Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффект гена ROL с AGROBACTERIUM RHIZOGENES на гормональный баланс и морфологические показатели трансгенных растений земляники садовой и актинидии коломикты

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Эффект гена ROL с AGROBACTERIUM RHIZOGENES на гормональный баланс и морфологические показатели трансгенных растений земляники садовой и актинидии коломикты"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. 1У1. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ

ЭФФЕКТ ГЕНА ROL С AGROBACTERIUM RHIZOGENES НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ И АКТИНИДИИ

КОЛОМИКТЫ.

специальность: 03. 00. 12- физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА, 1998

Работа выполнена в лаборатории «Станция искусственного климата «Биотрон» филиала Института биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Пущино.

Научные руководители:

доктор биологических наук Бурьянов Я. И. кандидат сельскохозяйственных наук Долгов С. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Шемякин М.Ф. доктор биологических наук Носов А. М.

Ведущая организация:

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Защита состоится: « 10 » бра и л 1998 г. в часов на заседании

Специализированного совета К 053 05 14 при Биологическом факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет, ЭЗ*/

Автореферат разослан «сГ » бар Л 1998 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Полесская О. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ,

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время в селекции сельскохозяйственных >астений всё большее значение приобретают генно-инженерные методы. Они дают юзможность переносить в растения и обеспечивать экспрессию чужеродных генов без нарушения генетической целостности сорта, что открывает перспективы для создания £орм сельскохозяйственных растений с уникальными свойствами.

Земляника садовая (Fragaria ananassa Объявляется важнейшей ягодной (ультурой многих стран с умеренным климатом. Несмотря на то, что известно множество гортов земляники, в России до сих пор почти отсутствуют сорта интенсивного типа, сочетающие высокую стабильную урожайность с устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам (Зубов, Попов, 1995). Это обусловлено, в значительной степени, исчерпанностью генетических ресурсов вида, недостатком фундаментальных знаний в области генетики, физиологии и биохимии земляники. Поэтому задача разработки новых методов селекции этой культуры является весьма актуальной.

Важной задачей в селекции плодовых и многих ягодных растений является создание слаборослых форм с компактным габитусом (Седов, 1995). Первичные молекулярно-биологические и физиологические механизмы, определяющие развитие характерного для каждого виде или сорта габитуса, детально еще не изучены. Тем не менее, уже сейчас генетическая инженерия открывает возможности для создания форм с изменённым габитусом, в частности путем переноса в растения генов, модифицирующих их гормональный статус, например, генов rol Agrobacterium rhizogenes. Удобным модельным объектом для такого рода исследований может быть актинидия коломикта. Актинидия коломикта (Actinidia kolomicta) является лианой, и морфологические изменения надземной части, вызванные экспрессией rol генов, вероятно будут особенно четко проявляться на этом объекте.

Генетическая инженерия позволяет не только улучшать существующие сорта сельскохозяйственных растений, но и является мощным инструментом для проведения фундаментальных исследований в области молекулярной генетики, физиологии и биохимии растений. Разработка методов генетической трансформации земляники садовой и актинидии коломикты позволит не только совершенствовать сорта этих культур, но и будет способствовать изучению фундаментаге>ных аспектов их биологии.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью нашей работы являлось получение трансгенных растений земляники садовой и актинидии коломикты, трансформированных геном rol С Agrobacterium itiizogenes, а также изучение некоторых особенностей морфологии и гормонального статуса полученных трансформантов. Исходя из

поставленных целей, нами решались следующие задачи: 1) разработать методику регенерации растений земляники садовой из листовых эксплантов и оценить регенерационный потенциал некоторых ценных сортов; 2) отработать методику культивирования in vitro и регенерации растений актинидии коломикты из различных соматических тканей; 3) разработать эффективную методику агробактериальной трансформации листовых эксплантов земляники садовой и актинидии коломикты, в том числе изучить вирулентность различных штаммов A. tumefaciens и A. rtiizogenes, подобрать бинарные векторные системы, оптимизировать условия трансформации с целью обеспечить наибольшую эффективность переноса чужеродных генов в геном изучаемых растений; 4) получить трансгенные растения земляники садовой и актинидии коломикты, экспрессирующие ген rol С A. rtiizogenes; 5) изучить некоторые особенности морфологии и гормонального статуса растений земляники и актинидии, трансформированных геном rol С, в частности содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК а органах rol С-трансформантов актинидии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Изучен регенерационный потенциал 6 перспективных сортов земляники. Определены штаммы А. tumefaciens, характеризующиеся высокой вирулентностью для земляники и актинидии, оптимизированы условия процедуры агробактериальной трансформации. Впервые получены трансгенные растения земгпники сорта Фейерверк и актинидии коломикты, трансформированные геном го! С A. rtiizogenes, и изучены их некоторые морфологические особенности. Впервые изучено содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК в растениях актинидии коломикты, трансформированных геном rol С. Показано стабильное изменение гормонального статуса rol С- трансформантов актинидии по сравнению с нетрансформированными растениями. Продемонстрирована возможность изменения габитуса надземной часта древесных растений посредством переноса в их геном гена rol С A. rtiizogenes Разработанная нами эффективная методика агробактериальной трансформации земляники садовой и актинидии коломикты может быть использована для переноса в и> геномы чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки, и для проведения фундаментальных исследований по биологии этих культур.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. Результаты работы апробированы нг международных симпозиумах: Plant Biotechnology and Molecular Biology. Seconc Symposium « Trends in Plant Biotechnology » (Russia, May 18-20, 1993, Пущино-на-Оке), 4" International Congress of Plant Molecular Biology (Amsterdam, June 19-24, 1994), Internationa Symposium « Plant Biotechnology and Genetic Engineering » (October 3-6, 1994, Kiev Ukraine), International Symposium on Engineering Plants for Commercial Products anc

