Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Регенерационный потенциал элитных форм малины в культуре in vitro

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Регенерационный потенциал элитных форм малины в культуре in vitro"

<r

ЧЕЛЯЕВ ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЭЛИТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ В КУЛЬТУРЕ m VITRO

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Г 2 MAP 2012

Брянск 2012

005012005

Диссертационная работа выполнена в научно-образовательном центре биотехнологии ФГБОУ ВПО Брянской государственной сельскохозяйственной академии в 2009-2012гг.

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

Сковородников Дмитрий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Айтжанова Светлана Дмитриевна

кандидат сельскохозяйственных наук Рожнов Николай Ильич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится 28 марта 2012 года в^ заседании диссертационного совета Д 220.005.01 при Брянской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 243365, Брянская обл., Выгоничский район, с. Кокино, Брянская ГСХА, корпус 4, конференц-зал.

Е-ншЫКя^Ьа.сот, факс (8-483-41)-24-721

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Брянской ГСХА. 11росим принять участие в работе Совета или прислать свой отзыв на автореферат в 2-х экземплярах, заверенных гербовой печатью, по указанному адресу.

Автореферат разослан 27 февраля 2012г. и размещен на официальном сай-, те Минобрнауки РФ http://mon.eov.ru и www.bgsha.com

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор с.-х. наук, профессор

А.В. Дронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Регенерацию растений считают краеугольным камнем всей методологии культуры тканей, без которой становятся бесполезными исследования по гибридизации протопластов, росту и дифференцировке, получению генетически изменчивых растений, культуре пыльников. Благодаря знаниям в области регенерации растений, подобные исследования превратились в мощные инструменты, применяемые в сельском хозяйстве и садоводстве (Тиссера, 1989).

Наиболее разработанным биотехнологическим методом является клональ-ное микроразмножение растений. За рубежом этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала плодово-ягодных культур в различных селекционных программах (Hall, 2009).

Применение биотехнологических приемов в селекциошюм процессе нашло место на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.), где уже более 15 лет ведется работа в этом направлении. Необходимость использования культуры ткани возникла в связи с трудностью размножения ценных форм ремонтантной малины (Казаков, Евдокименко, 1997). В ходе проведенных исследований были оптимизированы все этапы культивирования ремонтантной малины in vitro (Вовк, 2000, Сковородников, 2004, Нам, 2004, Озеровский, 2007).

Из факторов, определяющих успех культуры тканей, наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Экспериментально доказано, что сорта многих видов растений, культивируемых in vitro, обладают различным морфогенетическим потенциалом, т.е. имеют более или менее выраженную способность к образованию дополнительных почек и побегов, их росту, укоренению и, в конечном итоге, получению более высокого коэффициента размножения. Поэтому знания этих особенностей исследуемых генотипов растений даёт возможность планировать проведение работ в культуре in vitro и получать заданный объем селекционного материала.

Основой успешной работы в таких направлениях как генная инженерия, соматическая гибридизация и клеточная селекция является, прежде всего, получение стабильной и высокой частоты регенерации растений in vitro. Однако сложность данной проблемы заключается в том, что морфогенегичёскне потенции тканей многолетних культур, к которым относится малина, не высоки. Отсюда и трудность, возникающая при регенерации целых растений из тканевых культур различных генотипов.

Цель' исследований: оценить регенерационный потенциал новых форм малины, созданных на Кокинском опорном пункте ВСТИСП.

Задачи исследования:

1. Оценить морфогенетический потенциал новых элитных форм малины в культуре in vitro на всех этапах клонального микроразмножения;

2. Оптимизировать состав питательной среды для активной пролиферации и укоренения побегов;

3. Определить интенсивность транспирации растений малины в условиях in vitro и ex vitro-,

4. Усовершенствовать состав питательной среды для индукции каллусоге-неза и адвентивного органогенеза листовых эксплантов малины.

Научная новизна. Сделана оценка 45 элитных форм и сортов малины, культивируемых в условиях in vitro по основным морфобиологическим показателям. Установлено положительное влияние витаминно-минерального комплекса «Комнливит» на рост и развитие растений малины in vitro. Обоснована замена этапа укоренения микрочеренков малины этапом элонгации с последующим укоренением растений в субстрате. Продемонстрировано изменение интенсивности транспиращш растений малины в процессе их адаптации к нестерильным условиям среды.

Основные положения, выносимые на защиту:

• морфогенетическая реакция новых элитных форм малины в культуре in vitro-,

• оптимизированный состав питательной среды для клонального микроразмножения малины;

• способы индукции каллусогенеза и адвентивного органогенеза в культуре листовых эксплантов малины.

Практическая значимость. Оптимизирован состав питательной среды на этапах клонального микроразмножения малины. При адаптации к нестерильным условиям растений in vitro увеличен процент их приживаемости за счет включения этапа элонгации. Выявлена оптимальная концентрация производных дифенилмочевины (CPPU и TDZ), индуцирующая каллусогенез и адвентивный органогенез листовых эксплантов малины в культуре in vitro.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях кафедры биологии, кормопроизводства, селекции и семеноводства, на заседаниях ученого совета Агроэкологическо-го института и научно-практических конференциях: VI Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2009), VII Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2010), Международная научно-практическая конференция «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск 2010), Международной научно-практичсской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Орел 2011), Научные чтения, посвященные выдающимся ученым академику Н.И. Вавилову и селекционеру К.И. Савичеву (Брянск 2011), VIII Международная научная конференция («Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2011) и международная научно-практическая конференция «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (Москва 2011).

Публикация результатов исследований. По материалам, диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов и рекомендаций для практической деятельности. Работа содержит 21 таблицу и 26 рисунков. Список использованной литературы включает 182 наименования, в том числе 29 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Методика н условия исследования

Исследования проводились в Центре биотехнологии БГСХА в период с 2008 по 2011 гг. Использовался полевой материал Кокинского опорного пункта ВСТИСП и лабораторный материал Центра биотехнологии БГСХА.

Объектами исследования являлись" 14 сортов и 31 элитная форма малины с ремонтантным и обычным типом плодоношения.

Изолирование эксплантов и их культивирование осуществляли по общепринятым методикам (Бутенко, 1964)

Питательную среду готовили по стандартной методике по прописи Мура-сига и Скуга с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. Препарат «Компливит» (ОАО «Фармстандарт - УфаВИТА») в измельченном состоянии вводили в питательную среду в количестве 2г/л.

Стерилизация материала: нарезанные черенки стерилизовали в 0,1 /о растворе мертиолята (орто-этилртутьтиосалицилат натрия, С9Н9Н^а025 — органическое соединение ртути ароматического ряда), 20% раствора перикиси водорода 70% раствора этанола и 0,3% ББЗ (додецилсульфат натрия) в качестве поверхностно-активного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.

Этап элонгации: для получения крупных микрочеренков, пригодных к укоренению на последнем субкультивировании использовали питательную среду, не содержащую регуляторы роста растений, но обогащенную витамин-но-минеральным комплексом «Компливит» в концентрации 2 г/л.

