ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ IN VITRO

Нам, Ирина Ян-гуковна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ IN VITRO
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ IN VITRO"

¿шмз

На правах рукописи

НАМ Ирина Ян-Гуковна

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ IN VITRO

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Диссертационная работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный консучьтант - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН B.C. Шевелуха.

Официальные оппоненты доктор биологических наук A.B. Поляков, доктор биологических наук, профессор Н.Е. Павловская, доктор сельскохозяйственных наук С.Д. Айтжанова.

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исстедовательсклй институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится «¿?3> декабря 2004 года в / /часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, И-550, ут Тимирязевская, 49 Ученый совет МСХА С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан ноября 2004 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

Г.И. Кар

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Изучение влияния регуляторов роста и развития растений на их морфогенез, устойчивость и продуктивность является важнейшим направлением современной биотехнологии, имеющим теоретическое и практическое значение для создания новых сортов, гибридов и разработки высоких технологий.

Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ. Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н.-, 1973; Муромцев Г.С. и др., 1987; Кефели В.И. и др., 1989), направленно воздействующие на процессы, протекающие в растениях. Это позволяет использовать их в биотехнологиях in vitro (Шевелуха B.C., 1992), в частности, для клонального микроразмножения и регенерации, разработанных для многих видов культурных растений (Бутенко Р.Г., 1964, 1999). Однако для трудно размножаемых культур, в том числе для ремонтантной малины, актуальным является поиск эффективных регуляторов роста для разработки технологий размножения и регенерации растений в культуре in vitro.

Фундаментальной основой для разработки методов применения существующих и поиска новых физиологически активных веществ является изучение механизмов их действия на растения в онтогенезе. Большое значение в этом отношении имеют модельные системы in vitro на основе изолированных органов, тканей и клеток. Оптимизация таких систем включает характеристику их специфичности, чувствительности по отношению к регуляторам роста, физиологической значимости эффектов и т.д. Особый интерес представляют модельные системы, позволяющие изучать молекулярные механизмы действия фиторегуляторов на уровне транскрипции и регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ.

прорастающих и зародышей созревающих семян люпина желтого были использованы для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов, гормональной регуляции биосинтеза РНК и белков, активности РНК-полимераз и экспрессии генетических программ.

Воздействие фитогормонов на рост и развитие различных видов растений изучалось многими исследователями (Кефели В.И., 1984; Никелл Л.Дж., 1984; Шевелуха B.C. и др., 1998), однако синтетические регуляторы роста изучены недостаточно. Для ряда фиторегуляторов показано главным образом их пг tir r,-rT"°rTt-"'-rv сельскохозяйственных культур, а для

Разработанные нами модельные системы на основе семядолей

ЦНБ МСХА

некоторых экономически важных культур не получено и этих данных, например, на огурце при его возделывании в защищенном грунте К эффективным, но малоизученным фиторегуляторам, созданным в последние десятилетия, относятся препараты эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1 и кавказ (Ненько Н И, 1999, Ковалев В М , 2003) Наряду с исследованием их влияния на продуктивность и устойчивость растений огурца, важно было изучить морфофизиологические показатели эффективности этих веществ, регуляцию ими разных этапов онтогенеза

Такие исследования проводились нами в период с 1978 по 2004 гг на ремонтантной малине, огурце в защищенном фунте и люпине же чтом -культурах разных ботанических семейств

Целью настоящей работы является оптимизация применения регуляторов роста- а) при создании высокоэффективной системы кдонального микроразмножения, регенерации и генетической трансформации in vitro растений ремонтантных форм малины, б) при разработке модельных систем для изучения молекулярных механизмов действия фитогормонов на разных этапах онтогенеза люпина, в) при разработке методов использования новых регуляторов роста и развития для увеличения продуктивности растений огурца

При этом решались следующие задачи

- разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины: введение материала в культуру in vitro, оптимизация устовий побего- и корнеобразования, разработка способов длительного хранения пробирочных растений,

- разработка системы регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков, а также метода молекулярно-генетического анализа на основе ISSR-PCR для изучения генетической стабильности регенерантов,

- разработка метода трансформации растений ремонтантной малины с использованием A tumefaciens, доказательство его эффективности с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности,

- разработка модельных систем для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов в онтогенезе на растениях люпина же что го с использованием прорастающих и созревающих семян,

- изучение эффективности новых синтетических регуляторов роста растений эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1, кавказ на разных этапах онтогенеза огурца и оптимизация их применения в условиях защищенного грунта для повышения продуктивности и устойчивости

Научная новизна работы.

Впервые разработан метод клонального микроразмножения

ремонтантной малины, при этом оптимизированы этапы введения материала в культуру in vitro, размножения и укоренения пробирочных растений и длительного сохранения клонов в пробирочных условиях.

Впервые показана способность регуляторов цитокининового действия структурного ряда дифенилмочевины - тидиазурона (TDZ) и Н-(4-пиридил)-Ы-фенилмочевины (4-PU), индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек, что позволило вводить в культуру in vitro новые формы ремонтантной малины в течение всего года.

Разработан метод регенерации растений из листовых дисков ремонтантной малины с применением 4-PU и TDZ, универсальный для различных генотипов. Стеблевой морфогенез наблюдается у всех исследованных форм - на уровне 3.3 - 96.0% в зависимости от генотипа.

Впервые разработан молекулярно-генетический метод анализа растений малины на основе ISSR-PCR. Показана генетическая однородность полученных регенерантов ремонтантной малины и их идентичность исходному образцу. Эффективность метода подтверждена путем проведения генетической паспортизации и построения дендрограмм генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.

Разработана система генетической трансформации ремонтантной малины методом кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Эффективность метода доказана с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности.

Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих семян и незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro, для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян и экспрессии генов.

Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирования. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II и показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.

Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых препаратов кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта, показано их стимулирующее действие на рост, развитие и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9 г 17%.