г

Application (October 1-4, 1995, Lexington, Kentucky, USA), 10th FESPP Congress (September 9-13, 199S, Florence, Italy), 5th International Congress of Plant Molecular Biology (September 21-27, 1997, Singapore).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 157 страницах. Она включает: введение, 4 главы, выводы и приложения, 26 таблиц и 27 рисунков. Список литературы содержит 224 источника, в том числе 198 иностранных.

ОПУБЛИКОВАНИЕ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 15 статей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В наших экспериментах были использованы следующие сорта земляники: Рубиновый Кулон, Фейерверк, Урожайная ЦГЛ, Светлячок, Зенга-Зенгана и Холидей. Культуру земляники in vitro вели по методике, разработанной Boxus (1975).

Элитная форма актинидии коломикты была получена во ВНИИГиСПР им. И. В. Мичурина. Актинидию коломикту вводили в культуру in vitro по разработанной нами методике (Фирсов, Долгов, 1996). В экспериментах по размножению и укоренение актинидии были использованы полные и разбавленные в 2 раза среды Karada (1975), Кворина-Лепорье (Quorin et. al., 1977), WPM (Lloyd, McCown, 1981), содержащие БАП, зеатин, 2iP, ИМК и ГК в различных концентрациях.

В экспериментах по регенерации и трансформации земляники были использованы укоренённые на безгормональной среде растения. Маточные растения актинидии коломикты культивировали на среде Кворина-Лепорье, содержащей 1,0 мг/л зеатина и 1,0 мг/л ГК. Для регенерации брали кусочки (7x7 мм) самых молодых, полностью развернувшихся листьев. В экспериментах были использованы следующие среды: Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), Линсмайера-Скуга (Linsmaier, Skoog, 1965), В5 (Gamborg et. al., 1968), разбавленная в 2 раза среда N6 (Chu, 1975), содержащие различные концентрации БАП, зеатина, 2ÍP, ИМК, НУК и ИУК. В некоторых вариантах среды обогащали дополнительно гидролизатом казеина и азотнокислым калием.

Стеблевой каллус актинидии был получен из интернодапьных сегментов стебля, культивировавшихся на среде Кворина-Лепорье с 1,0 мг/л зеатина и 1,0 мг/л ГК. Для регенерации брали кусочки каллуса размером 5x5 мм, использовались те же среды, что и для регенерации из листовых эксгшантов.

Регенерацию земляники и актинидии вели в темноте при температуре 26°С, экспланты переносили на свежую среду с интервалом в 4 недели. Каждый эксперимент

з

продолжался в течение 3 пассажей. Эксперименты включали 3-4 повторносги (чашки Петри) и повторялись не менее 2 раз. Растения земляники и актинидии in vitro культивировали при следующих условиях: фотопериод-16/8 часов, температура- 25/22°С, освещенность- 3000-3500 локс (земляника) и 2500 люкс (актинидия).

В экспериментах по агробактериальной трансформации были использованы следующие штаммы: A. lumefariens- С58/С1 (вектор pGV3850neo), А281 (pTiBo542, вектор PPCV730), 8628 (pTi8628. pPCV730), В6 (рИВб, pPCV730), GV3101 (pMP90RK, векторы pPCV631, 701, 702, 730, pPCV002-CaMVC), LBA4404 (pAL4404, pBI121GUS); A. rtiizogenes-8196 (pRi8196, pPCV730), A4b (pRiA4b, pPCV730), A4abc (pRiA4abc, pPCV730). Векторы для трансформации растений переносили в различные штаммы A. tumefaciens и А. rhizogenes при помощи три родительских скрещиваний или методом прямого переноса (Скотт, 1988).

Для трансформадо« земляники и актинидии брали молодые, полностью развернувшиеся листья, которые разрезали на кусочки размером около 1 см2. После инкубации в бактериальной суспензии экспланты переносили на среду MS, содержащую 2,0 мг/л ИУК (земляника) или без неё (актинидия). Ко-культивацию эксплантов с агробаетериями вели при температуре 26°С до появления видимого бактериального роста на периферии эксплантов. После ко-культивации экспланты перекосили на среду регенерации и селекции трансформантов (MS) следующего состава: земляника- 5,0 мг/л БАП; 03 мг/л ИМК; актинидия- 3,0 мг/л зеатина. Среды содержали 500,0 мг/л цефотаксима и 50,0 мг/л канамицина или 10,0 мг/л гигромицинз, в зависимости от использовавшегося для трансформации вектора. Регенерацию трансформантов вели в темноте при температуре 26°С, длительность пассажа- 4 недели. Регенерировавшие побеги земляники и актинидии размножали на средах указанного выше состава, содержащих 50,0 мг/л канамицина или 10,0 мг/л гигромицина. Укоренение трансформантов земляники вели в присутствии канамицина или гигромицина (50,0 мг/л или 10,0 мг/л соответственно), трансформанты актинидии укореняли без антибиотиков.