Перенос пробирочных растений в субстрат и их адаптация к нестерильным условиям: укорененные растения крючком вынимали из пробирки и перРсаживали в минипарнички (пластиковые кассеты, вставленные в поддон и накрытые прозрачной крышкой) наполненные предварительно увлажненным готовым субстратом (Нестеровский). В один поддон помещается 24 ячешш. В каждую ячейку высаживалось по 3 растения малины. По мере отрастания растений и появления новых листочков, крышку с минипарничка снимали. Периодически проводили полив и опрыскивание растений. Через 1,5-2 месяца окрепшие растения распикировывали в пластиковые ящики, выстланные пленкой и заполненные субстратом. В один ящик помещали по 30 растений. С наступлением положительных температур в весенний период ящики переносились в легкие теплицы, накрытые нетканым материалом типа Лутрасил для адаптации

к ультрафиолетовому излучению.

Для определения интенсивности транспирации использовали модифицированный метод Л.И. Иванова (Практикум..., 2003).

Опыты, проводили в трехкратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М±ш, где М - математическое ожидание, а т-стандартная ошибка среднего (Б А. Доспехов, 1974).

1.1. Методика получения каллусной культуры

Источником исходных эксплантов служили пробирочные растения элитной формы ремонтантной малины 13-118-1, культивируемые на безгормональной среде Мурасиге-Скуга (1962). В качестве эксплантов использовались листовые пластинки и черешки. Для культивирования изолированных органов в эксперименте применялась среда МС с добавлением синтетических аналогов фитогормонов: 6-ВАР - 1мг/л, 2,4Д - 1мг/л,,СРР11 + 2,4Д + б-ВАР по 1мг/л, CPPU + 2,4Д по 0,5мг/л, CPPU - 1,5мг/л + 2,4Д - 0,5мг/л, CPPU - 1мг/л.

Скальпелем у листовых пластинок отсекали базальную часть и помещали эксплангы в чашки Петри нижней стороной к питательной среде. Культивирование осуществляли в термостате в отсутствие освещения при температуре 2325°С. Через 2 недели темновой инкубации половину материала из каждого варианта выставили на свет (t°=28-30°C) с 16-часовым фотопериодом.

1.2. Техника получения регенерантов из листовых эксплантов

Источником эксплантов служили апикальные листья укорененных in vitro растений. Листовые пластинки скальпелем изолировали на увлажненной фильтровальной бумаге и помещали в пробирки Флоринского по 2 экспланта в каждую. Для увеличения площади поранения скальпелем отсекали основание листовой пластинки. Питательные среды готовились на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (Murashige & Skoog, 1962) с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. Изучалось влияние различных концентраций (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 мг/л) тидиазурона (TDZ) и Лг-(2-хлор-4-тгридил)-Л-фенилмочевина (CPPU) на каллусогенез и адвентивный органогенез элитных форм ремонтантной малины. Экспланты культивировались 3 недели.

2. Результаты и обсуждение 2.1. Клональное микроразмножение элитных форм и сортов малины 2.1.1. Особенности введения в культуру in vitro

При введении б культуру in vitro сортов и элитных форм малины за три года исследования, частота контаминации варьировала в широком диапазоне (табл. 1,2). Высокая загрязненность культуры сапрофитной микрофлорой по всем изучаемым генотипам была отмечена у отборов, представленных для размножения в 2009 году в сравнении с образцами 8-го и 10-го года.

Показатель приживаемости исследуемых генотипов был достаточно высоким и, как правило, не опускался ниже 60%, исключение составили элитная форма 43-159-1 и сорт Рубиновое ожерелье.

Частота контаминации отборов 2008 года при введении в культуру варьировала в диапазоне err 3,3% у генотипа 3-238-10 до 36,7% у генотипа 1-12-10. Приживаемость эксплантов в этот год находилась в диапазоне от 54,9% до 100%.

Доля инфицированных эксплантов в отборе 2009 года на первом этапе находилась в интервале от 20,8% до 82,3%. Наибольшая приживаемость наблюдалась у 5 генотипов из 7 представленных, а наименьшая была у элитной формы 43-159-1 (33%).

Таблица 1. Введение в культуру in vitro генотипов малины отборов 2008 и 2009 гт

п.п Генотип Изолировано эксплантов, шт. Частота контаминации, % Приживаемость эксплантов, %

2008 год

1 3-238-10 30 3,3 100

2 1-12-10 39 36,7 100

3 7-4-10 24 10,0 100

4 37-15-4 29 6,7 96,5

5 Рубиновое ожерелье 53 3,8 54,9

6 Оранжевое чудо 77 27,3 84,5

7 Геракл 49 16,3 65,9

2009 год

1 8-118-1 31 64,5 81,8

2 28-159-1 17 82,3 100

3 2-55-10 40 57.5 100

4 16-31-10 48 20,8 100

5 43- і 59- і 8 25,0 33,0 і

6 13-118-1 30 50,0 100

7 1-61-11 10 40,0 100

Частота контаминации генотипов ремонтантных форм малины в 20 Юг в среднем по отбору составила 22,9%, а средний показатель приживаемости -89,6% (табл. 2).

Оптимизированные условия введения в культуру in vitro ремонтантных форм малины с успехом были применены на 11 генотипах с летним типом плодоношения.

Контаминация проявляется в попадании на питательную среду различных микроорганизмов, которые являются губительными для растительных тканей in vitro. В нашем случае доля зараженных эксплантов была достаточно низкой и не превышала 36%.

Таким образом, использованный состав питательной среды на одиннадцати генотипах малины на этапе введения оказался достаточно эффективным. Так как в научной литературе нет данных об использовании производных дифе-нилмочевины на малине с летним циклом плодоношения, то его можно рекомендовать для эффективного применения.

Полученные данные показали в целом низкий уровень инфицированности эксплантов за годы исследований, что говорит о надежной разработанной тех-

нологии первичного этапа клонального микроразмножения, заключающейся в правильном выборе стерилизующего агента (мертиолят 0,1%), экспозиции стерилизации (3 мин), оптимально подобранной питательной среды и использовании синтетического аналога цитокинина - СРРи в концентрации 0,2 мг/л.

Таблица 2. Введение в культуру in vitro генотипов малины отбора 2010 г.

№ п.п. Генотип Изолировано эксплантов, шт. Частота контаминации, % Приживаемость эксплантов, %

Ремонтантные формы

1 29-177-1 20 0 90,0

2 3-59-10 35 54,3 68,7

3 36-155-1 67 17,9 75,9

4 44-116-2 29 20,7 100

5 16-83-2 30 30,0 100

6 16-83-1 17 64.7 83,4

7 3-59-10 16 0 100

8 30-178-1 307 27,0 78,3

9 3-131-1 48 24,4 100

10 47-144-1 32 5,6 100

11 4-128-10 52 17,9 100

12 44-116-1 48 32,4 76,6

! з Лингв кч 271 п 1

і .і i-t Пурпуровая С ГІ JKJ 1 о п г\ г п

Итого 1022 - —

Средние значения по сортам 73 22,9 89,6

Легше генотипы

1 Гусар 138 15,2 100

2 Беглянка 83 26,5 100

3 Солнышко 60 6,7 100

4 Бальзам ■ -80 22,5 68,8

5 Журавлик 50 12,0 75,0

6 Метеор 50 36,0 94,7

7 Пересвет 61 4,9 96,6

8 Скромница . 87 9,2 100

9 10А 55 23,6 78,6 -

10 10Б 50 8,0 92,0

11 ДП-1 48 8,3 91,7

Итого 762 - -

Средние значения по сортам 69,3 15,7 85,7

2.1.2. Этап собственно размножения растений малины в культуре in vitro

Эффективность размножения растений in vitro во многом зависит от их индивидуальной генотипической реакции на включаемые в питательную среду гормоны. В качестве источника цитокинина на этапе собственно микроразмножения малины обычно применяют б-БАП в концентрациях 1,0-4,0 мг/л (Высоцкий, 1984; Стрыгина, 1989, Соловых, 2008). В работе, проведенной в лаборатории биотехнологии БГСХД. по оптимизации клонального микроразмножения, ремонтантной малины, предпочтительнее было использовать 6-БАП в концентрации 2 мг/л (Вовк, 2000).

