Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГЕНЕРАЦИЯ И ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РЕГЕНЕРАЦИЯ И ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ"

На правах рукописи

СОБОЛЕВА Анна Геннадьевна

РЕГЕНЕРАЦИЯ И ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафеяре сельскохозяйственной биотехнологии Мое ковской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева и в лаборатории биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель -Академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор В С Шевелуха

Официальные оппоненты -Доктор биологических наук Голденкова И В Кандидат биологических наук Ралдугина Г Н

Ведущая организация —

Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственном биотехнологии

Защита состоится 1' > ■ 2004 г в / / часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

МСХА

Автореферат разослан _» ■ ■ /' _2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

Карлов Г И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время сильно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано с увеличением роли клеточных культур • в фундаментальных исследованиях и с возможностью применения клеточных технологий в растениеводстве, селекции растений и в генетической инженерии.

Ремонтантные формы малины (Rubus idaeus) отличаются способностью формировать урожай на однолетних побегах. Технология их предусматривает осеннее скашивание отплодоносивших побегов, что позволяет решать проблемы зимостойкости, морозоустойчивости и препятствует перезимовке и размножению патогенов и вредителей. Но физиологические особенности развития ремонтантных форм обуславливают крайне низкую способность к вегетативному размножению. Разработка эффективной системы регенерации позволит решить проблемы размножения. А использование методов генетической инженерии может позволить решить ряд других проблем актуальных для ремонтантных форм: повысить вкусовые и технологические качества ягод, скороспелость и продуктивность растений; решить проблему устойчивости к вирусным болезням; создание сортов, устойчивых к экологически чистым гербицидам, позволит существенно снизить трудоемкость возделывания малины.

Для плодовых и ягодных культур возможности генной инженерии используются недостаточно из- за отсутствия эффективных методов регенерации растений из различного рода эксплантов.

Регенерация малины в большинстве работ получена на культуральных средах, где в качестве источника цитокининов использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП) (например Упадышев М. Т. и др., 1995). Существуют отдельные сообщения о возможности улучшения регенерации при использовании других типов цитокининов (Fióla J. A. et al., 1990; Millan-Mendoza В. et al., 1999). Однако для малины до сих пор не разработана эффективная универсальная система регенерации и генетической трансформации растений, пригодная для широкого круга генотипов. Регенерационная способность ремонтантных форм малины совсем не изучена. Поэтому работа в данном направлении является актуальной.

Цель исследования: определение оптимальных условий для проявления наибольшего регенерационного потенциала листовых эксплантов ремонтантной малины и подбор условий для генетической трансформации.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

ЦНБ МСХА

фО------

№

-Исследовать воздействие различных фитогормонов в системе т vitro и подобрать их оптимальные концентрации для получения побегов - регенерантов-регенерашш

-Изучить влияние внешних условий, типа экспланта, его физиологического состояния на проявление регенерационного потенциала различных генотипов Проверить с помощью ISSR-PCR наличие генетических изменений в полученных регенератах

-Выявить влияние агробакгерии на регенерацию и подобрать оптимальные способы инокуляции листовых эксплангов

-Подобрать условия для селекции трансформантов с помощью канамицина

-Получить трансгенные растения малины, содержащие селективные и ре-портерные гены и доказать присутствие вводимых генов в полученных растениях

Научная новизна исследований. В результате проведенных исследовании установлено

-Регенерационный потенциал эксплантов малины ремонтантной, полученной с участием межвидовой гибридизации, активно реализуется только в присутствии цитокининов структурного ряда дифенилмочевины, в частности ти-диазурона, а в присутствии 6-БАП (производное аденина) морфогенез практически отсутствует Другие фитогормоны, ауксины, АБК, существенно не влияют на процессы регенерации из листовых эксплантов

- В полученных регенерантах малины не обнаружено генетических отклонений от исходных форм при анализе методом ISSR-PCR с 9 праимерами, дающими наибольший полиморфизм на изучаемых генотипах ремонтантной малины

- В подобранных условиях стеблевой органогенез на листовых эксплантах малины идет двумя путями- как регенерация из субэпидермальных тканей без видимого каллусообразования (прямая регенерация) и как регенерация из первичного каллуса

- Ингибирующее действие, которое оказывает инокуляция A tumefaciens при регенерации из листовых эксплантов малины, зависит от способа инокуляции и может быть существенно снижено при включении в регенерационную среду АБК

- При использовании штамма A tumefaciens GANE 7, содержащего ген 66, влияющего на регенерацию, наблюдается значительное (полуторакратное) увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины по сравнению с контролем без инокуляции

- Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

- Определены селективные концентрации канамицина для использования на этапе регенерации из листовых эксплантов и для селекции полученных регенератов.