Активность гена NPTII в каллусах и листьях трансгенных растений определяли по методике Staebell et Al. (1990) и Скотт и др. (1991), активность гена GUS- по Jefferson et. al. (1987). Содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК в органах rol С- трансформантов актинидии определяли с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (Иванова, 1994). Для анализов использовали наборы для определения фитогормонсв производства АО НПФ «Уралинвест», г. Уфа. Образцы собирали не менее чем с Зх растений каждой линии и усредняли Измерения проводили в трёхкратной аналитической повторносги, все -эксперименты по определению содержания фитогормонов повторяли 2 раза.

Для получения ДНК, пригодной для PCR- анализа, был использован модифицированный нами метод Deilaporta et al. (1985). Разрушенный в жидком азоте листовой материал экстрагировали 3-4 раза охлаждённым до -70°С ацетоном, затем ДНК выделяли по методу Deilaporta et. al. (1985). Полученный препарат ДНК дополнительно очищали при помощи додецилсульфата натрия и СТАБ с последующими экстракциями хлороформом при температуре 65°С.

Интеграция последовательности гена NPT II подтверждалась методом PCR. Реакцию амплификации вели в буфере следующего состава: 67,0 мМ Трис-HCI (pH 8,8); 6,0 мМ MgCI2; 0,2 мМ каждого dNTP; 0,2 мг/л БСА; 0,5% Нонидет NP40; 2,0 ед. Taq-полимеразы; 1,0 цд ДНК; 25,0 пкм каждого праймера. Режим амплификации для ДНК земляники: предварительная денатурация (100°С)- 2мин.; отжиг праймеров- 58°С, 1мин.; достройка цепей- 72°С, 1,5 мин.; количество циклов амплификации- 30. Для ДНК актинидии был использован тот же режим PCR, но температура отжига праймеров была увеличена до 59°С. Для амплификации последовательности гена NPT II использовали следующие праймеры: №367- 5'-tgctctgatgccgccgtgttcc-3' и №368- 5'-gcatgcgcgccttgagcctgg-З'. Продукты PCR анализировали при помощи электрофореза в 2% агарозном геле, длина амплифицируемого фрагмента 423 п.н.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ ИЗ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ.

Оптимальной средой для регенерации побегов из листовых эксплантов 6 изучавшихся сортов земляники является среда Мурасиге-Скуга (MS), содержащая 6-бензиламинопурин (БАП) и индолилмасляную кислоту (ИМК) в различных концентрациях. Среды Линсмайера-Скуга, В5, разбавленная в 2 раза среда N6; цитокинины 2iP и зеатин; ауксины ИУК, НУК, 2,4Д оказались неэффективными для регенерации этих сортов.

Наибольшим регенерационным потенциалом характеризовались сорта Фейерверк и Холидей (табл. 1). Сорта Урожайная ЦГЛ и Светлячок обладали умеренным регенерационным потенциалом, а сорта Зенга-Зенгана и Рубиновый Кулон- низким. Адвентивные побеги на эксплантах сорта Рубиновый Кулон регенерировали с частотой 6,7% только при замене ИМК на НУК.

Известно, что на регенерацию растений из соматических тканей существенное влияние оказывает соотношение концентраций ионов нитрата и аммония в среде. В наших экспериментах обогащение сред дополнительными количествами нитрата калия в концентрации до 2,0 г/л не привело к существенному возрастанию частоты регенерации листовых эксплантов изученных сортов. Необходимо отметить, что сорт Зенга-Зенгана не

регенерировал ни на одной из изученных сред, содержащих только фитогормоны. При внесении в среду регенерации 1,0 г/л КЫ03 наблюдалось образование адвентивных побегов, хотя и с низкой частотой- 4,0%.

Обогащение среды гидролизатом казеина привело х существенному увеличению частоты регенерации сортов Фейерверк и Холидей (более 90% зксплантов образовывали адвентивные побеги) и не оказало положительного влияния в экспериментах с сортами Рубиновый Кулон и Светлячок.

Табл. 1. Состав модифицированной среды МБ, оптимальный для регенерации побегов

из листовых зксплантов различных сортов земляники.

