Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние типа экспланта и селективного агента на морфогенез и эффективность агробактериальной трансформации гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние типа экспланта и селективного агента на морфогенез и эффективность агробактериальной трансформации гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L.)"

На правах рукописи

МИРОШНИЧЕНКО Дмитрий Николаевич ' ^ ^

2 1 ш 2000

ВЛИЯНИЕ ТИПА ЭКСПЛАНТА И СЕЛЕКТИВНОГО АГЕНТА НА МОРФОГЕНЕЗ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ГВОЗДИКИ РЕМОНТАНТНОЙ (01'ап11т.ч сагуорИуПт Ь.)

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научные руководители:

кандидат сельскохозяйственных наук С.В.Долгов

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Е.В.Мамонов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.К.Завриев

кандидат биологических наук И.В.Орлова

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследователь-а институт селекции и семеноводства ов< ных культур РАСХН

Защита диссертации состоится «_» _ 2000

в_часов на заседании диссертационного совета Д.020.40.01 г

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адре 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельско зяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан «_»_2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета /1

кандидат биологических наук [ -7 С.А.Меликс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Цветоводство является одной из важных отраслей сельскохозяйственного производства. Основные доходы в этой области связаны со сре-вочными цветочными культурами, среди которых большое значение имеет гвоздика ремонтантная. Ежегодый годовой оборот от продажи гвоздики только на голландских аукционах составляет около 140 млн. долларов.

Несмотря на обилие и разнообразие сортов, работа по совершенствованию сортимента гвоздики ведётся непрерывно, поскольку требования рынка и вкусы покупателей постоянно меняются. Однако достичь желаемого сочетания характеристик в одном растении с помощью 'классических" селекционных программ не всегда удаётся, что связано с высокой гетерзиготностью генома большинства сортов. Сочетание классической селекции и генетической инженерии открывает большие перспективы по расширению существующего ассортимента.

В настоящее время достижения в области генетической инженерии цветочных культур, гораздо скромнее, чем для многих других сельскохозяйственных растений. Это связано с ограниченным числом методик трансформации, которые не всегда воспроизводимы. Тем не менее, гвоздика опережает остальные цветочные культуры по числу полевых испытаний (20), что указывает на важность и перспективность генно-инженерных манипуляций с этой культурой.

На сегодняшний день трансформация гвоздики является трудным и многоэтапным методом, сопряженным с подбором большого числа факторов для её успешного проведения. Но даже существующие методики, в силу важности этой культуры для цветоводства являются либо собственностью таких биотехнологических фирм, как DNA Plant Technology или Florigene, либо информация об эффективном протоколе трансформации ограничена, что не позволяет её воспроизвести, либо предлагаемая методика дает низкую частоту трансформации.

Настоящая диссертация посвящена определению оптимальных условий для быстрого агробактериального переноса генов в геном гвоздики ремонтантной и их экспрессии в растениях. Поскольку разработка такой системы требует изучения целого комплекса условий, нами рассмотрены различные аспекты, связанные с регенерацией побегов, касающиеся гормонального состава среды, генотипа, типа соматической ткани, физиологического возраста и происхождения эксплантов, а также значение гена селективного маркера и особенности экспрессии перенесенного гена.

Цели и задачи исследований

В задачи наших исследований входило подобрать условия для эффек тивной регенерации и трансформации гвоздики ремонтантной с помощьк Agrobacterium tumefaciens. Исходя из поставленных целей, нами решалис: следующие задачи:

1. Разработать методику регенерации гвоздики ремонтантной,

а) подобрать оптимальный гормональный состав среды для эффектив ной регенерации из различных типов эксплантов.

б) рассмотреть влияние физиологического возраста и происхожденн: экспланта на эффективность адвентивного органогенеза.

в) оценить регенерационный потенциал различных сортов и выделит: наиболее пригодные для генетической трансформации.

2. Разработать эффективную методику агробактериальной трансформа ции гвоздики ремонтантной в том числе:

а) оценить компетентность различных тканей гвоздики для успешно! агробактериальной трансформации;

б) изучить влияние селективного агента на эффективность трансформа ции.

в) воспроизвести методику трансформации на разных сортах гвоздики;

г) изучить особенности экспрессии репортерного гена в тканях транс генных гвоздик.

Научная новизна и практическая ценность исследований

Подобраны условия для эффективной регенерации побегов и различных эксплантов гвоздики. Показано влияние физиологическог возраста листовых и стеблевых эксплантов на эффективность регенераци!-Выявлены различия регенерационного потенциала листовых эксплантоЕ происходящих от растений iv vitro и in vivo. Впервые получен! трансгенные растения гвоздики одного генотипа с использование! различных типов ткани, что позволило определить оптимальный эксплан для агробактериальной трансформации. Впервые получены трансгенны растения гвоздики с использованием гена селективного маркер гигромицин-фосфотрансферазы. Достигнута высокая частот агробактериального переноса генов в геном гвоздики (более 10%' Впервые выявлена количественная экспрессия гетерологичного гена трансгенных растениях гвоздики.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатны работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, заключение, выводы, список литературы. Общий объем диссертации составляет 149 страниц. Включая 17 таблиц и 14 рисунков, библиография включает 258 наименований работ.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В исследованиях использовали 17 сортов гвоздики ремонтантной относящихся к двум садовым группам Spray и Standart (в работе сортам присвоены номера от Dial до D¡a33). Стерильные растения выращивали на среде МС содержащей половинный состав макроэлементов по Murashige и Skoog (1962), 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, 100 мг/л инозита и витаминов.