-Впервые получены трансформангы малины, содержащие зкспрессирую-щиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихеназы (lie В) вместе с геном устойчивости к антибиотику канамицину (nptll).

Практическая значимость работы. Разработанная система регенерации позволяет получать регенераты широкого спектра генотипов ремонтантной малины, где степень регенерации варьирует от 3,3 до 81 %. В силу отсутствия генетических отклонений эта система может использоваться для ускорения размножения ценных форм ремонтантной малины. Подобранные условия трансформации могут быть использованы для введения новых генов как с целью изучения генома и регуляторных элементов экспрессии, так и для придания малине новых хозяйственно ценных признаков.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научно-практических конференциях: «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001); «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харьков, 2003); V съезде общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003) и 4 региональных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая_таблиц и_рисунков.

Список цитируемых литературных источников включает_наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Объектом исследований является ремонтантная малина сложного межвидового происхождения, характеризующаяся плодоношением на побегах первого года, большой зоной плодоношения, ранней отдачей основного урожая, сниженной способностью к образованию корневой по-1 росли, вследствие чего эти формы ремонтантной малины имеют низкий коэффициент вегетативного размножения.

Культивирование ремонтантной малины проводили на питательных средах на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т, Skoog F, 1962) с увеличенной в три раза концентрацией хелата железа

Клональное микроразмножение проводили по методу, разработанному ранее для ремонтантной малины (Вовк В В , 2000), на среде МС, содержащей 2 мг/л 6-БАП, укоренение побегов проводили на среде МС, содержащей ИМК 0,5 мг/л

В опытах по регенерации изучали влияние гормональных факторов (тип цитокинина и его концентрация), влияние темновой прединкубации, а также физиологического состояния листового экспланта на регенерационную способность

Источником эксплантов служили листья и черешки, изолированные от укорененных ш vitro растений Для повышения выхода регенерантов экспланты первые 10 дней выдерживали в темноте с последующим переносом на свет Спустя 1,5-2 месяца определяли конечное число образовавшихся побегов и количество эксплантов, давших регенерацию

Отсутствие нарушений генома в полученных регенерантах доказывали, используя метод ISSR- PCR

Для трансформации использовали штаммы A tumefaciens любезно предоставленные лабораторией генетической инженерии растений ИОГен, Е 35S -L- hcB, Е 35S -hcB, Е-nptII Использованные вектора содержали ген устойчивости к канамицину под спиновым nos-промотором, ген репортерного белка ли-хеназы под промотором 35S Эта репортерная система основана на высокой термостабильности бактериального фермента лихеназы Clostridium thermocel-lum (Мусийчук К А 2001)

Кроме того, в опытах использовали штамм агробактерии GANE 7 содержащий ген ¿6, предоставленный институтом клеточной биологии и генетической инженерии национальной академии наук Украины Ген Ь6 участвует в тонкой регуляции действия цитокининов на растения, и способен приводить к увеличению регенерационной способности у табака (Кучук Н В , 1997)

Для снижения негативного действия агробактериальной трансформации на органогенез регенерационную среду дополняли АБК (3 мг/л) Опыты проводили в трехкратной повторности Трансгенную природу полученных растений доказывали методом PCR, в качестве праймеров использовали очигонуклеотиды, соответствующие последовательности гена nptll, длина амплифшшруемого фрагмента 791 п н

При демонстрации экспрессии в растениях генов Не Ь, кодирующих лихе-назу, использовали методику чашечного теста (Голденкова И. В., 2002).

За частоту регенерации принимали отношение количества регенерирующих эксплантов к общему числу эксплантов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины. Регенерация растений зависит от генетических особенностей выбранной культуры, сорта или формы, исходных органов и тканей для взятия -их возраста и физиологического состояния, используемых фитогормонов и их синтетических аналогов, концентраций выбранных гормонов, и условий, в которых культивируются экспланты - освещенности, температуры и т.д. На малине ремонтантной подобные исследования не проводились, а на малине обычных неремонтантных сортов регенерация наблюдалась лишь на некоторых сортах, и средний уровень регенерации был невысок (Хамукова Ф.Н., 1999).