Положения, выносимые на защиту:

1 Метод клонального микроразмножения in vitro ремонтантной малины с применением цитокининов TDZ и 4-PU для оптимизации этапов введения эксллантов в культуру in vitro и размножения пробирочных растений, обеспечивающий размножение образцов практически независимо от генотипа

2 Системы регенерации ремонтантной малины из чистовых дисков и ее трансформации методом кокультивирования с A tum

3 Метод молекулярно-генетического анализа малины для оценки генетической стабильности и однородности растений - регенерантов, а также для характеристики размножаемых ремонтантных форм

4 Модельные системы с использованием изолированных семядолей проростков и незрелых зародышей люпина желтого дтя исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов и регуляции экспрессии генов

5 Способы применения регуляторов роста Краснодар-1, кавказ и эмистим в условиях интенсивной технологии выращивания огурца в защищенном фунте для повышения продуктивности растений и ее стабилизации

Практическая значимость работы. Применение предложенных методов и технологий размножения m vitro ремонтантной малины обеспечило сокращение на 4 - 5 лет сроков селекции от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания, что особенно важно для ремонтантных генотипов, которые отчичаются низким коэффициентом вегетативного размножения В период с 1993 г по 2004 г размножено и передано селекционерам более 130 образцов и на этой основе ими создано 8 новых сортов ремонтантной малины

Применение экологически чистых препаратов эмистим, Краснодар-1 и кавказ повышает продуктивность растений огурца в условиях интенсивного производства в защищенном грунте на 9 - 17%

Обоснованность и достоверность научных положений н выводов обеспечивается обширным экспериментальным материалом, полученным в течение более 25 лет исследовательской работы, использованием современных существующих и разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности

Личный вклад автора. Автор принимал личное участие в постановке проблем, целей и задач исследований, разработке программ и новых методов исследований, руководстве аспирантами Лично автором и руководимыми им

аспирантами выполнена основная часть экспериментальной работы, а также обработка, анализ и обобщение полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы, выводы и предложения по диссертации докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: на конференции по молекулярным механизмам регуляции метаболических процессов (Минск, 1987), II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1988), международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), 5th and 8th International Lupin conference (Poznan, 1988; Pacific Grove, California, USA, 1996), Всесоюзной конференции "Физиология семян" (Душанбе, 1988), международном симпозиуме "Эмбриология и семенное размножение" (Ленинград, 1990), II и IV съездах Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990; Москва, 1999), II Всероссийском симпозиуме "Новые методы- биотехнологии растений" (Пущино, 1993), 4 и 5 международных конференциях "Регуляторы роста и 'развития растений" (Москва, 1997, 1999), 3 ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), международной научно-практической конференции «Биотехнология — возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (С.-Петербург, 2001), Penn State Plant Physiology Symposium «Plant Reproduction 2002» (Penncilvania, 2002), Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003) и др.

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 59 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора научной литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы диссертации изложены на 312 страницах машинописного текста, содержат 51 таблицу и 48 рисунков. Библиография включает 380 источников, в том числе 145 из зарубежной литературы.

Объекты исследования.

Настоящая работа была выполнена на малине обычных и ремонтантных форм, гибридов и сортов сложного межвидового происхождения (род Rubus); на сортах люпина желтого (Lupinus luteus (L.) Академический, Нарочанский; на длинноплодных гибридах огурца (Cucumis sativus L.), используемых для выращивания в защищенном грунте: НИИОХ-412, Королек, Аэлита и Московский юбилейный.

Методы исследования.

Культивирование in vitro малины проводили на среде Мурасиге-Скуга с увеличенной в три раза концентрацией хелата железа Приготовление питательных сред, стерилизация материала, выделение эксплантов осуществлялось с помощью стандартных методов и приемов (Бутенко Р Г, 1964)

Экспланты для клонального микроразмножения (апексы и зачатки цветков размером 0 2-07 мм) выделяли из почек побегов замещения Стерилизацию проводили с помощью 0 1% раствора сулемы

На разных этапах клонального микроразмножения ремонтантной малины применяли среды, содержащие цитокинины 6-БАП (1-4 мг/л), TDZ (0 025-0 2 мг/л), 4-PU (0 1 - 04 мг/л) и ауксины ИУК или ИМК (0 5-15 мг/л) При кратковременной обработке побегов для ризогенеза использовали ИМК, 1 г/т

При регенерации растений в качестве источника эксплантов использовали листья и черешки, изолированные от укорененных in vitro растений малины Отсутствие генетических изменений в полученных регенерантах доказывали с помощью метода ISSR-PCR по модифицированной методике Prévost G& Wilkinson J. A (1999) Все праймеры для метода 1SSR- PCR были синтезированы ЗАО «Синтол» (Москва)

Для генетической трансформации растений использовали штаммы А tumefaciens, любезно предоставленные лабораторией генетической инженерии растений Института общей генетики E35S-L-licB, E35S-licB, E-nptII Использованные векторы содержали ген устойчивости к канамицину под опиновым nos-промотором и ген репортерного белка лихеназы под промотором 35S Эта репортерная система основана на высокой термостабильности бактериального фермента лихеназы Clostridium thermocellum (Мусийчук К А , 2001) Наличие лихеназной активности в растениях - регенерантах опредетяли с помощью чашечного теста (Голденкова И В , 2002)

В опытах использовали также штамм A tumefaciens GANE 7, содержащий ген Ь6, любезно предоставленный Институтом клеточной биологии и генетической инженерии HAH Украины. Ген Ь6 участвует в тонкой регуляции действия цитокининов в растениях и способен вызвать повышение регенерационной способности у табака (Кучук H В , 1997)

Анализ ФГ в зародышах и семядолях люпина желтого проводили методом ГЖХ и ИФА (Заякин В В , 1997)

Электрофорез запасных белков люпина и иммуноэлектрофорез по Грабар-Уильямс проводили по стандартным методикам (Остерман Л.А., 1983).

Этиолированные семядоли изолировали у проростков люпина желтого разного возраста (до 8 суток) и культивировали в темноте на воде или растворах ФГ, далее из них выделяли ядра, хроматин или РНК-полимеразы. Транскрипцию хроматина в системе in vitro и определение протеинкиназной активности проводили по методу, описанному Заякиным В.В. (1990). Содержание хлорофилла в семядолях определяли по методике Авериной Т.С., Шлыка A.A. (1972).

