Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы

Моисеева, Елизавета Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы"

На правах рукописи

4854462

Моисеева Елизавета Михайловна

АНАЛИЗ ПЕРЕНОСА АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ Т-ДНК В ГЕНЕРАТИВНЫЕ КЛЕТКИ КУКУРУЗЫ

03.01.06 - оиотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ОЕЗ 2011

Саратов-2011

4854462

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Чумаков Михаил Иосифович

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Кочетов Алексей Владимирович

доктор биологических наук Богатырев Владимир Александрович

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится «16» февраля 2011 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайтах: http://www.ibpprn.saratov.ru/obyav.dis.html http://www.ibppm.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

В.Е. Никитина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Кукуруза является одной из важнейших зерновых культур в мире, ее ежегодное производство составляет около 700 млн. т. (http://www.rosinvest.com/dir/analysis/40/43/), в том числе в России около 3 млн. т. (http://www.newsru.com/russia/17jul2008/luzhkov). В настоящее время кукуруза используется в качестве кормовой и пищевой культуры, в промышленных целях используют материалы, полученные из кукурузного сырья. В связи с этим получение новых сортов кукурузы, обладающих необходимыми для этих целей признаками, является важной практической задачей. Одним из способов управления генетической изменчивостью организмов, используемых в селекционной практике, является генная инженерия. Получение трансгенных растений, несущих определенные признаки, при помощи методов генной инженерии - актуальное направление биотехнологии. Со временем возрастает роль трансгенных растений в производстве пищевых продуктов, медицинских и промышленных материалов (Daniell et al., 2001; Rabotyagova et al., 2009). Технология доставки функциональных генов в растительный геном в составе Т-ДНК (transfer DNA) агробактерий зарекомендовала себя как надежный способ получения трансгенных двудольных растений. Перенос Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens в клетки однодольных растений впервые зарегистрирован более двадцати пяти лет назад (Slogteren et al., 1984), в том числе в кукурузу в 1986 году (Graves, Goldman, 1986). Основные способы получения генетически-модифицированных растений на основе метода агробактериальной трансформации базируются на переносе Т-ДНК в культивируемые in vitro растительные клетки с последующей регенерацией трансформированных растений. Однако трансформация каллусных клеток имеет ряд ограничений и недостатков, процесс ее осуществления является трудоемким, длительным и затратным. Существенные трудности возникают при трансформации однодольных растений с низкой регенерационной способностью. Кроме того, трансформация однодольных растений с использованием A. tumefaciens происходит с меньшей эффективностью по сравнению с трансформацией двудольных. В связи с вышесказанным, особенно актуальной задачей является разработка методов трансформации однодольных растений без стадии культуры тканей. Поэтому ведется поиск нетрадиционных подходов для осуществления переноса агробактериальной Т-ДНК в однодольные растения, одним из которых может быть трансформация генеративных клеток. Половые клетки высших растений являются наиболее интересным объектом и инструментом для генетической трансформации. Их естественная способность передавать генетическую информацию следующему поколению может быть использована для внедрения фрагментов ДНК в растительный геном. Разработка способов генетической трансформации растений через генеративные клетки является актуальной задачей биотехнологии, способствующей решению, как фундаментальных проблем, так и прикладных задач генетики и селекции.

Цель диссертационной работы: изучение агробактериальной трансформации генеративных клеток кукурузы в условиях in planta.

Задачи исследования

1. Исследовать эффективность встраивания Т-ДНК штаммов A. tumefaciens LBA4404 и AGL0 в геном кукурузы (линии АТ-3, ЗМС, 3MCig, КМС, ЗМСП, гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго») при использовании метода агробактериальной трансформации в условиях in planta.

2. Определить эффективность трансформации генеративных клеток кукурузы при различных условиях.

3. Определить клетки-мишени для агробактериальной Т-ДНК.

4. Осуществить перенос функциональных генов (антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы и гена экстраклеточной рибинуклеазы циннии) в геном кукурузы методом агробактериальной трансформации в условиях in planta.

Научная новизна работы

Впервые показано, что использование технологии агробактериальной трансформации в условиях in planta позволяет получать инсерции Т-ДНК в геном кукурузы всех исследованных гибридных комбинаций и с использованием штаммов агробактерий с различными генетическими конструкциями.

Впервые для кукурузы показано, что клетками-мишенями для агробактериальной Т-ДНК при трансформации в условиях in planta служат клетки женского и мужского гаметофита.

Впервые показана инсерция агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы при температуре воздуха во время инокуляции кукурузы агробактериями выше 30 °С.

Научно-практическая значимость работы

В ходе работы получены доказательства инсерции в геном кукурузы Т-ДНК, несущей ген рибонуклеазы циннии и супрессор гена пролиндегидрогеназы. Показано, что инсерция Т-ДНК, несущей антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, сопровождается накоплением свободного пролина в тканях кукурузы. Полученные трансформанты могут быть использованы в дальнейшей работе по получению растений с повышенной устойчивостью к дефициту влаги и засолению.

Исследовано влияние температурного фактора на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях in planta, что позволяет предложить ряд мероприятий при проведении трансформации в условиях повышенных температур.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Обработка пестичных нитей кукурузы суспензией клеток агробактерий с активированными генами вирулентности позволяет получать трансгенные растения всех исследованных гибридных комбинаций при использовании штаммов А. tumefaciens, несущих различные генетические конструкции.

2. Перенос агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы в условиях in planta наблюдается в температурном диапазоне 18-35 °С.

3. Перенос агробактериальной Т-ДНК при трансформации в условиях in planta происходит в клетки женского и мужского гаметофитов кукурузы.

4. Встройка антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы в геном кукурузы сопровождается достоверным увеличением содержания свободного пролина в тканях проростков кукурузы.

Личный вклад диссертанта п результаты, полученные совместно с ругими исследователями

Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных кспериментальных данных по анализу встройки Т-ДНК в клетки женского и ужского гаметофитов кукурузы, экспрессии функциональных генов у кукурузы, а акже в описании и обработке полученных данных. Опыты по инокуляции растений ри трансформации кукурузы в условиях in planta, часть экспериментов по анализу кспрессии маркерных генов проведены при участии сотрудников лаборатории иоинженерии ИБФРМ РАН И.В. Волохиной, В.А. Беликова, что отражено в овместных публикациях. Планирование экспериментов, интерпретация кспериментальных данных, подготовка результатов к публикации проводились под уководством М.И.Чумакова

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН в течение 007-2010 гг. в рамках плановой темы НИР "Исследование переноса ДНК-белковых омплексов в эукариотические клетки", № госрегистрации 01200606182; научный уководитель - доктор биологический наук М.И. Чумаков. Исследования оддержаны грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках едеральной Программы «Исследования и разработки по приоритетным аправлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 оды» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы), шифр «2007-2.2-09-01-137», по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные летки кукурузы».

Публикации

По теме диссертации опубликованы 13 работ, в том числе 2 статьи в ецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, и 11 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания атериалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением обственных результатов, заключения, выводов и списка использованной итературы, включающего 276 источников. Диссертация изложена на 126 печатных траницах, содержит 19 рисунков и 14 таблиц.

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на: III Саратовском салоне зобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2007), школе-конференции по изико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века" (Уфа, 007), IV и V Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия заимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 008, 2010), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и иотехнология» (Пущино, 2008), III Международной школе молодых ученых Эмбриология, генетика и биотехнология» (Саратов, 2009), Всероссийской олодежной выставке-конкурсе прикладных исследований, изобретений и нноваций (Саратов, 2009), XXI Conference Maize and sorghum breeding in the enomic era (Bergamo, Italy, 2009), Международной научно-практической онференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 2009), Международной аучной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), АВ-

RMS PhD courses and symposium «Molecular Biotechnology Adaptation to Clima Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnolog (Mikkeli, Finland, 2010).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы A.tumefaciens: LBA4404, содержащ бинарный вектор pBi2E (в составе Т-ДНК - антисмысловая последовательность ге пролиндегидрогеназы арабидопсиса (АПГП) и маркерный г неомицинфосфотрансферазы (nptl!)); LBA4404, содержащий бинарный вект рА2069 (в составе Т-ДНК - маркерные гены nptll, gus-intron); AGL0, содержащ бинарный вектор pBi-RNS (в составе Т-ДНК - белок-кодирующая часть ге экстраклеточной рибонуклеазы (ZRNase II) циннии {Zinnia elegans) и маркерный г npt/Г); AGL0, содержащий вектор, полученный на основе E35S-eg#? (в составе ДНК - маркерные гены gfp и nptíf).

В работе использовали линии растений кукурузы селекции кафед генетики Саратовского государственного университета: ЗМСП (Зародышевь маркер саратовский пурпурный), АТ-3, ЗМС - Зародышевый маркер саратовски 3MCig - Зародышевый маркер саратовский (ig - indeterminate gametophyte), KMC Коричневый маркер саратовский, а также гибриды первого поколения (ФГ РосНИИСК «Россорго»).

Трансформацию кукурузы осуществляли в условиях in planta, как описано работе Чумакова с соавт. (2006), с модификациями. Отбор трансформант производили в поколении F0. Зерна проращивали на среде МС (Мурасиге и Скуга) добавлением канамицина (200 мкг/мл) в течение 7-8 дней и доращивали в грунте, зеленых, канамицин-устойчивых проростков выделяли тотальную ДНК подвергали ПЦР-анализу с праймерами на маркерные или функциональные гены.

Определение активности p-глюкуронидазы в листьях проростк кукурузы после трансформации проводили по методике, описанной в работе (Sh et al., 1993).

Определение экспрессии гена gfp в корнях проростков проводили флуоресцентном микроскопе (Carl Zeiss, Германия) при длине волны 355-425 нм.

Определение содержания свободного" пролина в тканях кукуруз определяли по методу, описанному в работе (Bates et al., 1973). Зерновки (опытные контрольные) проращивали на среде с канамицином (200 мкг/мл), высаживали грунт и обрабатывали 100 мМ раствором NaCl.

Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительн материале проводили, используя метод ПЦР-анализа на агробактериальные ге virCI и virC2 (Sawada et al., 1995).

Обработка данных. Частоту трансформации на початок определяли к среднее арифметическое % ПЦР-позитивных проростков на початках выбор Достоверность разницы между средними арифметическими двух выборочн совокупностей определяли при помощи коэффициента Стьюдента и критер Фишера. Эффективность трансформации рассчитывали как проце трансформированных ПЦР-позитивных проростков к числу семян, которые бы подвергнуты проращиванию на среде с канамицином.

Определение плоидности клеток кукурузы проводили на клетках кончи корня недельных проростков по методике, описанной в работе (Юдакова, 1999).

Трансформацию пыльцевых зерен кукурузы in vitro осуществляли, как описано в работе (Дун с соавт., 2007) с модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния различных факторов на частоту агробактериалыюй трансформации кукурузы в условиях in planta

В качестве факторов, оказывающих влияние на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях in planta, рассматривались температура обработки растений, способ и очередность нанесения агробактериальной суспензии и пыльцы на обрезанные пестичные нити кукурузы, линии кукурузы и штаммы агробактерий.

Частота трансформации кукурузы в условиях in planta при различной температуре

Обработку растений агробактериальным штаммом LBA4404, несущим в составе Т-ДНК АПГП и nptll, проводили в 2008 г. при температурах 28-29 °С и 30-31 °С (гибриды АТ-З/ЗМСП) и в 2009 г. при 33-35 °С (самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго»). Процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте семян статистически достоверно (р < 0,05) уменьшался при росте температуры - от 1,4 % при 28-29 °С до 0,3 % при 30-31 °С (табл. 1). В 2009 г. при температуре 33-35 °С трансформанты с использованием данного штамма агробактерий получены не были (табл. 1).

Таблица 1

Частота встраивания Т-ДНК с АПГП и прШ в геном кукурузы при _различной температуре___^_

———_____Температура (°С) Данные опытов " ----- 28-29 30-31 33-35

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 16/7 15/3 7/0

Зерна, использованные в опыте (шт.) 1890 1413 442

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 1425 984 192

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 178 101 8

ПЦР-позитивные проростки (шт.) / % ПЦР-позитивных проростков среди использованных в опыте зерновок 26/1,4 4/0,3 0

Процент ПЦР-позитивных проростков (%/початок), х±БЕ' 1,4^0,6 0,4±0,3 0

Примечание 1 — х~ ± БЕ — здесь и далее - средняя арифметическая ± стандартная ошибка; 2 -разница между эффективностями трансформации (% / початок) при 28-29 °С и 30-31 °С достоверна при (р < 0,05).