Для определения оптимального гормонального состава среды для регенерации была выполнена серия опытов, в которых изучалась эффективность различных концентраций цитокининов аденинового структурного ряда (6-БАП) и ряда дифенилмочевины (тидиазурон и 4-пиридилфенилмочевина), их сочетание с индолилуксусной кислотой (ИУК) (Табл. 1), а также в других опытах и с ин-долилмасляной кислотой (ИМК).

Таблица 1

Влияние 6-бензиламинопурина и индолилуксусной кислоты на проявляемую регенерационную способность листовых эксплантов ремонтантной малины сорта Бабье лето-2.

Гормональный состав среды Частота регенерации, %

БАЛ 1,0мг/л 4,4 ± 3,8

БАЛ 3,0 мг/л 6,7 ±6,7

БАЛ 5,0 мг/л 4,4 ± 7,7

БАЛ 3,0 мг/л + ИУК 0,1 мг/л 4,4 ± 7,7

БАЛ 3,0 мг/л + ИУК 0,5 мг/л 2,2 ± 3,8

4-Ри 1,0 мг/л 35 ±10

4-Ри 2,0 мг/л 18,3 ± 10,4

ТОг 1,0 мг/л 16,7 ± 5,8

тог 2,0 мг/л 8,3 ± 5,8

Наибольший выход регенерантов (35 %) наблюдался в варианте с 4-Р1/ 1,0 мг/л Включение в регенерационную среду 6-БАП было малоэффективно при стимулировании регенерации из листовых эксплантов ремонтантной малины Включение в состав регенерационной среды ауксина ИУК не оказывало положительного влияния на проявляемую регенерационную способность TDZ в концентрации 1,0 мг/л способствовал регенерации на 16,7 % эксплантов, что в два раза ниже в сравнении с аналогичной концентрацией у 4-Ри Повышение концентрации тидиазурона способствовало уменьшению количества регенерирующих эксплантов, в последующих опытах сочетание ауксинов с тидиазуро-ном не повышало регенерацию В дальнейшей работе опыты проводили с TDZ как с более доступным препаратом

Подобранная оптимальная концентрация тидиаз урона составляла 0,1-0,2 мг/л (табл 2) При повышении концентрации наблюдалась витрификация и морфологические нарушения у регенерантов

Таблица 2

Влияние различных концентраций 1DZ на образование регенерантов на сорте Геракл в зависимости от физиологического состояния листа

Концентрация цитокинина Частота регенерации, %

1 лист ' 2 лист 3 лист

ТОг 0,05 мг/л 13 ±3 3*4 0

тог 0,1 мг/л 47 ±4 21 = 1 ' 1 ±4

тог 0,2 мг/л 63 ±5 20 г 5 0

Изучение зависимости регенерации от типа и физиологического состояния листового экспланта показало, что наибольшим регенерационным потенциалом обладали экспланты, высеченные из самых молодых тистьев (табл 2,3)

Таблица 3

Влияние физиологического возраста листьев на способность к регенерации на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 (ТОХ -0,1 мг/л)

Вид экспланта Регенерация побегов, %

1 лист (самый молодой) 81 ± И

Черешок 1 листа 62 ±4

2 лист 20 ± I

Черешок 2 листа 7 ± 5

3 лист 3 + 2

Наибольшей регенерационной способностью обладали самые молодые листья. На 81 % таких эксплантов образовывались регенеранты. Уже после 5 дней культивирования на свету на жилках эксплантов формировался каллус, который спустя еще 7 дней дал первые регенеранты. На 62 % черешков первых листьев образовались побеги. Второй лист обладал существенно более низким ре-генерационным потенциалом - 20 %. Использование третьего листа в опытах для получения регенерантов является нецелесообразным, так как регенерация побегов на эксплантах происходит на очень низком уровне - 3%.

Обнаруженная зависимость, по видимому, объясняется тем, что самые молодые листья не закончили или только закончили рост, и в них еще остались фитогормоны, стимулирующие их развитие и положительно влияющие на регенерацию, кроме того, в этих листьях клетки делятся более активно и не полностью прошли процесс дифференцировки.