Высота пробирочных растений у четырех изучаемых генотипов не превышала 13,5 мм (табл. 3). Коэффициент размножения (количество образовавшихся побегов за 1 субкультивирование) варьировал в незначительном пределе и составил от 2,0 до 4,5.

Таблица 3. Коэффициент размножения и высота пробирочных растений на этапе собственно клонального микроразмиожения

№ п.п. Генотип Коэффициент размножения Высота растений, мм

1. 3-238-10 3,0±0,5 12,5±2,6

2. 1-12-10 4,5±0,5 8,510,5

3. 7-4-10 4,0±0,4 10,9+1,4

4. 37-15-4 2,0±0,3 13,5+2,2

_______, __________г., .С_____ ..^.-ч . пiTii.frm-r лопа t> ч-гчпчп(¿1

Ч^ДИаКО i> CJiyHiiC Cwi И I il^-ii^r.iii WJCni; lij....,!^:. i и

сколько лет на селекционном участке и в дальнейшем потребуется его дальнейшее массовое размножение, то для форм 37-15-4 и 3-238-10, имеющих не очень высокий коэффициент размножения потребуется поиск новых подходов для увеличения регенерационной способности их in vitro.

Эти данные соответствуют результатам, полученным ранее в лаборатории на других перспективных генотипах ремонтантной малины. Так у 50 представленных для размножения ремонтантных образцов при их культивировании на 6-БАП коэффициент размножения варьировал от 1,7 до 13,1, в среднем по двум годам он составил 4,1 (Сковородников, 2004),

Коэффициент размножения элитных форм малины взятых для тиражирования в 2010 годы варьировал в достаточно широком диапазоне от 1,3 до 8,8 (табл. 4). Данная биологическая особенность исследуемых генотипов влияет на срок, в течение которого они будут размножены до требуемого количества. Высота растений варьировала также в широких пределах - от 10,8 до 42,3 мм. По этому показателю можно судить об эффективности укоренения микропобегов в субстрате. В наших исследованиях установлено, что при высадке лучше приживаются более крупные растения. Кроме того они быстрее начинают отрастать в сравнении с более мелким материалом.

В лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА продемонстрирована эффективность применения производных дифенилмочевины для увеличения коэффициента размножения ремонтантных форм малины (Вовк, 2000).

№ п.п. Генотип Коэффициент размножения Высота растений

1 29-177-1 5,б±0,3 42,3+3,1

2 3-59-10 6,4+0,7 27,4±2,2

3 36-155-1 2,0±0,3 33,2±1,3

4 44-116-2 1,7±0,4 11,0±0,9

5 16-83-2 г ' " 8,8±1,7 38,4±3,4

6 16-83-1 3,0±1,7 17,3±0,9

7 3-59-10 2,8±0,2 22,3+2,7

8 9 30-178-1 2,9±0,2 25,7±1,6

3-131-1 2,4+0,8 15,9±2,5

10 47-144-1 4,4±0,4 28,2±3,0

11 4-128-10 3,1±0,6 41,5±3,7

12 44-116-1 2.0+0,4 34,3+2,8

13 Пингвин 1,3+0,8 10,8+1,4

14 Пурпуровая 3,3+0,3 25,8±2,8

Используя стандартные методы размножения (среда МС + 6-БАП 1 мг/л), удалось удовлетворительно размножить все изучаемые генотипы, которые, однако, существенно отличались по коэффициенту размножения (табл. 5). Так наибольший показатель образования дополнительных побегов был отмечен у сорта Солнышко (5,6), а наименьший у элитной формы 10в (1,5). Кроме того исследуемые генотипы различались между собой по высоте растении т vitro и но количеству образовавшихся листьев.

Таблица 5. Морфобиологические показатели сортов малины на этапе собственно размножения (среда с 6-БАП)

№ Генотип Коэффициент Высота растений, Количество

п.п. размножения мм листьев, шт

1 Гусар 2,4±0,5 32,7+2,6 12,8+1,9

2 Беглянка 1,9±0,3 16,9+0,5 7,5+0,4

3 Солнышко s^+o^1 34,2+3,1 15,6±2,8

4 Бальзам 2,3±0,2 26,3±2,5 10,2+1,8

5 Журавлик 3,0±0,2 25,5±1,4 8,6±0,5

6 Метеор 3,6+0,3 28,3±2,0 9,3±0,7

7 Пересвет 2,0±1,2 26,8±1,6 10,8+1,5

8 Скромница 4,7±1,0 36,0±3,9 12,3±1,6

9 10А 2,1+0,6 20,2±0,9 9,9±0,8

10 10Б 1,5±0,5 15,1±0,4 7,4±0,4

И дм 2,9±0,4 26,4±2,2 9,5±1,1

2.1.3. Влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на рост и развитие растений малины в культуре in vitro

При оценке трех сортов малины было установлено, что количество мелких побегов преобладает над средними и крупными, а так как размер растений напрямую зависит от способности к адаптации к нестерильным условиям, то возникает проблема в увеличении размеров побегов. Для решения этой задачи мы использовали вгпамишю-минеральньш комплекс «Компливит» в концентрации 2г/л (рис 1).

■ Количество мсякаи побегов (0,5-lCM), %

® Количество средних чсСегов

SS Количество крупных побегов (1.5см W выше}.''''

repawn Руб.ож. Ор.Чудо

Рис 1, Соотношение побегов по высоте культивируемых растений малины

Для увеличения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию витаминно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины (табл. б).

Таблица 6. Влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на коэффициент размножения и высоту растений малины т vm■o

Контроль «Компливит»

Генотип (MS + 6-БАП 1 мг/л) (2 г/л + 6-БАП 1 мг/л)

коэффициент высота коэффициент высота

размножения растений, см размножения растений, см

13-118-1 5,1 ±0,2 5,7±0,4 6,5±0,5 7,7±0,5

2-55-10 5,5±0,4 6,3±0,6 6,0±0,4 6,9±0,7

6-86-1 1,7±0,2 6,4±1,1 2,6±0,6 7,6±1,7

1-16-11 3,5±0,8 5,4±0,8 5,0±0,5 7,3±1,5

Данные, полученные на четырех новых формах малины, позволяют заключить, что введение в питательную среду витаминно-минерального комплекса «Компливит» приводит к увеличению коэффициента размножения и высоты

растений (табл. 6). Полученные растения имели следующие качественные отличия от контрольного варианта: листья приобретали интенсивно зеленую окраску, не имели признаков гипероводненности, размер листовых пластинок был более крупным. Данный эффект очень важен на последнем субкультивировании этапа размножения для получения более крупных побегов.