В опытах с использованием штамма АвЬО (в составе Т-ДНК маркерные гены прШ и обработку растений производили при температурах 24-27 °С в 2007 г. (гибриды АТ-З/ЗМСП и КМС/ЗМС) и 33-35 °С в 2009 г. (самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго»). Эффективность трансформации (процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен) в опытах со штаммом АСЬО составила 15,5 % (АТ-З/ЗМСП) и 12,7 % (КМС/ЗМС) в 2007 г. и 0,4 % в 2009 г. (табл. 2). Статистический анализ показал достоверность разницы между эффективностями трансформации в опытах, проведенных в 2007 г. при 24-27 °С и в 2009 г. при 33-35 °С (р < 0,01) (табл. 2).

Таблица 2

Частота встраивания Т-ДНК с генами и прШ в геном кукурузы при _различной температуре__

______ Температура (°С) Данные опытов ------ 24-27 33-35

Гибридная комбинация растений АТ-3/ ЗМСП КМС/ ЗМС СО гибриды1

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 8/5 9/9 11/2

Зерна, использованные в опыте (шт.) 84 188 755

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 56 87 667

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 26 35 41

ПЦР-позитивные проростки (шт.)/% ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен 13/15,5 24/12,7 3/0,4

Процент ПЦР-позитивных проростков (% / початок), х± Ж 11,9^±3,9 13,5±2,0 0,5±0,4

Примечание: 1 - самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго»; 2 - разница между эффективностями трансформации (%/початок) в опытах, проводимых при 24-27 °С в 2007 г. и 33-35 °С в 2009 г. достоверна (р < 0,05); 2 - разница между эффективностями трансформации (% / початок) гибридов АТ-З/ЗМСП и гибридов КМС/ЗМС не достоверна (р > 0,05) при использовании коэффициента Стьюдента, но достоверна (р <0,01) при использовании критерия Фишера.

При использовании штамма ЬВА4404 (в составе Т-ДНК векторной конструкции маркерные гены прШ и gus-intron) инокуляцию растений также производили при температурах 24-27 °С в 2007 г. (КМС/ЗМС) и 33-35 °С в 2009 г. (самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго»). Эффективность трансформации в 2007 г. составила 16,1%, а в 2009 г. - 4,8 % (табл. 3).

Таблица 3

Частота встраивания Т-ДНК с генами gus-intron и прШ в геном кукурузы

при различной температуре

----------- Температура (°С) Данные опытов ----_ 24-27 33-35

Гибридная комбинация КМС/ЗМС СО гибриды1

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 4/3 4/1

Зерна, использованные в опыте (шт.) 31 124

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 13 104

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 7 47

ПЦР-позитивные проростки (шт.) / % ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен 5/ 16,1 6/4,8

Процент ПЦР-позитивных проростков (% / початок), х±БЕ 16,72±6,8 2,9±2,9

Примечание: 1 - самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго»; 2 - разница между эффективностями трансформации (% / початок) в 2007 г. при 24-27 °С и в 2009 г. при 32-35 °С достоверна (р < 0,05).

Опыты с использованием штамма А. Ште/аает АСЬО (в составе Т-ДНК ген рибонуклеазы циннии и пр1П) проводили при температуре 32-33 °С и 18-20 °С в 2008 г.. Эффективность трансформации (процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерновок) при 32-33 °С составила 0,3 % (АТ-З/ЗМСП) и 1 % (ЗМаБ/КМС), при 18-20 °С - 3,9% (табл.4).

Таблица 4

Частота встраивания Т-ДНК с геном прШ и геном рибонуклеазы циннии

в геном кукурузы при различной температуре

--■———_____ Температура (°С) Данные опытов ___ 32-33 18-20

Гибридная комбинация АТ-3/ ЗМСП 3MCig/ KMC 3MCig /KMC

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 7/1 20/3 1/1

Зерна, использованные в опыте (шт.) 759 1320 128

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 524 929 91

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 77 120 11

ПЦР-позитивные проростки (шт.) /% ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен 2/0,3 14/1 5/3,9

Процент ПЦР-позитивных проростков (% / початок), J ± 0,2'±0,2 0,9±0,5

Примечание: 1 - разница между эффективностями трансформации (% / початок) гибридов АТ-З/ЗМСП и гибридов ЗМО'^МС не достоверна (р > 0,05) при использовании коэффициента Стьюдента, но достоверна (р <0,01) при использовании критерия Фишера.

При трансформации в условиях in planta не всегда возможен строгий контроль условий проведения опыта. При отсутствии возможности создания благоприятной температуры, этот важный для процесса агробактериальной трансформации фактор может варьировать в разные годы и сезоны. В наших исследованиях в опытах 2008 года при использовании агробактериального штамма LBA4404 (векторная конструкция, несущая в составе Т-ДНК АПГП и ген nptlî) и гибридной комбинации АТ-З/ЗМСП было показано, что увеличение температуры с 28-29 °С до 30-31 °С сопровождалось статистически достоверным снижением эффективности трансформации (табл. 1). Можно предположить, что именно фактор температуры послужил причиной существенного снижения частоты трансформации при использовании штаммов LBA4404 и AGL0 (табл. 2, 3) в опытах, проводимых в 2009 г. при 33-35 °С, по сравнению с эффективностью трансформации в 2007 г. при температуре 24-27 °С.

Появление трансформантов при температуре выше 28 °С в 2008 и 2009 гг. (табл. 1, 2, 3, 4) на первый взгляд противоречит литературным данным, поскольку множество проведенных исследований доказывают, что температура выше 28 °С критична для нескольких этапов агробактериальной трансформации: процесса экспрессии генов вирулентности и сборки белков вирулентности (Alt-Moerbe et al., 1988; Turk et al., 1991; Jin et al., 1993; Fullner, Nester, 1996a; Fullner, Nester, 1996b; Dillen et al., 1997; Lai, Kado, 1998). Однако инкубация культуры агробактерий и активация генов вирулентности в наших экспериментах происходили в лабораторных условиях (25-28 °С), а этапы трансформации, происходящие в

растительной клетке, могут быть не настолько термочувствительны. К тому же при трансформации в условиях in planta температура в вечерние и ночные часы была на несколько градусов ниже дневных.

По результатам проведенных исследований эффективность трансформации при температуре в диапазоне 24-27 °С оказалась выше, чем при 28-35 °С.

Зависимость эффективности трансформации от линии кукурузы и штамма агробактерий

В пределах экспериментов, проводимых при одинаковой температуре в один год, можно заметить, что трансформация разных линий кукурузы происходит с несколько различной эффективностью (табл. 2, 4). При использовании штамма агробактерий AGL0 (в составе Т-ДНК векторной конструкции - маркерные гены nptll и gfp) разница в эффективности трансформации различных гибридных комбинаций при 24-27 °С была статистически достоверной (р < 0,05) при использовании критерия Фишера, но не подтверждалась статистическим анализом по Стьюденту (р > 0,05) (табл. 2). При использовании штамма агробактерий AGL0 (векторная конструкция с геном ZRNase II и nptll) разница в эффективности трансформации различных гибридных комбинаций при 32-33 °С также была статистически достоверной (р > 0,05) при анализе с использованием критерия Фишера, но не достоверна при использовании коэффициента Стьюдента (табл. 4). Эффективность трансформации различных гибридных комбинаций может быть обусловлена генетическими или физиологическими особенностями (количество готовых к опылению цветков на початке, стадия развития цветка, состояние пыльцы) растений как материнских, так и отцовских линий.

Следует отметить, что штамм LBA4404, несущий векторную конструкцию с генами gus-intron и nptll, демонстрировал в среднем относительно более высокую частоту трансформации по сравнению с другими использованными штаммами на различных линиях кукурузы в разные годы. Эффективность трансформации кукурузы (КМС/ЗМС) в 2007 г. при температуре 24-27 °С агробактериальными штаммами AGL0 и LBA4404 (табл. 2, 3) статистически различалась при использовании критерия Фишера (р < 0,05). Трансформация кукурузы (самоопыленные гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго») этими же бактериальными штаммами в 2009 году при температуре 33-35 °С (табл. 2, 3) также происходила с различной эффективностью (р < 0,05 по Фишеру).

Частота встраивания Т-ДНК в геном кукурузы при различных способах нанесения суспензии агробактерий

Суспензию агробактерий наносили на обрезанные пестичные нити кукурузы двумя разными способами. В первом варианте 100 мкл суспензии наносили на пестичные нити при помощи пипетки. Во втором - при помощи распылителя в виде аэрозоля. В обоих случаях использовали суспензию штамма AGL0 с вектором pBiRNS, материнскую линию кукурузы 3MCig, отцовскую - КМС. Результаты опытов показали отсутствие статистически значимых различий (р > 0,05 по Фишеру и Стьюденту) в частоте трансформации для различных способов нанесения суспензии. При аэрозольном нанесении частота трансформации (процент ПЦР-положительных зерен на початок) составила 0,9±0,7, при нанесении при помощи пипетки -1,0±1,0.

Частота встраивания Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии A. tumefaciens на пестичные нити кукурузы

При трансформации кукурузы с использованием суспензии клеток агробактерий значительную роль играет взаимодействие бактериальной суспензии и пыльцевых зерен. Первую серию опытов проводили с использованием штамма LBA4404 с векторной конструкцией, несущей гены nptll и gus-intron. Пыльцу собирали с метелок и инкубировали с суспензией агробактерий в течение 40 минут при температуре 19-22 °С. Бактерии были ресуспендированы в среде с 5 % сахарозой (Clough, Bent, 1998), что обеспечивало оптимальное осмотическое давление для прорастающих пыльцевых зерен (Пухальский, 2007). В альтернативном методе суспензию клеток агробактерий в такой же инокуляционной среде наносили одновременно с пыльцой без проведения предварительной инкубации. Температура обработки растений в обоих случаях составляла 33-35 °С. Результаты опытов показали статистически незначимое (р > 0,05) увеличение частоты трансформации при проведении предварительной инкубации пыльцы и агробактериальной суспензии при температуре 19-22 °С (табл. 5).

Таблица 5

Частота встраивания Т-ДНК с генами и прШ в геном кукурузы

при различном порядке нанесения агробактериальной суспензии и _пыльцы на пестичные нити__

~ -—-—-_____Способ нанесения агробактерий Данные опытов ~---■—_____ I1 21

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 9/3 4/1

Зерна, использованные в опыте (шт.) 279 124

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 184 104

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 39 47

ПЦР-позитивные проростки (шт.) / % ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен 19/6,8 6/4,8

Процент ПЦР-позитивных проростков (% / початок), х±БЕ 3,6J±1,9 2,9±2,9

Примечания: 1 - одновременное нанесение пыльцы и суспензии агробактерий при 33-35 °С после предварительной совместной инкубации при 19-22 "С; 2 - одновременное нанесение пыльцы и суспензии агробактерий при 33-35 "С без предварительной совместной инкубации; 3 - разница в эффективностей трансформации при различном порядке нанесения агробактерий не достоверна (р > 0,05).

Во второй серии опытов использовали агробактериальный штамм АвЬО с вектором, несущим в составе Т-ДНК гены прШ и ^р. Суспензию клеток агробактерий и пыльцы (100) мкл наносили на обрезанные пестичные нити после совместной инкубации при температуре 19-22 °С. В альтернативных способах обработки агробактериальную суспензию (100 мкл) наносили на обрезанные пестичные нити до (за 30 мин.) или после (через 30 мин.) нанесения пыльцы. Данные опытов приведены в таблице 6.

Таблица б

Частота встраивания Т-ДНК с генами и прШ в геном кукурузы при различном порядке нанесения агробактериальной суспензии и пыльцы

на пестичные нити

~ -----_____^Способ нанесения агробактерий Данные опытов ------- I1 г1 З3

Початки в выборке (шт.) / початки в выборке, содержащие трансформированные зерна (шт.) 14/2 8/2 3/1

Зерна, использованные в опыте (шт.) 276 354 401

Проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 231 303 363

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином (шт.) 46 19 22

ПЦР-позитивные проростки (шт.) / % ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте семян 5/1,8 2/0,6 1 /0,2

Процент ПЦР-позитивных проростков (% / початок), х±8Е 3^2 0,6±0,4 0,3±0,3

Примечания: 1 - одновременное нанесение пыльцы и суспензии агробактерий при 33-35 °С после предварительной совместной инкубации при 19-22 °С; 2 - раздельное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии при температуре 33-35 °С: пыльцу наносили за 30 мин. до обработки агробактериями; 3 - раздельное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии при температуре 33-35 "С: агробактерии наносили за 30 мин. до пыльцы; 4 - разница между эффективностями трансформации (% / початок) при использовании методов 1 и 2 достоверна по Стьюденту (р < 0,05) и Фишеру (р < 0,01); 5 - разница между эффективностями трансформации (% / початок) при использовании методов 1 и 3 достоверна по Стьюденту (р < 0,05) и Фишеру (р < 0,01).

При проведении предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактерий 1,8% ПЦР-позитивных проростков было обнаружено от числа использованных в опыте семян (табл. 6). При раздельном нанесении на пестичные нити кукурузы пыльцы и агробактерий наблюдалась уменьшение эффективности трансформации - 0,6% при нанесении пыльцы за 30 минут до обработки агробактериями и 0,2 % при нанесении агробактериальной суспензии за 30 мин. до пыльцы (табл. 6), что подтверждается статистическими данными с использованием критерия Фишера (р < 0,01) и коэффициента Стьюдента (р < 0,05) (табл. 6). Однако очередность нанесения агробактерий и пыльцы оказалась фактором, не влияющим частоту трансформации.