Большинство авторов говорят о положительном влиянии периода темновой прединкубации эксплантов на проявляемую ими регенерационную способность. Хамукова Ф. Н. советует выдерживать экспланты малины и земляники в темноте в течение 12-15 суток (Хамукова Ф. Н., 1994). Две недели в темноте выдерживали экспланты ежевики, стимулируя регенерацию на сорте Tayberry (Swartz Н. J. et al., 1990). Однако американские ученые нашли отрицательным влияние темновой прединкубации на регенерационную способность эксплантов малины красной (Fióla J. A. et al., 1990).

В результате опытов, проведенных в нашей лаборатории, мы выявили, что прединкубация листовых эксплантов ремонтантной малины в темноте первые десять дней понижает каллусообразование и повышает побегообразование на эксплантах ремонтантной малины (табл. 4).

Таблица 4

Влияние темновой прединкубациии на частоту регенерации побегов на листовых эксплантах ремонтантного сорта малины Бабье легго-2 (на среде с TDZ 0,1 мг/л)

Вариант опыта Образование каллуса, % Образование побегов, %

Контроль (свет) 50,0 9,1

2 дня темноты 41,7 25,0

10 дней темноты 31,3 31,3

Количество эксплантов, образующих каллус, при 10-дневной инкубации в темноте снижается с 50% до 31,3%, в то время как побегообразование возрастает более чем в 3 раза.

Возможно, повышение частоты регенерации вследствие темновой предин-кубации эксплантов порисходит за счет уменьшения фоторазрушения ауксинов, которые необходимы для индукции процессов деления клеток (Хамукова Ф Н , 1994)

Анализ срезов, сделанных на полученных регенерантах ремонтантной малины, свидетельствует о наличии двух типов регенерации в подобранных условиях. В первом случае регенерант развивался из субэпидермальных тканей, без видимого слоя каллусных клеток (прямая регенерация) В других случаях на массе образовавшихся каллусных клеток отчетливо видны обособившиеся эм-бриоидоподобные структуры При разработке методики регенерации предпочтение следует отдавать регенерации без образования каллуса, так как в этом случае более вероятно получение генетически однородного материала

Отработанная нами методика регенерации была использована для получения регенерантов 10 различных образцов ремонтантной малины Поскольку на-бчюдались существенные генотипические различия в отзывчивости на уровень гормонов в средах, в опытах использовали 4 различных концентрации гормона (табл 5)

Таблица 5

Частота регенерации из листовых эксплантов разшчных форм ремонтантной малины

№ Частота регенерации, %

п п Генотип ТОг 0,05г/л тиг о,1мг/л ТОг 0 2мг/л тог 0 5г/л

1 19-99-1 13,3 ±4,1 16,7 ±4,1 0 0

2 17-60-1 13,3 ± 8,2 6,7 ± 4 1 0 0

3 №24 16,7 ±3,7 3,3 0 0

4 4-43-2 0 3,3 0 0

5 2-205-1а 0 4,5 8,3 -

6 2-85-1 3,3 6,7 0

7 21-232-2 68,5 ±88 46,7 = 8,3 -

8 9-35-10 1 25,9 ±92 - -

9 1-98-10 1 6,7 ±4,1 - -

10 18-65-10 3,3 ±4,1 - -

11 Бабье лето-2 8,3 I 3,4 81 ± 1,0 46,7 21

12 Геракл 13 ±3,3 47,0 ± 4,3 63 ± 5,2 -

13 8-79-2 - 72,5 ±5,1 - -

14 14-205-27 25 ± 3,2 47,0 ± 7,5 32 ± 4,2 -

15 5-253-1 - 9,3 ± 1,4 1

Для большинства генотипов оптимальной является концентрация TDZ 0 1 мг/л При этом экспланты 33 % испытанных генотипов показали регенерацию более 47 % Экспланты 20 % образцов регенерировали с частотой от 16 до 47 % и 47 % испытанных форм регенерировали с частотой от 3,3 до 16%