В опытах по влиянию регуляторов роста на прорастание семян и развитие проростков огурца использовали гибриды НИИОХ-412 и Королек. Огурцы выращивали в защищенном грунте согласно стандартной технологии. Семена . проходили предпосевную обработку методом замачивания в растворах исследуемых препаратов в течение 24 часов. Производственные опыты были проведены на гибридах НИИОХ-422, Королек, Аэлита и Московский юбилейный.

Опыты проводили в 3-4 - кратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М ± т, где М -математическое ожидание, am - стандартная ошибка среднего (Доспехов Б.А., 1974).

Результаты исследований и их обсуждение.

Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений при клональном микроразмножении и регенерации растений ремонтантной малины in vitro.

В работе на ремонтантной малине мы опирались на результаты отечественных и зарубежных исследователей, ранее разработавших методы клонального микроразмножения и регенерации in vitro для ряда плодово-ягодных культур, и в частности, на работы по культивированию in vitro малины и ежевики (Высоцкий В.А., 1984, 1998; Fióla J.A. et al., 1990; Graham J. et al., 1997). Для размножения in vitro большинства культур на этапах индукции из эксплактов первичного побега и размножения растений различными авторами применялись цитокинины 6-БАП, кинетин и зеатин, и для ризогенеза - ауксины ИУК, ИМК или НУК. При разработке метода клонального микроразмножения ремонтантной малины нами также изучалось действие разных цитокининов и ауксинов.

Разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины В настоящей работе были использованы ремонтантные формы малины селекции чл -корр РАСХН Казакова И В, полученные им при межвидовои гибридизации малины красной, замечательной, черной, боярышниколистной, душистой и поленики. В гибридном питомнике селекционерами было оценено более 120 тысяч гибридов, при этом отобрано более 250 образцов, превосходящих районированный ремонтантный сорт Бабье лето

Ремонтантные формы растений малины имеют ряд особенностей в своем развитии Главная из них - плодоношение на побегах первого года, в связи с чем вегетативные почки на отрастающих побегах рано дифференцируются по цветочному типу Распределение питательных веществ также подчинено раннему плодоношению, и ассимиляты преимущественно потребляются растущими побегами и гшодоэлементами. Это вызывает существенное уменьшение образования корневых отпрысков, замедление вегетативного размножения и, как следствие, удлинение селекционного процесса в целом. В связи с этим была поставлена задача разработать биотехнологические приемы для ускоренного размножения элитных селекционных образцов

При разработке метода введения ремонтантной малины в культуру m vitro основные сложности также были связаны с биологическими особенностями этих форм Вегетативные почки на отрастающих побегах рано дифференцируются по генеративному типу, а экспланты из цветочных почек на средах, содержащих 6-БАП, полностью погибают При этом период возможного введения вегетативных почек в кутьгуру in vitro составляет всего 2-3 недели в самом начале вегетации, что существенно ограничивает сроки проведения этого этапа работы

Кроме того, из-за малого количества корневых отпрысков было ограничено количество исходного материала - всего по 6 -15 эксплантов на образец, что объективно не позволяло проводить опыты по оптимизации питательных сред на этапе введения материала в культуру in vitro Поскольку метод предполагалось использовать для размножения большого количества ремонтантных образцов, необходимо было разрабатывать достаточно универсальные методики для эффективного введения материала в культуру in vitro, размножения, укоренения и высадки размноженных растений в субстрат

Важнейшим свойством при размножении новых видов растений является способность эксплантов к развитию в условиях m vitro Традиционно используемый 6-БАП в наших опытах недостаточно стимулировал развитие вегетативных эксплантов ремонтантных форм - более половины их погибало или плохо развивалось в культуре (рис 1) Так, в 1996 -1997 годах на средах с

б-БАП из 47 генотипов лишь 14 показали хорошую, а 6 -условиям in vitro.

среднюю адаптацию к

Рис.1. Влияние 6-БАП иД-PU на развитие in vitro эксплантов ремонтантной малины.

6-БАП, 6-БАП, 4-PU, 1994г. 1997г. 1997г.

□Трудно адаптировавшиеся генотипы, %

Ш Легко адаптировавшиеся генотипы, %

Ш Погибшие генотипы, %

Для образцов малины, погибавших in vitro, необходимо было найти регуляторы роста, более эффективные на этапе их введения в культуру. Нами был применен цитокинин ряда дифенилмочевины К-(4-пиридил)-Ы-фенилмо-чевина (4-PU), который ранее использовался на плодовых культурах для регенерации растений из листовых дисков. На средах, содержащих 4-PU, была достигнута высокая приживаемость вегетативных эксплантов генотипов, ранее полностью погибавших на 6-БАП (табл. 1). В 1997 году на среде с 4-PU не погиб ни один из 30 образцов, которые необходимо было размножить (рис.1).

Таблица 1

Влияние различных цитокининов на развитие в культуре in vitro эксплантов из вегетативных почек ремонтантной малины

Концентрация цитокинина (мг/л) Количество эксплантов

6-БАП 4-PU

исходных выживших (%) исходных выживших (%)

22-15-1

0.2 16 0 17 65

0.5 16 0 12 83

1.0 15 0 17 86

• ' 6-х-ж

0.2 15 0 16 69

0.5 17 0 16 94

1.0 16 0 17 100

Таким образом, использование нового препарата цитокин; вото действия 4-PU позволило провести оптимизацию введения в культуру in vitro эксплантов из вегетативных почек ремонтантных образцов малины

В связи с тем, что вегетативные почки ремонтантной малины доступны всего лишь 2-3 недели в мае, до наступления их дифференциации по генеративному типу, актуальной является проблема культивирования эксплантов из цветочных почек Нами впервые показано, что 4-PU индуцирует стеблевой морфогенез из цветочных зачатков Другой регулятор ряда дифенилмочевины, тидиазурон, также показал высокую эффективность при культивировании генеративных почек in vitro. Сравнение способности цитокининов 6-БАП, TDZ и 4-PU ин&уцировать стеблевой морфогенез из цветочных зачатков показано на рис 2 на примере ремонтантного образца 44302-1

.о-/-

6-БАП 4-PU ТО/

Тип цитокинина

Рис 2 Влияние 6-БАП, TDZ и 4-PU на стеблевой морфогенез цветочных зачатков ремонтантного образца малины 44-302-1