В дальнейшем была изучена зависимость частоты встраивания Т-ДНК в геном кукурузы от температуры предварительной инкубации пыльцевых зерен и агробактериальной суспензии. Инкубацию пыльцы с суспензией клеток агробактерий штамма АОЬО (векторная конструкция с генами прШ и осуществляли, как описано ранее. В одной серии опытов инкубацию проводили при температуре обработки растений 33-35 °С, в другой - при температуре 19-22 °С. В обоих случаях наносили суспензию агробактерий и пыльцу при температуре 33-35 °С. Результаты опытов показали увеличение частоты трансформации при уменьшении температуры предварительной инкубации пыльцы с суспензией агробактерий при статистической обработке данных с использованием критерия

Фишера. При проведении инкубации при 19-22 °С эффективность трансформации составила 1,8 %, а при 33-35 °С - 0,7 %.

Таким образом, можно заметить, что одновременное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии на пестичные нити кукурузы или нанесение после проведения предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактериальных клеток предпочтительнее, чем нанесение по отдельности. Кроме того, проведение предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактерий при пониженной температуре (19-22 °С) способствует достижению большей эффективности трансформации, что особенно актуально в условиях температуры обработки растений выше 28 °С.

Анализ растительного материала на наличие агробактериальной ДНК

Для подтверждения истинности трансформации и того, что ткани ПЦР-позитивных растений не содержат агробактериальной ДНК, препараты растительной ДНК, давшие положительную ПЦР-пробу на переносимые гены, были проанализированы на наличие генетического материала из клеток А. Ыте/аает (участки генов ми-С1 и \irC2). Эти гены расположены вне области Т-ДНК на Т1-плазмиде и, следовательно, не способны к переносу в составе Т-ДНК. Анализ контаминации проводили среди случайной выборки половины всех ПЦР-положительных на маркерный или целевой ген образцов ДНК. Ни в одном из проанализированных образцов растительной ДНК соответствующего ПЦР-продукта зарегистрировано не было. Таким образом, контаминация растительных тканей агробактериями, которая могла бы привести к ложноположительным результатам ПЦР-амплификации, не была выявлена.

Определение экспрессии генов, перенесенных в составе Т-ДНК, в растениях кукурузы

Экспрессия гена прШ у растений кукурузы

аботе штаммы А.1ите/ас1ет содержали бинарные векторы с геном неомицинфосфотрансферазы (прМГ). Экспрессия гена при! была использована для проведения первичного отбора трансформантов после проращивания семян на среде с канамицином (200 мкг/мл) (рис. 1). В качестве контроля проращивали растения кукурузы тех же гибридных комбинаций, которые не подвергались инокуляции агробактериями. Процент проросших на среде с канамицином в течение 7-8 дней зерен в контроле и опыте был практически одинаковым.

Рис. 1 Селекция проростков кукурузы после предварительной инкубации на среде МС с канамицином (200 мкг/мл)

Количество ПЦР-позитивных на ген прШ растений среди зеленых проростков варьировало от 0 до 80 %. Обесцвечивание листьев опытных и контрольных

растений кукурузы происходило через 5-7 дней после проращивания на среде с канамицином или уже после высадки в грунт - от недели до двух месяцев роста.

Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы

Проростки кукурузы, выросшие из зерен после трансформации кукурузы в условиях in planta с использованием штамма A. tumefaciens LBA4404 (в составе Т-ДНК гены nptll и gus-intron), были проанализированы гистохимически на активность Р-глюкуронидазы. У большинства трансформированных растений окрашивались ткани вблизи среза и сосудистых пучков (рис. 2). В I >-* , " 2 отрицательном контроле (листья нетрансформи-

рованных растений) окрашивания не наблюдалось.

Рис. 2 Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы

1 - ПЦР-положительное на ген gus-intron растение; 1. контроль - растение, не подвергавшееся трансформации.

Экспрессия гена gfp в корнях кукурузы

Для анализа экспрессии репортерного гена gfp использовали фрагменты корней проростков, ПЦР-анализ тотальной ДНК которых выявил ген nptll. В качестве отрицательных контролей использовали растения, не подвергавшиеся трансформации. Интенсивность флуоресценции в

отрицательном контроле была заметно ниже (рис. 3).

Рис. 3 Флуоресценция белка GFP в корнях кукурузы

Флуоресцентная микроскопия (Carl Zeiss, Германия) при 5-кратном увеличении объектива, съемку производили камерой Canon А640, использовали фильтр с длиной пропускания 355-425 нм; 1 - корень растения, содержащего вставку Т-ДНК с геном gfp\ 2 - корень растения, не подвергавшегося трансформации.

Определение концентрации пролина у трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы

Имеется ряд исследований, связывающих признак устойчивости растений к неблагоприятным факторам (засуха, засоление, холод) с содержанием пролина в тканях растения, который активно синтезируется в ответ на стрессовые воздействия, выступая в качестве осмопротектора. Пролиндегидрогеназа является скорость-лимитирующим ферментом деградации пролина. Антисмысловой супрессор блокирует экспрессию пролиндегидрогеназы растения на уровне мРНК, таким образом, предупреждая деградацию пролина. В работе использовали штамм A. tumefaciens LBA4404, содержащий конструкцию pBi2E, в состав Т-ДНК которой входит последовательность участка гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации.

; ix—250 t i ï 200

J±1

Концентрацию пролина определяли в трансгенных растениях кукурузы гибридов линий АТ-3 и ЗМСП, ПЦР-анализ которых подтвердил присутствие в их

геноме антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы (табл. 1). В качестве отрицательного контроля использовали нетрансформированные растения гибридов тех же линий. Концентрация свободного пролина в контрольных растениях составляла от 48 до 78 мкг на 1 грамм сырой массы растения, в то время как концентрация пролина в ПЦР-позитивных растениях - от 152 до 310 мкг на 1 грамм сырой массы (рис. 4).

Номер растения 1 41 '

Рис. 4 Содержание свободного пролина в листьях проростков кукурузы.

1-3 — контрольные растения кукурузы (гибриды линий АТ-3 и ЗМСП), не содержащие антисмысловой последовательности гена пролиндегидрогеназы; 4-8 - ПЦР-положительные на антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы растения кукурузы (гибриды линий АТ-3 и ЗМСП); различия между опытными и контрольными образцом достоверны (р <0,01)

Таким образом, исследованные ПЦР-позитивные растения кукурузы имели статистически достоверное увеличение концентрации пролина в тканях листа (р < 0,01) по сравнению с контролем, что позволяет говорить о супрессии гена пролиндегидрогеназы в тканях трансгенных растений.

Определение клеток-мишеней для встраивания Т-ДНК

Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro

В методе агробактериальной трансформации растений в условиях in planta, возможна трансформация либо мужского, либо женского гаметофита. Для определения возможности агробактериальной трансформации мужского гаметофита (пыльцы) инкубацию пыльцы кукурузы с суспензией агробактерий производили in vitro. Использовали штамм агробактерий LBA4404 (в составе Т-ДНК маркерные гены nptll и gus-intron), и штамм AGL0 (в составе Т-ДНК маркерные гены gfp и nptll) и пыльцу кукурузы линии ЗМСП. Экспрессию маркерных генов наблюдали только в образцах, подвергшихся обработке A. tumefaciens (рис. 5).

щшттшШ,

'"V

<с

Рис. 5 Экспрессия гена gus-intron (черная стрелка, А) и gfp (белая стрелка, Б) в пыльцевых зернах кукурузы после трансформации A. tumefaciens in vitro.

Микроскоп Leika DM2500 (Швейцария), объективхЮ, камера Leika DFC 420 С.

Встраивание Т-ДНК в клетки пыльцевых зерен кукурузы, наблюдаемую в условиях in vitro, можно рассматривать как принципиальную возможность трансформации мужского гаметофита в условиях in planta.

Трансформация женского гаметофита кукурузы в условиях in planta

Для выяснения возможности трансформации женского гаметофита использовали линии кукурузы с высокой частотой появления матроклинных гаплоидов (растений, несущих только один материнский набор хромосом). В качестве материнских растений использовали диплоидную линию кукурузы АТ-3, а в качестве опылителя - диплоидную гаплоиндуцирующую линию ЗМСП. Гаплоиды при использовании линии-гаплоиндуктора ЗМСП образуются в результате нарушения завершающих стадий развития пыльцевой трубки при неспособности спермиев к нормальному слиянию с женскими ядрами (Еналеева с соавт., 1997). Растения обрабатывали суспензией клеток A. tume/aciens штамма LBA4404 (в составе Т-ДНК гены nptll и gus-introri). Среди зеленых проростков кукурузы были отобраны шестнадцать растений, которые по внешним признакам могли быть отнесены к гаплоидным формам. Микроскопический анализ клеток меристемы корней растений подтвердил у них наличие гаплоидного набора хромосом. ПЦР-анализ тотальной ДНК, выделенной из листьев гаплоидных форм кукурузы, показал наличие маркерного гена у части проростков. Поскольку ядро спермия не участвовало в оплодотворении яйцеклетки, наличие трансформированных гаплоидных растений кукурузы говорит о возможности доставки Т-комплекса в составе цитоплазмы пыльцевой трубки к зародышевому мешку без трансформации ядер спермиев. Трансформация ядер спермиев при этом не обязательна, но не исключена. При вхождении пыльцевой трубки в зародышевый мешок ее содержимое изливается в одну из синергид, а затем достигает яйцеклетки, при этом Т-комплекс, находящийся в пыльцевой трубке, возможно, также переносится в зародышевый мешок. Т-ДНК может проникать в какую-либо из клеток женского гаметофита, в том числе в яйцеклетку, или уже в зиготу после оплодотворения. Таким образом, трансформация кукурузы в условиях in planta происходит посредством мужского гаметофита, а клетками - мишенями могут быть и спермий, и яйцеклетка.

Анализ наследования инсерций Т-ДНК во втором поколении у кукурузы

Трансгенные растения поколения Fo, полученные из зерен после трансформации в условиях in planta материнских растений были доведены до взрослого состояния в лабораторных условиях. После самоопыления от растений F0 были получены зерна, которые проращивали на среде с канамицином. Зеленые и белые растения поколения F, проанализировали методом ПЦР на наличие гена nptll. Было получено 3 початка (№1, №2, №3), с числом зерен 7, 7 и 15 соответственно. Необходимо заметить, что из-за разновременности появления мужских и женских цветков и сильной зависимости цветения у кукурузы от времени года, в лабораторных условиях произвести самоопыление растений в большинстве случаев было невозможно, а завязавшиеся зерна отличались маленьким размером, плохо выполненным эндоспермом и давали проростки, отстающие в росте и развитии. В таблице 7 приведены данные анализа проростков трех початков, полученных от гибридов линий кукурузы ЗМС и KMC в результате самоопыления. Материнские

растения в случае початков №1 и №2 обрабатывали штаммом А. Ыте/ааею АвЬО с геном %/р, в случае початка №3 - ЬВ А4404 с геном ^мл-Шгоп.

Таблица 7

Анализ ДНК проростков кукурузы поколения Е1 на наличие встроек

__т-днк_____

—------ Номер початка Количество " —-- пророс I ков, семян (шт.) __ 1 2 3

Верна, использованные в опыте 7 7 15

Проростки, выросшие на среде с канамицином 3 7 14

Белые проростки, выросшие на среде с канамицином 1 5 3

Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином 2 2 11

ПЦР-позитивные проростки 2 1 11

Наличие гена nptll в геноме растений F] говорит о наследовании приобретенного в результате агробактериальной трансформации гена в процессе полового размножения.

ВЫВОДЫ

1. Встраивание агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы после обработки пестичных нитей в условиях in planta наблюдается у всех использованных гибридных комбинаций и при использовании различных штаммов A. tumefaciens.

2. Перенос агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы в условиях in planta наблюдается в исследованном диапазоне температур 18-35 °С с частотой от 0,2 до 16,1% от числа использованных в опыте зерновок. При температуре выше 28 °С наблюдается статистически достоверное уменьшение частоты трансформации на початок.

3. Проведение предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактериальных клеток приводит к увеличению эффективности трансформации. Способ и очередность нанесения бактериальных клеток и пыльцы кукурузы на пестичные нити не влияют на частоту трансформации в условиях in planta.

4. Встраивание агробактериальной Т-ДНК после обработки пестичных нитей кукурузы суспензией агробактерий с активированными генами вирулентности и последующим искусственным опылением происходит в геном клеток женского и мужского гаметофитов.