Регенерация. Для экспериментов использовали следующие эксплан-гы: лепестки, листья растений in vitro и in vivo, стеблевые сегменты. Экс-планты помещали на чашки петри, содержащие среду МС с добавлением различных регуляторов роста (ТДЗ, БАП, НУК). Регенерацию вели в темноте при температуре 22-25°С. Экспланты переносили на свежие среды с интервалом в 3-3,5 недели. Учитыв&чи два показателя - частоту регенерации и число побегов на одном регенерирующем экспланте. Полученные данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа: однофакторно-го и двухфакторного комплексов по методу Н.А.Плохинского (1980) и Г.Ф.Лакина (1990).

Трансформация. Для трансформации гвоздики применяли обезоруженные супевирулентные штаммамыЛ. tumefaciens на основе pTiBo542:

- СВЕ21 (Revenkova и др., 1993), содержащий бинарный вектор рВ1121, позволяющий вести селекцию трансгенной ткани в присутствии канами-цина

- ЕНА105 (Hood и др., 1993), содержащий бинарный вектор p35SGUSintr, позволяющий вести селекцию трансгенной ткани в присут-:твии гигромицина Б. Обе векторные конструкции также содержат репор-герный ген gusA.

Трансформацию проводили методом совместного культивирования эксплантов с ночной культурой Agrobacterium tumefaciens. Бактерии выращивали в течение ночи при 28°С на жидкой среде LB. Для инициации морфогенеза у листовых и стеблевых эксплантов в среду добавляли 1.0 мг/л БАП, 0.3 мг/л ТДЗ, 0.1 мг/л НУК, для инициации морфогенеза у лепе-:тковых эксплантов - 0.3 мг/л ТДЗ, 0.1 мг/л НУК. После периода ко-культивации экспланты помещали на среды регенерации с добавлением

бактериостатического антибиотика Клафорана (Руссель) и селективных антибиотиков канамицина и гигромицина Б (Sigma).

Анализ трансгенных растений. Геномную ДНК гвоздики выделяли с использованием 2х СТАВ буфера по методике Rogers и Benedich (1994). Для подтверждения интеграции генов nptllu hp! проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) геномной ДНК гвоздики. Для амплификации последовательности гена nptll использовали следующие олигонуклеотиды: 5'-TGCTCTGATGCCGCCGTGTTCC-3' и 5'-GCATGCGCGCCTTGAGCC TGG-3'. Длина амплифицируемого фрагмента - 423 п.н. Для амплификации последовательности гена hpi использовали олигонуклеотиды: 5'-TCGCATCGACCCTGCGCCC-3' и 5'-GCATCGGCCGCGCTCCCG-3'. Длина амплифицируемого фрагмента - 680 п.н.

Флюориметрическое и гистохимическое определение активности GUS выполнялось по методике Jefferson и др. (1987). Для флюорометриче-ского определения растительную ткань гомогенезировали в буфере для экстракции с добавлением или без добавления 1% поливинилполипироли-дона (PVPP).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Регенерация адвентивных побегов из различных эксплантов гвоздики.

Регенерагщя побегов из лепестковых эксплантов

Предварительная оценка разных методик регенерации показала, чтс лишь один из сортов (Dial2) проявлял некоторую морфогенетическую ак тивность при добавлении в среду цитокинина БАП. Изучение сочетанж различных концентраций ТДЗ и НУК на лепестках этого сорта показали что эффективность регенерации при добавлении ТДЗ значительно возрас тает (Табл. 1). При этом повышение концентрации НУК с 0.05 до 1.0 мг/л приводило к увеличению частоты регенерации на 7-28%, достигнув мак симума при 0.3 мг/л ТДЗ (79±5%).

Однако полученные побеги, имели предрасположенность к цветенш в условиях it 1 vitro, подтверждая некоторые сообщения о детермированно! развитии регенерантов тканей цветка. Учитывая эти данные, мы протеста ровали несколько генотипов с целью обнаружения таковых, которые спс собны образовывать нормальные вегетативные побеги. Исследования п казали, что ни один из сортов не образовывал нормальных растений. Ср( ди изученных генотипов достаточно высокой побегообразовательной

Таблица 1. Влияние фитогормонов на регенерацию адвентивных побегов из лепестков гвоздики Dial 2 (А - частота регенерации, Б - количест-_во побегов на регенерирующем экспланте)_

Конценра- ции ТДЗ, мг/л Концентрации НУК, мг/л

0.05 0.1

А Б А Б

0.1 60 + 6 4.5 + 1.3 77 ±5 4.6 ± 0.4

0.3 51+7 4.0 ±0.6 79 ±5 4.2 ±0.9

0.5 58 ±7 4.5 ±0.4 77 ±8 5.0 ±0.3

1.0 60 ±5 4.4 ±0.5 67 ±6 4.3 ±0.2

НСР05: общая - 18%, фактор ТДЗ - 12%, фактор НУК - 9%

способностью обладал генотип Dia8 (47±9%), у сортов Dia3, Dial5 и Dial8 интенсивность морфогенеза оказалась очень низкой (0-7%). Принимая во-внимание полученные результаты, дальнейшие исследования по индукции морфогенеза у лепестков были прекращены.