Разработка метода регенерации из цветочных почек позволила использовать для работы побеги, срезанные осенью после селекционной оценки образцов В 2001 - 2002 гг на средах с TDZ из 28 образцов успешно были введены в культуру 27, при этом у 17 форм получена регенерация побегов свыше 80%

Таким образом, нами показана способность TDZ и 4-PU не только стимулировать побегообразование из вегетативных почек, но и индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек Использование этих регуляторов роста позволяет культивировать in vitro практически 100% образцов

ремонтантной малины, независимо от регенерационного потенциала изучаемого генотипа и типа дифференциации почек. Выделение эксплантов можно проводить в течение всего года, используя как вегетативные, так и цветочные почки молодых побегов возобновления и старых побегов после снятия с них плодов. В настоящее время разработанный метод успешно применен для введения в культуру in vitro 145 генотипов ремонтантной малины.

Регуляция образования адвентивных побегов у ремонтантной малины. В опытах на ремонтантной малине было показано, что для большинства образцов удовлетворительное побегообразование наблюдается на средах с б-БАП в концентрации 2 мг/л. При этом коэффициент размножения на разных образцах варьирует в пределах 3-8 (табл. 2). Добавление в среды ГК, ИУК или ИМК неэффективно, что показано на сортах Геракл, Бабье лето-2 и образце 47-Х-4.

Таблица 2

Влияние различных цитокининов на коэффициент размножения ремонтантных форм малины

Вариант Коэффициент размножения

М±ш . % М±ш • %

8-242-1 образец 47-Х-4

6-БАП, 1 мг/л 2.45 ±0.41 43.1 1.33 ±0.37 36.6

6-БАП, 2 мг/л 5.68 ± 1.09 100.0 3.63 ± 0.84 100.0

б-БАП, 4 мг/л 4.43 ± 0.57 78.0 1.33 ±0.40 36.6

TDZ, 0.1 мг/л 8.00 ± 0.68 140.8 8.25 ±2.55 227.2

TDZ, 0.2 мг/л 13.50 ±1.20 237.7 11.80± 1.31 325.1

4-PU, 0.2 мг/л 8.09 ± 0.79 142.4 3.29 ± 0.68 90.6

• Бабье лето-2 Геракл

6-БАП, 2 мг/л 4.11 ±0.90 100.0 8.36 ± 1.58 100.0

TDZ, 0,025 мг/л 3.20 ± 0.40 77.9

TDZ, 0.05 мг/л 11.33 ± 1.17 275.7

TDZ, 0.1 мг/л 16.40 ±1.18 399.0

4-PU, 0.1 мг/л 4.78 ± 0.62 116.3

4-PU.0.2 мг/л 7.86 ± 1.56 191.2 14.20 ± 1.44 169.5

4-PU.0.4 мг/л 14.00 ±2.32 340.0

Однако для ряда образцов б-БАП (2 мг/л) недостаточно эффективен, у них наблюдается коэффициент размножения 1.5-1.7 и ниже. Для этих образцов были разработаны среды с 4-Ри и ТЕ>г, которые существенно увеличивали образование адвентивных побегов. Как видно из табл. 2, TDZ в концентрации 0.1 — 0.2 мг/л и 4-Ри в концентрации 0.2 - 0.4 мг/л увеличивают коэффициент

размножения в 2 5 - 4 раза по сравнению с 6-БАП Высокий коэффициент побегообразования позволяет быстро размножить селекционный материал, но часто при этом образуются тонкие, нитевидные побеги, с которыми сложно работать в дальнейшем, так как они плохо растут и развиваются Поэтому предпочтительнее иметь коэффициент размножения 3-6 при образовании крупных, хорошо развитых побегов, быстро укореняющихся на средах с ауксинами Кроме того, при длительном культивировании на средах с TDZ часто образуются витрифицированные побеги, которые имеют нарушения в развитии и часто погибают даже посте их переноса на другие среды Поэтому при использовании TDZ лучше снизить его концентрацию, чтобы уменьшить образование верифицированных растений

У некоторых форм ремонтантной малины с плохим размножением на 6-БАП перенесение на среды с 4-PU и TDZ не увеличивало побегообразование Например, для образца 5-185-2 количество адвентивных побегов на среде с 6-БАП было равно 1, а на 4-PU и TDZ стало I 16 г 0 14 и 1 21 ±0 18 соответственно Таких генотипов очень мало, но они есть, и их размножение m v ltro малоэффективно

В целом можно сделать вывод, что дтя размножения in vitro большинства образцов ремонтантной малины подходит 6-БАП в концентрации 2 мг- i Для генотипов с низким регенерашюнным потенциалом необходимо использовать 4-PU и TDZ При массовом размножении отдельных селекционных образцов ,ыя них необходимо подбирать тип и концентрацию цитокинина для сочетания высокого коэффициента размножения и жизнеспособности растений

Индукция ризогенеза у пробирочных растений ремонтантной мтлины Регенерация корней у пробирочных растений следующий лап метода кло-нального микроразмножения Традиционно для индукции ризогенеза используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК Как показано в опытах по укоренению ремонтантных форм малины, при использовании для корнеобразования ИУК оптимальной является концентрация 0 5 мг/л, при этом у образца 11 -220-2 (рис 3) и ряда других форм корни индуцировались примерно у 80% растений Однако некоторые образцы на средах с ИУК дают укоренение тишь в 30-40% случаев, и для них более эффективна ИМК, вызывающая укоренение 100% растений сорта Геракл (при концентрации ИМК 10-15 мг/л) Но при уровне ИМК 0 5 мг/л корни появлялись раньше, и количество корешков было существенно больше, поэтому для ризогенеза выбрана концентрация ИМК 0 5 мг/л

Для растений некоторых плохо укореняемых генотипов был предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1 мг/мл) растения

переносятся на безгормональную среду МБ/2, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза-до 100%.

Ежегодно в лаборатории размножается несколько тысяч растений 10-15 генотипов ремонтантной малины. Для облегчения этой трудоемкой работы нами была разработана методика, по которой после обмакивания растения в раствор ИМК (1 г/л) его высаживали в стерильный песок. На растениях 7 генотипов показана очень высокая эффективность укоренения - от 71% до 95%.