5. Встраивание антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы в геном кукурузы методом агробактериальной трансформации в условиях in planta сопровождается увеличением содержания свободного пролина в тканях проростков кукурузы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

* - статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Агробактериальная трансформация генеративных клеток кукурузы // Биомика -наука XXI века: сб. тез. докл. шк.-конф. по физико-химической биологии и биотехнологии, 9-15 сент. 2007г., Уфа. - Уфа, 2007. - С. 134.

2. Чумаков М.И., Мамонтова Е. М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В. Технология получения новых форм однодольных растений // Сб. тез. докл. Третьего саратовского салона изобретений, инноваций и инвестиций, 5-7 дек. 2007г., Саратов. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2007. - С. 65.

3. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Анализ генома диплоидных и гаплоидных форм кукурузы на наличие маркерных генов после агробактериальной трансформации генеративных клеток кукурузы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сб. тез. докл. IV Межрегион, конф. мол. ученых, 14-16 окт. 2008г., Саратов. - Саратов, 2008.-С. 61.

4. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Анализ генома диплоидных и гаплоидных форм кукурузы на наличие маркерных генов после агробактериальной трансформации генеративных клеток кукурузы // Генетика микроорганизмов и биотехнология: сб. тез. докл. Международ, шк.-конф., 20-24 окт. 2008г., Москва-Пущино. - Пущино, 2008. - С. 158.

5. Mamontova Ye.M. (Moiseeva), Velikov V.A., Volokhina I.V., Tyrnov V.S., Chumakov M.I. Agrobacterium-mediated transformation of maize germ cells // Abstr. XXI Conf. Maize and Sorghum Breeding in the Genomic Era, June 21-24 2009, Bergamo, Italy. - Bergamo, 2009. - P. 110.

6. Мамонтова M.E. (Моисеева), Беликов B.A., Волохина И.В., Чумаков М.И. Высокоэффективная встройка Т-ДНК в геном гаплоидных и диплоидных растений кукурузы, трансформированных in planta /I Эмбриология, генетика и биотехнология: сб. тез. докл. III Международ, шк. мол. ученых, 29 июня-3 июля 2009г., Саратов. -Саратов. 2009.-С. 139.

7. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Волохина И.В., Беликов В.А., Чумаков М.И. Новая технология получения трансгенных линий кукурузы // Сб. тез. докл. Всеросс. молодеж. выставки-конкурса прикладных исследований, изобретений и инноваций, 27-28 окт. 2009г., Саратов. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. - С. 73.

8. Беликов В.А., Мамонтова Е.М. (Моисеева), Волохина И.В., Чумаков М.И. Экспериментальная оценка эффективности метода трансформации кукурузы in planta II Вавиловские чтения - 2009: сб. тез. докл. Международ, науч.-практ. конф., 25-26 нояб. 2009г., Саратов. - Саратов, 2009. - С. 15.

9. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Получение трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Биотехнология начала III тысячелетия: сб. тез. докл. Международ, науч. конф., 26-28 мая 2010г., Саранск. - Саранск, 2010. - С. 103.

*10. Мамонтова Е.М. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Трансформация in planta растений кукурузы // Генетика. - 2010. - Т. 46. -С. 568-571.

*11. Беликов В.А., Мамонтова Е.М. (Моисеева), Волохина И.В., Чумаков М.И. Агробактериальная трансформация генеративных клеток кукурузы in planta // Биотехнология. - 2010. -№3. - С. 57-63.

12. Mamontova Е.М. (Moiseeva), Velikov V.A., Volohina I.V., Chumakov M.I. Agrobacterium-mediated transfer of the antisense suppressor of proline dehydrogenase gene in the maize genome by an in planta method // Molecular Biotechnology Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial

Biotechnology: abstr. AB-RMS PhD courses and symposium, July 12-17 2010, Mikkeli, Finland. - Mikkeli, 2010.-P. 79.

13. Мамонтова M.E. (Моисеева), Беликов В.А., Волохина И.В., Чумаков М.И. Получение трансгенных растений кукурузы, несущих ген рибонуклеазы Zinnia elegans // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сб. тез. докл. V Всеросс. шк.-конф. мол. ученых, 28 сент. - 1 окт. 2010г., Саратов. - Саратов, 2010. - С. 117.

Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times. Тираж 100. Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Моисеева, Елизавета Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика основных методов генетической трансформации растений

1.1.1 Методы прямого переноса ДНК в клетки растений

1.1.2 Методы непрямого переноса ДНК в клетки растений

1.2 Аргобактериальная трансформация растений

1.2.1 Общая характеристика процесса агробактериальной трансформации растений

1.2.2 Функциональная организация Ti-плазмид

1.2.3 Процесс агробактериальной трансформации

1.2.4 Векторы для агробактериальной трансформации растений

1.2.5 Агробактериальная трансформация in vitro

1.2.6 Агробактериальная трансформация irt planta

1.2.7 Факторы, влияющие на эффективность аргобактериальной трансформации

1.3 Практическое и фундаментальное значение генетической трансформации растений

1.4 Проблемы генетической трансформации растений

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 8 2. 1 Материалы

2.1.1 Использованные штаммы A. tumefaciens

2.1.2 Среды

2.1.2.1 Среды для культивирования A. tumefaciens

2.1.2.2 Среда для проращивания пыльцы

2.1.2.3 Инокуляционные среды

2.1.2.4 Среды для выращивания растений

2.1.3 Растения

2. 2 Методы

2.2.1 Агробактериальная трансформация растений

2.2.1.1 Приготовление суспензии бактериальных клеток

2.2.1.2 Обработка растений агробактериальной суспензией

2.2.1.3 Отбор трансформантов

2.2.1.4 Выделение тотальной ДНК растений

2.2.1.5 Выделение тотальной ДНК агробактерий

2.2.1.6 ПЦР-анализ

2.2.1.7 Электрофорез

2.2.1.8 Обработка данных

2.2.2 Определение плоидности у растений кукурузы

2.2.3 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале

2.2.4 Определение активности p-глюкуронидазы в листьях проростков кукурузы после трансформации

2.2.5 Определение экспрессии гена gfp в корнях проростков после трансформации

2.2.6 Определение содержания свободного пролина в тканях кукурузы

2.2.7 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 53 3.1 Влияние различных факторов на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях in planta

3.1.1 Частота трансформации кукурузы в условиях in planta при различной температуре

3.1.2 Зависимость частоты трансформации от способа инокуляции кукурузы A tumefaciens

3.1.2.1 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при различных способах нанесения суспензии агробактерий

3.1.2.2 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии А. Ыте/аЫет на пестичные нити кукурузы

3.1.3 Анализ растительного материала на наличие агробактериальной ДНК

3.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы

3.2.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro

3.2.1.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gus-intron

3.2.1.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens AGL0, несущим векторную конструкцию с генами nptll и ф

3.2.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы в условиях in planta

3.3 Трансформация женского гаметофита кукурузы в условиях in planta

3.4 Определение экспрессии генов, перенесенных в составе Т-ДНК, в растениях кукурузы

3.4.1 Экспрессия гена nptll у растений кукурузы

3.4.2 Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы

3.4.3 Экспрессия гена gfp в корнях кукурузы

3.4.4 Определение концентрации пролина у трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы

3.5 Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы 92 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 97 БЛАГОДАРНОСТИ 98 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

АПГП - антисмысловая последовательность гена пролиндегидрогеназы;

3MCIT — Зародышевый маркер саратовский пурпурный;

ЗМС — Зародышевый маркер саратовский;

KMC - Коричневый маркер саратовский;

ПДГ - пролиндегидрогеназа;

ZRNase II - рибонуклеаза циннии {Zinnia elegans); gfp - ген зеленого флуоресцентного белка; gus- ген Р-глюкуронидазы; nptll- ген неомицинфосфотрансферазы;

МС - среда Мурасиге и Скуга.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы"

Актуальность проблемы

Кукуруза является одной из важнейших зерновых культур в мире, ее ежегодное производство составляет около 700 млн. т. (http://www.rosinvest.com/dir/analysis/40/43/), в том числе в России около 3 млн. т. (http://www.newsru.com/russia/17jul2008/luzhkov). В настоящее время кукуруза используется в качестве кормовой и пищевой культуры, в промышленных целях используют материалы, полученные из кукурузного сырья. В связи с этим получение новых сортов кукурузы, обладающих необходимыми для этих целей признаками, является важной практической задачей. Одним из способов управления генетической изменчивостью организмов, используемых в селекционной практике, служит генная инженерия. Получение трансгенных растений, несущих определенные признаки, при помощи методов генной инженерии является актуальным направлением биотехнологии. Со временем возрастает роль трансгенных растений в производстве пищевых продуктов, медицинских и промышленных материалов (Daniell et al., 2001; Rabotyagova et al., 2009). Технология доставки функциональных генов в растительный геном в составе Т-ДНК (transfer DNA) агробактерий зарекомендовал себя как надежный способ получения трансгенных двудольных растений. Перенос Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens в хромосомы вегетативных клеток однодольных растений впервые зарегистрирован более двадцати пяти лет назад (Slogteren et al., 1984), в том числе в кукурузу в 1986 году (Graves, Goldman, 1986). Основные способы получения генетически-модифицированных растений на основе метода агробактериальной трансформации базируются на переносе Т-ДНК в культивируемые in vitro растительные клетки с последующей регенерацией трансформированных растений. Однако трансформация каллусных клеток имеет ряд ограничений и недостатков, процесс ее осуществления является трудоемким, длительным и затратным. Существенные трудности возникают при трансформации однодольных растений с низкой регенерационной способностью. Кроме того, трансформация однодольных растений с использованием Agrobacterium tumefaciens происходит с меньшей эффективностью по сравнению с трансформацией двудольных. В связи с вышесказанным, особенно актуальной задачей является разработка методов трансформации однодольных растений без стадии культуры тканей. Поэтому ведется поиск нетрадиционных подходов для осуществления переноса агробактериальной Т-ДНК в однодольные растения, одним из которых может быть трансформация генеративных клеток. Половые клетки высших растений являются наиболее интересным объектом и инструментом для генетической трансформации. Их естественная способность передавать генетическую информацию следующему поколению может быть использована для внедрения фрагментов ДНК в растительный геном. Разработка способов генетической трансформации растений через генеративные клетки является актуальной задачей биотехнологии, способствующей решению, как фундаментальных проблем, так и прикладных задач генетики и селекции.

Цель исследования

Изучение агробактериальной трансформации генеративных клеток кукурузы в условиях in planta.

Задачи исследования

2. Определить эффективность трансформации генеративных клеток кукурузы при различных условиях.

3. Определить клетки-мишени для агробактериальной Т-ДНК.

Научная новизна работы

Впервые для кукурузы показано, что клетками-мишенями для агробактериальной Т-ДНК служат клетки женского и мужского гаметофита.

Впервые показана инсерция агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы при температуре воздуха во время инокуляции кукурузы агробактерлями выше 30 °С.

Научно-практическая значимость работы

В ходе работы получены доказательства инсерции в геном кукурузы Т-ДНК, несущей ген рибопуклеазы циннии и супрессор гена пролиндегидрогеназы. Показано, что инсерция Т-ДНК, несущей антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, сопровождается накоплением свободного пролина в тканях кукурузы. Полученные трансформанты могут быть использованы в дальнейшей работе по получению растений с повышенной устойчивостью к дефициту влаги и засолению.

Исследовано влияние температурного фактора на частоту агробактериальной трансформации кукурузы in planta, что позволяет предложить ряд технологических мероприятий при проведении трансформации в условиях повышенных температур.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Обработка пестичных нитей кукурузы суспензией клеток агробактерий с активированными генами вирулентности позволяет получать трансгенные растения всех исследованных гибридных комбинаций при ист ользований штаммов A. tumefaciens, несущих различные генетические конструкции.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями

Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных экспериментальных данных по анализу встройки Т-ДНК в клетки женского и мужского гаметофитов кукурузы, экспрессии функциональных генов у кукурузы, а также в описании и обработке полученных данных. Опыты по обработке растений при трансформации кукурузы in planta, часть экспериментов по анализу экспрессии маркерных генов проведены при участии сотрудников лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН И.В. Волоченной, В.А. Беликова, что отражено в совместных публикациях. Планирование экспериментов, интерпретация экспериментальных данных, подготовка результатов к публикации проводились под руководством Чумакова М.И.

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН в течение 2007-2010 гг. в рамках плановой темы НИР "Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки", № госрегистрации 01200606182; научный руководитель - доктор биологический наук

М.И. Чумаков. Исследования поддержаны грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы) шифр «2007-2-1.2-09-01-137» по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: III Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2007), школе-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века" (Уфа, 2007), IV и V Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008, 2010), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008), III Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Саратов, 2009), Всероссийской молодежной выставке-конкурсе прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, 2009), XXI Conférence Maize and sorghum breeding in the genomic era (Bergamo, Italy, 2009), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 2009), Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), AB-RMS PhD courses and symposium «Molecular Biotechnology Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Région: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (Mikkeli, Finland, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 13 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 276 источников. Диссертация изложена на 126 печатных страницах, содержит 19 рисунков и 14 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Моисеева, Елизавета Михайловна

выводы

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор признателен сотрудникам каф. генетики Саратовского госуниверситета: зав. каф. генетики, д.б.н., проф. B.C. Тырнову, с.н.с., к.б.н.