Регенерация побегов из листовых экстантов растений in vitro.

Исследование различных концентраций ТДЗ в сочетании с НУК выявили значительное варьирование частоты регенерации и числа адвентивных побегов у четырех сортов гвоздики (Табл. 2). Показано статистически достоверное влияние концентраций ТДЗ на морфогенетическую активность, в то время как влияние фактора концентраций НУК не обнаружено.

По морфогенетической реакции изучаемые сорта можно условно разбить на две группы. К первой следует отнести сорта Dial2, Dial 8 и Dia24, у которых при повышении концентрации ТДЗ от 0.5 до 1.5 мг/л наблюдали увеличение частоты регенерации, достигшее максимума при 1.5 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации до 2.0 мг/л приводило к снижению морфогенетической активности. Для второй группы (сорт Dia2) характерно последовательное увеличение регенерационной способности при росте концентраций ТДЗ, поэтому максимум (71%) отмечен при концентрации 2.0 мг/л.

Используя 1.5 и 2.0 мг/л ТДЗ в сочетании с 0.1 мг/л НУК мы изучили регенерационный потенциал 17 коллекционных сортов гвоздики. В качестве контроля в среду добавляли 1.5 мг/л БАП. Полученные данные свидетельствуют, что ТДЗ активнее стимулировал органогенез по сравнению с БАП (Рис. 1). Сравнивая два варианта ТДЗ необходимо отметить, что

Табл. 2. Влияние концентраций регуляторов роста на регенерационный потенциал листовых эксплантов гвоздики *

Концентра Со рта

ции, мг/л . Dia2 Dial 2 Dial8 Dia24

Частота регенерации (%)

ТДЗ 0.5 43±9а 77±6аб 56±7а 38±7а

ТДЗ 1.0 62±8б 74±7а 58—8а 58±8б

ТДЗ 1.5 66±7бв 89±5бв 81=66 61±8б

ТДЗ 2.0 71 ±7в 82±6бв 53:8а 56±8б

НУК 0.05 56±7а 81±6а 62±7а 53±7а

НУК 0.10 63±7а 79±6а 59±7а 53±8а

НУК 0.15 64±8а 82±5а 65±7а 50±7а

*- указаны среднегруповые значения для концентрации фитогормона

для большинства генотипов (12 из 17) концентрация 1.5 мг/л является оп тимальной. Однако, некоторые сорта при концентрации 2.0 мг/л проявлял1 более высокую морфогенетическую активность, причем в случае геноти пов Dia8 и Dia33 подтвержденную статистически (Рис. 1). С другой сторо ны, при добавлении БАП число побегов на экспланте превышало таково в вариантах ТДЗ, при этом статистически достоверная разница обнаружен у 8 из 17 сортов.

Максимальная частота регенерации сохранилась у генотипа Dial2 ка в контрольном варианте (80±6%). так п в одном из вариантов ТДЗ (93±4°/с подтверждая его высокий морфогенетический потенциал, наблюдаемы при использовании лепестков. Среди изученных сортов выделилась групп (Dia2, Dia8 и Dial8), которая при добавлении ТДЗ имела очень высок}^ способность к адвентивному органогенезу (частота регенерации боле 70%). В то же время, треть изучаемых сортов имела низкий морфогенетг ческиП потенциал (менее 40%).

Оба фитогормона вызывали некоторые нежелательные явления в время регенерации: ТДЗ приводил к витрификации и частичной фасциг ции адвентивных побегов; БАП вызывал быстрое старение и некроз тк< ней эксплантов. С целью совершенствования условий регенерации м провели эксперименты по одновременному использованию различны концентраций ТДЗ и БАП в сочетании с 0.1 мг/л НУК.

Исследования, проведенные на листовых эксплантах генотипа Dial: показали, что для успешного морфогенеза можно использовать различньк

6-БАП 1,5 мг/л и ТДЗ 1,5 мг/л ■ ТДЗ 2,0 мг/л

К!

ГО

са

го го

св

О О

Рис 1. Влияние фитогормонов на частоту регенерации адвентивных побегов различных генотипов гвоздики ремонтантной. Во всех вариантах добавляли 0.1 мг/л НУК. НСР05: концентрации фитогормонов - 7.5%, сорта - 16.2%

сочетания ТДЗ и БАП, среди которых вариант 1.0 мг/л БАП+0.3 мг/л ТДЗ является предпочтительным.

Используя данное сочетание, мы провели оценку регенерационного потенциала листовых эксплантов сортов Dia2, Dia3, Dia8, Dial 0, Dial2 и Dial5 имевших высокую частоту регенерации при использовании 1.5 мг/л ТДЗ. Сочетание концентраций ТДЗ и БАП позволило сохранить у большинства генотипов высокую частоту регенерации и одновременно с этим увеличить число адвентивных побегов. Однако избежать появления каллуса до конца не удалось, хотя число побегов проявляющих признаки вит-рификации и фасциации сократилось. Указанное сочетание фитогормонов мы использовали в дальнейших исследованиях.

Влияние возраста экстантов на эффективность морфогенеза.