Несмотря на полученные положительные результаты, следует сказать и об отрицательном действии препарата. Как правило, растения продолжительно находящиеся на питательной среде с «Компливитом» со временем начинают быстрее погибать, чем в стандартных условиях. Кроме того, на следующем этапе укоренения, изучаемая витаминно-минеральная добавка оказала негативное воздействие - микрочеренки растений, культивируемые как на безгормональной среде, так и на среде с ауксином, при наличии «Компливита» обладали более низким процентом укоренения (табл. 7). В то же время по всем изучаемым элитным формам малины растения также как и на этапе, собственно размножения, отличались от контрольного варианта по высоте растений.

Таблица 7. Влияние вигаминно-минерального комплекса «Компливит» на укореняемость и высоту растеши малины in vitro

н К ш я Контроль (безгормональная среда) ИМК 0,5 мг/л

Генотип S о v> укорененных ТТЛ^ЛГЧЧП 0/, UWV1 VU) / и высота no/vrorfrjii г»» г LKtliilZif WVL укорененных побегов, % высота растении, см

13-118-1 + 16,8±5,4 4,2±0,4 п 34,9±7,3 4,4±0,3

- 47,6±6,2 3,0±0,6 72,5±12,2 3,3±0,2

2-55-10 + 32,4±4,5 3,8±0,9 44,4±5,6 3,2±0,2

- 49,1±3,7 2,9±0,6 58,6±4,4 2,0±0,6

6-86-1 + 45,7±8,5 3,6±1,3 52,3±4,2 3,5±1,7

- 72,8±10,0 2,8±0,4 91,5±18,5 3,2±1,3

1-16-11 + 11,9±2,3 4,3±0,7 24,8±3,3 4,4±1,0

- 23,2±1,8 3,5±0,7 32,1±4,4 . 3,5±0,8

В исследованиях проведенных ранее в нашей лаборатории на малине было установлено, что укоренение растений можно осуществлять непосредственно в нестерильном субстрате. Для этого проводится предварительная обработка ба-зальной части черенков в ауксинсодержащих растворах. А так как показатели ук-ореняемости существенно увеличиваются при использовании более крупных побегов, то можно рекомендовать для осуществления такой технологии вводить дополнительный этап элонгации микрочеренков на безгормональной среде 1/2 МБ с «Компливитом» (контроль).

Полученные результаты говорят об имеющихся возможностях улучшения состава питательной среды с целью увеличения морфобиологических параметров растений малины in vitro. Однако, в связи со сложным составом препарата «Ком-пливит», в который входит 11 витаминов и 8 минералов, нельзя точно установить, какой компонент или группа веществ в составе комплекса вызывает подобный положительный эффект. Поэтому, в дальнейших исследованиях мы планируем оценить раздельное воздействие названных групп питательных веществ на выращиваемые in vitro растения. Кроме того следует испытать аналоги подобных вига-минно-минеральных комплексов на растительные культуры in vitro.

Традиционно для индукции ризогенеза микрочеренков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК.

Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивая™ основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза - до 100%.

Перспективное направление в получении посадочного материала малины -укоренение микропобегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1с.

Успех укоренения определяется качеством исходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений выше у крупных побегов, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов).

Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений, такими как слабое функционирование устьичного аппарата, отсутствие кутикулярного слоя и корневых волосков, могут наблюдаться значительные потери высаженного в субстрат материала (Pierik, 1987). Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его рН, влажность и температура воздуха.

В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно осуществляется опрыскивание растений и полив по мере необходимости.

Приживаемость растений ремонтантной малины 4 исследованных генотипов оказалась достаточно высокой и кроме элитной формы 16-83-1 (67,4%), превышала 89% у 3 генотипов (табл. 8).

После одного-двух месяцев адаптации в минипарниках, укорененные растения малины с несколькими образовавшимися листочками распикировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа

«Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений

Таблица 8. Показатели приживаемости растений малины в минипарничках некоторых генотипов малины (1-2 месяца культивирования)

№ п.и. Генотип Высажено растений, шт Выжило растений, шт. Приживаемость, %

1. 29-177-1 52 48 92,3

2. 3-59-10 67 60 89,6

3. 16-83-2 55 49 89,1

4. 16-83-1 34 22 67,4

2.1.4. Оценка сортов и элитных форм малины на этапе элонгации

Третьим этапом клоналъного микроразмножения является укоренение размноженных растений in vitro, за счет посадки микрочеренков на питательную среду с ауксинами (ИУК, ИМК). В наших исследованиях была продемонстрирована широкая сортоспецифичность по укореняемости генотипов малины (Вовк, 2000, Сковородников, 2004). Повысить эффективность метода удалось за счет исключения этапа укоренения. Высадку растений и их укоренение осуществляли непосредственно в субстпате с предтшпительной обпа-боткой базальной части черенка концентрированным раствором ИМК (1 г/л). Такой прием позволил увеличить долю укореняемых растений и сократить процесс клонального микроразмножения. Однако, высокие показатели укореняемости малины отмечались у более крупных микрочеренков, чем у мелких. Поэтому было решено использовать между этапом размножения и высадкой растений в грунт промежуточную фазу элонгации (вытягивания побегов). Для осуществления этого приема на последнем этапе размножения уменьшается концентрация цитокинина до 0,2 мг. В нашем случае растения культивировались на безгормональной питательной среде с добавлением ви-таминно-минерального комплекса «Компливит» для увеличения высоты и качества получаемых растений.

Разработанные приемы также были использованы и на летних сортах малины. Полученные данные (табл. 9) говорят о положительном влиянии на рост растений промежуточного этапа элонгации.

По всем генотипам было отмечено увеличение высоты растений. Кроме того, несмотря на исключение из питательной среды ауксина, многие черенки спонтанно образовали корни. Максимальным процентом укоренения характеризовался сорт Скромница (65,3%), минимальным - Метеор (5,8%).

Таблица 9. Морфобиологические показатели сортов малины на этапе элонгации

№ п.п. Генотип Доля укорененных растений, % Высота растений, мм

1 Гусар 34,2 45,9

2 Беглянка 55,1 32,2

3 Солнышко 16,8 . . .. 42,7

4 Бальзам 65,3 35,5

5 Журавлик 18,6 48,4

6 Метеор 5,8 34,1

7 Пересвет 37,8 46,4

8 Скромница 73,3 38,6

9 10А 44,2 31,7

10 10Б 16.7 35,2

11 ДД-1 40,0 39,0

2.1.5. Интенсивность транспирации растений малины при адаптации к нестерильным условиям

Интенсивная транспирация воды растениями затрудняет не только их адаптацию, но и проведение микрочеренкования генотипов с высоким коэффициентом пазмножения, когда затрачивается продолжительное время на манипу-

ГГ«ТТТТ1Т» ГКО Л П»ТТЧ1Ч1»Т Г» * ПГГ1"1(^Л* *

тавшихся побегов.