Таким образом, для регенерации корней у ремонтантной малины можно использовать как ИУК (0.5 - 0.75 мг/л), так и ИМК (0.5 мг/л). Разработаны разные способы укоренения побегов. Выбор метода укоренения зависит от особенностей генотипа. Для некоторых образцов необходимо применять технику обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов при дальнейшем культивировании их на безгормональной среде MS/2. После обмакивания возможно также выращивание растений в стерильном песке.

Высадка растений в субстрат и их адаптация к нему при пониженной влажности воздуха являются сложным этапом. В этих условиях наблюдалась полная гибель некоторых образцов. Согласно разработанному нами методу, при постепенном привыкании растений к пониженной влажности воздуха и рН субстрата около 6 приживаемость растений существенно повышается, нередко до 100%.

Для селекционных образцов необходимо сохранение их в культуре in vitro до получения результатов селекционной оценки, в связи с чем нами были разработаны условия поддержания коллекции при длительном беспересадочном культивировании: лучше всего растения сохранялись на холоду при +4°С. При комнатной температуре растения оставались зелеными и жизнеспособными в течение 9 месяцев на среде с 3% маннита и 3% сахарозы.

Рис.3. Влияние ИУК на корнеобразование образца 11-220-2.

0.2 0.5 0.75 1.0 1.5 Концентрация ИУК, мг/л

Таким образом, нами разработан метод клонального микроразмножения ремонтантной малины, оптимизированы все его этапы С 1993 по 2004 гг было размножено более 130 генотипов и передано се акционерам более 15 тысяч растений На этой основе ими было создано 8 новых сортов ремонтантной малины Сроки селекции ремонтантных сортов от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания при этом удалось сократить на 4 - 5 лет

При сравнении растений ремонтантной малины сортов Бабье аето-2 и Геракл, размноженных биотехнологическим и традиционным способами (табл 3), показано, что у растений, размноженных m vitro, резко увеличилось образование корневой поросли, имеется тенденция к увеличению количества побегов замещения, возросла продуктивность

Таблица 3

Побегообразоватечьная способность растений ремонтантной малины, полученных in vitro и традиционным способом

Растения, размноженные традиционным способом

Побеги . Корне-замещен, вая шт I поросль

Потенц. | Побеги продукт, і замещен г шт

2001 год

Растения, размноженные ,

in vitro _|

Корне- | Потенц

вая 1 продукт, I поросль ^ г [

Бабье лето- 4 0±0 4 1 0±0 2 | 4 5±0 4 3 2±1 3 I *

2 100% 100% 113% 320%

Геракл 3 7±0 2 100% 0 6±0 3 100% 1 4 2±0 5 114% 1 9±0 7 320%

1 1 2002 год

: Бабье лето- 4 1±0 5 0 7±0 3 | 1568 г 4 6±0 3 1 5±0 3 1 2142 г

2 100% 100% | 100% 112% | 214% 1 137%

Геракл 4 4±0 3 0 7±0 2 і 1260 г 6 4±0 8 і 2 9±0 3 , 2066 г

100% 100% ' 100% 145% | 414% 1 164%

Эти результаты можно объяснить тем, что при длительном культивировании образцов происходит отбор более интенсивно размножающихся клонов, обладающих большей энергией роста и развития, а также последействием экзогенных цитокининов, накопленных в тканях, что и проявляется в полевых условиях повышением вегетативного роста и продуктивности

Разработка метода регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков. Частным способом ускоренного размножения растений может быть их регенерация in vitro из листовых дисков. Метод регенерации растений необходим для создания трансгенных форм в работах по генетической инженерии, что широко используется в современной селекции.

При разработке метода регенерации ремонтантной малины нами изучены следующие факторы, влияющие на индукцию стеблевого морфогенеза: 1. гормональный состав среды; 2. генотипические особенности изучаемых форм; 3. тип экспланта — листовые диски, черешки листа; 4. возраст экспланта; 5. влияние освещенности и температуры.

Исследования показали, что традиционно используемое сочетание 6-БАП и ИУК при регенерации ремонтантной малины малоэффективно. Например, частота регенерации растений на листовых дисках сорта Бабье лето-2 не превышает 6.7%. Применение 4-PU' и TDZ. позволило резко увеличить стеблевой морфогенез (рис. 4), который на сортах Бабье лето-2 и Геракл в отдельных опытах достигает 95%.

■ TDZ 0.025 мг/л

■ TDZ 0.05 мг/л □TDZ0.1 мг/л □ TDZ 0.2 мг/л

■ TDZ 0.5 мг/л HTDZ 1.0 мг/л

18 суток 26 суток 31 сутки 39 суток

Рис. 4. Динамика регенерации на листовых дисках у сорта Бабье лето-2 в зависимости от концентрации ^DZ.

Регенерация растений на средах с ТЕ)2 существенно зависит от генотипа (табл. 4). Для большинства образцов оптимальной является концентрация ТП2, 0.1 мг/л, для Геракла это - 0.2 мг/л. При этом более трети изученных форм показали регенерацию на уровне 50% и более. Регенеранты были получены у всех изученных образцов. Молодые листья имеют более высокий потенциал регенерации, на старых' листьях морфогенез практически отсутствует. При использовании черешков верхних листьев регенеранты наблюдались у 62% эксплантов, у черешков нижних листьев регенерация отсутствовала. .