Таким образом, в результате проведенной работы нами предлагаются следующие рекомендации для получения растений - регенерантов ремонтантной малины в качестве эксплантов следует использовать молодые листья от укорененных т vitro растений с надрезанной центральной жилкой, помещая их на среду, содержащую тидиазурон в концентрации 0,1 мг/л, первые 10 дней экспланты следует выдержать в темноте Посте регенерации побегов, последние переносят на среду для размножения, содержащую 2 мг/л 6-БАП, или же 2-3 недели выдерживают на безгормональной среде для повышения жизнеспособности

Выявление генетических изменений у полученных регенерантов ремонтантной малины. Изменчивость среди растений, регенерированных m vitro из соматических клеток, бывает очень высокой (R М Skrrvin,I978) Наиболее вероятными источниками генетической вариабечьности могут быть мутации, хромосомные нарушения, а также возникновение полиплоидных клеток (FD'Amato, 1977) Эти нарушения накапливаются при культивировании кал-лусных тканей (N Sunderland, 1977) При опредетении оптимальных условий получения регенерантов ремонтантной малины немаловажным условием является сохранение цечостности генотипа полученных побегов Следует отметить, что в наших условиях побеги регенерировали павным образом из субэпидер-мальных клеток без видимого образования каллуса или же из первичного каллуса Таким образом, этап культивирования каллуса, при котором наблюдается накопление генетических отклонений, был сведен до минимума Для подтверждения генетической идентичности полученных регенерантов с исходными генотипами мы провели сравнение продуктов ISSR-PCR полученных регенерантов с продуктами ISSR-PCR исходных генотипов

По результатам работ, ранее проведенных в нашей лаборатории, были отобраны олигонуклеотидные праймеры, дающие наибольший полиморфизм на различных генотипах малины

При сравнении продуктов PCR полученных регенерантов с продуктами PCR исходных форм различий найдено не было, что может служить доказательством генетической идентичности полученных регенерантов Таким образом, разработанная система регенерации может использоваться для получения генетически однородных побегов широкого спектра генотипов ремонтантной малины

Подбор оптимальных условий для трансформация листовых эксплан-тов ремонтантной малины. Для трансформации растений кокультивацией с А. Ыте/аЫет использовали различные модификации этого метода: 1. инкубация растительных эксплантов в жидкой бактериальной культуре; 2. нанесение капель жидкой культуры бактерии на листовые экспланты; 3. использование газона ночной культуры, куда помещают экспланты. При этом в каждом случае было подобрано оптимальное время кокультивации эксплантов с бактерией. В табл. 6 приведены результаты опыта, в котором проводилось сравнение различных способов инокуляции.

Таблица 6

Влияние способа трансформации штаммом агробактерии Е25Б-1.-НсВ листовых эксплантов малины сорта Бабье лето-2 на их регенерационную способность

Способ обработки эксплантов агробактерией. Количество зеленых эксплантов (через 14 суток), % Частота регенерации, (через 30 суток), %

Инкубация с жидкой культурой, 4 часа 31,76 ±4,2 0

Капли ночной культуры 95,94 ±1,5 66,46 ±3,1

Газон ночной культуры 97,89 ±1,2 75,06 ± 2,3

Вакуумная инфильтрация 93,77 ± 1,9 0

Из приведенной таблицы видно, что наиболее щадящими способами кокультивации являются нанесение капель ночной культуры на листовые экспланты и помещение листовых эксплантов на агробактериальный газон. Важно, что при этих способах кокультивации сохраняется высокий уровень регенерации побегов - 66% - 75%.

Как отмечалось ранее, регенерационная способность испытываемых форм ремонтантной малины во многом определяется особенностями генотипа. Таблица 7 демонстрирует, что снижение уровня регенерации после кокультивации с агробактерией также имеет сортоспецифичный характер.

Инкубация с агробактерией незначительно снижает проявление регенера-ционного потенциала эксплантов сорта Геракл, существенно снижает способность к образованию побегов у сорта Бабье лето-2 и форм 14-205-27 и 8-79-2.