Сорт Концентрация гормонов, иг/л Гидролиэат казеина, мг/л КШз, мг/л Частота регенерации, % Среднее количество побегов на 1 регенерирующем экспланте

БАП ИМК НУК

Фейерверк 5,0 0,3 600 - 96,7 2,5

Холидей 4,0 0,3 - 300 - 93,3 2,1

Светлячок 5,0 0,5 - - - 60,0 1,2

Урожайная ЦГП 5,0 0,3 - - - 44,0 1,3

Рубиновый Кулон 2,0 - 0.2 - - 6,7 1,5

Зенга-Зенгана 4,0 1,0 - - 1000 4,0 1,0

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ И РЕГЕНЕРАЦИЯ АКТИНИДИИ КОЛОМИКТЫ ИЗ ЛИСТОВЫХ ЗКСПЛАНТОВ. Оптимальной для размножения женских растений актинидии коломикты является среда Кворина-Лепорье (01.), содержащая зеатин или БАП. Максимальный коэффициент размножения женских растений актинидии был получен на среде СИ, содержащей 1,0 мг/л зеатина и 1,0 мг/л ГК, а мужских- на разбавленной в 2 раза среде С1Ц содержащей 4,0 мг/л зеатина.

Наиболее подходящей средой для укоренения побегов актинидии коломикты является разбавленная в 2 раза среда 01, содержащая 0,1 мг/л ИМК. На среде этого состава 100% побегов образовывали корни в течение 3-4 недель культивирования независимо от пола растения.

Тип зкспланта не оказывал заметного влияния на регенерацию. Наилучшие результаты при использовании листовых зксплантов были получены при содержании в

б

среде МБ 5,0 мг/л зеатина. Обогащение среды ИМК и гидролизатом казеина увеличивало частоту регенерации побегов из сегментов стебля до уровня, наблюдавшегося в опытах с листовыми эксплантами (табл. 2).

Табл. 2. Регенерация побегов актинидии коломикты из листовых зксплантов и каллуса

стеблевого происхождения (среда МБ).

Гормоны, мг/л Гидролизат казеина, мг/л Тип эксплан-та Частота регенерации, % Количество побегов на 1 регенерирующем зкспланте

БАП НУК Зеатин ИМК

1,0 0,5 - - - лист 0 0

3,0 0,5 - - - лист 21,5±7,9 2,0+0,9

- - 1,0 - - лист 0 0

- - 3,0 - - лист 64,1±13,1 2,2+0,9

- - 5,0 - - лист 75,2+18,9 3,1±0,5

- - 3,0 - - стебель 15,0±11,0 1,0±1,0

- - 5.0 - - стебель 46,7г10,8 1.6±0,3

- - 5,0 0,1 - стебель 60,0+9,8 2,4+1,0

- - 5,0 - 300 стебель 50.0+17,1 2,2±1,1

- - 5.0 0,1 300 стебель 76,3±11,9 2,6±0,4

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ И АКТИНИДИИ КОЛОМИКТЫ. Эксперименты по генетической трансформации земляники проводились с сортом Фейерверк. Для оптимизации условий агробактериапьной трансформации этой культуры нами было изучено влияние различных концентраций ИУК в среде ко-культивации на частоту индукции каллусов, устойчивых к селективным антибиотикам.

ИУК в среде ко-культивации листовых эксплакгов с агробактериями в концентрации 2,0-2,5 мг/л обусловила тенденцию к заметному возрастанию частоты индукции канамицино- и гигромиуиноустойчивых каллусов- в 1,5-2,0 раза. Поэтому во всех последующих экспериментах по агробактериапьной трансформации земляники нами использовалась среда ко-культивации, содержащая 2,0 мг/л ИУК.

Для создания бинарной векторной системы, оптимальной для трансформации земляники, была изучена вирулентность ряда штаммов А. Ъдпе(айеп5 и А. тШодепеБ (табл.3).

Все изученные штаммы А. гМгодепеэ и коинтегративный вектор рв\/3850пео оказались слабовирулентными для земляники. Значительно более вирулентным оказался

7

штамм А. tumefadens GV3101. Трансформация листовых апеллянтов этим штаммом обеспечивала появление трансгенных каллусов более чем на 40,0% трансформированных эксплантов. Трансгенная природа полученных каллусов подтверждалась экспрессией в их клетках гена NPT II. Из полученных каллусов были регенерированы трансгенные побеги. Интеграция гена NPT II в геном земляники была подтверждена при помощи анализа геномной ДНК трансгенных растений методом PCR (рис. 1). Во всех изученных линиях ам-плифицировался фрагмент ожидаемой длины.

Наиболее эффективным для трансформации является супервирулентный штамм А. tumefadens А281, обеспечивший частоту трансформации, равную 2,6%. Интеграция гена NPT II в геном изученных трансгенных растений подтверждена PCR- анализом, (рис. 1).

Табл.3. Вирулентность различных штаммов А. tumefadens и А. rhizogenes для лис-

товых эксплантов земляники садовой.

Штамм агро-бактерий Vir- область Вектор Доля эксплантов с каллусами, растущими на селективной среде,% Регенерировало трансген-мых растений Частота трансформации, %

А. rhizogenes 8196 pRi8196 pPCV730 3,3±2,1 0 0,0±0,0

А rhizogenes А4Ь pRiA4b pPCV730 5,6+3,2 0 0,0±0,0

А rhizogenes A4abc pRiA4abc pPCV730 6,6±2,8 0 0,0+0,0

А. tumefadens С58 pTiC58 pGV3850 5,6±3,4 0 0,0±0,0

А. tumefadens В6 pTiB6 pPCV730 7,0+5,9 0 0,0±0,0

А. tumefadens GV3101 PMP90RK PPCV701 43,4±11,2 3 0,48±0,16

А. tumefadens GV3101 pMP90RK pPCV730 43,5±13,1 5 1,69±0,55

А. tumefadens А281 pTiBo542 PPCV730 55,6±13,1 6 2,59±0,89

* Среда для индукции каллуса и регенерации трансформантов содержала 50,0 мг/л

канамицина.