Скорость потери воды поверхностью листьев можно оценить с помощью показателя интенсивности транспирации. Этим методом можно изучить транс-пирацию целого растения или отдельных его частей. Работа с интактными растениями затруднена, поэтому чаще используют срезанные побеги или листья.

В зависимости от этапа культивирования растений малины, интенсивность транспирации существенно уменьшалась по мере усиления степени адаптиро-ванности растений к нестерильным условиям (ex vitro) (табл. 10).

У культивируемых in vitro растений интенсивность транспирации составила 2785,7 мг/гчас. Такой высокий показатель обусловлен тем, что при культивировании растений в изолированной среде in vitro с постоянной влажностью воздуха, устьичный аппарат не функционирует. Если поместить такие растения в нормальные условия, то они безвозвратно завянут уже через несколько минут. После высадки растений в минипарнички интенсивность транспирации несколько снижалась (2206,3 мг/гчас), но оставалась достаточно высокой благодаря накрытому прозрачному колпаку. И только когда растения распикировывали в ящики, и они адаптировались к естественной влажности воздуха, интенсивность транспирации в сравнении с пробирочными растениями снизилась в 3 раза.

Таблица 10. Сравнительная оценка интенсивности транспирации растений малины сорта Золотая осень, полученных in vitro и in vivo

Вариант Суммарная масса листьев, мг Потеря воды листьями через 5 мин после изолирования, мг (%) Интенсивность транспирации, мг/гчас

1. Растения in vitro 138,6 31,2 (22,5%) ' '2785,7

2. Растения адатгги-рованные в мини-парничках (in vivo) 199,9 35,3 (17,7%) 2206,3

3. Распикированные растения (in vivo) 2369,0 2170,7 (8,4%) 991,5

Размноженные и высаженные в нестерильный субстрат микрорастения, в сравнении с сеянцами отличаются особой динамикой роста. В первую очередь наблюдается отсутствие ростовых процессов в первые 2-3 недели, когда растения испытывают значительный стресс после высадки. Как правило, именно на этом этапе адаптации происходят существенные выпады материала.

После появления у высаженных растений первых листьев скорость роста растений постепенно усиливается, происходит увеличение количества и размера листьев. Выпады на этом этапе уже не значительны.

Зачастую на показатель приживаемости высаженных растений влияет

ллп^лоцгч/vrTi т-л'г! г т \ гп [ 1 *|Г\ПРГ ППЛЯО TtfTTL Л Я ami» ППН

IttlUl LKL li>^UJl V jiui, nutu^itiv 1" 4' j ■

выращивании in vitro. Так многие исследователи отмечают о разной способности сортов к образованию дополнительных побегов, силе роста, интенсивности корнеобразования при клональном микроразмножении (Маратова и др., 2008). Не вызывает сомнения тот факт, что лучшими ростовыми показателями после высадки в нестерильные условия будут отличаться генотипы имеющие высокие, хорошо облиственные побеги, а также хорошо развитую корневую систему. Поэтому главным требованием на последнем этапе культивирования in vitro должно быть получение качественных растений малины, ., готовых быстро перенести стресс при их адаптации к нестерильным условиям. Для удовлетворения данных условий в нашей лаборатории отработанны приемы, позволяющие получать качественный материал in vitro готовый к высадке в субстрат. Основные оптимизированные моменты технологии можно резюмировать следующим образом:

1) исключается этап укоренения микрорастеняй in vitro;

2) вводится этап элонгации побегов, для получения более крупных растений, для чего растения культивируют на безгормональной питательной среде с витаминно-минеральным комплексом «Компливит»;

3) индукцию укоренения осуществляют в нестерильном субстрате ауксин-содержащим препаратом «Корневин» (д.в. индолилмасляная кислота).

Анализируя данные по приживаемости размножаемых генотипов (табл. 11) можно сделать вывод, что среди представленных сортов и элитных форм малины нет генотипа, который отличался бы катастрофическими выпадами. Так минимальный показатель приживаемости составил 62,1% у элитной формы 41-411, что является достаточно высоким показателем.

Таблица 11. Показатели приживаемости некоторых генотипов малины

№ п.п. Генотип Высажено растений, шт. Выжило растений, шт. Приживаемость, %

1. Золотая осень 72 60 83,3

2. Оранжевое чудо 72 46 67,7

3. Гусар 50 43 86,0

4. 6-86-1 40 38 95,0

5. 46-41-20 36 27 75,0

6. 41-41-1 29 18 62,1

7. Д-1-1 72 62 86,1

8. 16-83-2 68 47 69,1

9. 36-155-1 47 43 91,5

10. 3-238-2 72 67 93,1

2,2,Получедшр. кзллусной ткяни на экгплантя» растений малины

Для индукции каллусообразования, как правило, необходимо сочетание в питательной среде двух экзогенных фитогормонов - цитокиннна и ауксина. Но проведенный опыт показал, что стимулирование каллусогенеза может происходить и в присутствии одного из них. Через 9 дней после начала культивирования листовые пластинки приобрели гофрированную поверхность. Незначительная часть эксплантов полностью почернела, а на некоторых появились некротические пятна. Спустя 16 дней - гибель фрагментов увеличилась. В конце культивирования лишь несколько из них остались зеленого цвета.

Характер каллусообразования зависел от возраста используемого материала: на старых органах оно происходило по периферии, а на молодых листовых пластинках в основании. Культивирование эксплантов в темноте привело к более интенсивной пролиферации каллусных тканей, чем на свету.

В варианте с присутствием в среде 2,4Д в концентрации 1мг/л листовые пластинки быстро погибли по сравнению с остальными. На свету каллус был мелким 1-2мм, а в темноте крупнее - 3-4мм, и образовывался, как правило, в месте среза черешка, рос интенсивно. Как и в случае с 6-ВАР, пролиферация каллуса была хуже на свету.

Сочетание в среде ауксина 2,4Д и двух цитокининов различной природы (6-БАП - производное аденина и СРР11 - производное дифенилмочевины) привело к более интенсивному каллусообразованию на старых листьях, у которых оно отмечалось не только по краю, но и по поверхности листовой пластинки. По сравнению с описанными выше вариантами, на свету частота каллусообра-зования была выше (рис. 2).

т свет ® тем нота

Рис. 2. Частота каляусообразования на листовых эксплантах в зависимости от используемых регуляторов роста и наличия освещенности

Экспланты, помещенные на питательную среду с добавлением цитоки-нина (СРРІІ) и ауксина (2,4Д) в равных концентрациях, хорошо разрослись. На свету каллусообразование наблюдалось у старых листьев по краю листовой пластинки. В темноте же некоторые экспланты остались зелеными, каллус вырос как по краям, так и на поверхности листовых пластинок. Это единственный вариант, у которого частота каллусообразования в темноте была несколько ниже, чем на свету (рис. 2).