Таблица 4

Влияние концентрации ТОг на частоту регенерации некоторых генотипов ремонтантной малины

№ Частота регенерации, %

п п Генотип тог, тог. тог. тог,

0,05 мг/л 0,1 мг/л 0.2 мг/л 0,5 мг/л

1 Бабье лето-2 8,3±3,4 81,0±1,0 46,7 21

2 Геракл 13,0±3,3 47,0±4,3 63.0±5,2

3 21-232-2 - 68,5 * 8,8 46,7 ± 8,3 -

4 14-205-27 25,0±3,2 47,0±7,5 32.0±4,2 -

5 19-99-1 13,3 ±4,1 16,7 ±4,1 0 0

6 17-60-1 13,3 ± 0,2 6,7 ± 4,1 0 0

7 8-79-2 - 72,5±5,1 - -

8 9-35-10 - 25,9 ± 9,2 -

9 5-253-1 9,3± 1,4 _

10 1-98-10 - 6,7 ±4,1

II 18-65-10 - 3,3±4,1

12 2-85-1 3,3 6,7 0 -

13 24 16,7 3,3 0 0

14 2-205-1а 0 4,5 8,3 -

15 4-43-2 0 3,3 о 0

Для регенерации необходимо строгое соблюдение температурного режима — оптимум наблюдается при 20°С, при повышении температуры до 25°С и выше побегообразование снижается

Анализ срезов морфогенных структур, образовавшихся на листовых дисках (рис.5), свидетельствует о наличии двух путей регенерации Возможно образование каллусной ткани, из которой развиваются отчепиво видимые обособившиеся эмбриоидоподобные структуры В других случаях регенеранты могут развиваться непосредственно из субэпидермальных тканей без образования видимого слоя каллусных клеток, что более желательно для получения генетически однородного материала, тождественного исходным генотипам. Регенерацию увеличивает темновая прединкубация листовых дисков: после 10-дневной инкубации каллусообразование снизилось с 50% до 31.3%, в то время как органогенез возрос более чем в 3 раза

Таким образом, нами разработана эффективная система регенерации растений из листовых дисков и черешков ремонтантной малины

Рис. 5. Прямая регенерация из листовых дисков сорта Бабье лето-2 (слева)

и регенерация через каллусогенез (справа). 1 — зачаток стеблевой почки на листовом экспланте, 2 — эпидермис листового диска, 3 — субэггадермальные слои клеток, 4 - сосудистые пучки регенерантов, 5 - масса каллусных клеток, 6 - обособившиеся эмбриоподобные структуры

Доказательство генетической стабильности полученных регенерантов проведено с помощью метода ГБЗЯ-РСЯ, впервые разработанного нами для малины. Для анализа ДНК подобрано 8 праймеров, дающих наибольший полиморфизм (табл. 5). Сравнение продуктов КБЯ-РСЯ исходных образцов и регенерантов показало отсутствие генетических изменений у регенерантов.

Разработка метода генетической трансформации растений малины является следующим необходимым этапом при создании трансгенных растений.

Из 4 испытанных нами способов трансформации методом кокультивирования листовых дисков с агробактерией А. ШтеГааепэ наиболее эффективными оказались культивирование эксплантов на питательной среде под каплей ночной бактериальной культуры и на газоне ночной бактериальной культуры. Полученная при этом частота регенерации (табл. 6) является вполне достаточной для успешной работы по трансгенозу.

Регенерационная способность эксплантов снижается при культивировании с агробактерией, однако при этом также проявляются особенности генотипа (табл. 7): в то время как некоторые формы, например, сорт Геракл, сохраняют высокую способность к регенерации, у других генотипов в этих условиях она существенно падает.

Для селекции на канамицине в целях получения максимального выхода трансформантов нами разработана двухэтапная схема: на этапе регенерации

Таблица 5

Полиморфизм м е ж м и кроса г ел и ті і их последовательностей видов и сортов малины.

Общее число полос Число полиморфных полос Процент полиморфизма

1 (АСЬУА 19 21 19 24 11 16 14 19 58 76 74 79

2 (АО^Уб 18 15 11 26 15 11 9 24 83 73 82 92

3 (АС)8С 15 15 10 18 11 12 7 15 73 80 70 83

4 (Г.А)8С 27 26 20 39 24 21 19 37 89 81 95 95

5 (вАЬУС 15 14 13 22 11 9 11 20 73 64 85 91

6 (СА)8КС 16 14 15 20 12 9 18 75 64 87 90

7 (СА)8А 16 11 11 20 14 8 10 18 87,5 73 91 90

8 (АО)8УТ 12 11 15 23 9 4 И 22 75 36 73 96

Таблица 6

Влияние способа трансформации листовых дисков сорта Бабье лето-2 штаммом А. tum. E35S-L-lic b на частоту регенерации

Способ инокуляции листовых дисков агробактерией. Кол-во зеленых эксплантов через 14 суток, % Частота регенерации через 30 сут., %

Инкубация в жидкой ночной бактериальной культуре, 4 часа 31.8 ±4.2 0

Культивирование под каплей ночной бактериальной культуры • 96.0 ± 1.5 66.5 ±3.1

Культивирование на газоне ночной бактериальной культуры 97.9 ± 1.2 75.1 ±2.3

Вакуумная инфильтрация эксплантов жидкой культурой 93.8 ± 1.9 0

предлагается использовать минимальную концентрацию канамицина 3 мг/л, практически полностью подавляющую регенерацию из нетрансформированных клеток, но обеспечивающую длительную жизнеспособность эксплантов. Для селекции образовавшихся побегов эффективна концентрация 15 мг/л.

Таблица 7

Влияние кокультивирования с А.Шт. Е358-Ь-Нс Ь на регенерацию разных генотипов ремонтантной малины

Образец Регенерационная способность листовых эксплантов

Без кокультивации с агробактерией После кокультивации с агробактерией

Бабье лето-2 95.6 ± 5.3 54.0 ± 5.4

Геракл 95.0 ±7.0 81.0 ± 1.2

14-205-27 87.0 ±7.5 56.3 ± 6.5

8-79-2 72.6 ± 5.2 57.0 ± 7.2

5-253-1 9.3 ±1.5 3.9 ±1.3

2-200-20 8.0 ±1.2 0

2-205-1а 0 0

В полученных регенерантах с помощью ПЦР доказано присутствие гена прі И; чашечный тест показал наличие в растениях - регенерантах активности бактериальной термостабильной лихеназы. То есть, разработанный метод трансформации является эффективным для ремонтантной малины.