Конструкция бинарного вектора оказывала существенное влияние на частоту регенерации трансгенных побегов. Наибольшую частоту трансформации при использовании

как канамицина, так и гигромицина обеспечивал вектор рРСУ730. Другие изученные нами

векторы были менее эффективны.

аа

11

_ 910

£3 _ 659

<ut _ 521

_ 403

Рис. 1. РСИ-анализ трансгенных растений земляники. 1 и 9- рВИ322/А1и I,* 2, 3, 8- не-трансформированный контроль. 4-7-трансгенные растения земляники, трансформированные следующими штаммами: 4-СУ3101,рРСУ701,5,6-

123 45678 9 ^281, pPCV730, 7- GV3101, pPCV002-CaMVC. Длина амплифицируемого фрагмента- 423

1.Н.

Низкая частота трансформации (0,34%), полученная при использовании вектора DPCV002 может быть объяснена тем, что в этом векторе был клонирован ген rol С А. tilzogenes под контролем 35Б-промотора. Экспрессия этого гена ведёт к различным нарушениям морфогенетичесхи* процессов (Schmulling et. al., 1988,Spena et.al., 1989). Возможно. что низкая частота peí операции побегов земляники из трачсгонного каллуса обусловлена экспрессией этого гена в трансформированных клетках.

Необходимо отметить, что в листьях и корнях трансгенных растениях земляники активность неомицинфосфотрансферазы II не детектировалась. Однако во вторичных каллусах, индуцированных из листовых эксплантсв этих растений, активность гена NPT II легко обнаруживалась.

Наиболее подходящими эксплантами для трансформации актинидии коломикты являются кусочки листьев. Максимальная частота трансформации листовых эксплантов актинидии коломикты была получена при использовании коинтегративного вектора pGV3850neo. Штаммы L8A4404 (вектор рВ1121) и GV3101 (вектор pPCV702) трансформировали листовые экспланты актинидии с существенно меньшими частотами (табл. 4).

Рис.2. PCR-анализ трансгенных растений актинидии. 7-

pBR322/Alu Г 6- нетрансформиро-ванный контроль, 1-5-трансгенные растения актинидии, 1 2 3 4 5 6 7 следующих линий: 1- В125, 2- Bt44, 3- R101, 4- R2, 5- ВИЗ. Длина амплифицируемого фрагмента- 423 п.н.

Табл.4. Эффективность различных штаммов А. ЮтеГааепБ и типов эксплантов для генетической трансформации актинидии коломикты.

Вектор Штамм A. tumefaci-ens Эксллант Концентрация селективных антибиотиков, мг/л Доля эксплантов с каллусами, растущими на селективной среде,% Среднее количество каллусов на 1 экспланте Частота трансформации,0/» Регенерировано линий трансгенных растений.

Km Нуд

pGV3850::neo C58 лист 50,0 0,0 58,7±9,4 2,54+1,11 8,48 33

pGV3850::neo C58 стебель 50,0 0,0 0,0+0,0 0,0±0,0 0,0 0

pPCV730 A281 лист 50,0 10,0 23,0+17,9 2,04+0,76 2,46 7

pPCV730 A281 стебель 50,0 10,0 1,7+1,7 1,0±1,0 1,37 1

pPCV702 GV3101 лист- 50,0 0,0 2,1+1,9 1,0±1,0 1,77 2

pPCV002-CaMVC (ro! C) GV3101 лист 50,0 0,0 50,5+21,0 сплошной рост каллуса 135,6 110

pBI121 LBA4404 лист 50,0 0,0 18,7±16,7 2,60+1,21 2,06 3

Методом PCR показана интеграция последовательности гена NPT II в геном транс-нных растений. Во всех изученных линиях наблюдалась амплификация фрагмента жидаемой длины- 423 п.н. (рис. 2). В растениях, трансформированных вектором рВ1121, егко детектировалась активность ß-глюкуронидазы, как в клеточном экстракте, так и гис-эхимически в органах растений.

Необычайно высокая частота трансформации актинидии наблюдалась при ислоль-овании вектора pPCV002 с клонированным в нем геном rol С Aitiizogenes под контролем ильного констмтуитивного 355-промотора. После трансформации актинидии геном rol С, оличество адвентивных побегов, возникающих на 1 регенерирующем экспланте, возрос-о в среднем до 17, что определило очень высокую частоту трансформации. Всего было олучено 110 линий актинидии, трансформированной геном rol С.