A.Н. Завалишиной, с.н.с., д.б.н. О.И. Юдаковой, О.И. Гуторовой за консультации и предоставленные линии кукурузы;

Э.С Пирузян (ИоГен РАН) и A.B. Кочетову (ИЦиГ СО РАН) автор перизнателен за предоставленные генетические конструкции; сотрудникам лаборатории Биоинженерии ИБФРМ РАН: с.н.с., к.б.н. И.В. Волохиной, с.н.с., к.б.н. В.А. Беликову, лаб-исслед. И.Б. Ивановой выражаю признание за сотрудничество, обсуждение результатов и помощь; вед. науч. сотр. лаборатории нанобиотехнологий ИБФРМ РАН, д.б.н., доц. каф. биофизики ФНП СГУ В.А. Богатыреву за консультации по микроскопии, прочтение рукописи и критические замечания; зав. лаб. кукурузы и сорго ФГНУ РосНИИСК «Россорго» д.с.-х.н.,

B.А. Жужукину автор признателен за предоставленные гибриды кукурузы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках диссертационной работы было проведено исследование факторов, влияющих на эффективность трансформации генеративных клеток кукурузы в условиях in planta.

Значимым фактором, влияющим на процесс агробактериальной трансформации, является температура. Полученные экспериментальные данные показали, что перенос агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы наблюдается в исследованном диапазоне температур 18-35 °С с частотой от 0,2 до 16,1%. При температуре выше 28 °С наблюдается статистически достоверное уменьшение частоты трансформации на початок.

Одним из преимуществ метода трансформации генеративных клеток перед традиционными методами агробактериальной трансформации клеток вегетативных органов является возможность использования любых сортов трансформируемой культуры. Полученные данные показали, что встройка агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы происходит при использовании различных гибридных комбинаций, что подтверждает проведенный ПЦР-анализ на маркерные (nptll, gus-intron) или целевые гены (супрессор гена пролиндегидрогеназы и ген рибонуклеазы циннии). Показана экспрессия перенесенных генов (,gfp, nptll, gus-intron, супрессор гена пролиндегидрогеназы) в гибридах кукурузы использованных линий.

Результаты исследований показали, что штамм агробактерий и линии кукурузы также являются факторами, влияющими на эффективность трансформации кукурузы в условиях in planta.

С целью оптимизации метода трансформации была изучена эффективность трансформации при различных способах нанесения пыльцы и суспензии клеток агробактерий. Было показано, что нанесение бактериальной суспензии при помощи пипетки или аэрозоля не оказывало влияния на эффективность трансформации, однако, завязываемость зерен при использовании аэрозольного метода была выше. Поэтому аэрозольный метод нанесения можно использовать для получения початков с большим количеством зерен. Проведение предварительной инкубации пыльцевых зерен с суспензией клеток различных штаммов агробактерий в среде с сахарозой, а также одновременное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии на пестичные нити кукурузы, способствовало увеличению эффективности трансформации. Отдельное нанесение пыльцы и агробактерий на пестичные нити оказалось менее предпочтительным способом трансформации кукурузы. Кроме того, проведение предварительной инкубации пыльцы и клеток агробактерий при пониженной температуре приводило к увеличению трансформации, что может быть использовано при проведении трансформации в условиях in planta при температуре окружающей среды выше 28 °С.

При проведении трансформации в условиях in planta во время цветения, не вполне ясен вопрос, какие именно клетки являются мишенями для Т-ДНК. При проведении обработки пыльцы кукурузы суспензией клеток агробактерий in vitro показано, что Т-ДНК может проникать в прорастающее пыльцевое зерно и встраиваться в геном одного из ядер мужского гаметофита. Данный факт подтверждает возможность участия мужского гаметофита при трансформации in planta. Встройка Т-ДНК в геном матроклинных гаплоидных растений показывает возможность проникновения Т-ДНК в зародышевый мешок (женский гаметофит) посредством прорастающей пыльцевой трубки. При этом трансформация спермиев не обязательна. Таким образом; трансформация кукурузы в условиях in planta происходит посредством мужского гаметофита, а клетками — мишенями могут быть и спермий, и яйцеклетка.

При использовании метода трансформации кукурузы in piar ta показана возможность наследования перенесенного в составе Т-ДНК гена во втором поколении.

В работе получены трансгенные растения кукурузы, несущие функциональные гены - антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы и ген рибонуклеазы циннии. В наших экспериментах с использованием штамма A. tumefaciens LBA4404, встройка антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы сопровождалась повышенным содержанием свободного пролина в тканях листа трансгенных растений кукурузы по сравнению с контролем. Полученные растения кукурузы с повышенным содержанием пролина могут быть использованы для дальнейшего анализа на устойчивость к засухе и засолению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моисеева, Елизавета Михайловна, Саратов

1. Викторэк-Смагур А., Хнатушко-Конка К., Кононович А.К. Сравнение двух методов трансформации Arabidopsis thaliana: погружение цветочных почек и вакуумная инфильтрация // Физиология растений. 2009. - Т. 56, № 4. - С. 619-628.

2. Данилова С.А., Кузнецов В.В., Долгих Ю.И. Новый эффективный метод генетической трансформации кукурузы с использованием агробактериального газона // Физиология растений. 2009. - Т. 56, № 2. - Р. 258-263.

3. Дун В., Мао И.Ф., Ли В. Факторы, влияющие на перенос Т-ДЫС в пыльцу лилии in vitro / Физиология растений. 2007. - Т. 54, №3. - Р. 475-480.

4. Еналеева Н.Х., Тырнов B.C., Селиванова Л.П., Завалишина А.Н. Одинарное оплодотворение и проблема гаплоиндукции у кукурузы // Докл. Акад. Наук. 1997. -Т. 353, № 3. - С. 405-407.

5. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами однодольных растений // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - С. 266-275.

6. Калаптур О.В., Соловова Т.К., Панасенко В.И., Чумаков М.И. Колонизация агробактериями корней пшеницы // Известия РАН. — 2004. — №6 — С. 1-10.

7. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов A.B., Комарова М.Л., Романова A.B., Коваль B.C., Шумный В.К. Оценка солеустойчивости растений табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. // Генетика. 2006. - Т. 42. -С. 278-281.

8. Кочетов A.B., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. // Генетика. — 2004.-Т. 40.-С. 282-285.

9. Курбанова И.В., Чумаков М.И. Образование внеклеточных структур, содержащих VirB2 белки в скрещивающихся культурах агробактерий // Биологические мембраны. 2000. - Т. 17, № 2. - С. 158-161.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. 480 с.

11. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988.-271с.

12. Пухальский В.А., Смирнов В.А., Коростелева С.П., Билинская E.H., Елисеева А. Генетическая трансформация пшеницы (Triticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. — 1996. Т. 32. — С. 1596-1600.

13. Пухальский В.А., Соловьев A.A., Бадаева Е.Д., Юрцев В.Н. Практикум по цитологии и цитогенетике растений. М.: Колос, 2007. - 198с.

14. Сангаев С.С. Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз на модели трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.): Автореф. дис. канд биол. наук. -Новосибирск, 2010. 16 с.

15. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова A.B., Колодяжная Я.С., Комарова M.JI. Эффективная экспрессия гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans в растениях табака Nicotiana tabacum SRI II Генетика. — 2007. Т. 43, №. 7.-С. 1002-1005.

16. Спайк Г., Кондороши А., Хукас П. Rhyzobiacea. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Пер. под ред. И.А. Тихоновича и H.A. Проворова — Санкт-Петербург, 2002. — 556 с.

17. Титов С.Е., Кочетов A.B., Коваль B.C., Шумный В.К. Тра гсгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам. // Успехи соврем, биолог. 2003. - Т. 123. - С. 487-494.

18. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: научное и прикладное значение. М.: Наука, 1998.-53 с.

19. Тырнов B.C., Завалишина А.Н. Индукция высокой частоты возникновения матроклинных гаплоидов кукурузы // Докл. Акад. Наук. — 1984. — Т. 276. — С. 735-738.

20. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В., Давоян Н.И., Зайцева JI.C. Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. -221с.

21. Чеботарь А.А. Эмбриология кукурузы. Кишинев: Штиинца, 1972. - 383с.

22. Чумаков М.И., Курбанова И.В. Локализация VirBl белка на поверхности агробактерий // Биологические мембраны. —1998. Т. 15, Вып. 6. — С. 719-721.

23. Чумаков М.И., Курбанова И.В., Соловова Г.К. Агробактериальная трансформация неповрежденных растений // Физиология растений. — 2002. Т. 49, №6.-С. 898-903.

24. Чумаков М.И., Рожок Н.А., Беликов В.А., Тырнов B.C., Волохина И.В. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей inplanta II Генетика. 2006. - Т. 42, №8. - С. 1083-1088.

25. Эльконин Л.А., Равин Н.В., Лешко Е.В., Волохина И.В., Чумаков М.И., Скрябин К.Г. Агробактериальная трансформация растения сорго в условиях in planta II Биотехнология. 2009. - № 1. - С. 23-30.

26. Юдакова О.И. Методы цитоэмбриологического анализа. Саратов: изд-во Саратовского университета, 1999. - 20 с.

27. Ahokas Н. Transfection by DNA-associated liposomes evidenced of pea pollination. // J. Hereditas. 1987. - Vol. 106. - P. 129-138.

28. Ahokas H. Transfection of germinating barley seed electrophoretically with exogenous DNA // Theor. Appl. Genet. 1989. - Vol. 77. - P. 469-472.

29. Akella V., Lurguin P.F. Expression in cowpea seedlings of chimeric transgenes after electroporation into seed-derived embryos // Plant Cell Rep. — 1993. Vol. 12. — P. 110-117.

30. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis // Prot. Natl. Acad. USA. 1984. - Vol.81. - P. 5994-5998.

31. Albright L.M., Yanofsky M.F., Leroux B. Ma D.Q., Nester E.W. Processing of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens generates border nicks and linear, single-stranded T-DNA // J. Bacteriol. 1987. -Vol. 169. - P. 1046-1055.

32. Alt-Moerbe J., Kuhlmann H., Schroder J. Differences in induction of Ti plasmid virulence genes virG and virD, and control of virD expression by four external factors // Molec. Plant-Microbe Interact. 1989. - Vol. 2, №.6. -P.301-308.

33. Alt-Moerbe J., Neddermann P., Lintig J., Weiler e.W., Schroder J. Temperature-sensitive step in Ti plasmid vz'r-region induction and correlation with cytokinin secretion by Agrobacteria II Mol. Gen. Genet. 1988. - Vol. 213. - P. 1-8.

34. Anderson A., Moore L. Host specificity in the genus Agrobacterium // Phytopathology. 1979. - Vol. 69. - P. 320-323.

35. Ankenbauer R.G., Nester E.W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens vilulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides // Journal of Bacteriology. 1990. - Vol. 172. - P. 6442-6446.

36. Arencibia A.D., Carmona E.R.C., Tellez P., Chan M.T., Yu S.M., Trujillo L.E., Oramas P. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp.U) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens II Transgenic Res. 1998. - Vol. 7. - P. 213-222.

37. Aulinger E., Peter S.O., Schmid J.E., Stamp P. Gametic embryos of maize as a target for biolistic transformation: comparison to immature zygotic embryos // Plant Cell Rep. -2003. Vol. 21, № 6. - P. 585-591.

38. Bahieldin A., Dyer W.E., Qu R. Concentration effects of dicamba on shoot regeneration in wheat // Plant Breed. 2000. - Vol. 119. - P. 437-439.

39. Barker R.F., Idler K.B., Thompson D.V., Kemp J.D. Nucleotide sequence of the T-DNA region from the A. tumefaciens octopine Ti plasmid pTi 15955 // Plant Mol. Biol. -1983.-Vol.2.-P. 335-350.

40. Barry G.F., Rogers S.G., Fraley R.T., Brand L. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene II Prot. Natl. Acad. USA. 1984. - Vol.81. - P. 4776-4780.

41. Bates G.W. Electroporation of plant protoplasts and tissues // Methods Cell Biol. 1995. - Vol. 50. - P. 363-373.

42. Bates L.E., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for waterstress studies II Plant and soil. 1973. - T. 39. - P. 205-207.

43. Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. In planta Agrobacterium-mQdiated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants // C.R. Academy of Sciences Paris, Life Science. 1993. - Vol. 316. - P. 1194-1199.

44. Bechtold N., Jaudeau B., Jolivet S., Maba B., Vezon D., Voisin R., Pelletier G. The maternal chromosome set is the target of the T-DNA in the in planta transformation of Arabidopsis thaliana II Genetics. 2000. - Vol. 155. - P. 1875-1887.

45. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scuteller tissue // Plant J. 1994. — Vol. 5. - P. 299-307.

46. Beijersbergen A.A., Dulk-Ras R., Schilperroort R.A., Hooykaas P. Conjugative transfer by the virulence system of Agrobacterium tumefaciens II Science. — 1992. Vol. 256. - P.1324-1326.

47. Belanger C., Loubens I., Nester E.W., Dion P. Variable efficiency of a Ti plasmid-encoded VirA protein in different agrobacterial host // J. Bacteriol. — 1997. -Vol.179, №.7.-P. 2305-2313.

48. Binns A.N., Thomashow M.F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants // Ann. Rev. Microbiol. 1988. - Vol. 42. - P. 575-606.

49. Boynton J.E., Gillham N.W. Genetics and transformation of mitochondria in the green alga Chlamydomonas II Methods in Enzymology. 1996 Vol. 264. - P. 279-296.

50. Braun A.C. Plant tumors // Biochim Biophys Acta. 1978. - Vol. 516. -P. 167-191.

51. Brettschneider R., Becker D., Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos // Theor. Appl. Genet. 1997. - Vol. 94. - P. 737-748.

52. Brisibe E.A, Gajdosava A., Olsen A., Andersen S.B. Cytodifferentiation and transformation of embryogenic callus lines derived from anther culture of wheat. // J. Exp. Bot.-2000.-Vol. 51.-P. 187-196.

53. Buchmann I., Mamer F.J., Schroder G., Waffenschmidt S., Schroder J. Tumor genes in plants: T-DNA encoded cytokinin biosynthesis // EMBO J. 1985. - Vol. 4. - P. 853-859.

54. Bundock P., Dulk-Ras A., Beijersbergen A., Hooykaas P.J.J. Trans kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae IIEMBO J. -1995.-Vol. 14.-P. 3206-3214.

55. Bundock P., Hooykaas P.J.J. Integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA in the Saccharomyces cerevisiae genome by illegitimate recombination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.-Vol. 93.-P. 12172-12175.

56. Cadoza V., Stewart C.N. Increased Agrobacterium mediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyls segment expiants // Plant Cell Rep. 2003. - Vol. 21. - P. 599-604.

57. Cangelosi GA., Ancenbauer R.G., Nester E.W. Sugar induces the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 67086712.

58. Castillo A.M., Vasil V., Vasil I.K. Rapid production of fertile transgenic plants of rye (Secale cereale L.) II BioTechnology. 1994. - Vol. 12. - P. 1366-1371.

59. Catlin D., Ochoa O., Me. Cormick S., Quiras C.F. Celery transformation by A. tumefaciens cytological and genetic analysis of transgenic plants // Plant Cell Rep. -1988.-Vol. 7.-P. 100-103.

60. Chang S.S., Park S.K., Kim B.C., Kang B.J., Kim D.U., Nam H.G. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta. Plant Journal. 1994. -Vol. 5. - P. 551-558.

61. Charles T.C., Nester E.W. A chromosomaly encoded two component sensory transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens II J.Bacteriol. 1993. - Vol. 175. -P. 6614-6625.

62. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou I., Hironaka C., Duncan D.R.I., Conner T.W.L., Wang Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant. Physiol. 1997. - Vol. 115. - P. 971-980.

63. Cheng M., Hu T., Layton J.I., Liu C-N., Fry J.E. Desiccation of plant tissues post-Agrobacterium infection enhances T-DNA delivery and increases stabletransformation efficiency in wheat // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2003. - Vol. 39. -P. 595-604.

64. Chilton M.- D., Drummond M.H., Merlo D.J., Sciaky D., Montoya A.L., Gordon M.P., Nester E.W. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis // Dept. Bioch. 1977. - Vol.11. -P. 263-271.

65. Christie P.J. Agi'obacterium tumefaciens T-complex transport apparatus: a paradigm for a new family of multifunctional transporters in eubacteria // J. Bacteriol. — 1997. Vol. 179. - P. 3085-3094.

66. Christie P.J., Ward J.E., Winans S.C., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens virE2 gene product is a sinle-stranded-DNA-binding protein that associates with T-DNA // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170, № 6. - P. 2559-2667.

67. Chowrira G.M., Akella V., Lurquin P.F. Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta II Molecular Biotechnology. 1995. - Vol. 3. -P. 17-23.

68. Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., Bi F.Y. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources // Sci. Sip. 1995. - Vol. 18. - P. 659-668.

69. Chung M.H., Chen M.-K., Pan S.-M. Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants // Trangenic research. 2000. - Vol. 9. -P. 471-476.

70. Chyi Y.S., Jorgensen R.A., Goldstein D., Tanksley S.D., Loaiza-Figueroa F. Locations and stability of Agrobacterium-mQdiztQd T-DNA insertions in the Lycopersicon genome //Mol. Gen. Genet. 1986. - Vol. 204.-P. 64-69.

71. Citovsky V., Warnick D., Zambryski P. Nuclear import of Agrobacterium VirD2 and VirE2 proteins in maize and tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. -P. 3210-3214.

72. Citovsky V.C., Wong M.L., Zambryski P. Cooperative interaction of Agrobacterium VirE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol.86. - P. 1193-1197.

73. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zambriski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science. 1992. - Vol. 256, № 5065. -P. 1802-1805.

74. Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana II The Plant Journal. 1998. - Vol. 16. -P. 735-743.

75. Cook D.M., Li P.L., Ruchaud F., Padden S., Farrand S.K. Ti plasmid conjugation is independent of vir: reconstitution of the tra functions from pTiC58 as a binary system. J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179.-P. 1291-1297.

76. Crossway A., Oakes J.V., Irvine J.M., Ward B., Knauf V.C., Shewmaker C.K. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts // Mol. Gen. Genet. 1986.-Vol. 202.-P. 179-185.

77. Gurel S., Gurel E., Kaur R., Wong J., Meng L., Tan H., Lemaux P.G. Efficient, reproducible Agrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of immature embryos // Plant Cell Rep. 2009. - Vol. 28. - P. 429-444.

78. Curtis I.S., Nam H.G. Transgenic radish (Raphanus sativus L. longipinnatus Bailey) by floral-dip method — plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency // Transgenic Research. 2001. - Vol. 10. -P. 363-371.

79. D'Halluin K., Bonne E., Bossut M., De Beuckeleer M., Leemans J. Transgenic maize plants by tissue electroporation // Plant Cell. 1992. - Vol. 4. - P. 1495-1505.

80. Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Sci. — 2001. -Vol. 6.-P. 219-226.

81. Das A. Agrobacterium tumefaciens virE operon encodes a single-stranded DNA-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85, № 9. - P. 2909-2913.

82. De Cleene M., De Ley J. The host range of crown gall // Bot. Rev. 1976. -Vol. 42, №. 4.-P. 389-466.

83. De Groot M.J.A., Bundock P., Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A.G.M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi // Nat. Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 839-842.

84. Dennehey B.K., Retersen W.L., Ford-Santino C., Pajeau M., Armstrong C. Comparison of selective agents for use with the selectable marker gene bar in maize transformation // Plant cell, tissue and organ culture. 1994. - Vol. 36. - P. 1-7.

85. Desfeux C., Clough S.J., Bent A.F. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mQdizted transformation by the Arabidopsis floral-dip // Methods Plant Physiol. 2000. - Vol. 123. - P. 895-904.

86. Dill en W., De Clercq J., Kapila J., Zambre M., Van Montagu M., Angenon G. The effect of temperature on Agrobacterium tumefaciens-mQdi&tQd gene transfer to plants // Plant J. 1997. - Vol. 12. - P. 1459-1462.

87. Duckely M., Hohn B. The VirE2 protein of Agrobacterium tumefaciens: the Yin and Yang of T-DNA transfer // FEMS Microbiology Letters. 2003. - Vol. 223. - P. 1-6.

88. Dumas F., Duckely M., Pelczar P., Van Gelder P., Hohn B. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol.98. - P. 485-490.

89. Dupuis J., Pace G.M. Gene-transfer to maize male reproductive structure by particle bombardment of tassel primordia // Plant Cell Rep. 1993. - Vol. 12. -P. 607-611.

90. Durrenberger F., Crameri A., Hohn B., Koukolikova-Nicola Z. Covalently bound VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens protects the T-DNA from exonucleolytic degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol.86, №. 23. - P. 9154-9158.

91. Durrenberger M. B., Villiger W., Bachi T. Conjugational junctions: morphology of specific contacts in conjugating Escherichia coli bacteria // J. Struct. Biol. 1991. -Vol. 107.-P. 146-156.

92. Eisenbrandt R., Kalkum M., Lai E.M., Lurz R., Kado C. I., Lanka E. Conjugative pili of IncP plasmids, and the Ti plasmid T-pilus are composed of cyclic subunits // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 22548-22555.

93. Ellis D., Roberts D., Sutton B. Transformation of white spruce and other conifer species by A. tumefaciens II Plant Cell Rep. 1989. - Vol. 8. - P. 16-20.

94. Enriquez-Obregon G.A., Vazquez-Padron R.I., Prieto-Samsonov D.L., De La Riva G.A., Selman-Housein G. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation // Planta. 1998. - Vol. 205.-P. 20-27.

95. Escudero J., Neuhaus G., Hohn B. Intercellular Agrobacterium can transfer DNA to the cell nucleus of the host plant 11 Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 230-234.

96. Feldmann K.A., Marks M.D. Agrobacterium-medmtQd transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach 11 Molecular and General Genetics. 1987. - Vol. 208. - P. 1-9.

97. Fennell A., Hauptmann R. Electroporation and PEG delivery of DNA into maize microspores // Plant Cell Reports. 1992. - Vol. 11. - P. 567-570.

98. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. -Vol. 82.-P. 5824-5825.

99. Fullner K., Stephens K., Nester E. An essential virulence protein of Agrobacterium tumefaciens, VirB4, requires an intact mononucleotide binding domain to function in transfer of T-DNA // Mol. Gen. Genet. 1994. - Vol. 245. - P. 704- 715.

100. Fullner K.J., Lara J.C., Nester E.W. Pilus assembly by Agrobacterium T-DNA transfer genes // Science. 1996a. - Vol. 273. - P. 1007-1009.

101. Fullner K.J, Nester E.W. Temperature affects the T-DNA transfer machinery of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1996b. - Vol. 178. - P. 1498-1504.

102. Garfinkel D.J., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in crown gall tumorigenesis and octopine catabolism 11 J. Bacteriol. 1980. - Vol. 144. -P. 732-743.

103. Gheysen G., Villarroel R., Van Montagu M. Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration // Genes Dev. 1991. - Vol. 5. - P. 287-297.

104. Graves A.C., Goldman S.L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens // Plant Molec. Biol. 1986. - Vol. 7. - P. 43-50.

105. Griesbach R.J. Chromosome-mediated transformation via microinjection // Plant Sci. 1987. - Vol. 50. - P. 69-77.

106. Griesbach R.J. Hammond J. An improved method for transforming plants through electrophoresis // Plant Sci. 1994. - Vol. 102. - P. 81-89.

107. I.Hansen G., Das A., Chilton M.-D. Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994,-Vol. 91. - P. 7603-7607.

108. Hepburn A. G., White J. The effect of right terminal repeat deletion on the oncogenicity of the T-region of pTiT37 // Plant Mol. Biol. 1985. - Vol. 5. - P. 3-11.

109. Herman L., Jacobs A., Van Montagu M., Depicker A. Plant chromosome marker gene fusion assay for study of normal and truncated T-DNA integration events // Mol. Gen. Genet. 1990. - Vol. 224. - P. 248-256.

110. Herrera-Estrella A., Chen Z.-M., Van Montagu M., Wang K. VirD proteins of A. tumefaciens are required for the formation a covalent DNA-protein complex at the 5'termonus of T-strand molecules // EMBO J. 1988. - Vol.7. - P. 4055-4062.

111. Herrera-Estrella L., Teeri T.H., Simpson J. Use of reporter genes to study gene expression in plant cells // Plant molecular biology manual. 1988. - Vol B1. - P. 1 -22.

112. Hess D. Investigations on the intra- and interspecific transfer of anthocyanin genes using pollen as vectors // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - Vol. 98. - P. 321-337.

113. Hess D. Pollen-based techniques in genetic manipulation // Int. Rev. Cytol. -1987.-Vol. 107.-P. 367-395.

114. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L) // Plant Sci. 1990. -Vol. 72.-P. 233-244.

115. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. Efficient transformation of rice {Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA // Plant Journ. 1994. - Vol. 6. - P. 271-282.

116. Holm P.B., Olsen O., Schnorf M., Brinch-Pederse H., Knudsen S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts // Transgen. Res. 2000. - Vol. 9. - P. 21-32.

117. Horsch R.B., Klee J., Stachel S.,. Winans S. C, Nester E. W., Rogers S. G., Fraley R. T. Analysis of Agrobacterium tumefaciens virulence mutants in leaf disks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. - P. 2571-2575.