Таким образом, предложенные нами методы регенерации и генетической трансформации растений малины позволяют перейти на качественно новый уровень в селекции ремонтантной малины и создавать трансгенные формы с новыми, уникальными свойствами

Молекулярно-генетический анализ и паспортизация образцов малины проводились на основе метода ISSR-PCR с помощью праймеров, при использовании которых проявляется высокий полиморфизм амплифици-рованных фрагментов (табл 5) На основании результатов ISSR-PCR построены дендрограммы генетического родства, отражающие взаимосвязь 15 ремонтантных сортов, 12 сортов с обычным типом плодоношения и 5 видов малины Rubus idaeus L («Новость Кузьмина»), Rubus crataegifohus Bunge, Rubus odoratus L , Rubus occidentals L и Rubus arcticus bfellarcticus G Lars son ("Sofia" из коллекции ВИРа) Эти дендрограммы могут быть использованы в селекционном процессе.

По дендрограммам, построенным при применении праймеров (GA)gYC, (CA)8RC, (CA)gA, (CA)sG, выявляется присутствие фрагментов ДНК диких видов в геномах сортов современной селекции, что отражает их участие в создании этих сортов При использовании праймера (AC)gYA получено четкое разделение исследованных образцов на 2 группы ремонтантных сортов и гибридов и сортов с обычным типом плодоношения

Наиболее информативным ампликонам с частотой встречаемости 0,4 - 0,6 были присвоены буквенные обозначения, и на их основе составлены генетические «формулы» сортов малины. Они оказались уникальными для всех изученных сортов малины Такие «паспорта» полезны для идентификации сортов и контроля сортовой чистоты

Разработка модельных систем для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов на разных этапах онтогенеза растений люпина желтого Модельные системы на основе изолированных органов растений позволяют подробно охарактеризовать отдельные физиологические процессы и вычленить воздействие на них различных факторов Среди них особенно важно изучение регуляторного действия фитогормонов, в том числе на молекулярном уровне, вплоть до регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ

Нами были разработаны модельные системы для исследования гормональной регуляции процессов, происходящих на этапах созревания и прорастания семян люпина желтого Модельная система на основе культивируемых in vitro изолированных зародышей незрелых семян использована для изучения основных физиологических процессов, происходящих при созревании, и их гормональной регуляции Система на основе изолированных семядолей проростков позволила исследовать

молекулярные механизмы действия цитокининов и абсцизовой кислоты на этапе прорастания и формирования фотосинтетического аппарата

Разработка модельной системы на основе незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro Модельная система для изучения механизма действия фитогормонов, их влияния на рост и развитие зародышей разного возраста, экспрессию отдельных генов и генетических программ была разработана нами на основе незрелых зародышей люпина культивируемых m vitro

Для разработки этой модельной системы нами были исследованы основные процессы, происходящие в созревающих семенах люпина - рост шродышей и накопление в них запасных балков При этом изучены динамика роста, биосинтеза запасных белков и содержания фитогормонов - абсцизовой кислоты, ИУК, цитокининов Показано, что масса зародыша резко возрастает после наступления сердцевидной фазы развития С помощью методов иммуноэлектрофореза по Грабар-Уильяме и электрофореза в диссоциирующих условиях выявлено, что биосинтез запасных белков в нижних мутовках начинается при размере зародыша 5-55 мм, причем сначала появляется вицилин, а позже легумин (рис 6)

Рис 6 Динамика накопления запасных белков в созревающих зародышах люпина желтого

12 3456789 1 - вицилин, 2-3-35 мм, 3-4-45 мм, 4 - 5-6 мм, 5 - 6-7 мм, 6 — 7-8 мм, 7-9-12 мм, 8 - сухие семена, 9 - легумин

В период активного накопления запасных белков содержание ауксина и абсцизовой кислоты резко возрастает, что может свидетельствовать об их участии в регуляции этого процесса В то же время содержание цитокининов плавно уменьшается, что может быть связано с уменьшением активности деления клеток зародыша

При культивировании in vitro на низкоосмотической безгормональной среде развитие изолированных незрелых зародышей зависит от их размера при

итШ

исходном размере 2.0 - 3.5 мм и более 8-9 мм они прорастают в течение 5 дней. При размере 4-7 мм в этих условиях зародыши не прорастают (рис. 7).

Полученные нами данные позволили выбрать в качестве физиологической модели для изучения гормональной регуляции процессов созревания и прорастания зародыши с исходным размером 4-4.5 мм и массой 11-13 мг. В них еще не начался биосинтез запасных белков, они не способны к прорастанию на безгормональной среде в течение 5 дней, уровень эндогенной АБК в них составляет 1.0 мкг/г сырой массы.

Гормональная регуляция процессов, происходящих при созревании семян люпина желтого. При изучении влияния фитогормонов разных классов на рост зародышей в культуре in vitro и накопление в них запасных белков выявлено, что АБК на этом этапе онтогенеза имеет стимулирующую функцию, активируя оба процесса. Действие этого гормона описывается типичной для физиологически активных веществ концентрационной кривой с наличием оптимума и области супероптимальных ингибирующих концентраций (рис. 8).

^«Мй /• -68 ГО

68 kD Рис. 8. Влияние АБК на биосинтез

58 ГО

запасных белков в созревающих зародышах

45kD 1 -контроль; 2-АБК,0.1 мг/л;

25 ГО

3 -0.4 мг/л; 4-.1.0 мг/л; 5-2.5 мг/л; 6 - 10.0 мг/л.

1 2 3 4 5 6

ИУК, 6-БАП и ПС увеличивают массу зародыша, но не стимулируют биосинтез запасных белков в отсутствие АБК Более того, композиция гормонов-стимуляторов ингибирует биосинтез запасных бетаов по сравнению с контролем Совместное действие АБК с этими гормонами вызывает резкое увеличение накопления запасных белков, особенно в варианте АБК ИУК, в котором моделируется гормональный фон, на котором происходит биосинтез запасных белков in vivo

Полученные результаты свидетечьствуют о синергическом взаимодействии фитогормонов в регуляции процесса синтеза запасных бет ков при созревании семян При этом АБК играет роль индуктора экспрессии генов запасных белков, а остальные гормоны способствуют этому процессу, стимулируя, но не вызывая биосинтез запасных белков То есть абсцизовая кислота, являющаяся ингибитором роста и развития растении, при созревании семян имеет стимулирующую функцию, индуцируя биосинтез запасных белков и способствуя увеличению биомассы зародышей