Таблица 7

Влияние агробактерии штамма ЕЗбЭ-Ь-Ьс Ь на регенерационную способность, проявляемую различными генотипами ремонтантной малины

Генотип Регенерационная способность листовых эксплантов

Без кокультивации с arpo бактерией После кокультивации с агробакгерией

Бабье лето-2 95,57 ±5,31 54,00 ± 5,35

Геракл 95,00 ± 7,00 81,00 ± 1,22

14-205-27 87,00 = 7,53 56,33 ± 6,53

8-79-2 72,57 ^ 5,19 57,00 ±7,19

5-253-1 9,33 ± 1,47 3,93 ± 1,27

В литературных источниках встречаются данные о положительном влиянии абсцизовой кислоты на регенерационную способность при трансформации некоторых культур (Белоногова М А и др , 2003) С целью повышения выхода регенерантов мы также включали АБК в питательные среды, испытывая ее влияние на 4 образцах

АБК (3 мг/л) добавляли в состав регенерационной среды непосредственно после этапа кокультивации с культурой агробактерии Посте двух недель ее исключали из состава сред, так как дальнейшая культивация приводила к гибели экстантов Из результатов проведенных опытов мы сделали вывод о положительной роли АБК, которая снижает отрицательное влияние агробактерии на регенерационную способность после этапа кокультивации, хотя и не повышает степень регенерации в вариантах без инокуляции

Ряд форм ремонтантной малины обладают пониженным регенерационным потенциалом Мы провали опыт, в котором изучали возможность повышения регенерации из эксплантов малины при использовании штамма агробактерии GANE 7 (рис 1)

Результаты показывают, что использование данного вектора может значительно повысить частоту регенерации на листовых эксплантах форм, обладающих низким регенерационным потенциалом

Рис.1. Регенерация на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 после кокульти-вации со штаммом A. tumefaciens GANE 7.

Получение трансформированных растений очень облегчается при использовании селективных агентов. Используемые нами штаммы содержали прШ -ген устойчивости к канамицину (Км), позволяющий проводить селекцию. В литературных источниках встречаются данные о возможности использования Км в концентрации 25-50 мг/л для отбора растений - трансформантов рода 11иЬш. При помещении листовых эксплантов ремонтантной малины на такие концентрации антибиотика в наших опытах наблюдалась слишком быстрая гибель эксплантов. Это может препятствовать образованию регенерантов даже из трансформированных устойчивых клеток. Поэтому нами были проведены опыты по подбору концентраций канамицина, эффективно подавляющих регенерацию из ^трансформированных клеток, но обеспечивающих достаточно длительное выживание эксплантов (табл. 8).

Таблица 8

Регенерация на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 после контакта со штаммом агробакгерии Е353-Ь-Нс Ь, в присутствии канамицина.

Концентрации канамицина, мг/л. Частота регенерации (через 32 суток), %

0,5 56 ±2

1 48 ±3,5

1,5 42 ±4,5

2 30 ± 4,0

2,5 9 ±2,5

На основании полученных данных, для селекции трансформантов на этапе регенерации мы выбрали концентрацию канамицина 3 мг/л

Дополнительно можно проводить селекцию с помощью канамицина уже образовавшихся регенерантов Их чувствительность к антибиотикам значительно ниже В специальном опыте было установлено, что при концентрации 15 мг/л выживает 18,36±2,6 % регенерантов, полученных без селективного фактора на стадии регенерации при инокуляции А tumefaciens с геном nptll Все растения были зелеными и хорошо росли При использовании более низких концентраций канамицина клоротичные побеги сохранялись в течение длительного времени

Таким образом, для получения максимального выхода трансформантов у ремонтантной малины мы предлагаем двухэтапную схему селекции на этапе регенерации 3 мг/л канамицина, а затем 15 мг/л для сетекции образовавшихся побегов

Отобранные растения были протестированы на присутствие в них гена npt II методом PCR анализа Посте разделения продуктов PCR в агарозном геле, с помощью эпекгрофореза, мы набтюдали присутствие последовательности гена npt II в составе ДНК полученных побегов Рассчитанная по нуклеотидной последовательности длина амплифицируемого фрагмента 791 п н соответствова-ia экспериментальным результатам при использовании маркера молекулярных весов

Трансгенная природа полученных регенерантов была доказана также на чашечном тесте, где растите чьи ые экстракты некоторых побегов обладали ли-хеназной активностью

В литературных источниках имеются данные о трансформации малины вектором на основе А rhizogenes (Бурдейная Т В 2003) Некоторые генотипы ремонтантной малины отличаются низким коэффициентом укоренения при использовании методов укоренения разработанных в лаборатории биотехнологии Поэтому они служили модельным объектом при анализе компетентности ремонтантной малины к заражению А rhizogenes Использование А rhizogenes позволило повысить укореняемость в 3-4 раза Таким образом, клетки ремонтантной малины также компетентны для инокуляции А rhizogenes Практическое значение этого приема будет изучено позднее

Выводы

1. Разработана система регенерации из листовых эксплантов ремонтантной малины, которая позволяет получать от 3,3 до 81 % стеблевого морфогенеза в зависимости от генотипа.