118. Huang M.L.W., Cangelosi G.A., Halperin W., Nester E.W. A chromosomal A. tumefaciens agent required for effective plant signal transduction // J. Bacteriol. 1990. -Vol. 172.-P. 1814-1822.

119. Huang Y. VirA, coregulator of Ti-specified virulence genes, is phosphorylated in vitro II J.Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 1142-1144.

120. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., Kumashiro T. High efficiency transformation of maize {Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens II Nature Biotechnol. 1996. - Vol. 14. - P. 745-750.

121. James D.J., Passey A.J., Baker S.A. Transgenic apples display stable gene expression in the fruit and Mendelian segregation of the transgenes in the R1 progeny // Euphytica. 1995. - Vol. 85. - P. 109-112.

122. Jarchow E., Grimsley N.H., Hohn B. VirF, the host-rangedetermining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -P. 88. -P. 10426-10430.

123. Jefferson R.A. Assaying chimeric genes in plants: the beta-glucuronidase fusion system // Plant Mol. Biol. Rep. 1987b. - Vol. 5. - P. 201-208.

124. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. Gus fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987a. - Vol. 6. -P. 3901-3907.

125. Jen G.C., Chilton M.D. The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border region in promoting T-DNA transformation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. -P. 3895-3899.

126. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T. Phosphorylation of the VirG protein of A. tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. -P. 4945-4950.

127. Jin S., Song Y.-N., Deng W.-Y.3 Gordon M., Nester E.W. The regulatory VirA protein of Agrobacterium tumefaciens does not function at elevated temperatures // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 6830-6835.

128. Jones A. L., Lai E.-M., Shirasu K., Kado C. I. VirB2 is a processed pilin-like protein encoded by the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid // J. Bacteriol. 1996. -Vol. 178.-P. 5706-5711.

129. Jones-Villeneuve E., Huang B., Prudhomme I., Bird S., Kemble R., Hattori J., Miki B. Assessment of microinjection for introducing DNA into uninuclear microspores of rapeseed // Plant Cell Tissue Org. Cult. 1995. - Vol. 40. - P. 97-100.

130. Kaeppler H., Gu W., Somers D.A., Rines H.W. Cockburn A.F. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into plant cells // Plant Cell Rep. 1990. - Vol. 9. -P. 415-418.

131. Kahl G., Schell J. Molecular Biology of plant tumors. New York Academic Press, 1982.-354p.

132. Katavic V., Haughn G.W., Reed D., Martin M., Kunst L. In planta transformation of Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1994. - Vol. 245. '— P. 363-370.

133. Ke J., Khan R., Johnson T., Somers D.A., Das A. High-efficiency gene transfer to recalcitrant plants by Agrobacterium tumefaciens I I Plant Cell Rep. — 2001. — Vol. 20. — P. 150-156.

134. Klee H.J., White F.F., Iyer V.N., Gordon M. P., Nester E.W. Mutational analysis of the virulence region of an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid // J. Bacteriol. 1983.-Vol. 153.-P. 878-883.

135. Klein T. M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. - Vol. 327. - P. 70-73.

136. Knauf V.C., Panagopoulos C.G., Nester E.W. Genetic factors controlling the host range of A. tumefaciens II Phytopathology. 1982. - Vol. 72. - P. 1545-1549.

137. Koncz C., Martini N., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Korber H., Redei G.P., Schell J. High-frequency T-DNA-mediated gene tagging in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 8467-8471.

138. Kumlehn J., Serazetdinora L., Hensel G., Becker D., Loerz H. Genetic transformation of barley (Hordeum vulgare L.) via infection of androgenetic pollen culture with Agrobacterum tumefaciens I I Plant Biotechnology J. 2006. - Vol. 4. - P. 251-258.

139. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. -Vol. 98.-P. 1871-1876.

140. Lai E-M., Kado C.I. Processed VirB2 is the major subunit of the promiscuos pilus of Agrobacterium tumefaciens II J.Bacteriol. 1998. - Vol.180. - P.2711-2717.

141. Lai E.-M., Kado C.I. The T-pilus of Agrobacterium tumefaciens I I Trends Microbiol. 2000. - Vol. 8. - P. 361-369.

142. Langridge P., Brettschneide R., Lazzeri P., Lorz H. Transformation of cereals via Agrobacterium and the pollen pathway: a critical assessment // The Plant Journal. -1992.-Vol. 2.-P. 631-638.

143. Leedel P.J., Zhany G., Cass D.D. Transient gfp expression in sperm cells and zygotes of Zea mays L. // Plant Physiol. 1997. - Vol. 114. - P. 297-298.

144. Lennon K.A., Roy S., Helper P.K., Lord E.M. The Structure of the transmitting tissue of Arabidopsis thaliana (L.) and the path of pollen tube growth // Sex. Plant Reprod. -1998.-Vol. 11.-P. 49-59.

145. Lessl M., Balzer D., Pansegrau W., Lanka E. Sequence similarities between the RP4 Tra2 and the Ti- VirB region strongly support the conjugation model for T-DNA transfer // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 20471-20480.

146. Lessl M., Lanka E. Common mechanisms in bacterial conjugation and Ti-mediated transfer to plant cells II Cell. 1994. - Vol. 77. - P.321-324.

147. Li L., Qu R., de Kochko A., Fauquet C., Beachy R.N. An improved rice transformation system using the biolistic method // Plant Cell Rep. 1993. - Vol. 12. -P. 250-255.

148. Linsmaier E.M., Skoog F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1965. - Vol. 18. - P. 100-127.

149. Lippincott B.B., Lippincott J.A. Bacterial attachment to a specific wound site as an essential stage in tumor initiation by Agrobacterium tumefaciens II J.Bacteriol. 1969. -Vol. 97, №.2.-P. 620-628.

150. Liu J., Iao S.Q., An L.3 Yang A. Transfer of a minimal linear marker-free and vector-free smgfp cassette into soybean via ovary-drip transformation // Biotechnol Lett. -2009.-Vol. 31.-P. 295-303.

151. Liu F., Cao M.Q., Yao L., Li Y., Robaglia C., Tourneur C. In planta transformation of pakchoi (Brassica campestris L.ssp. Chinensis) by infiltration of adult plants with Agrobacterium I I Acta Hortic. 1998. - Vol. 467. - P. 187-192.

152. Logemann E., Birkenbihl R.P., Ulker B., Somssich I.E. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol // Plant Methods. 2006. - Vol. 2. - P. 16-22.

153. Lundquist R.C., Close T.J., Kado C.I. Genetic complementation of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid mutants in the virulence region // Mol. Gen. Genet. 1984.-Vol. 193.-P. 1-7.

154. Luo Z.-X., Wu R. A simple method for the transformation of rice via the pollentube pathway II Molecular Biology Reporter. 1989. - Vol. 7. - P. 69-77.

155. Lurquin P.F. Binding of plasmid loaded liposomes to plant protoplasts: validity of biochemical methods to evaluate the transfer of exogenous DNA // Plant Sci. Leu. -1981.-Vol. 21.-P. 31-40.

156. Manoharan M., Dahleen L.S. Genetic transformation of the commercial barley (Hordeum vulgare L.) cultivar conlon by particle bombardment of callus // Plant Cell Rep. -2002.-Vol. 21.-P. 76-80.

157. Matsumoto S., Ho Y., Hosoi T. Integration of Agrobacterium T-DNA into a tobacco chromosome: possible involvement of DNA homology between T-DNA and plant DNA // Mol. Genet. 1990. - Vol. 224. - P. 309-316.

158. Matzk A., Mantell S., Schieman J. Location of persistence of engineered in transgenic tobacco plants // MPMI. 1996. - Vol. 9. - P.373-381.

159. Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Nawrath C., Bakkeren G., Crameri A., Angelis K., Redei G. P., Schell J., Hohn B., Koncz C. T-DNA integration: a mode of illegitimate recombination in plants // EMBO J. 1991. - Vol. 10. - P. 697-704.

160. Messens E., Dekeyser R., Stachel S. Nontransformable Triticum monococcum monocotyledonous culture produces the potent Agrobacterium vzr-inducing compound ethyl ferulate // Proc. Natl.Acad.Sc.USA. 1990. - Vol. 87. - P. 4368-4372.

161. Miller J.W., Crane G.L. Relative susceptibility of chrysanthemum cultivars to A. tumefaciens II Plant Disease Reporter. 1975. - Vol. 59. - P. 576-581.

162. Miki B., Mc. Hunh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety // Biotechnology. 2004. - Vol. 107. - P. 193-232.

163. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. - Vol. 15. - P. 473-479.

164. Mysori R.S., Bassuner D., Deng X.B., Darfmian N.S., Motchoulski A., Ream W. Role of Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein in T-DNA transfer and integration I I MPMI. 1998. - Vol. 11, № 7. - P. 662-683.

165. Nagatani N., Honda H., Shimada T., Kobayashi T. DNA delivery into rice cells and transformation using silicon carbide whiskers // Biotechnol. Techniq. 1997. - Vol. 11.-P. 781-786.

166. Obermeyer G., Weisenseel M. H. Introduction of impermeable molecules into pollen grains by electroporation // Protoplasma. 1995. Vol. 187. - P. 132-137.

167. Ohta Y. High efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA II Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. - P. 715-719.

168. Ohyama K., Pelcher L.E., Schaefer A.E., Fowke L.C. In vitro binding of Agrobacterium tumefaciens to plant cells from suspension culture // Plant Physiol. 1979. -Vol.63.-P. 382-387.

169. Olhoft P.M., Somers D.A. L-cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells // Plant Cell Rep. 2001. - Vol. 20. -P. 706-711.

170. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. Efficient soybean transformation using hygromycin В selection in the cotyledonary-node method // Planta. -2003. Vol. 216. - P. 723-735.

171. Pan S.Q., Charles Т., Jin S., Wu Z., Nester E.W. Preformed dimeric state of the sensor protein VirA is involved in plant -Agrobacterium signal transduction 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 9939-9943.

172. Pansegrau W., Lanka E. Enzymology of DNA transfer by conjugation mechanisms // Progress in Nucl. Acid Res. and Molec. Biol. 1996. - Vol. 54. -P. 197-251.

173. Pazour G.J., Та C.N., Das A. Constitutive mutations of Agrobacterium tumefaciens transcriptional activator VirG // J. Bacterol. 1992. - Vol. 174, №.12. -P. 4109-4174.

174. Peralta E. G., Ream L. W. T-DNA border sequences required for crown gall tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82. - P. 5112-5116.

175. Picton J.M., Steer M.W. A model for the mechanism of tip extension in pollen tubes // J. of Theoret. Biol. 1982. - Vol. 98. - P. 15-20.

176. Piers K.L., Heath J.D., Liang X., Stephens K.M., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -Vol. 93.-P. 1613-1618.

177. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Connier M.J., primary structure of the Aequorea Victoria green fluorescent protein // Gene. — 1992. -Vol. 111.-P. 229-233.

178. Rabotyagova O.S., Cebe P., Kaplan D.L. Self-assembly of genetically engineered spider silk block copolymers // Biomacromolecules 2009. - Vol. 10. -P. 229-236.

179. Raineri D.M., Boulton M.I., Davies J.W., Nester E.W. VirA, the plant-signal receptor, is responsible for the Ti-plasmid-specific transfer of DNA to maize by Agrobacterium 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol .90. - P. 3549-3553.

180. Rakoczy-Trojanowska M., Malepszy S. Genetic factors influencing the regeneration ability of rye (Secale cereal L.) II. immature embryos // Euphytica. 1995. -Vol. 83.-P. 233-239.

181. Rashid H., Yokoi S., Toriyama K., Hinata K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice // Plant Cell Rep. 1996. - Vol. 15. -P. 727-730.

182. Regensburg-Tuink A.J.G., Hooykaas P.J.J. Transgenic N. glauca plants expressing bacterial virulence gene virF are converted intohosts for nopaline strains of A. tumefaciens II Nature. 1993. - Vol. 363. - P. 69-71.

183. Roeckel P., Heizmann P., Dubois M., Duma C. Attempts to transform Zea mays via pollen grains. Effect of pollen and stigma nuclease activities // Sex. Plant. Reprod. -1988.-Vol. l.-P. 156-163.

184. Rollo F., Galli M.G., Parisi B. Liposome-mediated transfer of DNA to carrot protoplasts: a biochemical and autoradiographic analysis // Plant Sci. Lett. 1981. -Vol. 20.-P. 347-354.

185. Rossi L., Hohn B., Tinland B. Integration of complete transferred DNA units is dependent on the activity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 126-130.

186. Rout J. R., Lucas W.J. Characterization and manipulation of embryogenic response from in vitro cultured immature inflorescences of rice (Oryza sativa L.) // Planta. -1996.-Vol. 198.-P. 127-138.

187. Rubin R. A. Genetic studies on the role of octopine T-DNA border regions in crown gall tumor formation // Mol. Gen. Genet. 1986. - Vol. 202. - P. 312-320.