У видов семейства Caiyophylacea листья имеют супротивное расположение на побеге. Поэтому, у гвоздики можно легко разделить пары листьев и находящиеся между ними междоузлия по возрасту и изучить его влияние на морфогенетическую способность с целью максимально повысить частоту регенерации. Мы сравнили регенерационный потенциал листовых эксплантов первой, второй, третьей и четвертой пар листьев (от апикальной меристемы) взятых от растений in vitro и in vivo, а также первого, второго и третьего междоузлий растений in vivo используя сорта Dia2, Dia8 и Dial 2.

Наибольшую частоту регенерации у всех сортов проявляли экспланты второй пары листьев. Эта тенденция хорошо заметна как у эксплантов растений in vitro (67-97%), так и in vivo (74-96%). Листовые экспланты растений in vivo имели более высокие показатели регенерации, особенно касательно числа побегов на одном регенерирующем экспланте. При исполь зовании растений in vitro наименьшую частоту адвентивного органогенез; показали экспланты четвёртой пары листьев, в то время как у растений it vivo низкая эффективность морфогенеза наблюдалась чаще у экспланто! первой пары листьев. Отличие регенерационного потенциала мы объясня ем различной дифференцированностью клеток и разницей уровня эндо генных регуляторов роста. Поэтому экспланты, взятые от разных пар ли стьев, т.е. имеющих различный физиологический возраст по-своему pea тируют на индукцию экзогенными фитогормонами, что отражается на и: морфогенетической способности.

Частота регенерации, зависела не только от возраста эксплантов, но от генотипа, причем, если у листьев растений in vivo доля влияния факте

ров "генотип'7"пары листьев" была примерно одинакова (47 и 45%), то в случае листьев растений in vitro генотип определял 77% наблюдаемого варьирования.

Табл. 3. Влияние возраста листовых эксплантов на регенерацию (А- частота регенерации, %, Б- число побегов на экспланте, шт)

Проис Сорта

хожд. Dia2 Dia8 Dial 2

эксп А Б А Б А Б

ланта листья растений in vitro

1 пара 54±8аб 3.3±0.4а 57±9б 4.3±0.9аб 92±4ав 3.8±0.5абв

2 пара 67±8в 4.3±0.5б 73±8в 4.0±0.5аб 97±2в 5.4±0.3г

3 пара 64±8бв 3.8±0.6аб 50±9б 4.5±1.25 90±4ав 4.4±0.4бв

4 пара 46±8а 3.0±0.4а 37±8а 3.5±0.9а 87±5а 3.2±0.1а

листья растений in vivo

1 пара 25±10а 9.5±1.1абв 44±12а 9.4+1.36 77±8а 5.1±1.4а

2 пара 74±7г П.7±2.4бв 89±5в 12.2±0.8в 96±3б 13.5±1.4б

3 пара 62±8в 9.1±1.0аб 75+76 5.6±1.2а 96±3б 12.0+1.26

4 пара 37±8б 7.0±1.4а 37±8а 5.3±1.2а 83±5а 11.2+2.26

Регенерация побегов из стеблевых эксплантов растений in vivo в целом, оказалась менее успешной, чем регенерация из листьев. Однако влияние возраста междоузлий на регенерацию оказалось очевидным, поскольку частота регенерации определялась фактором "возраст междоузлий" на 95%, и примерно повторяет картину, наблюдаемую у листовых эксплантов.

Стеблевые экспланты первого междоузлия формировали побеги с частотой 57-64%, второго - 25-54%, третьего - 9-16%. В отличии от листовых и лепестковых эксплантов, формирующих побеги исключительно на проксимальном срезе, на стеблевых эксплантах адвентивные побеги формировались по всему периметру экспланта.

Однако по сравнению с листьями, междоузлия являются менее удобными объектами, поскольку имеют очень маленькие размеры. Это затрудняет работу с ними и не позволяет получать больше одного-двух стеблевых эксплантов с одного междоузлия.

Генетическая трансформация гвоздики ремонтантной.

Чувствительность экспчантов гвоздики к селективным агентам.

Полученные нами результаты свидетельствуют, что селективные агенты канамицин и гигромицин способны ингибировать регенерацию адвентивных побегов у различных эксплантов гвоздики. Лепестки являются самой чувствительной тканью. Даже небольшие концентрации антибиотиков (25 мг/л канамицина, 5 мг/л гигромицина) приводили к резкому снижению регенерационного потенциала.

Листовые экспланты, оказались более устойчивы к тем же концентрациям селективных агентов. Низкие концентрации канамицина и гигромицина почти не оказывали сильного ингибирующего действия. При добавлении канамицина заметное снижение морфогенетической активности наблюдалось у листовых эксплантов лишь при 75 мг/л и выше. Гигромицин оказался намного более жестким селективным агентом, при этом толерантность листьев in vitro и in vivo к нему отличалась. Однако, концентрация антибиотика 20 мг/л одинаково успешно подавляла адвентивный органогенез листовых эксплантов обоих типов.

Исходя из полученных данных, для селекции трансформантов использовали 100 мг/л канамицина для лепестков и 200 мг/л для листовых эксплантов; 20 мг/л гигромицина для всех типов эксплантов.

Агробактериапьная трансформация различных типов ткани гвоздики.

