 в большей степени вовлечен в биосинтез резвератрола, чем остальные формы представителей STS. Возможно, ген VaCDPK3c увеличивает продукцию резвератрола посредством увеличения экспрессии гена STS7, чей белковый продукт необходим для активного биосинтеза резвератрола. Возможно, что некоторые ферменты вторичного метаболизма растений (например, STS7) могут быть субстратами для VaCDPK3c.

Ранее нами было показано, что все короткие варианты транскриптов УаСРКЗа не имеют канонических донорно-акцепторных сайтов (Dubrovina et al., 2014). Было показано, что сплайсинг коротких вариантов транскриптов УаСРКЗа происходил на 5'- и 3'- сайтах по коротким прямым повторам SDRs длиной 3—7 пар нуклеотидов. Также было показано, что полученные необычные короткие варианты транскриптов УаСРКЗа являются артефактом ОТ-ПЦР (Dubrovina et al., 2014). Было показано, что клеточные характеристики VaCDPКЗaSFl-трансгенных клеточных линий значительно не отличались от векторной клеточной линии КА-0 (табл. 6). Так же было показано, что реком-бинантный белок VaCDPK3aSFl не обладает киназной активностью, что в свою очередь объясняет отсутствие каких-либо изменений в клеточных характеристиках VaCDPK3aSFl-трансгенных клеток винограда амурского (рис. 2). Также нами отмечено, что белковые продукты генов VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 обладают киназной активностью и не проявляют сродства к катионам Са2+ (рис. 2). Наличие ферментативной активности у белковых продуктов укороченных транскриптов VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 обуславливает схожий эффект увеличения прироста биомассы клеток, сверхэкспрес-сирующих полноразмерный ген VaCDPK3a, и увеличения прироста биомассы клеток, трансгенным по укороченным вариантам VaCDPK3aSF2 и

УаСБРКЗа^З (табл. 6).

Также ранее было показано, что все короткие варианты транскриптов УаСИРК]е имеют канонические сайты сплайсинга (БцЬгоута et а1., 2014). Выявлено, что короткие транскрипты УаСВРК1е§Р1 и УаСВРК1е$Р2 были получены в ходе сплайсинга экзона, а транскрипт УаСОРК1еЯР1 в результате альтернативного 5' вырезания экзона, что привело к сдвигу рамки считывания и, поэтому белковый продукт УаСОРКЛеЯП в своей аминокислотной последовательности содержал только N-терминальных домен (ОиЬгоуша е1 а1., 2014). Стоит отметить, что полученные короткие варианты транскриптов УаСБРК1е не являются артефактом ОТ-ПЦР, о чем свидетельствуют результаты эксперимента с термоустойчивой ревертазой (ОиЬгоуша е1 а1., 2014). Нами было показано, что сверхэкспрессия всех коротких вариантов транскриптов УаСОРК1е приводит к достоверному увеличению прироста сырой и сухой биомассы клеток относительно векторной и трансгенной по полной форме гена УаСБРК1е клеточных линий У. атигеж'к УаСБРКЗаБРЗ (табл. 6). По всей видимости, короткие транскрипты вовлечены в регуляцию роста клеток винограда, но в настоящее время мы затрудняемся объяснить механизм данного эффекта, поскольку для этого требуются дальнейшие исследования.

Таким образом, в нашей работе впервые показана связь биосинтеза резве-ратрола с кальциевой сигнальной системой растений через экспрессию генов Са2+-зависимых протеинкиназ. Полученные результаты открывают перспективу использования индивидуальных СОРК в качестве регуляторов накопления биомассы клеток и биосинтеза биологически активных стильбенов в клетках V. атигет1$, что представляет высокий интерес для биотехнологических исследований. Также показано, что отсутствие функционально значимых субдоменов киназного домена приводит к потере ферментативной активности белка СОРК, в то время как наличие всего 65% киназного домена не является лимитирующим фактором для киназной активности СОРК. Эффект увеличения прироста сырой биомассы клеток сверхэкспрессирующие короткие формы транскрипта УаСОРК1е, которые являются результатом альтернативного канонического сплайсинга, открывают новую область изучения роли сплайсированных форм генов в регуляции жизнедеятельности клетки.