По данным многих исследователей (Schmulling et. al., 1988;Spena et.al., 1939;) экс-рессия гена rol С вызывает существенные изменения в содержании эндогенных фито-зрмонов и I или чувствительности клеток к ним. Влияние этих изменений на процессы ре-энерации определяется генотипом растения и гормональным составом среды. Возмож-о, что противоположный эффект гена rol С на частоту трансформации земляники и акти-идии обусловлен особенностям;! их систем рецепции-трансдукции гормонального сигна-а или различиями в уровнях эндогенных гормонов, оптимальных для регенерации.

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ROL С A. RH1ZOGENES НА МОРФО^ИЗИОЛС-ИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ И АКТИНИДИИ, 'астения земляники, трансформированные геном rol С, по своим морфологическим па-аметрам резко отличались от нетрансформированных растений, или растений, транс-зормированных только селективными генами (табл.5). Rol С- трансформанты земляники мели увеличенное количество листьев по сравнению с контрольными растениями, одна-э по общей площади листовой поверхности достоверно не отличались от них. Уменьше-ие длины черешка и увеличение количества листьев у трансформантов обусловило ком-актный габитус их надземной части, которая имела полусферическую форму. Листовые ластинки трансгенных растений по форме не отличались от контрольных и имели слабо ыраженную гофрированностъ, характерную для rol С-трансформантов.

Экспрессия гена rol С обусловила существенные изменения в развитии генератив-ых органов. Трансформированные растения имели в среднем в 3 раза большее количе-тво укороченных цветоносов, чем контрольные. Среднее количество цветхов, приходящееся на 1 цветонос, у трансгенных растений было существенно меньше, чем у кон-рольных, поэтому по суммарному количеству цветков они достоверно не различались, [ветки, развивающиеся на цветоносах rol С-трансформантов, по сравнению с контролем мели меньшие размеры, чашелистики их были крупнее, чем лепестки и выступали за

и

пределы последних. Чашелистики трансгенных растений частично срастались между со бой, их края были сильнее изрезанны, лепестки были мельче и имели зеленоватый отте нок, особенно сильно выраженный в их апикальной части. Тычинки в цветках трансгенньн растений имели в 3-4 раза более короткие тычиночные нити; пыльники в них почти при-

Табл. 5. Морфологические особенности растений земляники садовой, трансформи рованных геном rol С.

Морфологические Линия

показатели Контроль rol С- трансформант

Высота растений, см 12,9±1,5 10,2±0,5

Количество листьев на 1 растение, шт. 10,3±0,6* 29,4±2,9*

Длина черешка, см. 8,9±0,8* 6,1 ±0,4*

Площадь 1 листа,см2. 44,9±2,0 20,9±1,3

Площадь листовой поверхности 1 растения, см2. 457,0+14,0 622,8+84,1

Количество цветоносов на 1 растение, шт. 1,5+0,3* 4,5+0,5*

Длина цветоноса,см. 12,9±2,1 6,4±0,4

Количество цветков на 1 растение, шт. 9,3+1,4 8,0±1,0

Диаметр цветка, см. 2,7±0,1 1,6±0,1

Количество рожков на 1 растение, шт. 1,0±1,0 3,4±0,5

мыкали к завязи, имели меньшие размеры и часто были деформированы. Цветки н; трансгенных растениях отцветали на 3-4 дня раньше, чем на нетрансформированны контрольных, причем значительная часть бутонов (до 40%) не раскрывалась и в течени периода цветения отмирала. К концу периода цветения отмирало до 90% бутонов и цвеп ков rol С трансформантов. Оставшиеся цветки образовывали деформированные завязь Прямо на этих завязях наблюдалось прорастание семян. Прорастающие семянки имел зелёный цвет и образовывали 1-2 листочка, отчего завязи приобретали " мохнатый " вщ На этом этапе развитие завязей прекращалось, и они отмирали. Нормально развиты плодов на rol С- трансформантах не было получено, в то время как контрольные н< трансформированные растения образовывали нормальные плоды.

Растения земляники, трансформированные геном rol, С характеризовались пон! женной жизнеспособностью. В ходе перезимовки при температуре +5-7°С гибло до 50,0' растений, в то время как отмирания контрольных растений не наблюдалось.

Морфологические показатели полученных нами rol С- растений актинидии таю* существенно отличались от соответствующих показателей контрольных нетрансформ!

ванных растений (табл. 6). Это, в первую очередь, ослабление роста надземной части и ормирование кустовидного габитуса. Средняя высота трансгенных растений была в 2> раз меньше, чем контрольных. Rol С- трансформанты значительно уступали контроль->1м растениям и по суммарной длине ветвей.

Среднее количество разветвлений на 1 м суммарной длины ветвей в различных >ансгенных линиях актинидии достоверно больше, чем а контроле. Ослабление роста эдземной части у трансгенных растений сопровождалось укорачиванием междоузлий, эедняя длина междоузлий на ветвях первого порядка у rol С- трансформантов была в 2-8 аз меньше, чем у контрольных растений.

Табл. 6. Морфологические особенности растений актинидии коломикты, трансформированных геном rol С (возраст растений- 2,5 года).