После инокуляции штаммом СВЕ21 (вектор рВ1121) лепестковых и листовых эксплантов генотипа Dial 2 получили несколько канамицин-устойчивых побегов (около 1-0.5% от числа инокулированных эксплантов), способных расти на среде селекции. Однако гистохимический и флюорометрический анализ не обнаружил активность репортерного гена в тканях ни одной из линий. Проведенный в дальнейшем ПЦР анализ также показал отсутствие фрагментов гена nptll в геноме всех полученных линий.

При трансформации штаммом ЕНА105 (вектор p35SGUSint) лепестковых эксплантов мы получили 4 независимых антибиотик устойчивых линии (Табл. 4), в тканях двух из которых наблюдали глюкуронидазную активность, подтвержденную гистохимическим и флюорометрическим анализом.

После кокультивации листовых эксплантов генотипа Dial2 со штаммом ЕНА105 нами получено 38 гигромицин-устойчивых линии. Частота их образования заметно различалась (Табл.4). У листьев in vivo она оказа-

lacb низкой (0.5%), у листьев растений in vitro, наоборот - высокой 11.5%). Гистохимический анализ показал, что большая часть этих линий 36 из 38) обладала GUS активностью. Однако у линий LG3 и LV4 GUS 1ктивность не была обнаружена даже более чувствительным флюоромет-шческим методом.

Интеграция гена hpt в геном гвоздики подтверждена методом ПЦР Рис. 2а,б). Во всех изученных линиях амплифицировался фрагмент ожи-1аемой длины - 680 п.н, включая линии PI, РЗ, LG3 и LV4 не обладающие 3US активностью.

Ранее сообщалось, что для эффективного переноса гетерологичных ■енов в геном гвоздики с помощью агробактериального метода можно ис-юльзовать стеблевые экспланты (Lu и др. 1991). Однако многие исследо-зательские группы не сумели воспроизвести данную методику, основанию на применении канамицина в качестве селективного агента. В эксперименте со стеблевыми эксплантами мы использовали векторную конструкцию p35SGUSint ведя селекцию с использованием гигромицина. После кокультивации 206 стеблевых эксплантов генотипа Dial 2 со штаммом ЕНА105, мы получили три независимых линии. Побеги этих линий пегко размножались и укоренялись в присутствии 20-60 г/л антибиотика и внешне ничем не отличались от нетрансгенных растений, культивируемых в тех же условиях на средах без антибиотиков. Трансгенная природа полученных гигромицин-усточивых побегов подтверждалась экспрессией гена gitsA в различных тканях и включением в геном растений гена устойчивости к гигромицину (Рис 2в). Таким образом, частота трансформации стеблевых эксплантов составила 1,5±0.9%.

Достигнутая эффективность трансформации примерно сопоставима с частотой, полученной Lu и др. (1991). Но, учитывая, что лишь 58-59% из полученных исследователями NPTII-позитивныхпроростков обладали GUS активностью, эффективность переноса репортерного гена в наших исследованиях оказалась выше.

Значение селективного агента и типа экстанта на эффективность трансформации.

Полученные нами данные свидетельствуют, что селективный агент оказывал существенное влияние на частоту трансформации гвоздики ремонтантной. Канамицнн недостаточно эффективно подавлял рост нетрансгенных адвентивных проростков, так как полученные побеги оказались псевдо-трансформированными. Известно, что канамицин проникает

Табл. 4. Эффективность агробактсриальной трансформации гвоздики ремонтантной при использовании раз_личных векторных конструкций и типов экспланта._

Векторная Число Количество Положи- Частота Количество Доля GUS

Тип экспланта конструк- эксплан- антибиотик- тельный трансфор- GUS пози- позитив-

ция тов позитивных ПЦР мации (%) тивных ных линий

линий анализ линии (%)

Dial 2

Лепестки pBI 121 542 1 0 0 - -

p35S GUSint 750 4 4 0.5 ± 0.4 2 50

Листья раст. in vivo pBI 121 830 9 0 0 - -

p35SG USint 558 3 3 0.5 ± 0.4 2 67

Листья раст. in vitro pB 1121 647 6 0 0 - -

p3SSGUSint 305 35 35 11.5+ 1.8 34 95

Стеблевые сегменты p35SGUSint 206 3 3 1.5 ± 0.9 3 100

Dia2

Листья раст. in vivo p3 5SGUSint 210 1 1 0.5 ± 0.4 1 100

Листья раст. in vitro p35 SG USint 308 6 6 2.0 ± 0.8 6 100

Dial 5

Листья раст. in vitro p3 5SG USint 65 1 1 1.5 ± 1.1 1 100

з клетки растений только диффузно через межклеточное пространство и не способен передвигаться по клеткам проводящих тканей. В связи с этим возможно образование химерных побегов выживающих за счет NPTII активности трансгенных клеток экспланта и питательных веществ внутренних слоев.

Отсутствие трансгенных проростков при селекции на канамицине также может быть следствием особенности конструкции бинарного вектора, поскольку мы использовали плазмиду рВЛ21 где nptll ген находился под действием слабого нопалинового промотора. Тогда как его замена на более сильный промотор 35S CaMV, позволило нескольким группам исследователей получить трансгенные побеги (Lu и др., 1990; Van Altvorst и др., 1995; Zuker и др., 1997). Однако частота трансформации оставалась по-прежнему низкой.

