Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Микроклональное размножение селекционных форм ремонтантной малины с использованием новых регуляторов роста

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Микроклональное размножение селекционных форм ремонтантной малины с использованием новых регуляторов роста"

ЧМ№

На правах рукописи

ОЗЕРОВСКИЙ

Александр Владимирович

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННЫХ ФОРМ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВЫХ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Брянск 2007

Работа выполнена в центре биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии в 2003-2006 гг

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор В.В ЗАЯКИН

Официальные оппоненты: - доктор сельскохозяйственных наук

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский

Защита состоится 30 мая в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220 005 01 при Брянской государственной сельскохозяйственной академии по адресу 243365, Брянская область, Выго-ничский район, п Кокино, Брянская ГСХА, корпус 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Брянской ГСХА Просим принять участие в работе Совета или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью

Автореферат разослан 30 апреля 2007 г

Каньшина Майна Владимировна

кандидат сельскохозяйственных наук Рожнов Николай Ильич

институт селекции плодовых культур

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат с - х наук, доцент

Общая характеристика работы

Актуальность темы Выращивание сортов ремонтантного типа, наряду с обычными сортами дает возможность создать в условиях средней полосы России конвейер поступления свежих ягод малины в течении 2,5-3 месяцев, начиная с конца июня и до наступления осенних заморозков

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП с начала 70-х годов прошлого века ведется интенсивная работа по созданию ремонтантных сортов малины, формирующих основной урожай в конце лета - начало осени на однолетних побегах Ремонтантные формы малины обладают низкими коэффициентами размножения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли Поэтому для ускорения селекционного процесса актуально использование метода микроклонального размножения растений Гибриды сложного межвидового происхождения резко отличаются по реакции на условия культивирования in vitro Поэтому для новых селекционных форм требуется индивидуальный подбор условий на всех этапах микроклонального размножения Следует отметить, что некоторые ремонтантные формы обладают низким коэффициентом размножения даже в культуре т vitro, поэтому применение новых препаратов стимулирующего действия является весьма актуальным

Цель и задачи исследований. Целью данной работы была оптимизация условий микроклонального размножения новых ремонтантных форм малины, испытание влияния новых регуляторов роста в культуре т vitro В ходе работы решались следующие задачи

- определение эффективности использования цитокинина CPPU на этапе введения в культуру т vitro и при получении регенерантов ремонтантных образцов малины,

- изучение реакции новых форм малины на условия микроклонального размножения,

- изучение возможности использования фитогеля в качестве желирую-щего вещества при микроклональном размножении,

- определения эффективности использования новых регуляторов роста при размножении ремонтантных формах малины в культуре in vitro,

- проверка сцепления молекулярного маркера с признаком ремонтантно-сти у новых селекционных форм малины

Научная новизна исследований. Подобраны условия для культивирования in vitro 52 новых ремонтантных форм малины Показана высокая эффективность CPPU на этапе введения в культуру новых форм ремонтантной малины, экспланты которых обладают низкой адаптивной способностью к условиям in vitro, а также при стимуляции регенерации побегов из листовых эксплантов

Впервые продемонстрирована высокая эффективность новых регуляторов роста растений негормональной природы при микроклональном размножении ремонтантной малины

Практическая значимость. Оптимизированные методики культивирования in vitro активно применяются для размножения новых элитных форм как на этапе первичных отборов, так и подготовки сортов для передачи в сортоиспытание За время работы в селекционный питомник передано 3772 растений 64 форм Применение микроклонального размножения позволяет ускорить селекционный процесс на 3-4 года

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета Агроэкологического института и научно-практических конференциях Брянской государственной сельскохозяйственной академии в 2004-2006 гг, изложены на Всероссийской научно-методической конференции «Состояние и перспективы развития яго-доводства в России» (Орел, 2006),

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и рекомендаций для практической селекции Работа содержит 18 таблиц и 15 рисунков Список использованной литературы включает 204 наименования, в том числе 87 на иностранных языках

Место, условия, материал и методика исследований. Исследования проводились в 2004-2006 годах в центре биотехнологии Объектом исследований являлись образцы ремонтантной малины сложного межвидового происхождения, полученные под руководством академика РАСХН И В Казакова Питательные среды готовились на основе минеральной части среды Му-расиге-Скуга (TMurashige & F Sroog, 1962), с увеличенной в три раза концентрацией хелата железа

Стерилизацию проводили в асептических условиях с помощью 0,1% раствора сулемы (хлорид ртути) в течении 3-5 минут, далее почки отмывали от стерилизующего раствора несколькими порциями стерильной воды в течении 10-30 минут

На этапе введения в культуре в качестве цитокининов использовали NDZ в концентрации 0,1 мг/л и CPPU в различных концентрациях

В опытах по регенерации изучали влияние различных концентраций CPPU и темновой инкубации на адвентивный органогенез ремонтантных образцов малины с использованием питательной среды МС

ISSR-ПЦР проводили по модифицированной методике Prevost и Wilkinson (1999)

Продукты ПЦР разделяли в 2%-м агарозном геле с буфером ТБЕ X 0,5 при напряжении 6 V/см После окрашивания бромистым этидием продукты ПЦР были визуализированы с помощью источника УФ света

Результаты исследований

Введение новых генотипов в культуру in vitro

В настоящее время введение новых сортов и образцов малины в культуру т vitro происходит в основном осенью После проведения осенних учетов в селекционных питомниках из многих тысяч исследуемых форм малины отбирается 12-20 перспективных Вводимые образцы отличаются значительным генотипическим разнообразием и сильно различаются по регенерацион-ныму потенциалу Поэтому при введении в культуру in vitro ремонтантных форм малины с использованием стандартных методик количество прижившихся меристем колеблется от 0 до 92% в зависимости от генотипа

На этапе введения в культуру т vitro фрагментов почек новых генотипов ремонтантной малины особая роль принадлежит используемому цитоки-нину, так как он стимулирует регенерацию и определяет адаптацию почек к условиям т vitro Ранее в лаборатории была показана более высокая эффективность цитокининов структурного ряда дифенилмочевины TDZ и 4-PU по сравнению с производным аденина (6-БАП) По литературным данным среди производных фенилпередилмочевины наибольшей активностью обладает хлорфенилпередилмочевина (CPPU) Для определения эффективности CPPU сравнили влияние этого препарата и TDZ на приживание почек и коэффициент размножения (табл 1)

Таблица 1

Влияние CPPU на адаптацию фрагментов почек ремонтантной малины в культуре т vitro

Концентрация цитокинина Форма 22-140-20 Форма 4-43-1

Количество прижившихся почек, % Коэффициент размножения побегов/экспл Количество прижившихс? почек, % Коэффициент размножения побегов/экспл

CPPU-0,05 мг/л 75±2,5 2,8 46,7±5,8 2,6

CPPU- 0,1 мг/. 77,7±5,3 1,5 81,1±1,9 2

CPPU-0,2 мг/л 80,5±7,3 3,6 94,4±9,6 4,6

CPPU-0,5 мг/л 83,3±4,4 6,7 73,8±5,8 8

CPPU-1 мг/л 97,2±4,8 6,85 42,4±6,2 3,9

TDZ-0,1 мг/л 79,7±7,2 3 35,5±3,8 6,6

При введении в культуру in vitro генотипа 22-140-20 большей приживаемостью (97,2%), обладали экспланты культивируемые на питательной

среде содержащей цитокинин CPPU в концентрации 1 мг/л, коэффициент размножения при этом составил 6,85 побега на эксплант Следует отметить, что при названной концентрации цитокинина отдельные побеги обладали признаками витрификации, то есть дальнейшее повышение концентрации цитокинина повлечет снижение жизнеспособности развивающихся побегов

Культивирование фрагментов почек на питательной среде содержащей CPPU в концентрации 0,1 мг/л обеспечило приживаемость 77,7% почек, в то время как тидиазурон в аналогичной концентрации стимулировал развитие 79,7% эксплантов

Экспланты формы 4-43-1 при включении в состав питательной среды тидиазурона в концентрации 0,1 мг/л приживались лишь на 35,5 % Использование хлорфенилперидилмочевины в аналогичной концентрации стимулировало развитие 81,1 % эксплантов, но коэффициент размножения при этом составил лишь 2 побега на почку, в то время как тидиазурон стимулировал образование в среднем 6 побегов на почку Применение CPPU в оптимальной концентрации 0,2 мг/л обеспечило повышение приживаемости эксплантов до 94,4 % Дальнейшее повышение концентрации цитокинина в питательной среде способствовало существенному снижению приживаемости фрагментов почек

Проведенные исследования позволили заключить, что CPPU более эффективен на этапе введения в культуру in vitro по сравнению с TDZ, но оптимальные концентрации CPPU выше в 2-10 раз

Сравнение эффективности использования желируюших веществ при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro

Одним из самых дорогих и дефицитных компонентов питательной среды является агар-агар Кроме того свойства этого вещества сильно колеблются в зависимости от фирмы производителя и партии препарата Поэтому многие фирмы проводят поиск более дешевых и эффективных заменителей агар-агара Одним из самых перспективных в этом отношении препаратов является фитогель Для многих видов растений фитогель обеспечивает получение даже лучших результатов по сравнению с агар-агаром Влияние фитогеля на размножение нескольких форм ремонтантной малины по сравнению с агар-агаром представлены в таблице 2

На этапе размножения в вариантах с использованием фитогеля наблюдалось образование большого количества мелких побегов, которые ко второму месяцу культивирования начинали бледнеть и погибать Значительная часть побегов была деформированной или витрифицированной В итоге гибель растений через полтора месяца культивирования составила от 26 до 79 % для различных форм малины Поэтому замена агара на фитогель на этой стадии не целесообразна

Таблица 2

Влияние желирующих веществ на жизнеспособность пробирочных растений на стадии размножения

Форма малины Фитогель Агар-агар

Кол-во растений, шт Погиб растения % Коэф размножения, шт/ экс Кол-во растений, шт Погиб растения % Коэф размножения, шт/ экс

8-79-2 275 79 0,6±0,5 381 3 3,1±0,4

40-241-1 225 26 3,4±0,3 184 7 3,8±0,3

7-56-1 77 49 1,2±0,6 115 4 3,2±0,2

8-202-1 108 31 0,7±0,5 102 6 2,8±0,3

18-183-1 121 34 1,6±0,3 157 8 4,1±0,4

Таблица 3

Влияние желирующих веществ на укореняемость побегов малины

Форма малины Фитогель Агар-агар

Количество растений, шт Укореняемость, % Количество растений, шт Укореняемость, %

40-241-1 338 92±7,3 254 83±5,2

8-202-1 106 46±4,1 172 56±4,2

32х 164 38±3,2 204 64±6,8

16-136-6 167 0±0 131 96±2,3

4-199-1 69 30±3,2 118 68±3,8

На этапе укоренения реакция растений различных форм малины на включение фитогеля в состав питательных сред сильно различалась (табл 3) Для большинства генотипов наблюдалось увеличенное каллусообразование, ухудшение укоренения, повышенная гибель растений, побеги становились более мелкими, а листья хлоротичными Например, на форме 4-199-1 88 % растений имеют каллус, укореняемость составляет только 30 %, а гибель растений составляет 13 % В варианте с использованием агар-агара в качестве

желирующнго вещества 68% растений этой формы образуют корни, каллусо-образование незначительное, гибель растений при этом составляет 5%

Наиболее значительное отрицательное действие фитогеля отмечалось на побегах формы 16-136-6 При этом наблюдалось полное подавление корнеоб-разования, в то время как при использовании агар-агара укореняемость составила 96 %

Исключением была форма 40-241-1 на побегах которой степень укоренения была в присутствии фитогеля не ниже, чем при содержании агар-агара, но приживаемость пробирочных растений в почвенном субстрате оказалась значительно ниже

Следует отметить некоторые особенности действия фитогеля на растения малины на этапе укоренения На многих генотипах наблюдалось образование боковых побегов, причем в некоторых случаях они появлялись не в нижней, а в верхней части побега около верхушки Например, на растениях формы 40241-1 количество образовавшихся побегов составило 4-5 побега на одном растении, в то время как на средах содержащих агар-агар ИМК полностью подавляет образование новых побегов

В целом можно заключить, что использование фитогеля вместо агар-агара при культивировании растений малины т vitro нецелесообразно

Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на их регенерационную способность в культуре in vitro

В данном опыте определяли влияние месторасположения изолируемой почки на стебле на коэффициент размножения в культуре in vitro в двух последующих пассажах Опыт был заложен на ремонтантных сортах малины Геракл и Бриллиантовая

Выделение эксплантов проводили в июне, когда растения имели хорошо сформированные почки В качестве эксплантов использовали фрагменты почек без кроющих верхних чешуй и пары зачаточных листочков

На рисунке 1 видно, что как для сорта Геракл, так и сорта Брилиантовая наблюдается закономерное увеличение коэффициентов размножения с 1 по 5-7 почку Это связано с тем, что глубина покоя почки находится в обратной зависимости от высоты ее расположения на стебле Кроме того, первая почка довольно мелкая, и постепенное увеличение размера почки приводит к возрастанию коэффициента размножения В дальнейшем наблюдается некоторое понижение активности почек Это можно наблюдать на почках 8-14 Можно предположить, что данный факт обусловлен дифференцировкой почек в цветочные Начиная с 15 почки наблюдается повышение активности меристем Это связано с тем, что верхушечные почки еще не прошли процесс дифференцировки

Во тором пассаже на сорте Бриллиантовая проявляются те же закономерности, но несколько сглаженные На „сорте Геракл выявленная зависимость во втором пассаже проявляется более четко, хотя в среднем коэффициенты размножения несколько снизились

} •

f I т I i .. T "

Тг*Г * * ^ .

1 1 - 1 ~ ш f 1 т ¥ -г f i

{ * i I

01 23456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ♦ Геракл ш Бриллиантовая I Номер почки на стебле

Рисунок 1 Коэффициент размножения почек малины ремонтантных сортов Геракл и Бриллиантовая во втором пассаже в зависимости от их положения на стебле

При введении в культуру фрагментов почек ремонтантной малины предпочтение следует отдавать почкам расположенным в верхней трети побега Они хорошо приживаются и обладают изначально высоким потенциалом-размножения Почки, расположенные в нижней трети побега крупнее и их проще выделять, однако они обладают низким коэффициентом размножения и худшей приживаемостью На почках расположенных в средней части побега идет процесс дифференцировки, вследствие этого приживаемость их на питательных средах снижается

Влияние регуляторов роста на развитие побегов малины в культуре in vitro.

В результате проведенных исследований по крупномасштабному испытанию вновь синтезированных веществ самой различной химической природы на наличие биологической активности были открыты новые регуляторы

роста Они используются в очень низких концентрациях, их применение весьма технологично и экономически эффективно

Форма малины 2-205-1а характеризуется низким корнеобразованием на питательных средах содержащих ауксины, в частности ИМК в оптимальной концентрации 0,5 мг/л В опытах определяли влияние регуляторов роста на укоренение побегов данного образца и формы 8-79-2 обладающей высокой корнеобразующей способностью (табл 4)

Таблица 4

Влияние регуляторов роста на укоренение побегов ремонтантных форм малины в культуре in vitro

Регулятор роста 2-205-1а 8-79-2

Концен- Укоре- Каллу- Коцен- Укоре- Каллу-

трация ненные сообра- трация ненные сообра-

регулятора, мг/л растения, % зование, % регулятора, мг/л растения, % зование, %

Конт- - 33±4,7 - - 65±5,8 22

роль

Эмис- 02 14±5,2 - 02 28±6,4 -

тим 0 04 17±4Д 7 0 04 46±3,2 24

0 008 42±3,5 3 0 008 79±3,7 62

0 0015 59±3,3 - 0 0015 89±3,6 53

0 0003 50±3,6 - 0 0003 83±3,0 42

цитрон 02 7±4,2 - 02 22±1,7 -

0 04 21±5,1 - 0 04 31±2,0 22

0 008 42±5,0 34 0 008 74±3,4 43

0 0015 59±3,6 17 0 0015 84±4,1 38

0 0003 55±3,3 0 0003 86±3,9 34

кавказ 02 15±2,0 - 02 25±2,7 -

0 04 13±2,7 - 0 04 52±2,2 -

0 008 41±4,3 - 0 008 71±3,4 34

0 0015 58±3,8 - 0 0015 94±8,2 56

0 0003 59±3,4 - 0 0003 87±6,1 53

* контроль ИМК 0,5 мг/л Регуляторы роста добавлялись в среду содержащую ИМК

Все препараты в концентрации 0,2 и 0,04 вызвали угнетение корнеобра-зования, а в концентрации 0,0015 и 0,0003 мг/л стимулируют корнеобразова-ние на обоих формах На форме 2-205-1а регуляторы вызвали увеличение укоренения с 33 до 59% то есть почти в два раза, а на форме 8-79-2 степень

укоренения повысилась с 65 до 86-94% Кроме того было замечено, что препараты значительно увеличивали высоту растений (в 1,5-2 раза), особенно это было заметно при воздействии эмистима и цитрона На форме 2-205-1а препарат цитрон и кавказ вызвали увеличение листьев пробирочных растений

Таблица 5

Применение регуляторов роста на ремонтантных формах малины в фазу размножения in vitro

Регулятор роста Форма 1-98-10 Форма 8-79-2

Концентрация Коэффициент Витри-фикация Концентрация Коэффициент Витри-фикация

регуля- размно- % регуля- размно- %

тора, мг/л жения тора, мг/л жения

кон- - 2,6±0,4 7 - 3,1 ±0,4 -

троль

Эмис- 1 0,2±0,1 - 1 0,1±0,1 -

тим 0,2 2,5±0,3 - 0,2 3,3±0,5 22

0,04 2,4±0,4 22 0,04 3,0±0,1 17

0,008 2,9±0,7 И 0,008 3,7±0,4 24

0,0015 3,4±0,2 - 0,0015 4,4±0,3 И

0,0003 3,1±0,5 - 0,0003 4,5±0,3 -

Креза- 1 0,1±0,1 - 1 0,1±0 -

цин 0,2 2,7±0,2 - 0,2 3,4±0,2 -

0,04 2,5±0,4 - 0,04 3,3±0,4 -

0,008 3,0±0,3 - 0,008 3,5±0,7 -

0,0015 3,4±0,2 - 0,0015 4,0±0,2 -

0,0003 3,2±0,6 - 0,0003 3,6±0,5 -

кавказ 1 0,1±0,05 1 0,2±0,1 -

0,2 2,6±0,3 43 0,2 3,6±0,4 -

0,04 2,5±0,4 38 0,04 3,5±0,1 24

0,008 2,8±0,3 32 0,008 3,7±0,3 14

0,0015 3,5±0,6 28 0,0015 4,7±0,2 -

0,0003 3,7±0,3 29 0,0003 4,2±0,4 -

* контроль БАП 2,0 мг/л Регуляторы роста добавлялись в среду содержащую БАЛ

Помимо корнеобразования в опыте наблюдалось влияние регуляторов роста на образование каллуса На форме 2-205-1а существенное корнеобразо-вание вызвал только цитрон в концентрации 0,008 мг/л, а на 8-79-2 все препараты вызвали увеличение каллусообразования Значительно меньше каллу-сообразование вызвал цитрон Поскольку образование каллуса существенно

ухудшает приживаемость побегов, то для стимуляции корнеобразования на этой форме лучше использовать цитрон 0,0003 мг/л, а на форме 2-205-1а можно рекомендовать препараты эмистим и кавказ 0,0003-0,0015 мг/л, цитрон 0,0003

Также как при укоренении побегов, на этапе размножения оптимальными являются концентрации регуляторов роста 0,0015 и 0,0003 мг/л Коэффициент размножения увеличивается на 30-50 %. Отмечалося некоторое увеличение количества витрифицированных растений, особенно при более высоких концентрациях препаратов 0,2 - 0,008 мг/л Поэтому можно рекомендовать применение всех препаратов в концентрациях 0,0003 - 0,0015 мг/л, в которых не вызывает увеличение витрификации, за исключением препарата Кавказ на форме 1-98-10 Для размножения этой формы лучше использовать эмистим и крезацин (табл 5)

Адаптация к нестерильным условиям

Укорененные пробирочные растения пере высадкой в поле необходимо адаптировать к почвенному субстрату Первым этапом является перенос растений в промытый и прокаленный песок Через 2-3 месяца растения переносят в специально подготовленный почвенный субстрат В почвенном субстрате растения крепнут и достигают более крупных размеров Поэтому при пересадке в поле растения меньше гибнут и быстрее трогаются в рост В зависимости от генотипа различные формы малины по разному реагируют на адаптацию к нестерильным условиям (табл 6)

Таблица 6

Приживаемость растений при адаптации на различных субстратах

Форма малины Количество вы- Растения укоре- Растения укоре-

саженных расте- ненные в песке,% ненные в почвен

ний, шт субстрате, %

2-205-1а 77 57±7,4 14±3,2

16-207-2 150 78±8,3 63±4,3

1-ж-З 107 83±9,1 73±5,1

17-60-1 161 80±5,2 80±5,0

40-241-1 109 99±1,0 77±2,3

40-241-1* 203 41±6,2 41±0

5-159-2 67 100±0 100±0

25-15-1 260 73±6,2 69±1,3

4-199-1 50 30±4,2 30±0

16-136-6 356 87±3,2 83±1,8

3-72-2 91 63±4,1 60±1,3

1-220-1 94 93±2,1 93±0

* - использование в качестве желирующих веществ в среде фитогеля

Ремонтантная форма малины 5-159-2 приживается в почвенном субстрате на 100%, а 2-205-1а — только на 14% Причем для этой формы отмечается как высокая гибель, как на при адаптации в песке, так и при последующем переносе в почву Хотя для большинства образцов основная гибель наблюдается на стадии адаптации в песке, а при переносе в почву значительно ниже Из данных таблицы 6 также следует, что при укоренении пробирочных растений формы 40-241-1 в среде с фитогелем гибель растений при перенесении в почвенный субстрат почти в два раза выше, чем после стандартной среды с агар-агаром

Регенерация ремонтантных Форм малины из листовых эксилаитов

Регенерация адвентивных побегов из различных эксплантов была получена у ряда сортов и гибридов рода Rubus Как правило, хорошим мофоген-тическим потенциалом характеризовались лишь некоторые генотипы, и в особенности сорта ежевики (Graham, 1997)

Большинство исследований по регенерации было сфокусировано на оптимизации гормонального состава питательных сред В качестве экзогенных регуляторов роста при адвентивном органогенезе растений in vitro в среду вводят цитокинины — чаще всего используют TDZ и 6-БАП в сочетании с ауксинами или без них При сравнении цитокининов пуринового ряда (6-БАП, кинетин, зеатин) и ряда дифенилмочевины (TDZ, CPPU), последние, как правило, эффективнее индуцировали процесс регенерации (Millan-Mendoza, 1998, 1999)

Таблица 7

Влияние различных концентраций CPPU на проявление регенерационной способности листовых эксплантов ремонтантной малинвы

Концентрация ци-токинина Форма16-136-6* Форма 22-15-1*

20 суток 35 суток 20 суток 35 суток

CPPU 0,05 мг/л 18,8±6, 4 24,24±3 0 0

CPPU 0,1 мг/л 19,0±3,2 30,6±2,8 0 0

CPPU 0,2 мг/л 23,8±4,8 33,3±4,8 14,1 ±4,4 25,5±7,5

CPPU 0,5 мг/л 33,3±3 33,3±3 24,2±4,9 36,4±9

CPPU 1 мг/л 45,2±2,9 54,8±2,8 35,5±5 61,2±2,9

TDZ-0,1 мг/л 6,7±3,2 16,7±3,3 17,4±6.5 31,1±2,9

* указан % листовых эксплантов с признаками регенерации

Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована высокая эффективность TDZ для стимуляции регенерации побегов из листовых эксплантов ремонтантной малины В таблице 7 показаны результаты опыта по сравнению влияния на процесс регенерации оптимальных концентраций TDZ и различных концентраций CPPU, который хорошо закоремендовал себя при введении новых форм ремонтантной малины в культуру т vitro

Листовые экспланты генотипа 16-136-6 обладают сравнительно низкой регенерационной способностью, тидиазурон в концентрации 0,1мг/л стимулировал регенерацию лишь 16,7 % эксплантов CPPU во всех испытанных концентрациях более эффективно стимулировала проявление регенерацион-ного потенциала листовых эксплантов ремонтантной малины Включение в состав питательной среды CPPU в концентрации 1 мг/л обеспечило частоту регенерации на уровне 54,8 % Экспланты генотипа 22-15-1 на питательных средах, содержащих тидиазурон ОД мг/л обладали частотой регенерации 31,1%, использование CPPU в аналогичной концентрации вообще не дало результата Однако повышение концентрации CPPU до 1 мг/л способствовало проявлению регенерационного потенциала у 61,2 % эксплантов, то есть для генотипа 22-140-20 это концентрация обеспечивающая наилучший результат регенерации

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что при введении в культуру т vitro фрагментов почек новых форм ремонтантной малины более эффективно использование в качестве цитокинина хлор-фенилперидилмочевины (CPPU) Оптимальная концентрация этого цитокинина на порядок выше, чем TDZ

Молекулярное маркирование признака уемонтантности у малины с использованием ISSR-PCR.

Ранее в центре биотехнологии Брянской ГСХА проводились исследования по определению признаков ремонтантности на молекулярном уровне При использовании праймера (AC)gYA был обнаружен специфический меж-микросателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины, длиной около 270 п н Который при проведении ПНР анализа сортов малины с обычным неремонтантным типом плодоношения он не амплифициро-вался (Соболев, 2004)

В наших исследованиях мы использовали 20 новых сортов и генотипов ремонтантной малины для проверки сцепленности наличия этого фрагмента с признаками ремонтантности 25-15-1, 8-79-2, 4-43-1, 1-Ж-1, 9-35-10, 19-99-1, 19-39-11, 5-253-1, 1-98-10, 24-139-2, 24-139-1, 37-15-4, 9-126-4, 18-183-1, Шапка Мономаха

На рисунке 2 видно, что межмикросателлитный фрагмент длиной около 270 п н стабильно амплифицировался на всех анализируемых нами ремонтантных формах малины и не детектировался на сортах с летним типом пло-

доношсния {Бригантина, Беглянка, Спутница. Бальзам, Пересвет, Скромница, Солнышко),

Рисунок 2: Полимеразная цепная реакция ДНК различных форм малины с праймером (АС)8УА

-»

I -8 ремонтантные сорта, 9-1 1 нерсмонтантные, М - маркер Ьр 100

Выводы

1. Показана высокая эффективность применении новых регуляторов роста негормональной природы (Эмистим, Цитрон, Кавказ, Кремации), В процессе микроклоналыюго размножения ремонтантной малины. Они стимулируют укореняемость растений в 1,5-2 раза и увеличила коэффициент размножения на 20-50 %. Действующая концентрация препаратов на несколько порядков ниже, чем обычно используемые регуляторы гормональной природы и составляет 0,0003-0,0015 мг/л.

2. Применение хЯорфёнилпередилмочевины (СРРи) обеспечивает высокую приживаемость фрагментов почек при введении новых форм ремонтантной малины в культуру /п 177л?, свыше 90% даже для форм плохо приживающихся в присутствии Т02, Оптимальная концентрация СРРи 0,2-1 мг/л.

3. Использование в качестве цитокинина СРРи при регенерации листовых эксплантов побегов ремонтантной малины обеспечива-

ет повышение регенерации в 2-3 раза по сравнению с TDZ Оптимальная концентрация CPPU 1 мг/л, что на порядок выше оптимальной концентрации TDZ.

4 Замена агар-агара на фитогель при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro нецелесообразно Фитогель вызывает угнетение корнеобразования и значительную гибель растений на этапе размножения

5 Потенциальная способность почек ремонтантной малины к размножению в культуре in vitro зависит от месторасположения почки на однолетних побегах замещения С 1 по 5-7 почку наблюдается значительное увеличение коэффициентов размножения (примерно в 2 раза у сорта Бриллиантовой и на 30% у Геракла) После этого происходит небольшое снижение коэффициента в центральной части побега и начиная с 13-15 почки коэффициент размножения снова существенно возрастает до максимальных значений

6 На 20 новых формах ремонтантной малины была подтверждена сцепленность признака ремонтантности и молекулярного маркера - межмикросателитного фрагмента длиной около 270 п н

7 Введено в культуре in vitro и размножено 52 новых образца ремонтантной малины В процессе работы выращено и передано на селекционный питомник 3772 растения малины адаптированных к почвенному субстрату

Рекомендации

1 Препараты Эмистим, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,00030,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии укоренения побегов ремонтантной малины совместно с ИМК 0,5 мг/л

2 Препараты Крезацин, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,00030,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии размножения побегов ремонтантной малины совместно с БАП 2,0 мг/л

3 Рекомендуется использовать CPPU при введении в культуру in vitro эксплантов пазушных почек в концентрации 0,2-1 мг/л

4 Для стимуляции регенерации из листовых эксплантов рекомендуется использовать CPPU в концентрации 1 мг/л

Работы, опубликованные по теме диссертации

1 Озеровский, А В Сравнение эффективности использования жели-рующих веществ агар-агара и фитогеля при культивирования ремонтантной малины в культуре m vitro / Озеровский А В , Зуева Е JI, Заякин В В , Казаков ИВ// Материалы Международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» -23-24 мая 2006-С 11-14

2 Соболев В В Использование ISS - маркеров для молекулярно-генетическогй идентификации и паспортизации сортов малины / Соболев В В , Казаков И В , Карлов Г И, Соболева А Г , Озеровский А В , Феськов А А // Сельскохозяйственная биология - 2006 - №5 - С 48-52

3 Озеровский, А В Идентификация растений малины на ранних этапах размножения по признаку ремонтантности с применением молекулярно-генетических методов анализа / Озеровский, А В , Соболев В В , Соболева А Г , Ощепков А В // Материалы Международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» - 23-24 мая 2006-С 7-9

4 Соболева А Г Подбор концентраций цитокинина CPPU на этапе введения в культуру новых генотипов ремонтантной малины / Соболева А Г, Соболев В В , Озеровский, А В , Зуева ЕЛ // Материалы Международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» - 23-24 мая 2006 -С 9-11

5 Озеровский, А В Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на коэффициент размножения в культуре m vitro / Озеровский, А В , Заякин В В // Материалы Всероссийской научно-методической конференции «Состояние и перспективы развития яго-доводства в России» - 19-22 июня 2006-С 228-231

6 Соболева А Г Определение возможности использования цитокинина CPPU для проявления регенерационного потенциала листовых эксплантов ремонтантных форм малины / Соболева А Г, Соболев В В , Озеровский, А В // Материалы Всероссийской научно-методической конференции «Состояние и перспективы развития ягодоводства в России» - 19-22 июня 2006 -С 271273

7 Соболев В В Об использовании цитокининов для оптимизации кло-нального микроразмножения ремонтантных форм малины / Соболев В В, Соболева А Г, Озеровский, А В , Казаков И В , Евдокименко С H // Сельскохозяйственная биология -2007-№1-С 91-95

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д б н В В Заякину за огромную помощь при проведении исследований, обсуждении результатов изложенных в диссертационной работе и ее подготовке

Автор признателен заведующему кафедрой плодоовощеводства Брянской ГСХА, академику РАСХН ИВ Казакову за полезные советы и поддержку при проведении исследований

Автор благодарит за помощь в проведении исследований директора научно-образовательного центра биотехнологии к б н Соболева Владимира Васильевича и старшего научного сотрудника, кбн Соболеву Анну Геннадьевну

Автор благодарит всех сотрудников центра биотехнологии Брянской ГСХА В В Соболева , А Г Соболеву, Е Л Зуеву, А В Ощепкова за поддержку и дружеское отношение

Лицензия № 020880 от 26 мая 1999 года Формат 60x84 Бумага печатная

_Уел п л 1,0 Тираж 100 Изд №971_

Издательство Брянской государственной сельскохозяйственной академии 243365, Брянская обл , Выгоничский р-он, с Кокино, Брянская ГСХА

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Озеровский, Александр Владимрович

Перечень сокращений, условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Использование биотехнологических методов в селекции ремонтантных форм малины.

1.1 Характеристика объекта исследований.

1.2 Микроклональное размножение растений.

1.3 Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro.

1.4 регуляторы роста растений.

1.4.1 Биопрепараты на основе симбионтных грибов.

1.4.2 Регуляторы роста на основе фурфурола.

1.4.3 Крезацин - новый синтетический препарат.

1.5. Современные методы исследования генома растений.

1.5.1 Морфо-фенотипические и биохимические методы.

1.5.2. Задачи решаемые ПЦР.

1.6 Использование молекулярных маркеров в изучении генома и селекции малины.

ГЛАВА 2. Методики и условия окружающей среды.

2.1 Место проведения и объекты исследований.

2.2 Методики исследований.

2.2.1 Методика микроклонального размножения.

2.2.2 Методика получения регенератов ремонтантной малины.

2.2.3 Методы по определению генома малины.

2.2.3.1. Выделение геномной ДНК.

2.2.3.2 ISSR-PCR.

2.3 Климатические и почвенно-агротехнические условия проведения исследований.

ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение.

3.1 Микроклональное размножение ремонтантных форм малины.

4 3.1.1 Введение новых генотипов.

3.1.2 Сравнение эффективности использования желирующих веществ при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro.

3.1.3 Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на их регенерационную способность в культуре in vitro.

3.1.4 Влияние регуляторов роста на развитие побегов малины в культуре in vitro.

3.1.5 Адаптация к нестерильным условиям.

• 3.2 Регенерация ремонтантных форм малины из листовых эксплантов.

3.3 Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины при микроклональном размножении.

ГЛАВА 4. Экономическая эффективность применения регуляторов роста при микроклональном размножении ремонтантной малины.

Выводы.

Рекомендации.

Список используемой литературы.

Перечень сокращений, условных обозначений

6-БАП - 6-бензилоаминопурин,

ГК - гибберелиновая кислота,

ИМК - индолилмасляная кислота,

ИУК - индолилуксусная кислота,

НУК - нафтилуксусная кислота,

4-PU - К-(4-пиридил)-Ы-фенилмочевина,

CPPU - N-(2 хлор-4-пиридил)-Ы-фенилмочевина,

TDZ - тидиазурон,

PCR - полимеразно-цепная реакция,

ISSP-PCR - ПСР с праймерами для определения полиморфизма межмикросателитных последовательностей

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Микроклональное размножение селекционных форм ремонтантной малины с использованием новых регуляторов роста"

Актуальность темы. Выращивание сортов ремонтантного типа, наряду с обычными сортами дает возможность создать в условиях средней полосы России конвейер поступления свежих ягод малины в течении 2,5-3 месяцев, начиная с конца июня и до наступления осенних заморозков. При этом реализация ягодной продукции ремонтантных сортов в «несезонное» для малины время по более высоким, чем летом ценам стимулирует расширение насаждений малины во всех категорий хозяйств (Казаков, 2001).

Возделывание ремонтантных сортов малины по типу однолетней культуры снимает проблему зимостойкости стеблей, а их удаление с плантации после скашивания позволяет избавиться от основных болезней и вредителей без применения пестицидов. Использование в производстве сортов ремонтантного типа с неполегающими под тяжестью урожая стеблями создает возможность максимальной механизации по уходу за насаждениями, включая машинную уборку урожая. При этом отпадает необходимость в устройстве дорогостоящей шпалеры, подвязке стеблей к проволоке и их поштучной вырезке после плодоношения (Казаков, 2000).

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП с начала 70-х годов прошлого века ведется интенсивная работа по созданию ремонтантных сортов малины, формирующих основной урожай в конце лета - начало осени на однолетних побегах.

Актуальной проблемой при создании таких сортов является оптимизация селекционного процесса. Ремонтантные формы малины сложного межвидового происхождения отличаются низкими коэффициентами происхождения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли. Данная биологическая особенность увеличивает период полевого размножения, и следовательно значительно удлиняет процесс перехода элитных форм к сортоиспытанию. Поэтому для ускорения селекционного процесса актуально использование метода микроклонального размножения растений. Гибриды сложного межвидового происхождения резко отличаются по реакции на условия культивирования in vitro. Поэтому для новых селекционных форм требуется индивидуальный подбор условий на всех этапах микроклонального размножения. Следует отметить, что некоторые ремонтантные формы обладают низким коэффициентом размножения даже в культуре in vitro, поэтому применение новых препаратов стимулирующего действия является весьма актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы была оптимизация условий микроклонального размножения новых ремонтантных форм малины, испытание влияния новых регуляторов роста в культуре in vitro. В ходе работы решались следующие задачи:

- определение эффективности использования цитокинина CPPU на этапе введения в культуру in vitro и при получении регенерантов ремонтантных образцов малины;

- изучение реакции новых форм малины на условия микроклонального размножения;

- изучение возможности использования фитогеля в качестве желирующего вещества при клональном микроразмножении;

- определения эффективности концентраций новых регуляторов роста растений при стимулирования физиологических процессов протекающих в растениях ремонтантной формах малины в культуре in vitro;

- проверка сцепления молекулярного маркера с признаком ремонтантности у новых селекционных форм малины.

Научная новизна исследований. Подобраны условия для культивирования in vitro 52 новых ремонтантных форм малины. Показана высокая эффективность CPPU на этапе введения в культуру новых форм ремонтантной малины, экспланты которых обладают низкой адаптивной способностью к условиям in vitro, а также при стимуляции регенерации побегов из листовых эксплантов.

Впервые продемонстрирована высокая эффективность новых регуляторов роста растений негормональной природы при микроклональном размножении ремонтантной малины.

Практическая значимость. Оптимизированные методики культивирования in vitro активно применяются для размножения новых элитных форм как на этапе первичных отборов, так и подготовки сортов для передачи в сортоиспытание. За время работы в селекционный питомник передано 3772 растений 64 форм. Применение микроклонального размножения позволяет ускорить селекционный процесс на 3-4 года.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии, на заседаниях Ученого совета Агроэкологического института и научно-практических конференциях : Международной научно - практической конференции молодых ученых : «Производство экологически безопасной продукции растениеводства и животноводства» (Брянск, 2004), Международной научно - практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2005); изложены на Всероссийской научно-методической конференции «Состояние и перспективы развития ягодоводства в России» (Орел, 2006).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Озеровский, Александр Владимрович

Выводы

1. Показана высокая эффективность применения новых регуляторов роста негормональной природы (Эмистим, Цитрон, Кавказ, Крезацин) в процессе микроклонального размножения ремонтантной малины. Они стимулируют укореняемость растений в 1,5-2 раза и увеличивают коэффициент размножения на 20-50 %. Действующая концентрация препаратов на несколько порядков ниже, чем обычно используемые регуляторы гормональной природы и составляет 0,0003-0,0015 мг/л.

2. Применение хлорфенилпередилмочевины (CPPU) обеспечивает высокую приживаемость фрагментов почек при введении новых форм ремонтантной малины в культуру in vitro, свыше 90% даже для форм плохо приживающихся в присутствии TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 0,2-1 мг/л.

3. Использование в качестве цитокинина CPPU при регенерации листовых эксплантов побегов ремонтантной малины обеспечивает повышение регенерации в 2-3 раза по сравнению с TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 1 мг/л, что на порядок выше оптимальной концентрации TDZ.

4. Замена агар-агара на фитогель при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro нецелесообразна. Фитогель вызывает угнетение корнеобразования и значительную гибель растений на этапе размножения.

5. Потенциальная способность почек ремонтантной малины к размножению в культуре in vitro зависит от месторасположения почки на однолетних побегах замещения. С 1 по 5-7 почку наблюдается значительное увеличение коэффициентов размножения (примерно в 2 раза у сорта Бриллиантовой и на 30% у Геракла). После этого происходит небольшое снижение коэффициента в центральной части побега и начиная с 13-15 почки коэффициент размножения снова существенно возрастает до максимальных значений.

На 20 новых формах ремонтантной малины была подтверждена сцепленность признака ремонтантности и молекулярного маркера -межмикросателитного фрагмента длиной около 270 п. н. Введено в культуре in vitro и размножено 52 новых образца ремонтантной малины. В процессе работы выращено и передано на селекционный питомник 3772 растения малины адаптированных к почвенному субстрату.

Рекомендации

Препараты Эмистим, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,0003-0,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии укоренения побегов ремонтантной малины совместно с ИМК 0,5 мг/л.

Препараты Крезацин, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,00030,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии размножения побегов ремонтантной малины совместно с БАП 2,0 мг/л.

Рекомендуется использовать CPPU при введении в культуру in vitro эксплантов пазушных почек в концентрации 0,2-1 мг/л. Для стимуляции регенерации из листовых эксплантов рекомендуется использовать CPPU в концентрации 1 мг/л.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Озеровский, Александр Владимрович, Брянск

1. Айала, Ф. Введение в популяционную генетику. /Айала Ф. // 1984. М.: Мир. -С.27-31

2. Артемьева, Г.М. Цитогенетическая активность эмистима и его влияние на продуктивность яровой пшеницы и люцерны. / Артемьева Г.М., Хохлова Л.П., Кашина О.А. // Агрохимия. 1999. - №1. - С. 60-64

3. Алтухов, Ю.П. Генетический мономорфизм видов и его возможное биологическое значение. / Алтухов Ю.П., Рычков Ю.Г. // Журн. общ. Биологии, -1972.-№33,- с.281-300.

4. Бленда, В.Ф. Клональное микроразмножение подвоев косточковых культур. / Бленда В.Ф., Радилова Л.Д. // Садоводство и виноградарство,- 1991.- №3,- С. 21-24.

5. Бурень, В.М. Влияние ростовых веществ на формирование корней и листьев у картофеля. / Бурень В.М., Иванова А.И. // Селекция и семеноводство картофеля на основе биотехнологии. Л. - 1990. - С. 5761

6. Бурмистров, А.Д. Ягодные культуры / А.Д Бурмистров. Л.: Агропромиздат, 1985. - 208 с.

7. Бургутин, А.Б. Быстрое клональное размножение виноградного растения. / Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Голодрига П.Я. // С.-х. биология. 1983. - № 5. - С. 48-50

8. Бутенко, Р. Г. Использование культуры тканей растений в сельскохозяйственной науке и практике. // Сельскохозяйственная биология. -1979. № 3, С. -306-315

9. Бутенко, Р.Г. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин. М.: Высшая школа, 1987. - С. 11-27

10. Ю.Бутенко, Р.Г. Использование культуры ткани растений в с.-х. науке и практике. / Бутенко Р.Г. // С.-х. биология. 1990. - №3. - С. 306-315

11. П.Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. / Бутенко Р.Г. Учеб. пособие. - М: ФБК -ПРЕСС.- 1999.- 160 с.

12. Бычков, В.В. О плодоуборочных машинах для косточковых культур / Бычков В.В.,Кротов A.M. // Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии. 1980. - № 2. - С. 49

13. Вакуленко, В.В. Регуляторы роста растений. / В.В. Вакуленко, О.В. Шаповал // Защита растений. 2000. - №11. - С 36-40

14. Вакуленко, В.В. Результаты испытания эмистима на капусте белокочанной, картофеле, яблоне зимних сортов, рисе и сахарной свекле / Вакуленко В.В. // Аграрная Россия. 1999. - №1. - С. 27-35

15. Вартапетян, А.Б. Полимеразная цепная реакция. / Вартапетян А.Б. // Молекулярная биология,-1991.- с.926-936.

16. Ващенко, М.И. Влияние силатранов на структуру урожая льна-долгунца. / Ващенко М.И., Рожкина Н.Ф., Андреева И.А. / Рост растений и его гормональная регуляция. М. - 1989. - с. 113-116

17. Вовк, В.В. Использование цитокининов ряда дифенилмочевины при микроклональном размножении ремонтантной малины. // Вовк В.В., Заякин В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. // С.-х. биология. 1999. - №5. -С. 52-56

18. Вовк, В. В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro II Дисс. Канд. с.-х. наук. Брянск., 2000.

19. Высоцкий, В.А. Усовершенствование способов получения растений малины из изолированных меристематических верхушек. / Высоцкий В.А. // Ягодоводство в Нечерноземье. 1984. - С. 3-8

20. Высоцкий, В.А. Микроразмножение здорового посадочного материала ягодных культур. / В.А. Высоцкий, З.Т. Гарашвили // Садоводство. -1982. -№1.- С. 22-23

21. Высоцкий, В.А. Влияние тидиазурона на процессы органогенеза в культуре листовых дисков и апексов плодовых растений. / Высоцкий В.А., Бурдейная Т.В., Алексеенко J1.B. // Регуляторы роста и развития растений. М. -1997. - С. 323-324

22. Высоцкий, В. А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур./ Высоцкий В. А. // Сельскохозяйственная биология. 1995.- № 5 - С. 57-63.

23. Высоцкий, В.А. Особенности клонального микроразмножения некоторых форм ремонтантной малины. / Высоцкий В.А. // Плодоводство и ягодоводство России. 1996. - Т.З. - С. 90-95.

24. Высоцкий, В.А. Влияние тидиазурона на процессы органогенеза в культуре листовых дисков и апексов плодовых растений. / Высоцкий В.А., Бурдейная Т.В., Алексеенко JI.B. // Регуляторы роста и развития растений. М. - 1997. - С. 323-324

25. Высоцкий, В. А., Бурдейная Т. В. Влияние селективных агентов на регенерационные процессы в культуре листовых дисков малины красной. Сб. трудов. Плодоводство и ягодоводство России. М. 1998, № 5, С. 72-77.

26. Глазко, В.И. Генетика изоферментов животных и растений. / Глазко В.И., Созинов И.А. // Киев, -1993. -с.89-102

27. Горьковцева, Е.А. Микроклональное размножение ценных сортов винограда. / Е.А. Горьковцева, О.Х. Юлдашев // Садоводство и виноградарство. 1991. - №11. - С. 17-20

28. Дерфлинг, К. Гормоны роста. Системный подход. / Дерфлинг К. М.: Мир.-1985.-303 с.

29. Диас, С. Роль физиологических факторов в повышении эффективности регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы / Диас С., Долгих Ю. // Биотехнология. 1997. - № 11-12. - С. 32-36

30. Дорошенко, Н.П. Микроклональное размножение столового винограда сорта Агат Донской. / Дорошенко Н.П., Кострикин И. А. // Садоводство и виноградарство. 1989. - №3. - С. 40

31. Джонс О.П. Размножение хозяйственно важных древесных растений in vitro / Джонс О.П.// Биотехнология сельскохозяйственных растений. М. 1987. -№7.-С. 134-152

32. Дьяков, В.М. Экологически безвредные регуляторы роста мивал и крезацин. / В.М. Дьяков, Ю.С. Корзинников, В.В. Матыченков // Регуляторы роста растений. ВАСХНИЛ. М.: Агропромиздат, 1990. -С. 52-62

33. Егоров, И.В. Изменение пола различных систематических групп под действием регуляторов роста. / И.В. Егоров, В.И. Сутулова, И.Н. Львова // Регуляторы роста растений. ВАСХНИЛ. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 73-87

34. Ежов, М.Н. Повышение продуктивности и улучшение качества зерна гречихи под действием эмистима и эпибрассинолида. / Ежов М.Н., Сальников А.И., Прусакова Л.Д. // Агрохимия. 1999.- №5.- С. 88-90

35. Зотова, З.С. Крыжовник в саду / З.С Зотова, В.В Иноземцев JL, - 1987. -88 с.

36. Казакова, В.Н. Продуктивность картофеля при обработке крезацином. / В.Н. Казакова, Н.П. Карсункина // Регуляторы роста растений. ВАСХНИЛ. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 62-68

37. Казаков, И. В. Селекция малины в средней полосе РСФСР / И. В Казаков. Тула: Приокское книжное издательство, 1989.-217 с.

38. Казаков, И. В. Малина в вашем саду / И. В Казаков. «Придесенье», 1994.144 с.

39. Казаков, И. В. Совершенствование исходных форм малины ремонтантного типа. Казаков И. В., Рожнов Н. И., Евдокименко С. Н. // Генетика и наследование важнейших хозяйственных признаков плодовых растений. Мичуринск. 1994. - с. 64-69

40. Казаков, И. В. Проблемы и перспективы создания сортов малины ремонтантного типа. / Казаков И. В // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части

41. России. Мичуринск. - 1995. с. 26-29.

42. Казаков, И. В. Селекционные возможности создания сортов малины для машинной уборки урожая / Казаков И.В., Кулагина B.JL, Ковалев

43. A.Н //. Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России: Сб. докл. и сообщ. / ВНИИС им. И.В. Мичурина Мичуринск, 1995. С. 92-94.

44. Казаков, И. В. Перспективное направление селекции малины / Казаков И. В. // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых Брянск.- 2001.- С. 85

45. Казаков, И. В. Малина и ежевика / И. В Казаков. Москва: Фолио, 2001.-252 с.

46. Калашникова, В.Г. Перспективы применения препарата «Краснодар -1» экологически чистого регулятора роста растений. / Калашникова

47. B.Г., Ненько Н.И., Кульневич В.Г. // Перспективы создания экологически безопасных регуляторов роста растений, средств защиты и технологии их применения в производстве с. х. продукции. - Киев, 1992.-с. 6

48. Карпова, О.В. Повышение укореняемости и адаптации пробирочных растений ягодных культур с помощью эписиторов. / О.В. Карпова // Молодые ученые возрождению с.х. России в XXI в. - Брянск, 1999.1. C. 11

49. Катаева, Н.В. Клональное размножение растений в культуре ткани. / Катаева Н.В., Аветисов В.А. // Культура клеток растений. М.: Наука. -1981. -С.25-34

50. Катаева, Н.В. Принципы микроклональиого размножения растений на примере герберы. / Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. // Изв. АН СССР, сер. биол. 1982. -№1. - С. 126-129

51. Киров, Е.И. Применение регуляторов роста растений в оптимальной аэрозольной технологии. / Е.И. Киров, Ю.Н. Самсонов, В.И. Макаров и др. // Агрохимия. 1996. - №10. - С. 84-94

52. Кичина, В.В. Как выводить крупноплодные сорта малины и ежевики для интенсивного производства / Кичина В.В. // Методические указания. М., НИЗИСНП, 1990. - 60с.

53. Ковалев, В.М. Нетрадиционные регуляторы роста в культуре тканей картофеля. / Ковалев В.М., Глушкова Т.Н. // Биотехнология -возрождению с.х. России в XXI в. Санкт-Петербург, 2001. - С. 38-40

54. Ковалев, В.М. Особенности морфогенеза картофеля in vitro при использовании цитокининов. / В.М. Ковалев, Т.Н. Глушкова, Е.А. Калашникова // С.-х. биология. 2002. - №1. - С. 88-91

55. Ковалева, И.С. Усовершенствование методики микроклональиого размножения малинно-ежевичного гибрида Тайберри. / Ковалева И.С., Данилова Т.В., Молканова О.И. // Бюлл. Гл. бот. сада. 2000. - Вып. 179.-С. 136-143

56. Клоконос, Н.П. Культура изолированных тканей ежевики. / Клоконос И.П. // Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Москва, 2001. - С. 105-107

57. Кольцова, Е.И. Селекция и агротехника земляники и малины в среднем Поволжье //КольцоваЕ.И. -Куйбышев, 1983. С. 101.

58. Корнацский С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала / Корнацский С.А// Атореф. дисс. канд. с.-х. наук.- М. 1991.- С. 22

59. Кудасова, И.М. Уборка вишни и сливы машинами / Кудасова И.М. // Садоводство. 1981. - № 9. - С. 18-20.

60. Кудрявцев, Н.А. Эффективность и безопасность применения препарата эмистим в льноводстве / Кудрявцев Н.А. // Аграрная Россия. 1999. -№1.-С. 22-27

61. Кулаева, О.Н. Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений. / О.Н. Кулаева // Новые направления в физиологии растений. Москва, 1985. - С. 62-83

62. Кульневич, В.Г. Новые перспективные регуляторы роста растений, полученные на основе фурфурола. / Кульневич В.Г., Бадовская JI.A., Ненько Н.И. // Регуляторы роста и развития растений. М. 1991. - 55 с.

63. Кульневич, В.Г. Новый стимулятор роста сладкого перца препарат Краснодар. / Кульневич В.Г., Калашникова В.Г., Ненько Н.И. // Метод, рекомендации. - Краснодар, 1986. - 5 с.

64. Куминов, Е.П. Ремонтантная малина / Куминов Е.П. // Агробиология. -1956.-№5.-С. 148-149.

65. Куминов, Е. П. Некоторые результаты селекции черной смородины в СССР / Куминов Е. П., Равкин А.С., Литвинова В.М., // Селекция и сортоизучение плодовых и ягодных культур. М., 1981. - С. 31 -46.

66. Куминов, Е. П. Селекция черной смородины в Восточной Сибири: Автореф. дис. . д-ра с.-х. наук: 06.01.05 / Е.П. Куминов; Л., 1982. 43 с.

67. Лукин, Е.С. Вишня для механизированного сбора урожая / Лукин Е.С. // Садоводство. 1981. - № 12. - С. 33-34.

68. Лутова Л. А. Влияние генотипа растения на регенерационные процессы. /Лутова Л. А., Бондаренко Л. В., Бузовкина И. С., Левашина Е. А., Тиходеев О. Н., Ходжайова Л. Т., Шарова Н. В., Шишкова С. О., // Генетика. Т. -3 №8 -с. 1065-1074.

69. Маслов, P.M. Влияние физиологически активных веществ на продуктивность различных сортов и гибридов сахарной свеклы в условиях Белгородской области: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук / P.M. Маслов; ВНИИССС. Рамонь, 2002. - 26 с.

70. Матушкина, О.В. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур и перспективы его использования. / Матушкина О.В., Пронина И.Н. // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им. И.В. Мичурина. Тамбов, 2001. Т. 2. - С. 87-115

71. Меркулов С. М., Бартиш И. В., Глеба Ю.Ю. Регенерация адвентивных побегов из листовых тканей груши (Pyrus communis L.) II Физиология и биохимия культурных растений. 1993. Е. 25. № 4. С. 375-380.

72. Меркулов С. М., Бартиш И. В., Долгов С. В., Пастернак Т. П., Макхьюген А. Генетическая трансформация груши (Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens. // Генетика. 1998, Т. 34, № 3, с. 373-378.

73. Муратова, С. А. Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов сливы {Prunus domestica). / Муратова, С. А. // Сборник тезисов. Саратов. -2003.-е. 219.

74. Муратова, С.А. Размножение ягодных культур in vitro. / Муратова С.А., Янковская М.Б., Соловых Н.В., Тюленев В.М. // Плодоводство. 2004. -Т. 15.-С. 232-236

75. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. / Муромцев Г. С., Бутенко Р. Г., Тихоненко Т. П., Прокофьев М. Н. М. Агропромиздат, 1990.-383 с.

76. Муромцев, Г.С. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. / Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н. //Л. Агропромиздат, 1987. - 384 с.

77. Мусияка, В.К. Влияние эмистима и других регуляторов на рост и морфогенез изолированных тканей кукурузы / Мусияка В.К. // Физиология и биохимия культурных растений. 1998. - Т. 30 - №4. -С.213-215

78. Ненько, Н.И. Перспективы использования на озимой и яровой пшенице регуляторов роста, синтезированных на основе фурфурола. / Ненько Н.И. Краснодар, 1999. - 133 с.

79. Ненько, Н.И. Эффективность применения препарата Кавказ на яровой пшенице. / Ненько Н.И., Бадовская Л.А. // Регуляторы роста и развития растений. М. - 1997. - С. 194

80. Никиточкин Д.М Влияние синтетических экологически чистых регуляторов роста на рост, урожайность и сохраняемость плодов яблони сорта Антоновка обыкновенная: Автореф. дисс. . канд. с.-х. наук. / Д.М. Никиточкин; МСХА. Москва, 2001. - 23 с

81. Новиков, Н.Н. Действие фитогормонов на синтез белков и качество зерна пшеницы. / Новиков Н.Н., Войесса Б.В. // Изв. ТСХА. 1995. -№1.-С. 65-75

82. Норишина, М.В. Новые регуляторы роста растений на основе фурфурола. / Норишина М.В., Клочкова И.Н., Суслова Т.А., Хатаева Л.Ю. // Развитие научного наследия академика Н.И.Вавилова. -Саратов, 1997.-Ч.2. С. 260-262.

83. Павлютина, И.П. Влияние биологически активного препарата эмистима на ускорение роста и развития растений сои. / Павлютина И.П. // Молодые ученые возрождению с.х. России в XXI в. - Брянск, 2000. -С. 131-134

84. Павлютина, И.П. Влияние обработки эмистима на продуктивность сои. / Павлютина И.П., Кистень А.В. // Использование достиженийсовременной биологической науки при разработке технологий вагрономии, ветеринарии и зоотехнии. Брянск, 2002. - С. 46

85. Панков, В.В. Новое в ягодоводстве Нечерноземья. / Панков В.В. М. -1990.-С.45

86. Петрова А.Д. Фенолкарбоновые кислоты как регуляторы роста при размножении ягодных и плодовых растений in vitro. / А.Д. Петрова // Молодые ученые возрождению с.х. России в XXI в. - Брянск, 1999. -С. 16-17

87. Полевой, В.В. Фитогормоны. / В.В. Полевой. Изд-во ЛГУ, Ленинград. - 1982. - 249 с.

88. Поликарпова, Ф.Я. Влияние предварительной подготовки маточных растений и физиологически активных веществ на зеленое черенкование клоновых подвоев яблони. / Ф.Я. Поликарпова, В.А. Яковлева // Плодоводство нечерноземной полосы. М. - 1984. -С.28-35

89. Поликарпова, Ф.Я. Выращивание посадочного материала зеленым черенкованием. / Ф.Я. Поликарпова, В.В. Пилюгина. М.: Росагропромиздат. - 1991. - С. 11-15

90. Поликарпова, Ф.Я. Влияние новых регуляторов роста на укоренение стеблевых черенков. / Поликарпова Ф.Я., Леонтьев-Орлов О.А., Леонтьева-Орлова Л.А. и др. // Плодоводство и ягодоводство России. М.-1994.-С. 50-55

91. Попов, Ю.Г. Культура in vitro меристематических верхушек стебля как метод оздоровления и размножения растений. / Ю.Г. Попов // Биологические науки. 1976. - №6. - С. 13-24

92. Попов, Ю.Г. Оздоровление и размножение плодовых и ягодных растений методом культуры меристематических верхушек. / Попов Ю.Г / Метод, указания. М. - 1979. - С. 11-19

93. Попова, И.В. Оценка гибридов земляники на пригодность к машинной уборке урожая / Попова И.В., Цымбал А.А., Макарова А.Ф. //

94. Плодоводство и ягодоводство Нечерноземной полосы. М., 1979. - С. 99-111.

95. Попова, И.В. Изучение потенциальной продуктивности новых сортов земляники, размноженных методом меристематических верхушек. / И.В. Попова, И.В. Жаркова, А.У. Зекалошвили // Проблемы вегетативного размножения в садоводстве. Москва, 1985. -С. 112-118

96. Приходько, Ю.Н. Получение и микроклональное размножение безвирусных клонов крыжовника. / Приходько Ю.Н. // Молодые ученые садоводству России. - Москва. - 1995. - С. 150-154.

97. Протасов, В.Т. Механизация уборки плодов и ягод. / Протасов

98. B.Т., Утков Ю.А. М.: Россельхозиздат, 1977. -72 с.

99. Прохоров, JI.A. Технология комбайновой уборки семенных плодов томата / Прохоров J1.A., Горобец В.Н. // Селекция и семеноводство овощных культур: Сб. науч. тр. / М.: МСХА, 1992.1. C. 58-60.

100. Расторгуев, С. JI. Разработка способов индукции растений регенерантов земляники и малины в культуре in vitro. / Расторгуев C.JL // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем.- Мичуринск, -1998. -С. 49-52.

101. Расторгуев, C.JI. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины. / Расторгуев C.JI. // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур. Метод, рекомендации. Мичуринск, 1996. - С. 40-61

102. Рахманинова, А.Б. Определение структуры рецептора цитокининов. / Рахманинова А.Б. // Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции. Москва, 1981.-С. 167-202

103. Рожнова, Н.А. Эмистим индуктор устойчивости к вирусным болезням пасленовых / Рожнова Н.А., Геращенков Г.А., Янина М.М. и др. // Аграрная Россия. - 1999. - №1. - С. 35-38

104. Савельев, Н.И. Использование биотехнологических методов в генетико-селекционных исследованиях плодовых и ягодных культур. / Савельев Н.И., Тюленев В.М., Соловых Н.В. и др. // С.-х. биология. 2003. -№3.-С. 51-63

105. Сакало, В.Д. Влияние сроков обработки эмистимом С и бетастимулином на метаболизм сахарозы и продуктивность сахарной свеклы. / Сакало В.Д., Пономаренко С.П., Курчий В.М. // Агрохимия. -2004.-№5.-С. 59-65

106. Сакало, В.Д. Регуляция эмистимом С и бетастимулином метаболизма сахарозы и продуктивности сахарной свеклы. / Сакало В.Д. // Агрохимия. 2001. - №10. - С. 49-55

107. Скоробогатова, Н.В. Изменение содержания фитогормонов в проростках ячменя в онтогенезе и при внесении регуляторов стимулирующих рост. / Н.В. Скоробогатова, Е.В. Захарова, Н.П. Карсункина и др. // Агрохимия. 1999. - №8. - С. 49-53

108. Сковородников Д. Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины Дисс. Канд. с.-х. наук. Брянск., 2004

109. Соболев, В.В. Использование метода полимеразной цепной реакции для генетического маркированиея ремонтантной малины. / Соболев В.В. // Автореф. дис. канд. биол. наук- М. -2004.- с. 18.

110. Соболева А.Г. Регенерация и трансформация ремонтантной малины / Соболева А.Г. // Автореф. дис. канд. биол. наук- М. -2004.-с. 22

111. Соколова, В. А. Селекция малины в Сибири: Дис. . уч. ст. д-рас.-х наук: 06.01.05 / В.А. Соколова; Барнаул, 1993. 392 с.

112. Стрекач, А.Н. Снижение потерь при комбайновой уборке черной смородины / Стрекач А.Н. // Тракторы и сельскохозяйственные машины. 1987. - № 10. - С. 44-46.I

113. Стрыгина, О.В. Размножение новых сортов малины методом культуры тканей. / Стрыгина О.В. // Достижения науки в практику. -М.- 1990.-С. 123-124

114. Томилин, А.А. К вопросу об эффективности оздоровления растений малины красной от вируса мозаики резухи с использованием метода культуры меристем. / Томилин А.А., Упадышев М.Т. // Ягодоводство в Нечерноземье. М. - 1993. - С. 25-29

115. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений. /Тиссера Б. // В кн.: Биотехнология растений: культура клеток. -М., 1989.- С. 97-127.

116. Троян, В. Физиологическая активность регулятора роста растений эмистим. / Троян В. // Регуляторы роста и развития растений. М. 1997.- С. 248

117. Троязыков Д.Д. Использование биологически активных веществ при выращивании яровой пшеницы в Приангарье. / Троязыков Д.Д., Абрамов А.Г., Корзинников Ю.С. // Вестник РАСХН. 2002. - №6. -С. 31-33

118. Трушечкин В. Г. Размножение клоновых подвоев яблони методом культуры тканей. / В.Г. Трушечкин, В.А. Высоцкий, О.А. Леонтьева-Орлова // Сельскохозяйственная биология. 1992. - №4. - С. 455-457

119. Туровская, Н.И. Микроклональное размножение груши. / Туровская Н.И. // Садоводство и виноградарство. 1987. - №6. - С. 22-24

120. Туровская, Н.И. Формирование адвентивных почек на эксплантах малины. / Туровская Н.И., Стрыгина О.В. // Сортоизучение и селекция плодовых и ягодных культур. Сб. науч. трудов НИИ им. И.В. Мичурина. 1992. - С. 82-84

121. Тюленев, В.М Получение растений регенерантов из изолированных тканей земляники. / Тюленев В.М., Расторгуев C.JL, Туровский И.И. // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. 1991. - Вып. 50. - С. 21-27

122. Тюленев, В.М. Сомаклональная изменчивость земляники. / Тюленев, В.М., Соловых Н.В. // Биотехнология. 1999. - №1. - С. 3440

123. Тюленев, В.М. Способ укоренения побегов яблони in vitro. / Тюленев В.М., Нафталиев П.М., Осипова П.В., Расторгуев С.Л. // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. 1990. - Вып. 48. - С. 34-36

124. Ульяненко, Л.Н. Влияние картолина и крезацина на развитие ячменя и накопление 137Cs. / Ульяненко Л.Н., Филипас А.С., Дьяченко И.В. // Доклады РАСХН, 1993. №5. - С. 17-19

125. Упадышев, М.Т. Ауксины и фенолкарбоновые кислоты как индукторы ризогенеза растений рода Rubus in vitro. / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // С.-х. биология. 1996. - №1. - С. 92-98

126. Упадышев, М.Т. Об использовании флоридзина при микроразмножении садовых растений. / Упадышев М.Т.,

127. Дроздовский Э.М. // С.-х. биолгия, 2003. №1. - С. 87-93

128. Упадышев, М.Т. Размножение ежевики и малины черной методом культуры тканей. / Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. // Садоводство и виноградарство. 1991 а. - №6. - С. 24-27

129. Упадышев, М.Т. Цитокининовая активность тидиазурона при микроразмножении ежевики и малины черной. / Упадышев М.Т. // Перспективы отечественного садоводства. Киев, 1991 Ь. - С. 111112

130. Фаустов, В.В. Анатомо-морфологические особенности развития микрочеренков земляники в культуре in vitro. / В.В. Фаустов, О.О. Белошапкина// Известия ТСХА. 1995. - №1. - С. 127-138

131. Хамукова Ф. Н. Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения / Хамукова Ф. Н. // Автореф. Дисс. Канд. с. -х. наук. М., -1994.- с. 22.

132. Хапова С.А. Условия культивирования in vitro и последующая продуктивность растений земляники / С.А. Хапова // Автореф. дис. . канд. с.-х. наук, ВСТИСП Москва, 1997. - 23 с.

133. Хапова, С.А. Влияние условий культивирования на клональное микроразмножение земляники и процессы ее адаптации к нестерильным условиям. / Хапова С.А. // Молодые ученые -садоводству России. Москва, 1995.-С. 156-158

134. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro. / Хасси Г. / Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., 1987. -С. 105-133

135. Шакиров, Ф.Р. Применение крезацина при выращивании сеянцев сосны обыкновенной в условиях Башкирского Предуралья: Автореф. дис. канд. биол. наук / Ф.Р. Шакиров; БГУ. Уфа, 2002. - 16 с.

136. Шахова, JI.H. Применение химических регуляторов роста на землянике. / JI.H. Шахова // Применение физиологически активных веществ в садоводстве. Москва, 1972. - С. 122-127

137. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология. / B.C. Шевелуха, С.В. Дегтярев, Г.М. Артамонова и др. М.: Изд-во МСХА, 1998.-310 с.

138. Шмырко, Н.В. Микроклональное размножение садовой земляники. / Шмырко Н.В. // Биотехнология возрождению с.х. России в XXI в. - Санкт-Петербург, 2001. - С. 98-100

139. Чернышев, Е.А. Испытание регуляторов роста в питомниководстве. / Чернышев Е.А. // Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых. М., 2001. С. 142-143

140. Чернядьев, И.И. Картолин-4 как антистрессовый препарат для защиты фотосинтетического аппарата хлебных злаков при водном стрессе. / Чернядьев И.И. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. Москва, 2001. - Т. 1. - С. 475-477

141. Юсуфов А. Г. Регенерация высших растений / Юсуфов А. Г. // М. -1982.-с. 176

142. Ярославцев, Е. И Малина / Е. И Ярославцев.- М.: Агропромиздат, 1987.-207 с.

143. Ярославцев, Е.И. Технология возделывания малины, пригодная к механизированной уборке плодов / Ярославцев Е.И. Состояние и перспективы развития ягодоводства в СССР: Сб. науч. работ / ВНИИС им. И.В. Мичурина Мичуринск, 1990. С. 68-72. ,

144. Anderson W. С. Tissue culture propagation of red and black raspberries, Rubus ideus and Rubus occidentalis. /Anderson W. C. // Acta Horticulturae.- 1980. -N. 112. -P. 13-20.

145. Baker B. S. Factors affecting adventitious shoot regeneration from leaf explants of quince (Cydonia oblonga) / Baker B. S., Bhatia S. K. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. -N.35 -P. 273-277.

146. Barg R. Effects of sugar concentration on growth, greening and shoot formation from callus culture from 4 genetic lines of tobacco / Barg R., Umiel N. // Pflanzenphysiol. -1977.-81.S.- pp. 268-273.

147. Chevreau E. Adventitious shoot regeneration from leaf tissue of three pear (Pyrus sp.) cultivars in vitro. Chevreau E., Skirvin R., Abu-Qaoud H. A., Korban S. S., Sullivan J. G. // Plant Cell Reports., 1989- V. 7 -P.688-91.

148. Cousineau J. C. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of tissue cultured and greenhouse-grown raspberry / Cousineau J. C., Donnely D. J., Donnely D. J. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1991.- N.27 -P. 249-255.

149. D'Amato F. Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants. In: T. A. Thorpe (Ed.) Frontiers of plant tissue culture, International Association of Plant Tissue Culture, U. of Calgary, Canada. 1987. p. 278-295.

150. Dorokhov D. Rapid of RAPD analyses of plant genome and nature of the RAPD spectra. / Dorokhov D., Kloke E. // German Russian Cooper. Biotechnology. Workshop lv. Plant Molec. Biol., Genetics and Biotechnology, 1996. P. 34.

151. Fiola J. A. Somatic embryogenesis, organogenesis and proliferation In vitro from Rubus embryos. Fiola J. A., Swartz H. J. // Acta-Horticulturae -1986.-N. 183.-P. 91-98.

152. Franclet A. Rejeunissemennt des arbres adultes en vue de leur propagation vegetative / Franclet A. // Micropropagation d'Arbres Forestiers. 1979. - V.6.-№12 - P.3-18.

153. Graham J. Towards genetic based insect resistance in strawberry using the Cowpea trypsin inhibition gene / Graham J., McNicol R. J., Greig K. // Ann. appl. Biol. 1995 - N.127- P. 163-173.

154. Graham J. An examination of the ability of RAPD markers to determine the relationships within and between Rubus species / Graham J., McNicol R. J. // Theoretical and Applied Genetics. -1995.- V. 90. -P. 321128.

155. Graham J. Use of the GUS gene as selectable marker for Agrobacterium- mediated transformation of Rubus / Graham J., McNicol R. J., Kumar A. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1990.- N.20- P. 9-35.

156. Greelman, R.A. Oligosaccharins, brassinolides and jasmonates: nontraditional regulators of plant growth development and gene expression. / Greelman, R.A., Mullet J.S. // Plant Cell., 1997.- V. 9. P. 1211-1223.

157. Hall H. K. Isolation of a pure thornless Loganberyy by meristem tip culture / Hall H. K., Quazi M. H., Skirvin R. M. // Euphytica. -1986. -N. 35. -P.44-1039.

158. Haskell G. and Garrie. J.B. Fingerprinting raspberry cultivars by empirical paper chromatography. / Haskell G. and Garrie. J.B. // Journal of the Science of Food and Agriculture, -1966. -p. 189-192.

159. Hussey, G. In vitro propagation of the onion Allium сера by axillary and adventitious shoot proliferation. / Hussey G. // Scientia Horticulturae. -1978. V.9. - P. 227-36.

160. Huetteman, C.A. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture. / Huetteman C.A., Preece J.E. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993.-V. 33.-P. 105-119

161. Jennings D. L. Raspberries and Blackberries Their Breeding, Deseases and Growth. / Jennings D. L. // Academic Press., London, New York,-1988.-p. 1-230.

162. Jennings D.L. Blackberries and raspberries. / Jennings D.L., Daybeny H.A. and Moore J.N. // Acta Hortiadturae,- 1990.- p.330-389.

163. Lane W. D. Adventitious shoots from cotyledons of immature cherry and apricot embryos / Lane W. D., Cossio F. // Can J. Plant Science. -1986. -N. 66. -P. 953-959.

164. Lowe K.C. Plant tissue culture: past, present and future / Lowe K.C., Davey M.R. // Plant Tissue Culture and Biotechnology.- 1996.- V.2. №2.- P. 173-186

165. Kerns H. R. Tissue culture propagation of Acer x-Freemanii using thidiazuron to stimulate shoot tip proliferation / Kerns H. R., Meyer M. M. // Horticular Science. -1986. -N. 21. -P. 1209-1210.

166. Maretzki A. Influence of osmotic potential on the growth and chemical composition of sugar cane cell cultures / Maretzki A., Thom M., Nickell L.M. // Hawaii Plant Rec. 1972.- V.58.- P. 183-199.

167. McNicol R. J. Genetic manipulation in Rubus and Ribes. / McNicol R. J., Graham J. // Acta- Horticulturae. 1989. -N. 262. -P. 41-46.

168. Millan-Mendoza B. Organogenesis and micropropagation in red raspberry using forchlorfenuron. /Millan-Mendoza В., Graham J. // Horticultural science & biotechnology. -1999.- N. -74(2). -P. 219-223.

169. Millan-Mendoza B. Regeneration of Rubus in viyro using forchlorfenuror (CPPU) / Millan-Mendoza B. // Rev. Fac. Agror. (LUZ). -1998.- V.15.- p. 242-248.

170. Murashige, T.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. / Murashige Т., Skoog F. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15. №13. - P. 473-497

171. Nyman M. Improved culture technique for strawberry (Fragaria*ananassa Duch.) protoplasts and the determination of DNA content in protoplast derived plants / Nyman M., Wallin A. // Plant Cell Tissue Organ Cult., -1992. -V. 30.- P. 127-133.

172. Pierik R.L.M. In vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff

173. Publishers, Dordrecht, Boston, Lancaster 1987. 341 p.

174. Read P. E. Effectiveness of thidiazuron and CPPU as cytokinin-like compounds. In Vitro. / Read P. E., Yang G., Auko С. O. // 1992. -V. -28 (2).- P. 57.

175. Rout G. R. In vitro regeneration of shoots from callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora. / Rout G. R., Debata В. K. // Indian Journal of Experimental Biology. -1992. -N. 30 -P. 15-18.

176. Saiki R.K. Primer directed enzymatic amplification of with a thermosteble DNA polymerase. / Saiki R.K., Gelfand D., Staffel S. et al. // Scince. 1988.-239.- c. 487-491.

177. Saiki R.K. Enzymatic amplification of P globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. / Saiki R.K., Scharf F., Faloona F. et al. // Ibid. -1985. - 230 C.-1350-1354.

178. Schuerman P.L. Transformation of temperate woodycrops: progress and potentials. / Schuerman P.L., Dandekar A. M. // Scientia Horticultural -1993.-V. 55-P. 101-124.

179. Sorvari S. Preculture medium promotes direct shoot regeneration from micropropagated strawberry leaf disks. / Sorvari S., Ulvinen S., Hietaranta Т., Hiirsalmi H. // Horticular Science. 1993 N.28(1). P. 55-57.

180. Swartz H. J The use of Agrobacterium as a genetic vector in Rubus / Swartz H. J., McNicols R. Hyman B. // Annu Rep Scottish Crop Rep Inst 1987 V. 7. P. 85-86.

181. Swartz H. J. The effect of in vitro pretreatments on subsequent shoot organogenesis from excised Rubus and Malus leaves. / Swartz H. J., Bors R., Mohamed F., Naess K. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1990. -N. 21.- P. 179-184.

182. Swartz H.J. Field performance and phenotypic stability of tissue culture-propagated strawberries / Swartz H.J., Galetta G.J., Zimmerman R.H. //Am. Horticular Science. 1981.-V. 106.-P. 667-675.

183. James D. J. Genetic transformation of apple (Malus pumila Mill.)using a disarmed Ti-binary vector / James D. J., Passey A. J., Barbara D. J., Bevan M. W.// Plant Cell Reports -1989 V. 7. -P. 658-661.

184. James D. J. Factors affecting high frequency plant regeneration from apple leaf tissues cultured in vitro. /James D. J., Passey A. J., Rugini E // Plant Physiology. -1988. -N.132.- P. 148-154.

185. James D.J Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstocks /James D.J., Mackenzie KAD, Malhotra S. В.// Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1984.- V.3. -P.333-341.

186. Turk B. A. Adventitious shoot regeneration in vitro-cultured leaves of 1 Rubus genotypes. / Turk B. A., Swartz H.J. & Zimmerman R. H. // Plant

187. Cell, Tissue and Organ Culture. -1994. -N. 38 -P. 11-17.

188. Wang D. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of strawberry / Wang D., Wergin W. P., Zimmerman R. H. // Horticular Science. -1984. -N. 19 -P.71-72.

189. Wareing P.F. Phase chende and vegetative propagation / Wareing P.F. // Improving vegetatively propagated crops. Academic Press Limited., 1987.-P. 263-270.

190. Walkey, D.G.A. Production of virus-free plants by tissue culture. / Walkey D.G.A., Ingrain D.S., Helgeson J.P. // In Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, 1980. P. 109-117

191. Welander M. In vitro culture of raspberry (Rubus ideaus) for mass propagation. / Welander M. // Horticular Science. -1985. N. 60 (4). -P. 493-499.

192. Welander M. Plant regeneration from leaf and stem segments of shoots raised in vitro from mature apple trees / Welander M. // Plant Physiology -1988. -V 132. -P. 738-744.

193. Welander M. Shoot regeneration from leaf explants of dwarfing apple ) rootstocks. /Welander M., Maheswaran G. // Plant Physiology. -1992.1. N.140 P.8-223.

194. Williams J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. / Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. & Tingey S.V. // Nuc. Acids Res.,- 1990. c.531-535.

195. Yao J. Regeneration of transgenic plants from the commercial apple cultivar Royal Gala / Yao J.-L., Cohen D., Atkinson R. et al. // Plant Cell Reports. 1995. -V. 14 № 7 -P.402-412.

196. Yeoman M.M. Plant cell culture technology / Yeoman M.M.// Oxfors etc. Blackwell. 1986. - 12.-p 427.

197. Yepes L.M. Factor that affect leaf regeneration efficiency in apple, and effect of antibiotics in morphogenesis / Yepes L.M. & Aldwinle H.S. // Plant Cell Tiss. Org. Cult. -1994. V.37. -P. 34-38.

198. Zhu L. H. Adventitious shoot regeneration of two dwarfing peat rootstocks and the development of a transformation protocol / Zhu L. H., Welander M. // Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 20001. N.75 6-P. 745-752.