Линия Средняя вы- Суммарная Средняя длина Среднее количество Габитус над-

сота расте- длина вет- междоузлий на вет- разветвлений на 1 м земной части

ний,см вей, см вях 1 порядка, см суммарной длины ветвей

онтроль 104,3 392,3 2,4 8,4 лиановидный

R1 55,0 251,6 1,4 16,3 кустовидный

R2 56. "5 302,0 1,2 10,9 кустовидный

R3 24,0 73,5 0,6 23,0 кустовидный

R6 24,0 53,1 0,6 24,5 кустовидный

R7 30,0 173,4 0,7 10,7 древовидный

R9 41,7 133,6 1,7 13,1 кустовидный

R10 54,9 179,2 1.3 13,9 кустовидный

R101 8,5 27,2 0,3 43,7 древовидный

На rol С- трансформантах актинидии формировались удлиненные листья с увели-(енным отношением длины к ширине и более бледной окраской по сравнению с контрольными. Отмечено запаздывание в наступлении фенофаз у rol С-трансформантов.

С целью изучения возможного механизма действия гена rol С нами было опреде-пено содержание некоторых фитогормонов в молодых листьях и апикальных частях побе-•ов трансгенных растений актинидии, растущих in vitro и в теплице (табл. 7). В условиях in /¡tro наблюдалось значительное увеличение содержания фитогормонов в молодых листьях трансгенных растений линии R2 по сравнению с контролем. Особенно резко возросла <онцентрация ИУК- почти в 10 раз. Содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида) и абсцизовой кислоты в листьях rol С трансформантов увеличилось соответственно в 5,0 и 7,0 раз по сравнению с контрольными растениями. Однако, несмотря

на такие большие различия в содержании эндогенных регуляторов роста, трансгенны растения не отличались по своим морфологическим показателям от контрольных.

При переходе от культивирования in vitro к выращиванию растений в теплице е апексах побегов rol С- трансформантов актинидии наблюдалось резкое уменьшение содержания активных форм цитокининов, одновременно происходило увеличение содержа ния ИУК и абсцизовой кислоты.

Табл. 7. Содержание и соотношение эндогенных фитогормонов в апексах побегов контрольных растений актинидии коломикты и rol С-трансформантов.

Линия Год Содержание фито- Соотношение концен- Фенотипические измене-

гормонов, нг/г траций фитогормонов ния

З+ЗР ИУК АБК З+ЗР/ИУК З+ЗР/АБК

IN VITRO

Контроль 1995 49,6 13,0 27,6 3.8 1.8 -

R2 1995 248,0 134,0 196,1 1,9 1,3 нет

IN VIVO

Контроль 1995 355,0 23,6 7,74 15,0 45,9 -

R2 1995 1,25 275,0 278,8 0,005 0,005 ослабление силы роста апикального

R14 1995 8,4 147,1 277,3 0,06 0,03 доминирования,

Контроль 1996 4,9 0,22 Н. 0. 22,3 н. 0. -

R2 1996 0,09 1,7 н.о. 0,05 н.о. ослабление силы роста апикального

R101 1996 0,05 7,5 . н.о. 0,007 н.о. доминирования,

н.о,- не определяли, 3- зеатин, ЗР- зеатин-рибозид

Некоторые фенотипические особенности го1 С- трансформантов различных раст ний напоминают определенные гормональные эффекты, в частности, увеличение сос ношения цитокининов к ауксинам (БсЬтиШпд е1 а!., 1988,Брела е1.а1., 1989). Черн! (1989), Шэзоп е1 а1. (1993), напротив, считают, что для растений, зкспрессирующих ген С, характерна тенденция к снижению концентрации активных цитокининов и их предшес венников, а не к их увеличению. Наши данные показали уменьшение содержания акп ных форм цитокининов в трансгенных растениях актинидии коломикты, растущих ¡п уп Наблюдавшееся нами резкое возрастание содержания ИУК в апексах может быть о<

овлено вторичными эффектами гена rol С и быть связанным с особенностями гормо-льной регуляции в растениях актинидии коломикгы.

Одним из объяснений механизма апикального доминирования является предполо-;ение об ингибировании прорастания латеральных почек ауксином, базипетально транс-ортирующимся из апексов побегов (Bangerth, 1989; Cline, 1991, 1994). Возможно, что величение содержания ИУК в трансформантах является ответом растения на усиление етвления побегов, вызванное геном rol С.

Имеются сообщения, что ИУК может индуцировать синтез ингибиторов, таких как йсцизовая кислота (Eliasson, 1975). Возможно, что увеличение содержания АБК в транс-енных растениях связано с увеличением содержания в их органах ИУК.

ВЫВОДЫ.

I. Разработана методика регенерации 6 сортов земляники садовой и охарактеризован их зегенерационный потенциал.

I. На основе методики регенерации целых растений земляники садовой разработан протокол агробактериальной трансформации листовых эксплантов этой культуры и установ-пено, что бинарный вектор pPCV730 в составе супзрэирулентного штамма A. tumefaciens \281 является наиболее эффективным и сбеспе- явает частоту трансформации земляники, равную 2,59%.

3. Разработана методика микроклонального размножения женских и мужских побегов актинидии коломикгы и её регенерации из листовых и стеблевых эксплантов.