Применение гена hpt в сочетании с жёсткой селекцией с применением гигромицина позволило нам преодолеть главный недостаток протоколов трансформации гвоздики, где для селекции использовали канамицин (nptll), генетицин (nptlT) и биалофос (bar), а именно, образования большого числа нетрансгенных побегов среди относительно малого трансгенных. Высокая ингибирующая активность гигромицина, скорее всего, является следствием более эффективного связывания этого вещества со своей мишенью в клетках гвоздики и его способностью активно диффундировать по растительным тканям.

Как правило, успешный перенос генов в растительный геном возможен при наличии эксплантов, ткани которых компетентны для адвентивного органогенеза. Известно множество методик успешной регенерации побегов из эксплантов разных органов гвоздики и растений различного физиологического состояния (тепличных и in vitro) (Zuker и др., 1998). Однако данные, касающиеся оптимального типа ткани для трансформации, не многочисленны и противоречивы. В одних работах ими были листья или сегменты стебля, в других - лепестки.

Данные, полученные нами в результате трансформации p35SGUSint, показывают, что ткани листьев растений in vitro являются более компетентными для успешного агробактериального переноса ДНК, чем эксплан-ты тепличных растений (листья, лепестки и стеблевые экспланты). Частота трансформации генотипа Dial2 при использовании листьев in vitro составила 11.5%, тогда как листовые и лепестковые экспланты тепличных растений, несмотря на свой высокий регенерационный потенциал, формировали трансгенные побеги с частотой 0.5, а стеблевые экспланты - 1.5%.

Мы провели трансформацию листовых эксплантов гвоздики генотипе Dia2 штаммом ЕНА105 (Табл. 4). В результате этого эксперимента получили 7 трансгенных линий: одну - из листьев in vivo (частота трансформации 0.5±0.4%), шесть - из листовых эксплантов растений in vitre (1.5±0.9%). Все линии обладали GUS активностью и содержали в геноме ген гигромицин-фосфотрансферазы перенесенный путем трансформации (Рис. 2в). Таким образом, данные, о высокой компетентности листьев ir vitro для агробактериальной трансформации подтверждены на двух генотипах гвоздики.

Разница в компетентности, вероятно, вызвана различным физиологическим состоянием клеток изучаемых эксплантов. Клетки листьев in vitro скорее всего, имеют более тонкие клеточные стенки, что облегчает перенос ДНК из бактериальной плазмиды в геном гвоздики. Небольшой рост частоты трансформации стеблевых сегментов скорее всего объясняется и> способностью образовывать побеги по всему периметру экспланта. Лепестки, можно признать самым неудачным типом ткани, поскольку из-за постоянного образования цветков их побеги не удалось адаптировать к условиям in vivo и получить нормальные фертильные растения.

Изучение экспрессии gusA гена в различных органах трансгенных линш гвоздики ремонтантной.

Основная задача генетической трансформации растений - эффективная экспрессия перенесенных гетерологичных генов. Важно знать в каки> тканях и на какой стадии развития растения следует ожидать появленш белков, кодируемых переносимыми генами. Используя векторную конструкцию p35SGUSint мы получили большое число трансгенных линиР гвоздики, в тканях которых наблюдалась активность ß-глюкуронидазы.

Гистохимический анализ различных органов трансгенных линий показал, что наиболее интенсивная активность gusA гена проявляется в тканях проводящей системы растений - камбиальном слое побега, цветоложе состоящем из большого числа проводящих пучков, нижней части лепестков и тычиночных нитей.

Высокая активность ß-глюкуронидазы обнаружена в активно делящихся меристематических клетках корневого чехлика и молодых клетка? дифференцирующихся тканей корня, а также клетках апикальной меристемы побегов. В листьях GUS активность проявлялась достаточно активно в клетках паренхимы. Причем у линий, листья которых имели частичное окрашивание, более интенсивная синяя окраска обнаруживалась в

679 пн 521 пн

257 пн 8 пн

со э о о.

_ > О d

<§ >

in

CNI

^ d d d d

S >

~ ?f if if-W f W p>'111:

-679 пн -521 пн

• 257 пн ■ 118 пн

772 пн 696 пн

Рис 2. ПЦР анализ трансгенных растений гвоздики ремонтантной. Электрофорез продуктов, образовавшихся в результате амлификации проб ДНК с праймерами специфичными для гена hpt.

A. М - маркер pGem2/AluI; pGUS/ii/ - плазмида pGUS/w; I-C - нетрансгенное растение гвоздики генотипа Dial2; I-P - линии, полученные из лепестковых эксплантов генотипа Dial2; I-Lg - линии, полученные из листьев растений in vivo генотипа Dial2;

Б. М- маркер молекулярного веса pGem2/A!uI; pGUS/nf - плазмида pGUSinr; I-C - нетрансгенное растение генотипа Dial 2; I-Lv - линии, полученные из листьев растении in \itro генотипа Dial 2.

B. М- маркер pUCI9/NciI; pGUS/н/ - плазмида pGUSml: 11-С - нетрансгенное растение гвоздики генотипа Dia2; Il-Lgl - линия. полученная из листьев растений in vivo генотипа Dia2; II-Lv - линии, полученные из листьев растении т vitro генотипа Dia2; I-C - нетрансгенное растение гвоздики генотипа Dial 2; I-S - линии, полученные из стеблевых эксплантов генотипа Dial2.