2. показано, что использование Тидиазурона (цитокинин ряда дифенилмо-чевины) в 2-3 раза усиливает регенерацию ремонтантной малины по сравнению с действием б- БАЛ. Присутствие ауксинов существенно не влияет на процесс регенерации.

3. Выявлено два типа стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины: регенерация из субэпидермальных тканей без существенного каллусооб-разования (прямая регенерация) и развитие побегов из первичного каллуса.

4. С помощью метода ISSR- PCR с 9 различными праймерами показано, что побеги полученные при регенерации из листовых эксплантов не имеют генетических отклонений.

5. Установлено, что A. tumefaciens в значительной степени подавляет процессы регенерации, степень подавления зависит от генотипа и варьирует в пределах от 14 до 42 %. Оптимальными способами обработки эксплантов А. tumefaciens являются- использование газона ночной культуры или нанесение капель жидкой культуры на экспланты.

6. Абсцизовая кислота достоверно не увеличивает степень регенерации, но отмечено, что АБК уменьшала ингибирующее действие агробакгерии на процесс регенерации.

7. Значительное увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах ремонтантной малины наблюдается при использовании пггамма А. tumefaciens GANE 7, содержащего ген Ьб (влияющего на регенерацию).

8. Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

9. Получены трансформированные растения малины с генами nptll, lie В. Факт трансформации подтверждается устойчивостью растений к канамицину, анализом активности термостабильной лихеназы, PCR анализом на наличие гена nptll.

Практические рекомендации -разработанную методику регенерации можно использовать для размножения ценных образцов ремонтантной малины

- для селекции трансформантов ремонтантной малины предлагается использовать двухэтапную схему, 3 мг/л канамицина на этапе регенерации и 15 мг/т для образовавшихся побегов

-для повышения регенерационного потенциала некоторых образцов ремонтантной малины использовать штамм агробактерии GANE 7

-предложенная схема трансформации с помощью кокультивирования листовых эксплантов с культурой агробактерии может быть использована для получения трансгенных форм малины

Перечень работ опубликованных по теме диссертации

1. Соболев В. В., Сковородников Д. Н., Шматова А. Г.. Заякин В. В. Подбор Оптимальных сред для размножения различных генотипов ремонтантной малины. // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых: «молодые ученые - возрождению сельского хозяйства Росси в XXI веке». - Брянск, 2000. - С. 69-71.

2. Сковородников Д. Н., Соболева А. Г., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка системы регенерации адвентивных побегов применительно к ремонтантной малине // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». - Брянск, 2002. - С. 55-56.

3. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». - Брянск, 2002. - С. 56-57.

4. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Подходы к разработке метода трансформации ремонтантных форм малины через листовые экспланты // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». - Санкт-Петербург, 2001. - С. 72-74.

5. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты // Материалы П международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений». Харьков, 2003.- С. 8990.

6. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Регенерация и трансформация ремонтантной малины // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». -Пенза,2003.-С. 524.

7. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Влияние разных факторов на регенерацию ремонтантной малины из листовых эксплантов // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков». - Ярославль, 2003. - С. 51.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю академику РАСХН Шевелухс Виктору Степановичу за поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы Автор выражает пубокую признательность и благодарность профессору кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии, д б н Заякину Владимиру Васильевичу и заведующей тбораторией биотехнологии БГСХА, к б в Нам Ирине Яновне за огромную помощь при проведении исследований, обсуждении результатов, изложенных в диссертационной работе^ и ее подготовке Автор выражает благодарность аспирантам Соболеву Владимиру, Белоноговой Марине за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов, всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БГСХА, а также Шматовой Марии Павловне и Ясинской Валентине Павловне за понимание и поддержку.

Уст пл I 16 Зак 259 Тираж 100зкз

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская 44