выводы

1. Установлено, что в клеточных линиях V. amiirensis, которые отличаются повышенной продукцией резвератрола, при добавлении блокатора потенциал-зависимых каналов плазматической мембраны VER или ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ W7 наблюдается достоверное уменьшение продукции резвератрола в 4.4-9.8 раз, ингибирование экспрессии генов STS и некоторых генов CDPK. При добавлении в питательные среды ионофора кальция А23187 в культуре клеток винограда V2 наблюдается увеличение продукции резвератрола в 2.7 раза, а также увеличение экспрессии генов STS и CDPK.

2. Сверхэкспрессия гена VaCDPK3c в полученных линиях V. amurensis достоверно увеличивает в 8.8-67.8 раза (до 34 мг/л) продукцию резвератрола по сравнению с контрольной векторной клеточной линией винограда. Увеличение продукции идет за счет значительного увеличения биосинтеза резвератрола в клетках винограда.

3. Показано, что гены VaCDPKla и VaCDPK3a являются позитивными регуляторами клеточного роста, поэтому их сверхэкспрессия увеличивает продукцию резвератрола 1.4-1.9 раза посредством увеличения прироста биомассы. В VaCDPKIe, VaCDPKld, VaCDPK2a-vpü\\cre\iuux клеточных линиях продукция резвератрола была выше в 1.2-4.8 раза за счет небольшого увеличения прироста биомассы клеток и увеличения содержания резвератрола.

4. Показано, что полноразмерный рекомбинантный белок VaCDPK3a обладает Са2+-зависимой протеинкиназной активностью, в то время как его укороченные варианты либо не фосфоршшруют гистон Hl (VaCDPK3aSFl), либо не проявляют сродства к катионам Са2+ (VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3).

5. Сверхэкспрессия VaCDPK3aSFl не влияет на клеточные характеристики культуры клеток винограда, в то время как влияние сверхэкспрессии VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 кореллируют с влиянием сверхэкспрессии полноразмерного гена VaCDPK3a на клеточные характеристики в клетках V. amurensis. Сверхэкспрессия всех коротких вариантов транскрипта VaCDPKIe приводит к достоверному увеличению прироста сырой и сухой биомассы клеток относительно векторной и трансгенной по полной форме гена VaCDPKIe клеточных линий V amurensis.

Список работ по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах из списка ВАК РФ:

1. Shumakova O.A., Manyakhin A.Y., Kiselev K.V. (2011) Resveratrol content and expression of phenylalanine ammonia-lyase and stilbene synthase genes in cell cultures of Vitis amurensis treated with coumaric acid // Appl Bio-chem Biotechnol, 165:1427-1436.

2. Kiselev K.V., Shumakova О.A., Manyakhin A.Y., Mazeika A.N. (2012) Influence of calcium influx induced by the calcium ionophore, A23187, on resvera-trol content and the expression of CDPK and STS genes in the cell cultures of Vitis amurensis И Plant Growth Regul, 68:371-381.

3. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Shumakova O.A., Karetyn Y.A., Manyakhin A.Y. (2013) Structure and expression profiling of a novel calcium-dependent protein kinase gene CDPK3a, in leaves, stems, grapes, and cell cultures of wild-growing grapevine Vitis amurensis Rupr. // Plant Cell Rep, 32:431-442.

4. Шумакова O.A., Киселев K.B. (2013) Влияние экспрессии гена PgCDPK2dsl на содержание резвератрола в клеточных культурах винограда амурского Vitis amurensis Rupr. // Вестник КРАСГАУ, 1:50-53.

5. Киселев К.В., Шумакова О.А., Маняхин А.Ю. (2013) Влияние предшественников фенольных соединений растений на биосинтез резвератрола в культурах клеток винограда амурского Vitis amurensis Rupr. // Прикладная биохимия и биотехнология, 49(1):61-66.

6. Шумакова О.А., Дубровина А.С., Киселев К.В. (2013) Влияние бло-катора потенциал-зависимых Са2+-каналов (верапамил) на биосинтез резвератрола и экспрессию генов CDPK в культуре клеток винограда амурского Vitis amurensis Rupr. // Вестник КРАСГАУ, 6:124-130.

7. Kiselev K.V., Shumakova О.А., Manyakhin A.Y. (2013) Effects of the calmodulin antagonist W7 on resveratro! biosynthesis in Vitis amurensis Rupr. // Plant Mol Biol Rep, 31:1569-1575.