проксимальной части листьев, что позже подтвердилось флюорометириче-ским анализом.

Нами изучено влияние поливинилполипиролидона (PVPP) на значение GUS активности, определяемое флюорометрическим методом. Kai показывают полученные результаты (Табл.5), использование буфера с 1°/ PVPP позволяет увеличить чувствительность определения GUS активно сти в трансгенных линиях гвоздики в 2-20 раз. Эффект увеличения выяв ляемой активности гена gusA, мы связываем со способностью PVPP аб сорбировать фенольные соединения при выделении растительных белков.

Таблица 5. GUS активность в трансгенных линиях генотипа Dial2 (Конт. • нетрансгенное растение, Р - трансгенные линии полученные из лепестков, LG - из листьев тепличных растений, LV - из листьев in vitro)

Окрашивание листо- GUS активность после

вой ткани после об- экстракции с MUG,

работки рМ 4-Ми/мин/1мг ткани **

Х-СШС, % * -PVPP + PVPP

Контроль 0 0.16±0.9 0.4110.25

LG1 >75 нт 12.8414.32

LG2 <50 2.90±1. 6.4911.58

LG3 0 0.5810.42 0.8210.33

LV1 >50 нт 24.23112.70

LV4 0 0.3810.20 0.4410.20

LV6 >50 2.7111.33 42.11116.19

LV10 <50 нт 6.8713.00

LV12 <50 0.9910.41 5.2811.54

LV17 <50 1.2010.94 22.8018.47

LV25 >50 1.6111.07 24.68110.68

LV30 >75 нт 28.2619.14

LV32 >75 нт 35.5112.32

нт - не тестировали

Используя методику экстракции с PVPP, мы провели флюорометр! ческий анализ листовых тканей некоторых трансгенных линий генотиг Dial2. В целом, наблюдали значительное варьирование GUS активное! между линиями, не всегда соответствующее тому, которое наблюдали пр гистохимическом методе анализа (Табл. 5). Это можно объяснить тем, чте

для гистохимического анализа мы использовали листья растений in vitro, которые выращивали на среде содержащей селективный антибиотик, тогда как для флюорометрического - листья тепличных растений, выращиваемых в естественных условиях.

Данные, полученные в результате анализа различных вегетативных и генеративных органов показывают, что наибольшая активность, как и при гистохимическом анализе, обнаруживается в тканях цветоложа, составляя 92,2 рМ4-МШмин/1мг ткани, что в 2-45 раз превышает значение GUS активности в других изучаемых органах (Рис 3.). В фотосинтезирующих тканях, таких как листья, стебли и чашелистики, значение GUS активности находилось примерно на одном уровне. Самая низкая активность - 2,11 рМ4-Ми/мин/1мг ткани - обнаружена в корнях.

Варьирование GUS активности у вегетативных и генеративных органов различного типа, скорее всего, является следствием действия 35S промотора. Это подтверждается некоторыми данными, полученными на других растениях (Benfry и др., 1989; Wilde и др., 1992; Holtorf и др. 1995).

Действием 35S промотора также можно объяснить более низкую

120 -,

я 100 Н я

н

U

80

60 -40 -j 20 -

о а. о ьг

й É

05 a се

О

н о и с и с;

ü s н о

s

о

3 rt У

о ¡F

О

s

3"

3

н

л п о ю о н о

(о

и *

о ч о н а> а =Г

Рис. 3. GUS активность в различных вегетативных и генеративных органах трансгенной линии LV6 генотипа Dial 2.

GUS активность в молодых листьях трансгенных растений в сравнении с более старыми, которую мы наблюдали при исследовании листьев первой, четвертой и восьмой пар листьев (относительно апикальной меристемы). То, что флюорометрическая активность gusA гена в листьях трансгенной гвоздики напрямую зависит от степени дифференциации ткани, подтвердило исследование экстрактов различных частей одного листа. Так, в менее дифференцированной проксимальной ткани активность оказалась вдвое ниже (40.1 рМ 4-Ми/мин/1мг ткани), чем в более зрелой дистальной (84.7 рМ 4-Ми/мин/1мг ткани).

Проведенные исследования показывают, что при использовании 35S промотора ген gusA успешно работает почти во всех тканях гвоздики ремонтантной, включая различные вегетативные и генеративные органы. Это позволяет надеяться, что при использовании этого промотора можно добиться достаточной экспрессии различных агрономически-ценных генов в растениях гвоздики.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные концентрации фитогормонов для получения высокой частоты регенерации с использованием различных типов экс-планта. Для листьев in vitro большинства сортов оптимальными являются концентрации 1,5 мг/л ТДЗ и 0,1 мг/л НУК. Для лепестковых - 0,3 мг/л ТДЗ и 0,1 мг/л НУК.

2. Для сокращения нежелательных эффектов, возникающих при использовании ТДЗ для регенерации из листовых эксплантов целесообразнее сочетать 6-БАП и ТДЗ, что позволяет избежать излишнего каллусообразо-вания и фасциации побегов, а также увеличить их число.

3. Отобраны 6 сортов гвоздики, обладающих высокой частотой регенерации.