4. Разработан протокол агробактериальной трансформации листовых эксплантов актинидии коломикгы и установлено, что коинтегратавный вектор pGV3850 в клетках A. tumefaciens является наиболее эффективным и обеспечивает частоту трансформации актинидии, равную 8,48%.

5. Получена 21 линия земляники садовой сорта Фейерверк и 20 линий актинидии коломикгы, трансформированных различными агробактериальными векторами. Исследована пригодность различных генетических маркеров для отбора трансформантов и изучены морфологические признаки и особенности роста трансформантов в условиях теплицы.

6. Получены трансгенные растения земляники садовой и актинидии коломикгы с геном rol С A. rhizogenes. Проведён морфолого-биохимический анализ полученных трансформантов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Фирсов А. П., Долгов С. В. 1992. Регенерация земляники из листовых дисков. // Бюллетень научной информации ЦГЛ им. И. В. Мичурина, вып. 51, 29-33, г. Мичуринск.

2. Долгов С. В., Фирсов А. П., Бурьянов Я. И. 1992. Разработка методов генетической трансформации плодовых и ягодных культур с целью получения трансгенных растений. // Тезисы докладов II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ноябрь-декабрь 1991 г., Пущино-на-Оке), 178-179, г. Москва.

3. Фирсов А. П., Долгов С. В. 1993. Регенерация актинидии коломикты из листовых и стеблевых эксплантов. // Краткие тезисы докладов областной научно-производственной конференции "Повышение эффективности сельскохозяйственного производства: опыт и проблемы". 25-26 ноября 1992 г., 43-45. Мичуринск, 1993.

4. Фирсов А. П., Долгов С. В., Бурьянов Я. И. 1993. Генетическая трансформация земляники садовой Fragaria ananassa. // Plant Biotechnology and Molecular Biology. Second Symposium "Trends in Plant Biotechnology". Russia, May 18-20,1993. p. 55. г. Пущино.

5. Фирсов А. П., Степанова В. И., Долгов С. В. 1993. Разработка методов регенерации и генетической трансформации Actinidia kolomicta. // Plant Biotechnology and Moleculai Biology. Second Sympc^um "Trends in Fiant Biotechnology". Russia, May 18-20,1993. p. 56 г. Пущино.

6. Dolgov S. V., Firsov A. P., Buryanov Ya. I. 1994. Development of methods for genetic transformation of fruit and berry cultures. // Abstracts 4th International Congress o! Plan Mclecular Biology. Amsterdam, June 19-24,1994, p. 2042.

7. Dolgov S. V., Firsov A. P.. Filippenya V. L„ Skryabin K. G. 1994. Development of the method! for genetic transformation of fruit and Ьегту cultures. // Abstracts of International Symposiun "Plant Biotechnology and Genetic Engineering". October 3-6,1994, Kiew, the Ukraine, p. 14.

8. Firsov A. P., FilippenyaV. L., Dolgov S. V. 1995. Genetic transformation of Ьегту cultures. Abstracts of International Symposium on Engineering Plants for Commercial Products an Applications. October 1-4,1995. Lexington, Kentucky, USA, p. 18.

9. Фирсов А., Долгов С. В. 1996. Микроклональное размножение Actinidia kolomicta (Rupr Maxim. II Методы эффективного ведения садоводства, 132-137, г. Мичуринск.

10.Firsov А. P., Ivanova Е. P., Dolgov S. V. 1996. Effect of expression of rol С gene from / rhizogenes on morphological parameters and content of endogenous phytohormones transgenic plants of Actinidia kolomicta. //10th FESPP congress. Florence, Italy. Septemb 9-13,1996. p. 207.

. Dolgov S. V., Firsov A. P., Filippenya V. L., Skryabin K. G. 1996. Genetic engineering for improvement frost and herbicide resistance of fruit and berry crops. // 10th FESPP congress. Florence, Italy. September 9-13,1996. p. 305.

!. Firsov A. P., Mitiouchkina T. Yu., Ivanova E. P., Dolgov S. V. 1997. Effect of expression of rol C gene from A. rhizogenes on morphological parameters and content of endogenous phytohormones in transgenic horticultural crop. // 5,h International congress of Plant Molecular Biology. 21-27 September 1997, Singapore, Book of Abstracts, 867.

i. Dolgov S. V., Firsov A. P. 1997. Transgenic strawberry and sour-cherry (Cerasus vulgaris) plant with antifreeze protein from arctic fish. // 5th International congress of Plant Molecular Biology. 21-27 September 1997, Singapore, Book of Abstracts, 1254.

1.Dolgov S. V., Liebedev V., Firsov A. P., Tukavin G. B., Taran S. A. 1997. Fruit taste modification of horticultural crops by thaumatin II gene "ntroduction. // 5th International congress of Plant Molecular Biology. 21-27 September 1997, Singapore, Book of Abstracts, 1256.

S.Firsov A.P., Dolgov S.V. 1997. Agrobacterial transformation of Actinidia kolomicta. // Acta Horticulturae, Number447, p. 323-327.

)бъём 1 п.л.

Тираж 100

Заказ 3111

МГСХА. г. Мичуринск, Интернациональная, 101.