188. Sanford J.C., Skubik K.A., Reisch B.I. Attempted pollen-mediated plant transformation employing genomic donor // Theor. Appl. Genet. — 1985. Vol. 69. -P. 571- 574. DNA

189. Satoh R., Nakashima K., Seki M. ACTCAT, a novel cis-acting element for proline- and hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding proline dehydrogenase in Arabidopsis. 11 Plant Physiol. 2002. - Vol. 130. - P. 709-719.

190. Schafer W., Gorz A., Kahl G. T-DNA integration and expression in a monocot crop plant after induction of Agrobacterium 11 Nature. 1987. - Vol. 327. - P.529-532.

191. Schnorf M., Neuhaus-Url G., Galli A., lida S., Potrykus I., Neuhaus G. An improved approach for transformation of plant cells by microinjection: molecular and genetic analysis // Transgenic Research. 1991. - Vol. 1, № 1 — P. 23-30.

192. Schroder G., Waffenschmidt S., Weiler E., Schroder V. The T-region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid // Eur. J. Biochem. -1984.-Vol. 138.-P. 387-391.

193. Shen W.H., Escudero J., Schlappi M. T-DNA transfer to maize cells: histochemical investigation of beta-glucuronidase activity in maize tissues // Proc. Natl Acad Sci USA. 1993. - Vol. 90. - P. 1488-1492.

194. Shimoda N., Toyoda-Yamamoto A., Nagamine J. Control of expression of Agrobacterium vir genes by synergestic actions of phenolic signal molecules and monosaccharids I I Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P.6684-6688.

195. Slogteren G., Hoyokaas P.J.J., Schilperoort R.A. Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens II Nature. 1984. -Vol. 311.-P. 763-764.

196. Somers D.A., Rines H.W., Gu W., Kappler H.F., Bushnell W.R. Fertile, transgenic oat plants // Biotechnology. 1992. - Vol. 10. - P. 1589-1594.

197. Songstad D.D., Armstrong C.L., Petersen W.L., Hairston B. Production of transgenic maize plants and progeny by bombardment of Hi-II immature embryos // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1996. - Vol. 32. - P. 179-183.

198. Songstad D.D., Somers D.A., Griesbach R.J. Advances in alternative DNA delivery techniques // Plant Cell Tissue Org. Cult. 1995. - Vol. 40. - P. 1-15.

199. Stachel S.E., Messens E., van Montagu M., Zambryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens II Nature. 1985. - Vol. 318. - P. 624-629.

200. Stachel S.E., Nester E.W., Zambryski P.C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. -Vol. 83.-P. 379-383.

201. Stachel S.E., Zambryski P.C. Vir A and virG control the plantinduced activation of the T-DNA transfer process of A. tumefaciens II Cell. 1986. - Vol. 46. - P. 325-333.

202. Staub J.M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P.T.J., Hunter P., Nehra N. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Nature Biotechnology:-2000.-Vol. 18.-P. 333-338.

203. Stoger E., Benito Moreno R. M., Ylstra B. Comparison of different techniques for gene transfer into mature and immature tobacco pollen // Transgenic Research. -1992.-Vol. 1.-P. 71-78.

204. Sudan C., Prakash S., Bhomkar P., Jain S., Bhalla-Sarin N. Ubiquitous presence of ^-glucuronidase (gus) in plants and its regulation in some model plants // Planta. -2006. Vol. 224. - P. 853-864.

205. Sundberg C.D., Meek L., Carroll K., Das A., Ream W. VirEl protein mediated export of the single-stranded DNA binding protein VirE2 from Agrobacterium tumefaciens into plant cells II J.Bacteriol. 1996. - Vol. 178, №4. - P. 1207-1212.

206. Sykes L.C., Matthysse A.G. Time required for tumor induction by Agrobacterium tumefaciens. II Appl. Environm. Microbiol. 1986. - Vol. 52, №3. -P. 597-598.

207. Sawada H., Ieki H., Matsuda I. PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains 11 Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. -P. 828-831.

208. Tague B.W., Mantis J. In Planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration // Methods Mol. Biol. 2006. - Vol. 323. - P. 215-223.

209. Tang K., Wu A., Yao J., Qi H., Lu X. Development mediated transformation and genetic analysis based selection // Acta Biotech. - 2000. - Vol. 20. - P. 175-183.

210. Tempe J., Petit A., Holsters M., Montagu M., Shell J. Termosensivity step associated with transfer of the Ti plasmid during conjugation possible relation to transformation in crown gall // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 711. -P. 2848-2849.

211. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium tumefaciens: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype // Cell. — 1984.-Vol. 37.-P. 959-967.

212. Thomashow M.F., Hugly S., Buchholz W.G., Reeves S., Thomashow L.S. Molecular basis for the auxin-independent phenotype of crown gall tumor tissues // Science. 1986.-Vol. 231.-P. 616-618.

213. Thompson C.J., Mowa N.R., Tizard R., Crameri R., Davies J.E., Lauwereys M., Botterman J. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus IIEMBO J. 1987. - Vol. 6. - P. 2519-2523.

214. Tian L., Levee V., Mentag R., Charest P. J., Seguin A. Green fluorescent protein as a tool for monitoring transgene expression in forest tree species // Tree Physiology. -1999.-Vol. 19.-P. 541-546.

215. Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M. Brettel R. Agrobacterium-mediated barley transformation // Plant J. 1997. - Vol. 11. - P. 13691376.

216. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends of Plant Science/- 1996.-Vol. 1.-P.178-184.

217. Toro N., Datta A., Carmi O.A., Young C., Prusti R.K., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens virCl gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer// J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 6845-6849.

218. Toro N., Datta A., Yanofsky M., Nester E.W Role of the overdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1988. -Vol. 85.-P. 8558-8562.

219. Urushibara S., Tozawa Y., Kawagishi-Kobayashi M., Wakasa K. Efficient transformation of suspension-cultured rice cells mediated by Agrobacterium tumefaciens II Breed. Sci.-2001.-Vol. 5.-P. 33-38.

220. Van Haaren M.J.J., Sedee N.J.A, de Boer H.A., Schilperoort R.A., Hooykaas P.J.J. Bidirectional transfer from a 24 bp border repeat of Agrobacterium tumefaciens. Nucleic Acids Res. 1988. - Vol. 16. - P. 10225-10236.

221. Veluthambi K., Ream W., Gelvin S.B. Virulence genes, borders, and overdrive generate single-stranded T-DNA molecules from the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - P. 1523-1532.

222. Volokhina I.V., Sazonova I.A., Velikov V.A., Chumakov M.I. Isolation, purification, and identification of the virulence protein VirE2 from Agrobacterium tumefaciens II Microbiol. Research. 2005. - V.160. - P. 167-178.

223. Wagner V., Matthysse A.G. Involvement of a vitronectin-like protein in ttachment of Agrobacterium tumefaciens to carrot suspension culture cells // J.Bacteriol. — 1992.-Vol. 174, №18. -P. 5999-6003.

224. Wallroth M., Gerats A.G.M., Rogers S.G., Fraley R. T., Horsch R. Chromosomal localization of foreign genes in Petunia hybrida // Mol. Gen. Genet. -1986.-Vol. 202.-P. 6-15.

225. Wan Y., Lemaux P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants II Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 37-48.

226. Wan Y., Widholm J.M., Lemaux P.G. Type I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize (Zea mays L.) // Plant J. 1995. - Vol. 196. - P. 7-14.

227. Wang K., Drayton P., Frame B., Dunwell J., Thompson J. Whisker-mediated plant transformation: an alternative technology // In Vitro Cell Dev. Biol. 1995. -Vol. 31.-P. 101-104.

228. Wang K., Herrera-Estrella L., Van Montagu M., Zambryski P. Right 25 bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essential for and determines direction of DNA transfer from Agrobacterium to the plant genome // Cell. 1984. - Vol. 38. -P. 455-462.

229. Wang K., Stachel S.E., Timmerman B., Van Montagu M., Zambryski P.C. Site-specific nick in the T-DNA border sequence as a result of Agrobacterium vir gene expression// Science. 1987. - Vol. 235. - P. 587-591.

230. Ward E.R., Barnes W.M. VirD2 protein of A. tumefaciens very tightly linked to the 5'end of T-strand DNA // Science. 1988. - Vol. 242. - P.927-930.

231. Watson B., Currier T.C., Gordon M.P., Chilton M.D., Nester E.W. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens 11 J. Bacteriol. — 1975. Vol. 123. -P. 255-264.

232. Weeks I.T., Anderson J.D., Blechl A.E. Rapid production of multiple independent line of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum) // Plant Physiol. — 1993. -Vol. 102.-P. 1077-1084.

233. Wenck A. R., Quinn M., Whetten R.W., Pullman G., Sederoff R. High efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine {Pinus taeda) II Plant Mol. Biol. 1999. - Vol. 39. - P. 407-416.

234. White P., Braun A.C. A Cancerous neoplasm of plants. Autonomous bacteria-free crown-gall tissue // Cancer Res. 1942. - Vol. 2. - P. 597-617.

235. Willmitzer L., Simons G., Schell J. The TL-DNA in octopine crown-gall tumors codes for 7 well-defined polyadenylated transcripts 1982 // EMBO J. Vol. 1. -P. 139-146.

236. Winans S.C., Kerstetter R.A., Nester E.W. Transcriptional regulation of the virA and virG genes of Agrobacterium tumefaciens II J.Bacteriol. 1988. - Vol. 170. -P. 4047-4054.

237. Wu H., Sparks C., Amoah B., Jones H.D. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat // Plant Cell Rep. 2003. -Vol. 21.-P. 659-668.

238. Wu H.M., Wang H., Cheung A.Y.A Pollen tube growth stimulatory glycoprotein is deglycosylated by pollen tubes and displays a glycosylation gradient in the flower// Cell. 1995. - Vol. 82. - P. 395-403.

239. Yang A., Su Q., An L. Ovary-drip transformation: a simple method for directly generating vector- and marker-free transgenic maize {Zea mays L.) with a linear gfp cassette transformation // Planta. 2009. - Vol. 229. - P. 793-801.

240. Yanofsky M.F., Lowe B., Montoya A., Rubin R., Krul W., Gordon M., Nester E.W. Molecular and genetic analysis of factors controlling hostrange in Agrobacterium tumefaciens II Mol. Gen. Genet. 1985. - Vol. 201. - P. 237-246.

241. Yanofsky M.F., Nester E.W. Molecular characterization of a host-range-determining locus from Agrobacterium tumefaciens 11 J. Bacteriol. 1986. — Vol. 168. — P. 244-250.

242. Ye G.N., Stone D., Pang S.Z., Creely W., Gonzalez K., Hinchee M. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation // The Plant J. 1999. - Vol. 19. - P. 249-257.

243. Yusibov V.M., Steck T.R., Gupta V., Gelvin S.B. Association of single-strand transferred DNA from Agrobacterium tumefaciens with tobacco cells // Proc. Natl. Acad. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 2994-2998.

244. Zaenen L., Van Larebeke N., Teuchy H., Van Montagu M., Schell J. Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains // J. Mol. Biol. — 1974.-Vol. 86.-P. 109-127.

245. Zale J.M., Agarwal S., Loar S., Steber C.M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Rep. 2009. - Vol. 28. -P. 903-913.

246. Zambrysky P., Depicker A., Kruger k., Goodman H.M. Tumor induction by A. tumefaciens: analysis of the bordaries of T-DNA // J. Mol. Appl. Genet. 1982. -Vol. 1.-P. 361-370.

247. Zhang F.L., Takahata Y., Watanabe M. Agrobacterium-mediated transformation of cotyledonary explants of chined cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis) // Plant Cell Rep.-2000.-Vol. 19.-P. 569-575.

248. Zhang H.M., Yang H., Rech E.L., Golds T.J., Davis A.S., Mulligan B.J., Cocking E.C., Davey M.R. Transgenic rice plants produced by electroporation mediated plasmid uptake into protoplasts // Plant Cell Rep. 1988. - Vol. 7. - P. 379-383.

249. Zhao Z.Y., Cai T., Tagliani L., Miller M., Wang N., Pang H., Rudert M., Schroeder S., Hondred D., Seltzer J., Pierce D. Agrobacterium mediated sorghum transformation // Plant Mol. Biol. 2000. - Vol. 44. - P. 789-798.

250. Zhou F.Y., Wang G.Y., Xie Y.J., Cui H.Z., Guo S.D, Dai J.R. Establishment of a genetic-transformation system for maize inbred P9-10 // Chin. Sci. Bull. 1999. -Vol. 44. - P. 624-627.

251. Zhu Z., Sun B., Liu C., Xiao G., Li X. Transformation of wheat protoplasts mediated by cationic liposome and regeneration of transgenic plantlets // Chin. J. Biotech. 1993.-Vol. 9. - P. 257-261.

Информация о работе

Моисеева, Елизавета Михайловна
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы