Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO И УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИИ НОВЫХ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO И УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИИ НОВЫХ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ"

Л--И

На правах рукописи

СКОВОРОДНИКОВ Дмитрий Николаевич

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO И УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИИ НОВЫХ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ

Специальность 06.01.05. - селекция и семеноводство, 03.00.12. - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Брянск - 2004

Работа выполнена в межкафедральной лаборатории биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии и на селекционном участке Коки не кого опорного пункта Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и п нтом н и ко во дет ва в 2000-2003 гг.

Научные руководители - заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор И.В, КАЗАКОВ,

доктор биологических наук, профессор В.В. ЗАЯКИН

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук

М.В, Каньшнна кандидат биологических наук, доцент В А. Попов

Ведущая организация — Брянский государственный университет

им. академика И.Г. Петровского.

Защита диссертации состоится-£_ января 2004 г. в Л' на заседание диссертационного совета Д 220. 005. 01 в Брянской государствен сельскохозяйственной академии по адресу: 243365, Брянская об.!. ВыгоничскнЙ район, п. Кокино, Брянская ГСХА, корпус 1, зал заседай и»:.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Брянской . < Автореферат разослан декабря 2003 г.

Просим принять участие в работе Совета или прислать свсГ' m -2-х экземплярах, заверенных гербовой печатью.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук, доцент

А,И, Артюхов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На Коки не ком опорном пункте ВСТИСП (Брянская область) с начала 70-х годов прошлого века ведется интенсивная работа по созданию ремонтантных сортов малины, формирующих основной урожай в конце лета - начале осени на однолетних побегах. Актуальной проблемой при создании таких сортов является оптимизация селекционного процесса. Ряд ремонтантных сортообразцов малины сложного межвидового происхождения отличается низкими коэффициентами размножения, а отдельные из них вовсе не образуют корневой поросли (И.В. Казаков, 2001). Эта биологическая особенность затрудняет размножение таких генотипов традиционными способами и, таким образом, значительно удлиняет период от выделения гибридов в элиту до передачи в сортоиспытание. Кроме того, ограничивается объем скрещиваний при использовании их в качестве родительских форм. Эти препятствия в значительной мере можно преодолеть путем использования метода клонального микроразмножения (В.В. Вовк, 2000). Данная работа является продолжением исследований по оптимизации клонального микроразмножения новых межвидовых ремонтантных форм малины для ускорения селекционного процесса.

Для межвидовых ремонтантных форм малины остаются неизученными вопросы регенерации из листовых эксплантов, что представляет определенный интерес для получения генетического разнообразия форм с использованием клеточной селекции, генетической инженерин м других биотехнологических методов,

В настоящее время в лаборатории биотехнологии БГСХА накоплено в пробирочной Культуре около 100 селекционно-ценных генотипов ремонтантной малины, которые нуждаются в совершенствовании методологических подходов для выяснения наиболее эффективных способов их длительного хранения in vitro.

Крайне мало информации о поведении размноженных в культуре in vitro растений малины в полевых условиях и практически отсутствуют такие сведения о ремонтантных сортах межвидового происхождения.

Решение затронутых выше проблем является актуальным и имеет важное теоретическое и практическое значение для ускорения селекции ремонтантной малины.

Цель исследования. Целью проводимых исследований являлось изучение особенностей клонального микроразмножения новых ремонтантных форм малины, поведения размноженных in vitro растений в полевых условиях и оптимизация условий адвентивного органогенеза для ускорения селекционного процесса и внедрения новых сортов в производство. Задачи исследований;

• Оптимизировать условия осеннего введения в культуру in vitro

ремонтантных образцов малины; . ----------------....

5 ' '.", л: '

• Изучить поведение новых генотипов на всех этапах клонального микроразмножения;

• Определить эффективные способы длительного хранения растений в культуре in vitro;

• Оптимизировать условия адвентивного органогенеза и изучить регенерационную способность листовых эксппантов различных форм ремонтантной малины;

• Оценить в полевых условиях полученные in vitro растения ремонтантной малины и сравнить их с растениями, размноженными традиционным способом.

Научная новизна исследований и практическая значимость работы. В результате проведенной работы показана возможность осеннего введения в культуру in vitro межвидовых ремонтантных сортов и форм малины с использованием в качестве источника экспланта фрагментов почек, изолированных от побегов замещения. Изучены факторы, влияющие на приживаемость и регенерационную способность эксплантоа.

Изучено поведение в культуре in vitro новых ремонтантных гибридов на всех этапах клонального микроразмножения с использованием различных типов регуляторов роста.

Оптимизированы условия адвентивного органогенеза из листовых эксплаитов для новых генотипов ремонтантной малины и изучена их реге-нерационная способность,

Показано увеличение генеративной и вегетативной продуктивности у размноженных in vitro растений ремонтантных сортов малины в сравнении с растениями, полученными традиционным способом.

Реализация результатов исследований. Растения малины, полученные в лаборатории биотехнологии in vitro, использованы для закладки маточников ремонтантных форм малины на участке Кокинского опорного пункта ВСТИСП. Всего передано для высадки в почву 4325 растений малины 41 генотипа.

В результате проведенной работы подготовлены для передачи в госсортоиспытание три новых сортообразш ремонтантной малины Бриллиантовая, Элегантная и Надежная.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научно-практических конференциях: «Молодые учёные - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Брянск, 2000); «Молодые учёные - возрождению сельского хозяйства в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001). «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» (Брянск, 2002); V съезде общества физиологов растений России «Физиология растений — основа фи-тобиотех коло ги и» (Пенза, 2003)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

4

Одъё.и и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из 3 глав, выводов и рекомендаций для практической селекции списка использованной литературы. Работа содержит 36 таблиц и 13 рисунков. Список использованной литературы включает 220 наименований, в том числе 154 на иностранных языках.

Место проведения, материал и методика исследований.

Исследования проводились в 2000-2003 годах в лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА и на селекционных участках малины Кокин-ского опорного пункта Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомннководства (ВСТИСП). Объектом исследования являлись образцы ремонтантной малины сложного межвидового происхождения, полученные под руководством доктора с.-х. наук И.В, Казакова.

Питательные среды готовились на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (T.Murashige & F.Skoog, 1962), с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа.

Стерилизацию материала проводили в асептических условиях с помощью 0,1% раствора сулемы в течение 3-5 минут.

На этапе введения в культуру в качестве источника цитокинина вводили тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,1 мг/л.

Для размножения малины применяли цитокинины б-БАП в концентрации 2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05,0,1 и 0.2 мг/л.

В качестве индукторов ризогенеза применяли ИУК или ИМК, Использовали различные способы воздействия: введение ауксинов непосредственно в питательную среду в концентрации 0,5-0,75 мг/л; кратковременная обработка в течение нескольких секунд в водном растворе ауксина в концентрации 1000 мг/л с последующей посадкой их на среды без гормонов или в субстрат, минуя стадию укоренения в пробирке.

В опытах по регенерации изучали влияние различных концентраций TDZ (0,025-2 мг/л) и темновой инкубации на адвентнвный органогенез ремонтантных образцов малины с использованием питательной среды МС.

При изучении оптимальных условий хранения пробирочных растений в культуре in vitro в качестве цитокинина во всех вариантах использовали 6-БАП в концентрации 1мг/л. Из осмотических ингибиторов было изучено влияние маннита (1 -3%)и сахарозы (3-9%) в различных соотношениях, из регуляторов роста - ССС и АБК в концентрациях 0,25, 1 г/л и 5, 20 мг/л соответственно, В качестве контроля использовали среду без ингибиторов роста.

При оценке полученных форм ремонтантной малины в полевых условиях учитывали элементы продуктивности растений н их порослеобра-зовательную способность, которые сравнивали с растениями, размноженными традиционным способом.

Опыты, проводили в трехкратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М±т, где М - математическое ожидание, а m-стандартная ошибка среднего (Б.А.Доспехов, 1974),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация осеннего введения в культуру in vitro ремонтантных Форм малины Введение в культуру межвидовых ремонтантных форм малины может ограничиваться тем, что ряд ценных отборов сложного межвидового происхождения, включающих геноплазму малины красной, черной, боярышни кол истной, душистой, замечательной и поленики, отличается очень низким коэффициентом размножения в полевых условиях, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли.

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП селекция ремонтантной малины ведется в направлении создания сортов, реализующих основную часть своей продуктивности осенью на однолетних побегах, что позволяет ежегодно после заморозков срезать всю надземную часть куста. В связи с этим после проведения селекционной оценки сеянцев (конец августа - начало сентября) для введения в культуру ш vitro можно использовать почти все нераспустившиеся почки на побегах замещения, которые на этом этапе развития дифференцированы по цветочному типу.

Успешная реализация такого подхода, то есть введение образцов в культуру осенью вместо весны будущего года, может почти на год ускорить размножение перспективных форм, а значит и создание новых сортов малины.

Для определения возможности использования почек, изолированных от однолетних побегов замещения, для введения в культуру in vitro были использованы размноженные сорта ремонтантной малины - Геракл, Бриллиантовая и Надежная.

Через месяц культивирования на питательной среде с TDZ (0.1 мг/л) стопроцентной приживаемостью отличались экспланты всех сортов, выделенные из почек побегов размножения (поросли) (табл. 1).

Использование эксплантов, изолированных от побегов замещения при введении в культуру in vitro, также дает высокий выход выживших эксплантов. Наибольший процент приживаемости был отмечен у сортов Бриллиантовая и Геракл (100 и 97,1% соответственно), несколько ниже у сорта Надежная^0/»).

Лучшая приживаемость эксплантов, взятых от побегов размножения, может быть связана с большей регенерационной способностью молодых тканей у почек, сформировавшихся на побегах размножения, которые у малины образуются в течение всего периода вегетации, вплоть до заморозков (Е.И. Ярославцев, 1979).

Таблица 1

Приживаемость эксплантов, изолированных от побегов замещения к размножения

№ п.п, Тип побегов Количество изолированных эксплантов, шт. % выживших эксплантов через 1 месяц Количество образовавших ся побегов на эксплант, шт.

Геракл

1 Побеги размножения 38 100 1,9±0,4

Побеги замещения 34 97,1 1,9±0,1

Бриллиантовая

2 Побеги размножения 23 100 1,7±0,2

Побеги замещения 21 100 2,5±0,5

Надежная

3 Побеги размножения 40 100 1,1 ±0,2

Побеги замещения 36 90,0 1,7±0,б

Другим объяснением может быть то, что используемые для изолирования почки от побегов возобновления находятся в нижней части побега, а у малины наименее развитые почки находятся в нижней и верхней части побега (ВЛ, Витковский, 1984).

Преимущество использования эксплантов с плодоносящих побегов замещения заключается еше и в том, что при густой посадке сеянцев или сильном разрастании растений малины нередко возникает вопрос о принадлежности поросли к тому или иному генотипу, тогда как во время плодоношения отличительные признаки нужной формы легко можно определить по плодам. Возможность использования эксплантов с плодоносящих побегов позволяет размножить элитные сеянцы уже в первый год их плодоношения, когда, как правило, они еще не образуют поросли.

Местоположение почек на побеге оказывало влияние на количество инфицированных эксплантов и на их приживаемость в первые дни культивирования (рис 1.).

Так, наибольшее количество инфицированных эксплантов было отмечено у фрагментов почек, расположенных в основании побега (46% инфицированных эксплантов), а лучшей приживаемостью обладали верхние почки.

А

н о о И ж (Й п о ^ в в ^

v а

•в« о

к н

а 5

s §

S а

8 й зо н

а К

и___

3 5 7 9

Порядок расположения почек на побеге 0% выживших эксплантов В % инфицированных эксплантов

Рис 1. Приживаемость и инфицированность фрагментов почек сорта Бабье лето - 2 в зависимости от их расположения на побеге

После 1 месяца культивирования фрагментов почек с однолетних побегов замещения на среде с TDZ прослеживалась тенденция увеличения количества образовавшихся побегов от основания до первого латерала (табл. 2). Максимальное количество побегов отмечено у эксплантов 11 порядка (2,7 шт.).

После перенесения эксплантов на среду размножения (ВАР 2 мг/л) было отмечено пропорциональное увеличение, почти в два раза, количества образовавшихся побегов с сохранением той же закономерности - повышенной способности к регенерации верхних почек. Такую зависимость можно объяснить как морфологической неоднородностью почек, так и их различным физиологическим состоянием.

При введении в культуру in vitro лучшей приживаемостью характеризовались крупные экспланты (1-4 мм), представляющие собой фрагменты почек без кроющих чешуй и пары зачатков настоящих листочков. В качестве источника цитокинина на этом этапе эффективнее оказался TDZ в концентрации 0,1 мг/л.

Таблица 2

Ре генерационная способность эксплантов в зависимости от расположения

почек на побеге

Порядок расположения почек на побеге Количество побегов на эксплант, шт.

1 пассаж (TDZ 0,1 мг/л) 2 пассаж (ВАР 2мг/л)

1 1,0±0,5 1,4 ±0,5

3 0,8±0,2 2,3+1,1

5 0,9+0,3 1,6 ±0,7

7 1,3 ±0,5 2,2+0,1

9 1,8±0,2 3,6±0,6

11 2,7±0,2 4,5 ±0,7

При введении в культуру in vitro ремонтантных форм малины наиболее трудным этапом оказалась адаптация эксплантов к среде размножения. После перенесения эксплантов, представляющих собой конгломераты маленьких побегов с инициальной среды (TDZ 0,1 мг/л) на среду размножения (6-БАП 2 мг/л), наблюдалась гибель тех трасплантов, у которых имелись признаки витрификации. Улучшить приживаемость эксплантов удалось с помощью культивирования в течение первых недель после их перенесения на среду с 6-БАП при низкой интенсивности освещения (275-300 лк). По-видимому, при ярком освещении происходит отмирание верифицированных под действием TDZ тканей. Недостаток света замедляет этот процесс и дает возможность для образования и роста нормальных побегов.

Размножение новых ремонтантных Форм малины в культуре in vitro Эффективность размножения растений in vitro во многом зависит от индивидуальной генотипической реакции растений на включаемые в питательную среду гормоны.

У представленных для размножения в 1999-2000 гг. ремонтантных образцов малины при их культивировании на 6-БАП коэффициент размножения варьировал от 1,7 до 13,1, в среднем по двум годам он составил 4,1. Существенно отличались растения по высоте побега и количеству образовавшихся листьев.

Из 18 генотипов выделились трудноразмножаемые формы - 15-220-2 и 16-67-1, у которых коэффициент размножения составил соответственно 1,7 и 1,9. При использовании стандартных методов культивирования эти генотипы даже за 2 года не удалось размножить до количества 50 растений. Использование простого черенкования (по междоузлиям) не дало положительных результатов — жизнеспособными оставались только верхушки

растений, базальные черенки не образовывали дополнительных побегов и со временем усыхали. Трудность размножения таких генотипов обусловлена тем, что наряду с низкими коэффициентами размножения эти генотипы имеют укороченные побеги с малым количеством междоузлий.

Частично решить проблему размножения таких генотипов можно за счет повторного введения в культуру in vitro дополнительного количества материала после первичной оценки. Такой подход даст возможность передать ценные формы ремонтантной малины в количестве, необходимом для конкурсного испытания. Однако нужно заметить, что трудноразмножаемые генотипы ремонтантной малины отличаются слабой приживаемостью и регенерационной способностью на этапе введения в культуру in vitro, что erne более усложняет их размножение.

Генотипы, выделенные в 2001 году также отличались по коэффициенту размножения, высоте растений и количеству образовавшихся листьев. Коэффициент размножения варьировал от 1,4 и 1,5 у генотипов 5-Б-87-2 и 21-76-1 соответственно до 8,7 у генотипа 6-43-5. На среде с 6-БАП высота растений у некоторых форм достигала 36 мм (18-183-1); самым слабым ростом характеризовался генотип 21-76-1 (1,5), который отличался плохой способностью к образованию пазушных побегов.

При изучении особенностей динамики размножения гибридов ремонтантной малины (отборы 2002 г.) только у генотипов 9-35-10, 7-254-1, 1-98-10 и 32-Х наблюдалось существенное увеличение коэффициента размножения во втором пассаже. Использование в качестве цитокинина TDZ в третьем пассаже эффективнее стимулировали размножение только для генотипов 7-254-1 и 21-232-2, но при этом значительная часть растений имела признаки в игр нф и каин и (табл. 3).

Таблица 3

Влияние типа цитокининов на размножение _ремонтантных образцов малины_

№ п. п. Генотип Коэффициент размножения * Высота растений *, мм

6-БАП 2 мг/л TDZ 0,1 мг/л 6-БАП 2 мг/л TDZ 0,1 мг/л

1 9-35-10 3,3±0,3 4,2±0,б 25,2+2,7 11,9±1,0

2 7-254-1 3,0 ±0,7 7,0±0,8 10,2+0,8 7,3 ±0,1

3 18-65-10 2,5 ±0,2 2,8+0,7 14,0±1,3 10,2±0,9

4 21-232-2 2,5+0,1 4,2+0,5 16,5±2,4 8,6± 1,2

5 1-98-10 2,2±0,2 1,5±0,4 22,8+3,4 13,6±2,3

* - третий пассаж

Отрицательное действие 702 при клональном микроразм ножен ни малины проявлялось в слабом росте пазушных побегов (табл. 3). Так, у всех изученных генотипов высота образовавшихся побегов на среде с 6-БАП (2 мг/л) существенно превышала этот показатель при культивировании растений на среде с TDZ.

Укоренение и адаптация пробирочных растений ремонтантной малины к нестерильным условиям

В экспериментах были использованы оптимальные концентрации ауксинов (ИУК, ИМК), подобранные ранее для ремонтантных форм малины (В.В. Вовк, 2000). Учитывался тот факт, что тип используемого ауксина и способ его применения зависят от генотипических особенностей растений.

При определении оптимального типа ауксина при его добавлении в среду на 6 ремонтантных формах малины была отмечена сортоспецифичность. Для генотипов 4-43-2, 2-21-20 большее количество образовавшихся корней наблюдалось в варианте с использованием ауксина ИУК, для генотипа № 24 - в присутствии ИМК, для генотипов 2-85-1, 3-125-1 и 3-2-1 существенных отличий обнаружено не было. Причем для генотипов 2-85-1 и 4-43-2 длина корней была больше при использовании ИУК, для остальных —достоверных отличий не было.

При сравнении способов обработки ауксинами по количеству образовавшихся корней на одно растение выделился вариант с использованием импульсной обработки микрочеренков в растворе ИМК (1000 мг/л) и дальнейшем их культивированием на безгормональной среде. У всех шести испытанных генотипов при данном способе применения ауксина образовывалось существенно большее количество корней на побеге, чем при введении ауксинов непосредственно в питательную среду. Этот эффект проявлялся с начала ризогенеза и до окончания опыта. При этом наблюдалась тенденция к увеличению длины корней, кроме генотипа 2-85-1, у которого при большом количестве корней их средняя длина несколько уменьшилась.

При сравнении двух способов укоренения - в песке и на питательной среде, более высокий процент укоренения, за исключением двух генотипов (2-85-1 и 4-43-2), был отмечен в варианте с непосредственной посадкой микрочеренков в песок (от 40% у генотипа 32-1 до 100% у генотипа №24) (табл. 4),

После высадки пробирочные растения уступали в развитии растениям, укорененным непосредственно в песке, что связано с более продолжительной адаптацией, вследствие повреждения корней при пересадке в песок.

Таблица 4

Укоренение ремонтантных форм малины в зависимости от способа

обработки и типа ауксина

Хе п./п. Генотип Количество укорененных растений, %

В песке На питательной с эеде

ИМК обм а кивание 1000 мг/л ИМК обмакива-ние 1000 мг/л ИМК 0,5 мг/л ИУК 0,75 мг/л

1 2-85-1 41,38 88,6±7,4 72,9± 18,6 85,7±10,2

2 3-125-1 84 68,3±1,9 24,6±4,9 50,0±5,1

3 3-2-1 40 39,0±9,2 13,9±6,1 15,3±3,2

4 №24 100 73,9*7,1 57,5±7,3 37,5±8,7

5 4-43-2 40,48 77,5±7,4 48,8±15,4 63,9±4,2

6 2-21-20 75 40,0±4,7 12,8*5,5 39,2±13,1

В зависимости от способа обработки и типа ауксина на питательной среде, в варианте с импульсной обработкой процент укорененных растений был либо достоверно выше, либо не уступал вариантам с постоянным присутствием ауксинов в среде (табл. 4). При сравнении влияния ИУК и ИМК также наблюдалась сортоспецифичность в реакции укоренения.

При соблюдении таких условий культивирования, как использование простерилизованного субстрата, оттитрованного до уровня рН 6,0-7,0, создание высокой влажности воздуха в первые недели культивирования, оптимальный температурный режим, своевременный полив и подкормка растений разбавленным раствором МС, можно обеспечить высокую приживаемость и дальнейшее развитие растений малины на этапе адаптации к нестерильным условия.

Из всех этапов клонального микроразмножения для ремонтантных образцов малины процесс адаптации пробирочных растений имел наименее четко выраженную генотипическую зависимость,

Оптимизация адвентивного органогенеза и регенепаиионная способность межвидовых ремонтантных Форм малины In vitro

Предварительный эксперимент для определения оптимальных концентраций TDZ по регенерации адвентивных побегов малины был проведен на листовых эксплантах ремонтантной формы 1-125-1. В исследуемом диапазоне концентраций TDZ 0,2-3 мг/л, только в варианте с добавлением 3 мг/л TDZ не было отмечено регенерационных процессов. При использовании TDZ от 2 мг/л и ниже, наблюдалось образование адвентивных побегов.

В следующем опыте, проведенном на сорте Бабье лето - 2 диапазон концентраций TDZ был смещен в меньшую сторону. Динамика регенерации адвентивных побегов на листовых дисках малины представлена на рис. 2

Интервал в днях

TDZ0.02S ■ Т020.05 —*—TDZO.t К TOZ 0.2 Ж TOZ 0.5 —TD21

Рис. 2 Динамика регенерации листовых дисков малины Бабье лето - 2 при различной концентрации TDZ

Через 2,5 недели культивирования на листовых эксплантах при концентрации тЪz 0.1, 0.2, 0.5, 1 мг/л было отмечено начало стеблевого морфогенеза. После 26 дней инкубации увеличения числа образовавшихся регенерантов не происходило, за исключением варианта TDZ 0,5 мг/л. При концентрации ТОг 0.5 и 1.0 мг/л регенерировавшие побеги имели морфологические нарушения, Наибольшая частота регенерации была отмечена в варианте ТЕК 0,2 мг/л и составила 46.7 %-

После 7 недель культивирования регенеранты отсекали от листовой пластинки и помешали на среду размножения (б-БАП 2 мг/л). Приживаемость

растений, снятых с меньших концентраций TDZ, была выше и составила 90.9%, 30.0% и 12.5% соответственно на средах с 0.1,0,2, 0.5 мг/л TDZ.

Плохая приживаемость растений образовавшихся на средах с TDZ на среде с БАП может быть связана с явлением витрификации, которое наблюдается в присутствии TDZ, Гибель растений после их перенесения на 6-БАП может быть также связана с разной природой тидиазурона и 6-БАП, первый из которых относится к классу дифенилмочевины, а второй к производному аденина. Такое явление прослеживалось нами на этапе введения в культуру in vitro, при этом выживаемость образовавшихся растений при переносе на б-БАП повышалась при их культивировании при низкой интенсивности света. Вероятно, такой прием может быть полезен при адаптации регенерантов, полученных из листовых дисков.

Положительное влияние на регенерационные процессы оказывала темновая инкубации эксплантов в течение 10 дней в полной темноте в начале культивирования.

При изучении реге нерацион вой способности некоторых генотипов ремонтантной малины было выявлено, что все изученные формы были способны к образованию адвентивных побегов на листовых эксплантах, однако частота регенерации и количество образовавшихся побегов на эксплант существенно зависели от используемого генотипа (табл. 5).

Таблица 5

Частота регенерации некоторых генотипов ремонтантной малины

№ п,п. Генотип Частота регенерации, %

TDZ 0.05 мг/л TDZ 0.1 мг/л TDZ 0.2 мг/л TDZ 0.5 мг/л

1. 19-99-1 13,3±4,1 1б,7±4,1 0 0

2. 17-60-1 13,3±8,2 6,7±4,1 0 0

3, №24 1б,7±4,1 3,3±4,1 0 0

4. 4-43-2 0 3,3±4,1 0 0

5. 2-205-1А 0 4.5±2,8 8,3±2,8 -

6. 2-85-1 3,3±4,1 б,7±4,1 0 -

7. 21-232-2 - 68,5±8,8 4б,7±8,3 -

8, 9-35-10 - 25,9±9,2 - -

9. 1-98-10 - 6,7±4,1 - -

10. 18-65-10 - 3,3±4,1 - -

В исследованном диапазоне концентраций Т02 (0,05-0,5 мг/л) наибольшая частота регенерации адвентивных побегов наблюдалась при добавлении в питательную среду 0,1 мг/л Т02. Поэтому для некоторых генотипов регенерат юн ная способность была изучена только при этой концентрации цитокинина.

Среди ремонтантных форм малины выделились генотипы, обладающие как низкой органогенной способностью (18-65-4, 1-98-10, 17-60-1) с частотой регенерации 3,3-6,7 %, так и высокой (21-232-2)-68,5%.

У изученных гибридов малины количество образовавшихся побегов на эксплант варьировало от 1 до 4 в зависимости от генотипа, причем не было отмечено четкой взаимосвязи между этим показателем и частотой регенерации побегов.

На процесс морфогенеза большое влияние оказывал тип используемого экспланта. При использовании в качестве источника эксплантов черешков, частота регенерации у них варьировала от 0 до 16,7 %. Среди изученных генотипов большей частотой регенерации обладали листовые экспланты, чем черешки.

Влияние регуляторов роста. осмотических ингибиторов и низкой температуры на хранение in vitro ремонтантной малины

В зависимости от использованного способа ингибирования роста растений, по-разному шел процесс образования и роста пазушных побегов (табл. 6). В контрольном варианте, после заполнения культивируемого сосуда, растения начинали постепенно погибать.

Таблица 6

Эффективность использования различных ингибиторов роста при длительном хранении in vitro ремонтантной формы 11-63-1

Вариант Количество побегов на эксплант, шт. (2 мес.) Высота побегов, мм (2 мес.) Приживаемость, %

2 мес. 7 мес. 12 мес.

Контроль(без ингибиторов) 3,63 ±0,40 11,74±0,47 90,0 70,0 0

Манит 3% (без сахарозы) 1,14±0,01 б,34±0,77 73,3 0 0

Манит 3% 5,60±1,14 17,25±0,63 82,8 76,7 10,0

ССС I г/л 1,61±0,25 7,85±1,28 92,0 0 0

ССС 0,25 г/л 3,27±1,28 16,01 ±0,51 70,0 0 0

АБК 20 мг/л 1,00±0,00 6,97±0,39 53,8 0 0

АБК 5 мг/л 1,25±0,18 8,69±1,05 42,8 0 0

Холод (+4 °С) 1,93 ±0,12 9,60±0,33 90,0 90,0 85,0

Наиболее отрицательное действие на рост пробирочных растений оказал гормональный ингибитор роста - абцизовая кислота. При введении в питательную среду АБК растения не образовывали пазушных побегов и со временем усыхали.

ССС в концентрации 1мг/л также сильно ингибировал рост и размножение растений. При концентрации 0,25 мг/л ССС не оказывал угнетающего влияния на развитие пробирочных растений малины. При таком содержании регулятора роста в среде, происходило образование дополнительных побегов и их рост.

В варианте с удалением из состава среды сахарозы, очень сильно угнеталось развитие пазушных побегов. Совместное сочетание 3% сахарозы и 3% маннита оказало положительное влияние на рост и развитие ремонтантных образцов малины,

В первые недели культивирования наибольшая гибель материала была отмечена в вариантах с использованием гормонального ингибитора роста - абцнзовой кислоты. Большая часть растений погибла уже на второй месяц культивирования. Отрицательный эффект на выживаемость оказало и использование ССС.

Хорошие результаты, в сравнении с контролем, удалось получить при использовании в качестве осмотического ингибитора 3% маннита. Через 7 месяцев культивирования осталось 76,7% выживших растений.

Лучший результат при хранении in vitro был получен при культивировании пробирочных растений в условиях пониженной температуры. Показатель выживаемости через 12 месяцев в этом варианте составил 85%. Культивирование растений при пониженных температурах способствует вытягиванию черешков и их этиолированию, что связано с отсутствием освещения при хранении. Возможно, при небольшой интенсивности света результаты при хранении можно было бы улучшить.

Оценка размноженных in vitro растении ремонтантной малины в полевых условиях Продуктивность изученных сортов ремонтантной малины зависела как от использованного генотипа, так и от способа размножения. Растения, полученные in vitro, превосходили растения размноженные порослью по следующим компонентам продуктивности: количеству образовавшихся побегов, числу латералов, общему количеству генеративных органов и зрелых ягод.

Независимо от происхождения, большей продуктивностью характеризовались растения сорта Бабье лето - 2, для которого потенциальная продуктивность при традиционном и микроклональном способе размножения составила 1568 и 2142 г соответственно. Для сорта Геракл эти показатели составили 1260 и 2066 г.

При оценке влияния различных способов размножения на побегооб-разовательную способность растений ремонтантной малины в полевых условиях было обнаружено, что полученные in vitro растения обладают существенно большей способностью образовывать корневую поросль в сравнении с растениями, размноженными традиционным способом (табл. 7).

У размноженных in vitro растений сорта Геракл за 2 года исследований было отмечено также существенное увеличение количества образовавшихся побегов замещения и тенденция к их увеличению для сорта Бабье лето-2 (табл. 7).

Таблица 7

Побегообразовательная способность растений ремонтантной малины полученных in vitro и традиционным способом

Сорт Растения, размноженные традиционным способом Растения размноженные in vitro

Побеги замещения, шт. Корневая поросль, шт. Потенциальная продуктивность, г Побеги замещения, шт. Корневая поросль, шт. Потенциальная продуктивность, г

2001 г.

Бабье лето- 2 4,0±0,4 1,0±0,2 - 4,5±0,4 3,2±1,3 -

Геракл 3,7±0,2 0,6±0,3 - 4,2±0,5 1,9±0,7 -

2002 г.

Бабье лето-2 4,1 ±0,5 0,7±0,3 1568 4,б±0,3 1,5±0,3 2142

Геракл 4,4±0,3 0,7±0,2 1260 6,4 ±0,8 2,9±0,3 2066

Применительно к сортам ремонтантной малины, характеризующихся низкой порослеобразовательной способностью, это свойство последействия условий in vitro имеет большое значение при закладке маточников этой культуры. Наблюдения селекционеров за ростом размноженных in vitro растений за 10 лет использования метода клонального микроразмножения показали, что со временем (4-5 лет) явление увеличение вегетативной и генеративной продуктивности у ремонтантной малины затухает.

При оценке размноженных in vitro растений в полевых условиях не было обнаружено, каких либо мутантных форм, отличающихся от исходных сортов и гибридов.

ВЫВОДЫ

1. Для осуществления осеннего введения в культуру in vitro (после селекционной оценки) в качестве источника эксплантов можно использовать почки, изолированные от побегов замещения.

2. Для увеличения выживаемости, регенерационной способности и уменьшения инфицированности эксплантов предпочтение должно отдаваться

17

верхним нераспустившимся почкам, изолированным без нескольких кроющих чешуй. Для лучшей приживаемости эксплантов после перенесения с TDZ на 6-БАП, необходимо культивировать их при слабой интенсивности света (около 300 лк),

3. На этапе собственно размножения проявляется генотипическое разнообразие ремонтантных форм малины в способности к образованию дополнительных побегов. Растения проявляли разную чувствительность по отношению к TDZ, после культивирования образовывались укороченные витрифицированные побеги.

4. На этапе укоренения представленные образцы малины отличались способностью к ризогенезу при использовании различных типов ауксинов. После проведения импульсной обработки микрочеренков в концентрированном растворе ИМК (1000 мг/л) генотипические особенности сглаживались.

5. Установлено, что оптимальными условиями адвентивного органогенеза из листовых эксплантов ремонтантной малины является использование питательной среды МС с добавлением 0,1 мг/л TDZ и предварительной инкубацией эксплантов в темноте в течение 10 дней.

6. Исследованные генотипы отличались по частоте регенерации и ко: личеству образовавшихся побегов на эксплант; большим органогенным потенциалом характеризовались листовые экспланты, по сравнению с черешками.

7. Применение низких положительных температур (+4 °С) дает возможность длительного хранения пробирочных растений малины (более одного года). Перспективным способом хранения при пониженных температурах является культивирование растений на питательной среде МС с добавлением 3% маннита.

8. В полевых условиях полученные in vitro растения малины превосходили растения размноженные традиционным способом по продуктивности и количеству образовавшихся побегов. У высаженных генотипов не было отмечено появления мутантных форм, отличающихся от исходных сортов и гибридов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

1, Для осеннего введения в культуру in vitro межвидовых ремонтантных форм малины, при отсутствии поросли, в качестве источника эксплантов можно использовать почки, изолированные осенью от побегов замещения. Предпочтение должно отдаваться крупным эксплантам изолированных с верхних нераспустившихся почек.

2. Для адвентивного органогенеза ремонтантных форм малины следует культивировать изолированные листовые экспланты на питательной среде МС с добавлением в качестве источника цитокиннна TDZ в концентра-

18

ции 0,1 мг/л. Для увеличения частоты регенерации рекомендуется использовать в начале культивирования темновую инкубацию эксплантов в течение 10 дней в полной темноте.

3. При длительном беспересадочном культивировании побегов малины in vitro (около I года) предпочтение должно отдаваться методам депонирования с использованием пониженных температур (+4°С).

4, При закладке маточников ремонтантной малины рекомендуется использовать растения, полученные в культуре in vitro для увеличения коэффициента их вегетативного размножения и повышения качества посадочного материала.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соболев В.В., Сковородников Д.Н., Шматова А.Г., Заякин В.В. Подбор оптимальных сред для размножения различных генотипов ремонтантной малины И Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых: «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». - Брянск, 2000.-С. 69-71.

2. Сковородников Д.Н., Бъядовский И.А., Заякин В.В., Нам И.Я. Изучение влияния TDZ и темноты на регенерацию растений из листовых эксплантов межвидового ремонтантного сорта Бабье лето-2. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодые учёные - возрождению сельского хозяйства в XXI веке». - Санкт-Петербург, 2001.-С. 68-72.

3. Сковородников Д,Н., Бъядовский И.А., Заякин В.В., Нам И.Я, Осеннее введение ремонтантных образцов малины в культуру in vitro // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». - Брянск, 2002.-С. 54-55.

4. Сковородников Д.Н., Соболева А.Г., Заякин В.В., Нам И.Я. Разработка системы регенерации адвентивных побегов применительно к ремонтантной малине // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». -Брянск, 2002.-С. 55-56.

5. Сковородников Д.Н., Заякин В,В„ Нам И.Я. Клональное микроразмножение и длительное хранение in vitro ремонтантных форм малины // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». - Пенза, 2003. - С. 522-523.

>20813

6. Сковородников Д.Н., Нам И.Я„ Казаков И.В., Заякин В.В. Особенности начального этапа клонального микроразмножения ремонтантной малины in vitro // Сельскохозяйственная биология. 2004. № I. (в печати).

7. Сковородников Д.Н. Оценка размноженных in vitro растений ремонтантной малины в полевых условиях 1! Межвузовская научно-практическая конференция молодых ученых. - Брянск. 2003. (в печати)

8. Сковородников Д.Н., Озеровский А. Длительное хранение пробирочных растений ремонтантной малины в культуре in vitro П Межвузовская научно-практическая конференция молодых ученых. -Брянск, 2003. (в печати)

Формат 60x841/16

Объем 1 п. л.

Тираж 100

Редащионно-издательскоЙ отдел Брянской ГСХА