8. Aleynova-Shumakova O.A., Dubrovina A.S., Manyakhin A.Y., Karetin Y.A., Kiselev K.V. (2014) VaCPK20 gene overexpression significantly increased resveratrol content and expression of stilbene synthase genes in cell cultures of Vitis amurensis Rupr. // Appl Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s00253-014-5625-7.

9. Dubrovina A.S., Aleynova O.A., Kiselev K.V., Novikova G.V. (2014) True and false alternative transcripts of calcium-dependent protein kinase CPK9 and CP КЗ a genes in Vitis amurensis И Acta Physiol Plant, DOI 10.1007/sl 1738014-1547-3.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных научных конференциях и симпозиумах:

10. Шумакова О.А., Киселев К.В. (2010) Влияние кумаровой кислоты на экспрессию генов фенилаланин-аммиак-лиаз, стильбен синтаз и содержание резвератрола в культуре клеток Vitis amurensis II XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. С. 80.

11. Шумакова О.А., Киселев К.В. (2011) Воздействие активатора кальциевых каналов на содержание резвератрола, экспрессию генов Са2+-зависимых протеинкиназ и стильбен-синтаз в культурах клеток винограда Vitis amurensis II X региональная конференция студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток. С. 304.

22

12. Шумакова O.A., Дубровина A.C., Киселев K.B. (2011) Участие Са2+-сигнальной системы в биосинтезе резвератрола в культурах клеток Vitis amurensis II Третий международный симпозиум "Клеточная сигнализация у растений". Казань. С. 223-224.

13. Шумакова O.A., Киселев К.В., Дубровина A.C., Новикова Г.В.

(2012) Протеинкиназная активность полноразмерной Са2+-зависимой протеинкиназы CDPK3a винограда Vitis amurensis и ее транкированных вариантов II Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии. Владивосток. С. 320-323.

14. Шумакова O.A., Киселев К.В. (2012) Влияние экспрессии гена PgCDPK2dsl на продукцию резвератрола в клетках винограда амурского Vitis amurensis Rupr. II XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ. Владивосток. С. 67.

15. Киселев К.В., Дубровина А.С, Тюнин А.П., Шумакова O.A. (2012) Регуляция биосинтеза резвератрола в клеточных культурах дикого винограда Vitis amurensis Rupr. II VIII международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва. Том 1. С. 310-311.

16. Шумакова O.A., Киселев К.В. (2012) Влияние предшественников фенольных соединений растений на продукцию резвератрола в культуре клеток винограда амурского Vitis amurensis Rupr. II VIII международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва. Том 1. С. 498-501.

17. Шумакова O.A., Киселев К.В., Дубровина A.C. (2012) Регуляция биосинтеза резвератрола генами CDPK в клетках винограда амурского Vitis amurensis Rupr. II V международная школа молодых ученых по молекулярной генетики «Непостоянство генома». - Москва - Звенигород. Том 1. С. 73.

18. Шумакова O.A., Дубровина A.C., Киселев К.В. (2013) Влияние ингибитора Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK) W7 на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов стильбен-синтаз и CDPK в клеточных культурах винограда Vitis amurensis II I Межрегиональная молодежная школа-конференция "Актуальные проблемы биологических наук». — Владивосток. С.322-324.

19. Киселев К.В., Дубровина A.C., Шумакова O.A. (2013) Регуляция биосинтеза резвератрола в культурах клеток винограда Vitis amurensis Rupr. с помощью генов кальций-зависимых протеинкиназ // X Международная конференция "Биология клеток растений in vitro и биотехнология", Казань, 14-18 октября, С. 171-172.

20. Дубровина A.C., Шумакова O.A., Христенко B.C., Киселев К.В.

(2013) Влияние сверхэкспрессии сплайсированных форм гена VaCDPK3a на рост и морфологию клеточных культур винограда амурского Vitis amurensis Rupr. II X Международная конференция "Биология клеток растений in vitro и биотехнология", Казань, 14-18 октября, С. 225-226.

Алейнова Ольга Артуровна

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА РЕЗВЕРАТРОЛА ГЕНАМИ Са2+-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В КЛЕТКАХ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО VITIS AMURENSIS RUPR.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 17.07.2014 г. Формат 60 х 84/16. Усл. печ. л. 1.0. Уч. изд. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ №. 27 Отпечатано в типографии ООО «ТРИО». Владивосток, Пограничная 22а.