4. Физиологическая стадия развития листовых и стеблевых эксплантов оказывает существенное влияние на регенерационый потенциал, поэтому для успешной регенерации следует использовать: вторую-третьк пары листьев растений in vivo, вторую пару листьев растений in vitro, стеблевые сегменты первого междоузлия побегов.

5. Проведена трансформация всех типов эксплантов, показывающая что частота образования трансгенных побегов значительно определяете* типом ткани. Листья растений in vitro являются более компетентными дл? успешного агробактериального переноса ДНК, чем экспланты тепличны? растений (листья, лепестки и стеблевые экспланты). Лепестковые эксплан

ы образуют цветочные бутоны in vitro, что не позволяет получить нор-1альные фертильные растения, адаптированные к условиям теплицы.

6. Показана зависимость частоты трансформации гвоздики ремон-антной от используемого гена-селективного маркера. Применение гена иромицин-фосфотрансферазы позволяет получать, независимо от типа кани и генотипа, трансгенные побеги, легко размножающиеся и укоре-1яющиеся при концентрациях гигромицина Б, превышающих летальные юзы для нетрансгенных растений в 10-15 раз. Показана неэффективность ена неомицин-фосфотрансферазы как гена селективного-маркера, по-:кольку селекция на канамицине не позволяет получать трансгенные побе-и.

7. Разработанная методика регенерации и трансформации позволила юлучить трансгенные побеги трех сортов гвоздики ремонтантной.

8. Интенсивность и локализация экспрессии гена GUSint в трансген-1ых линиях гвоздики определяется типом ткани, её дифференцированно-:тю и физиологическим возрастом. Показано 2-20 кратное увеличение )увствительности GUS экспрессии, выявляемой флюорометрическим методом, при добавлении поливинилполипиролидона в буфер для экстрак-дии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Мирошниченко Д.Н., Мамонов Е.В., Долгов C.B. Регенерация адвентивных побегов из различных эксплантов гвоздики ремонтантной [Dianthus caryophyllus L.) // Тезисы докладов II городской научной конференции молодых ученых города Пущино. 23-25 апреля 1997 г. С. 59-60.

2. Мирошниченко Д.Н., Долгов C.B. Генетическая трансформация гвоздики ремонтантной (Dianthus caiyophyllus L.) II Тезисы докладов III городской научной конференции молодых ученых города Пущино. 1998. С. 47.

3. Мирошниченко Д.Н., Долгов C.B. Генетическая трансформация гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L.) II Тезисы докладов VIII конференции "Новые направления Биотехнологии". Москва. 27-29 апреля 1998 г. С. 27.

4. Мирошниченко Д.Н., Долгов C.B. Генетическая трансформация гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L.) II Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова. Москва - Пущино. 2-12 ноября 1998. стр. 84.

5. Мирошниченко Д.Н., Мамонов Е.В. Использование генной инжеш рии в селекции цветочных растений // Известия ТСХА. Вып.1. 1998. С

6. Мирошниченко Д.Н., Долгов С.В. Влияние типа экспланта и селеь тивного агента на эффективность агробактериальной трансформации гво: дики ремонтантной (Dianthns caryophyllus L.) // Материалы IV Пущинско конференции молодых ученых города. Молекулярная биология и биохг мия / Биотехнология. Пущино, 1999. С. 38-39.

7. Мирошниченко Д.Н., Долгов С.В. Влияние типа экспланта на эффеь тивность агробактериальной трансформации гвоздики ремонтантно {Dianthus caryophyllus L.) при селекции на гигромицине Б // Генетик; 1999. Т. 35. №9. С. 1208-1213.

8. T.Yu.Mityshkina, D.N.Miroshnichenko, S.V.Dolgov. Genetic engineerin in breeding of ornamental cultures // In International Symposium о Engineering Plant for Commercial Products and Applications, 1-4 Octobe 1995, Kentuckky, USA. Abstracts: P. 32.

9. D.N.Miroshnichenko, T.Yu.Mitoushkina, S.V.Dolgov. Adventitious shoe regeneration from 'in vitro' leaf explants of carnation (Dianthus caryophylli, L.J II Theses of II International Symposium "Breeding, propagation in vitro an disease resistance of horticultural plants. Salaspils, April 16-18, 1996. P.27-28.

10. S.V.Dolgov, A.P.Firsov, V.G.Lebedev, T.Yu.Mityshkin; D.N.Miroshnichenko, S.A.Taran, K.S.Skryabin. Molecular breeding i horticulture // International Congress on Molecular Genetics. Cairo, Egyp February 21-25, 1998. Program and Abstracts: P. 38-39.

11. D.N.Miroshnichenko, S.V.Dolgov. Production of transgenic hygromyci resistance carnation {Dianthus caryophyllus L.) plants after cocultivation wit A.tumefacience II Abstracts of EUCARPIA 19th International Symposiur "Improvement of Ornamental Plants". Angers. July 1998. P. 16-17.

12. D.N.Miroshnichenko, S.V.Dolgov. Transformation of carnatio {Dianthus caryophyllus L.) // Abstracts of XXV International Horticultur; Congress. Brussels, 2-7 August 1998. P.437.

13. D.N. Miroshnichenko and S.V. Dolgov. Production of transgeni hygromycin resistant carnation (Dianthus caryophyllus L.) plants afte cocultivation with A. tumefaciens II Acta Hort. 2000. V. 255. P. 255-258.

120-132.