- В пятом варианте (СРРи - 1,5мг/л + 2,4Д - 0,5мг/л) каллусы образовались по краю и по поверхности черешков, а на листовых пластинках - по краям у молодых и по области фрагмента у старых. Экспланты продолжительное время оставались живыми в темноте по сравнению с экземплярами, культивируемыми на свету. Каллус интенсивно образовывался в темноте, был крупным по сравнению с остальными вариантами.

В последнем варианте (СРРЬ7 - 1мг/л) наблюдался каллусогенез в местах среза черешков, а также на самих черешках, причем с одной его стороны каллус был в 3 раза больше, чем с другой. На свету размер каллуса составил 2-4мм; к моменту учета все экспланты погибли, листовые пластинки были незначительно гофрированы. В темноте же больше всего осталось жи-

вых зеленых листьев, по сравнению с остальными вариантами. Каллус был крупным и образовывался по периметру на старых и в местах среза у молодых листьев.

Цвет каллуса во всех вариантах на свету был темным, почти черным, в темноте - белесым

В ходе опыта было выявлено, что наилучшими вариантами стали питательные среды с добавлением СРР1Ы,5мг/л+2,4Д-0,5мг/л и СРРЦ-1мг/л; для каллусогенеза оптимальными условиями являются темнота и температура 2325°С, так как наблюдалась массовая гибель эксплантов, находящихся на свету и при температуре 28-30°С. Образование каллуса, визуально заметного, шло не только на зеленых фрагментах, но и потемневших, то есть мертвых.

2.3. Адвентивный органогенез к культуре in vitro некоторых генотипов малины

По истечении трех недель культивирования часть листовых пластинок погибла, при этом каллусная ткань и образовавшиеся из них регенеранты, оставались жизнеспособными. У некоторых эксплантов наблюдалось появление некротических пятен, а также изменение цвета до бледно-зеленого. В большей степени такие отрицательные изменения отмечались при культивировании эксплантов на средах с высоким содержанием цитокининов (0,5мг/л), тогда как в контроле листовые пластинки оставались светло-зелеными с незначительными некротическими пятнами. Спустя еще 10 дней наблюдалось массовое отмирание листовых пластинок, а также появление новых регенерантов из каллуса.

Особенности каллусообразования зависели от генотипа, а также от типа и концентрации испытанных регуляторов роста. Более интенсивная пролиферация каллусной ткани отмечалась в местах поранения жилок листа, причем в большей степени центральной. В вариантах с высоким содержанием тидиазу-рона (более 0,2мг/л) у генотипа 13-118-1 каллусообразование происходило по всему периметру экспланта. Максимальная частота каллусогенеза была отмечена у этого генотипа при всех изучаемых концентрациях тидиазурона. При использовании CPPU лучший результат был получен при концентрации 0,5мг/л у генотипа 13-118-1, тогда как у элитной формы 29-101-20 образование каллуса было не значительным (табл. 12).

Более высокие концентрации регуляторов роста вызвали образование рыхлого каллуса темного цвета, тогда как при невысоких концентрациях - плотных шарообразных светлых каллусов.

Регенерация адвентивных побегов происходила главным образом в месте среза центральной жилки. Кроме стеблевого органогенеза в контроле на безгормональной среде, а также в присутствии CPPU в низких концентрациях наблюдалось образование корней. Возможно, это явление может быть связано с высоким уровнем содержания эндогенных ауксинов в тканях растений.

Наибольшая частота регенерации была получена при добавлении в среду ТОг 0,2мг/л у генотипа 29-101-20. У элитной формы 13-118-1 наилучшими вариантами стали с тидиазуроном в концентрации 0,05мг/л и СРРи в концентрации 0,2мг/л.

Таблица 12. Влияние производных дифенилмочевины на морфогенез листовых эксплантов малины

29-101-20 13-118-1

Вариант Частота каллусогенеза, % Частота регенерации, % Частота каллусогенеза, % Частота регенерации, %

Контроль 0,0 0,0 0,0 0,0

TDZ-0,05 11,9 7,1 35,7 10,0

TDZ-0,1 100,0 2,1 100,0 2,2

TDZ-0,2 30,4 13,0 100,0 7,5

TDZ-0,5 32,6 2,2 100,0 0,0

CPPU-0,05 0,0 0,0 4,5 0,0

CPPU-0,1 9,1 4,5 15,2 2,4

CPPU-0,2 12,5 5,0 35,0 10,9

CPPU-0,5 22,2 0,0 100,0 8,7

На основании полученных данных можно заключить, что регенерация

—U1 ыапгтг.тгтяшгг.ту 1КПП71ЛНТПР. in vitro В neDBVIO

ulMumamajJiA mu.uui«. •--------г -----------1----------------»

очередь обусловлена генотипическими особенностями гибридов, что подтверждается рядом других исследований (Расторгуев C.JL, 2006, Сковородников Д.Н., 2004).

выводы

1. В результате проведенной работы усовершенствована технология кло-нального микроразмножения элитных форм малины.

2. Продемонстрировано генотипическое разнообразие элитных форм малины в культуре in vitro, которое проявлялось в различной способности к размножению и укоренению.

3. Витаминно-минеральный комплекс «Компливиг» введенный в состав питательной среды MS в концентрации 2 г/л в сочетании с 6-БАП (1 мг/л) увеличивает коэффициент размножения и улучшает качество растений малины in vitro;

4. Высокая приживаемость растений малины достигается при включении на последнем этапе размножения in vitro дополнительного этапа элонгации и укоренения непосредственно в обогащенный торфяной субстрат.

5. Интенсивность транспирации растений малины снижается по мере перевода материала из условий in vitro в ex vitro.

6. Максимальная частота каллусообразования малины in vitro достигается при культивировании листовых эксплантов в темноте на питательной среде MS с добавлением CPPU в концентрации 1 мг/л и CPPU в сочетании с 2,4-Д в концентрации 1,5 мг/л и 0,5 мг/л соответственно;

7. Оптимальными условиями для адвентивного органогенеза является культивирование изолированных листовых эксплантов с добавлением в качестве источника цитокинина тидиазуронз в концентрации 0,05 — 0,2 мг/л и O'PPl J n концентрации 0,1 и 0,2 мг/л.

РЕКОМЕНДАЦИИ

Для ускорения селекционного процесса малины целесообразно использовать метод клонального микроразмножения. Для увеличения приживаемости первичных эксплантов в питательную среду следует вводить цитокинин ряда дифенилмочевины CPPU в концентрации 0,2 мг/л.

На этапах размножения и элонгации малины в культуре in vitro вводить в состав питательной среды MS витаминно-минеральный комплекс «Компливит» в концентрации 2 г/л.

Для снижения интенсивности транспирации при адаптации полученных in vitro растений малины следует осуществлять посадку материала в минипарнич-ки с обогащенным торфяньм субстратом.

Для индукции адвентивного органогенеза у листовых эксплантов малины следует культивировать на питательной среде с добавлением тидиазурона в концентрации 0,05 - 0,2 мг/л и CPPU в концентрации 0,1 и 0,2 мг/л

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Ковалев, О.В. Влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины in vitro/ Ковалев О.В., Челяев Д.Н., Сковородников Д.Н. //Материалы VI Международной научной конференции «Агроэкологиче-ские аспекты устойчивого развития АПК». - Брянск. 2009. - с. 242-245.

2. Сковородников Д.Н. Получение каллусных культур из листовых эксплантов малины / Сковородников Д.Н., Челяев Д.Н.//'Материалы VII Международной научной конференции «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК». - Брянск: Изд. Брянской ГСХА, 2010. - С. 32-34.

3. Сковородников, Д.Н. Этапы клонального микроразмножения ремонтантной малины / Сковородников Д.Н., Челяев Д.Н.// Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России», посвященный 30-летию Брянской ГСХА и 70-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, д. с.-х. наук, проф. В.Ф. Мальцева. - Брянск: Изд-во БГСХА, 2010. - С. 325-329.

4. Сковородников, Д.Н. Индукция адвентивного органогенеза у листовых эксплантов малины / Сковородников Д.Н., Челяев Д.Н.// «Пути повышения устойчивости растениеводства к негативным природным и техногенным воздействиям»: сборник материалов Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов -Орёл, 2011.-С. 365-367.

5. Сковородников, Д.Н. Возможность использования листовых эксплантов в культуре in vitro изолированных от адаптированных к нестерильным условиям растений малины / Сковородников Д.Н., Челяев Д.Н./У Научные чтения, посвященные выдающимся ученым академику Н.И. Вавилову и селекционеру К.И. Савичеву. - Брянск: Изд. Брянской ГСХА, 2011. - С. 96-99.

6. Сковородников, Д.Н. Влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на растения малины in vitro / Сковородников Д.Н., Озеровский А .ВЧеляев Д.Н.// Вестник Брянского государственного университета. - 2011.-№4.-С. 279-281.

7. Челяев, Д.Н. Индукция каллусогенеза in vitro у листовых эксплантов малины / Челяев Д.Н., Сковородников ДЛ. // Вестник Брянского государственного университета. - 2011. - №4. - С. 314-315.

8. Челяев, Д.Н. Влияние тидиазурона и CPPU на регенерацию адвентивных побегов у ремонтантных форм малины/Челяев Д.Н. // Материалы \ТП Международной научной конференции «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК». - Брянск, Изд. Брянской ГСХА, 2011. - С. 361-363.

9. Челяев, Д.Н. Влияние производных дифенилмочевины (TDZ и CPPU) на индукцию каллусогенеза и адвентивного органогенеза у листовых эксплантов малины / Челяев Д.Н. // П-39 Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. - М., 2011. -T.XXVI. - С. 287-292.

■ Подписано к печати 22.02.2012 г.Формат 60 х 84 1/1-6 _Бумага писчая. Усл.п.л.1,0. Тираж 100 экз. Изд. №2134._

Издательство Брянской государственной сельскохозяйственной академии 243365 Брянская обл., Выгоничский район, с. Кокино, Брянская ГСХА

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Челяев, Дмитрий Николаевич, Брянск

61 12-6/344

ФГБОУ ВПО «БРЯНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ

АКАДЕМИЯ»

На правах рукописи УДК 634.711:581.143 (470.333) ЧЕЛЯЕВ ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЭЛИТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель -кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Сковородников Д.Н.

БРЯНСК 2012

Оглавление

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СОКРАЩЕНИЙ......................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................8

1.1. клональное микроразмножение.............................................................8

1.1.1. Этапы клонального микроразмножения..............................................9

1.1.2. Методы клонального микроразмножения..........................................15

1.1.3. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения 20

1.2. Морфогенез в культуре in vitro..............................................................23

1.2.1. Морфогенез в каллусных тканях.........................................................24

1.2.2. Факторы, влияющие на морфогенез in vitro.......................................29

1.3. сомаклональная вариабельность........................................................33

1.4. Методы клеточной селекции................................................................35

ГЛАВА 2. ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.....38

2.1. Цель и задачи исследований......................................................................38

2.2 Объекты исследований.................................................................................38

2.3 Методика исследований..............................................................................42

2.3.1 Техника изолирования эксплантов, субкультивирования, укоренения in vitro и адаптации растений ex vitro......................................................................42

2.3.2. Методика получения каллусной культуры...............................................50

2.3.3. Техника получения регенерантов из листовых эксплантов....................51

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................52

3.1. клональное микроразмножение элитных форм и сортов малины......52

3.1.1 Особенности введения в культуру in vitro.................................................52

3.1.2. Этап собственно размножения растений малины в культуре in vitro....63

3.1.3. Этап укоренения и адаптации....................................................................71

3.1.4. Влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на рост и развитие растений малины в культуре in vitro...................................................74

3.1.5. Оценка сортов и элитных форм малины на этапе элонгации.................79

3.1.6. Этап адаптации растений летних сортов и форм малины к нестерильным условиям........................................................................................80

3.1.7. Интенсивность транспирации растений малины при адаптации к нестерильным условиям........................................................................................82

3.2. Получение каллусной ткани на эксплантах растений малины .... 86

3.3. Адвентивный органогенез в культуре in vitro некоторых генотипов

малины...................................................................................................................91

ВЫВОДЫ..............................................................................................................96

РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................................................................97

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................98

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СОКРАЩЕНИЙ

6-БАП (6-ВАР) - 6-бензиламинопурин

ИМК - индолилмасляная кислота

ИУК - индолилуксусная кислота

НУК - нафтилуксусная кислота

СРРи - N-(2 хлор-4-перидил)-Ы-фенилмочевина

TDZ - тидиазурон

4-Ри - К-(4-пиридил)-1Ч-фенилмочевина

ВВЕДЕНИЕ

Регенерацию растений считают краеугольным камнем всей методологии культуры тканей, без которой становятся бесполезными исследования по гибридизации протопластов, росту и дифференцировке, получению генетически изменчивых растений, культуре пыльников. Благодаря знаниям в области регенерации растений, подобные исследования превратились в мощные инструменты, применяемые в сельском хозяйстве и садоводстве (Тиссе-ра, 1989).

Наиболее разработанным биотехнологическим методом является кло-нальное микроразмножение растений. За рубежом этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала плодово-ягодных культур в различных селекционных программах (Hall, 2009).

Применение биотехнологических приемов в селекционном процессе нашло место на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.), где уже более 15 лет ведется работа в этом направлении. Необходимость использования культуры ткани возникла в связи с трудностью размножения ценных форм ремонтантной малины (Казаков, Евдокименко, 1997). В ходе проведенных исследований были оптимизированы все этапы культивирования ремонтантной малины in vitro (Вовк, 2000, Сковородников, 2004, Нам, 2004, Озе-ровский, 2007).

Из факторов, определяющих успех культуры тканей, наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Экспериментально доказано, что сорта многих видов растений, культивируемых in vitro, обладают различным морфогенетическим потенциалом, т.е. имеют более или менее выраженную способность к образованию дополнительных почек и побегов, их росту, укоренению и, в конечном итоге, получению более высокого коэффициента размножения. Поэтому знания этих особенностей исследуемых генотипов растений даёт возможность планировать проведение работ в культуре in vitro и получать заданный объем селекционного материала.

Основой успешной работы в таких направлениях как генная инженерия, соматическая гибридизация и клеточная селекция является, прежде всего, получение стабильной и высокой частоты регенерации растений in vitro. Однако сложность данной проблемы заключается в том, что морфогенетиче-ские потенции тканей многолетних культур, к которым относится малина, не высоки. Отсюда и трудность, возникающая при регенерации целых растений из тканевых культур различных генотипов.

Цель исследований: оценить регенерационный потенциал новых форм малины, созданных на Кокинском опорном пункте ВСТИСП.

Задачи исследования:

1. Оценить морфогенетический потенциал новых элитных форм малины в культуре in vitro на всех этапах клонального микроразмножения;

2. Оптимизировать состав питательной среды для активной пролиферации и укоренения побегов;

3. Определить интенсивность транспирации растений малины в условиях in vitro и ex vitro;

4. Усовершенствовать состав питательной среды для индукции каллу-согенеза и адвентивного органогенеза листовых эксплантов малины.

Научная новизна. Сделана оценка 45 элитных форм и сортов малины, культивируемых в условиях in vitro по основным морфобиологическим показателям. Установлено положительное влияние витаминно-минерального комплекса «Компливит» на роста и развитие растений малины in vitro. Обоснована замена этапа укоренения микрочеренков малины этапом элонгации с последующим укоренением растений в субстрате. Продемонстрировано изменение интенсивности транспирации растений малины в процессе их адаптации к нестерильным условиям среды.

Основные положения, выносимые на защиту: • морфогенетическая реакция новых элитных форм малины в культуре in vitro;

• оптимизированный состав питательной среды для клонального микрораз-

множения малины;

• способы индукции каллусогенеза и адвентивного органогенеза в культуре

листовых эксплантов малины.

Практическая значимость. Оптимизирован состав питательной среды на этапах клонального микроразмножения малины. При адаптации к нестерильным условиям растений in vitro увеличен процент их приживаемости за счет включения этапа элонгации. Выявлена оптимальная концентрация производных дифенилмочевины (CPPU и TDZ), индуцирующая каллусогенез и адвентивный органогенез листовых эксплантов малины в культуре in vitro.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях кафедры биологии, кормопроизводства, селекции и семеноводства, на заседаниях ученого совета Агроэколо-гического института и Международных научно-практических конференциях: «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2009), «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2010), «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск 2010), Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Орел 2011), Научные чтения, посвященные выдающимся ученым академику Н.И. Вавилову и селекционеру К.И. Савичеву (Брянск 2011), VIII Международная научная конференция «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск 2011), «Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве» (Москва 2011).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов и рекомендаций для практической деятельности. Работа содержит 21 таблицу и 26 рисунков. Список использованной литературы включает 182 наименования, в том числе 29 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клональное микроразмножение

Клональное микроразмножение растений — один из способов вегетативного размножения в условиях «in vitro».

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный (Расторгуев, 2007). Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако, для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной (Казаков И.В. и др., 2006, Чупеева Н.В. и др., 2008).

Это обусловлено следующими причинами:

• не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

• практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;

• не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);

• трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;

• неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовать присущую ей тотипотентность. Размножение растений in vitro можно осуществлять с помощью культуры изолированных апексов, индукции возникновения адвентивных побегов из каллусной ткани,

а также непосредственно из тканей исходных эксплантов (Джонс О.П., 1987, Бутенко Р.Г., 1990)

Термин «клон» был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

- получение генетически однородного посадочного материала (Сковородников, Д.Н, 2003.);

- высокий коэффициент размножения (Шипунова и др., 2002, Ковальчук И.Ю., 2008, Атанасов, 1993);

- получение оздоровленного посадочного материала (Паскеев, H.A., 2001.);

- сокращение продолжительности селекционного процесса (Чупеева Н.В. и

др., 2008);

- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития (Кашин В.И., 2002, Hogue E.J. et al, 1991, Machnik В. et al, 1981);

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами (Чупеева Н.В. и др., 2008);

- возможность проведения работ в течение всего года (Клоконос Н.П., 1987);

- возможность автоматизации процесса выращивания.

1.1.1. Этапы клонального микроразмножения

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения - донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов;

3. Ускорение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений - реге-нерантов при пониженной температуре (+2°С, +10°С);

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды (Сидоренко Т.Н. и др., 2009).

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры (Калинин Ф.Л. и др., 1980). Как правило, исходный материал обрабатывают раствором сулемы 0,1% (Фролова, JI.B., 2003, Сковородников, Д.Н., 2003), этанолом 70% (Фролова, Л.В., 2003, Мохаммед А.И., 1998), раствором перекиси водорода 16% (Мохаммед А.И., 1998), «Белизны» (Шорников, Д.Г., 2009.) или другими хлорсодержащими и кислородсодержащими моющими и отбеливающими средствами (Ковальчук И.Ю. и др., 2008) с экпозицией 2-6 мин в зависимости от состояния и сезона взятия экс-плантов (Фролова, J1.B., 2003) и последующей неоднократной промывкой стерильной дистиллированной водой (Чупеева Н.В. и др., 2008).

В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100-200мг/л и другие (Ковальчук И.Ю., 2008).

Также на данном этапе используют среду, содержащую минеральные соли, предложенные Мурасигой и Скугой (Фролова, JI.B., 2003, Мохаммед А.И., 1998), и различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины и цитокинины) (Нам И.Я. и др., 2000), такие как тидиазурон (Сковородников, Д.Н., 2003, Райков, И.А. и др., 2009, Соболева. А.Г. и др., 2006), CPPU (Райков, И.А. и др., 2009, Соболева. А.Г. и др., 2006), БАЛ (Райков, И.А. и др., 2009, Соболев В.В. и др., 2007) и другие в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибиро-вание роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно непосредственным добавлением их в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют аскорбиновую кислоту (1мг/л), глютатион (4-5мг/л), дитиотриэтол

(1-Змг/л), диэтилдитиокарбомат (2-5мг/л), поливинилпирролидон (5000-10000мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5-1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Му-расига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов (Мохаммед А.И., 1998, Сковородников Д.Н. и др., 2004). Из цитокининов наиболее часто используют БАП (Паскеев, H.A., 2001, Мохаммед А.И., 1998, Сковородников, Д.Н., 2003 , Геринг X., 1991, Pyott J.L. et al., 1981, Упадышев М.Т., 1997) в концентрациях от 1 до 10 мг/л, TDZ (Сковородников, Д.Н., 2003, Нам И.Я. и др., 2001, Huetteman С.А. et al, 1993) в концентрациях от 0,05 до 1мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л (Сковородников, Д.Н., 2003), Муратова С.А. и др., 2001). Также на данном этапе некоторые исследователи используют смесь цитокининов: 6-БАП с кинетином (Панькова O.A. и др., 2007, Туровская и др., 1992, Панькова O.A. и др., 1999).

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией (Фролова, JI.B., 2003), Вместе с тем, можно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем у некоторых

видов (Ковальчук И.Ю., 2008, Ковалева И.С. и др., 2000, Соболев В.В. и др., 2007), образование верифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой (1984) и Р.Г. Бутенко (1979), путем использования питательных сред с минимальной кон