Однако ингибиторная функция АБК также продемонстрирована на модели изолированных зародышей in vitro - гормон препятствует их прорастанию (рис 9) При культивировании зародышей исходного размера 3 5-4 0 мм показано, что ГК и ИУК вызывают рост зародышевой оси, а АБК ингибирует прорастание, и ее действие тем выше, чем выше концентрация гормона

Таким образом, на модели изолированных зародышей люпина в культуре in vitro показана особая роль АБК при созревании именно этот гормон индуцирует экспрессию генов запасных белков и блокирует преждевременное прорастание незрелых зародышей, то есть АБК является триггером программ прорастания и созревания семян Гормоны стимулирующего действия являются антагонистами АБК при прорастании и синергистами — в процессах накопления запасных белков и увеличения биомассы зародыша

Рис 9. Влияние фитогормонов на рост и прорастание зародышей размером 3 5 -40 мм

Модельная система на основе изолированных семядолей проростков люпина желтого. Для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов прорастания семян была разработана модельная система на основе изолированных семядолей проростков люпина. Для характеристики основных процессов, происходящих в семядолях при прорастании - роста семядолей и формирования фотосинтетического аппарата, изучена их регуляция цитокинином 6-БАП и абсцизовой кислотой.

Показано, что изолированные семядоли очень чувствительны к цитоки-нинам, которые стимулируют их позеленение и рост. Компетентность семядолей к восприятию гормонов и оптимальная действующая концентрация 6-БАП зависят от возраста проростков. Установлено, что максимальная отзывчивость семядолей на 6-БАП по накоплению хлорофилла наблюдается у проростков 5-дневного возраста. На этих семядолях была снята концентрационная кривая действия 6-БАП и для проведения опытов выбрана концентрация 5x10"5 М.

АБК подавляет рост семядолей и накопления в них хлорофилла (рис. 10). Наибольшую чувствительность к АБК проявляют проростки в начале прорастания.

100,00

с; 90,00

X 80,00

■в-

о 70,00

О. ь. §1 О £ «0,00

50,00

* * 40,00

а * 30,00

а. 20,00

Ч 10,00

о 0.00

Рис. 10. Влияние 6-БАП и АБК на позеленение семядолей люпина 5-дневного возраста.

> 24 30 48

Время освещения, час

На этапе прорастания водный дефицит вызывает резкое накопление АБК в тканях, особенно в семядолях 5-дневных проростков (табл. 8). Физиологическое значение быстрого накопления абсцизовой кислоты при водном стрессе заключается в том, что высокая концентрация АБК замедляет метаболитические процессы в семядолях, предохраняя проростки от повреждений. Особенно высока чувствительность тканей к АБК в первые дни прорастания, позже она снижается. Поэтому для замедления метаболитических процессов при воздействии стрессорного фактора (водного дефицита) в первые сутки прорастания требуется сравнительно низкий уровень гормона. Для

ингибирования метаболитических процессов в проростках большего возраста требуется гораздо более высокое содержание АБК

Таблица 8

Влияние водного дефицита на накопление АБК в семядолях люпина разного возраста

Возраст

Содержание АБК (нг/г сырой массы)

семядолей Контроль Водный дефицит

(сутки) 3 часа 24 часа

1 172*49 12 8 ± 5 5 54 0± 5 9

з 34 6 ± 9 5 107.4 ± 15 8 511 4± 1255

5 21 6 ±8 4 92 4 ± 58 9 862 4 ±212 0

Таким образом, на физиологической модели этиолированных изолированных семядолей люпина разного возраста, культивированных in vitro, показано действие фитогормонов - антагонистов 6-БАП и АБК на процессы накопления биомассы и позеленения семядолей, изучены концентрационные кривые их действия, выяснен возраст семядолей, в котором их компетентность к восприятию гормонов является максимальной Показано также быстрое накопление АБК при водном дефиците, которое зависит от возраста семядолей

Возможность применения разработанных модельных систем для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов, протекающих при созревании и прорастании семян, показана в следующих опытах

Инкубация семядолей 5-дневного возраста в темноте на растворах 6-БАП и АБК с последующим выделением из семядолей ядер и хроматина позволила показать влияние фитогормонов на транскрипционные процессы - оба фитогор-мона воздействуют на РНК-полимеразную активность хроматина (табл 9)

Из семядолей люпина были выделены и с помощью методов осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации, аффинной и ионообменной хроматографии частично очищены индивидуальные РНК-полимеразы I и II, были определены солевые условия, при которых проявляется максимальная активность ферментов, а также проведен ингибиторный анализ с помощью альфа-аманитина, показавший достаточно хорошее разделение двух ферментов

При этом на люпине впервые было показано, что оба фермента ассоциированы с автокиназной активностью, которая стимулируется цитокинином 6-БАП в широком диапазоне ее концентраций

При инкубации семядолей на растворах фитогормонов 6-БАП и АБК наблюдается не только воздействие гормонов на транскрипционную активность РНК-полимераз in vitro, но и изменение степени фосфорилирования ферментов

Таблица 9

Влияние фитогормонов на активность РНК-полимеразы хроматина in vitro при добавлении гормона в среду гомогенизации

Вариант Концентрация ФГ (М) Включение 14С-АМФ в РНК

Имп. / 10 мкг ДНК %

Контроль 0 631 ±21 100

6-БАП 1.34 х Ю-7 732 ± 30 116

6-БАП 4.47x10"7 1033 ± 63 164

6-БАП 1.34 х 10"6 1016±61 162

АБК 1.14x10"' 834 ± 12 132

АБК 7.60 х 10 7 647 ± 29 102

Наблюдается прямая зависимость между этими параметрами (табл. 10): 6-БАП увеличивает как степень фосфорилирования, так и активность РНК-полимераз, а АБК снижает их.

^ . Таблица 10

Влияние фитогормонов на активность транскрипции in vitro и степень фосфорилирования РНК-полимераз, выделенных . из семядолей люпина

Вариант Удельная активность Степень фосфорилир.

Имп/мин на 1 мг белка % Имп/мин на 1 мг белка %

Контроль 7490 ± 1160 100 94400 ± 150 100

6-БАП, 9 х 10~5 М 11720 ±1280 140 142000 ± 420 153

АБК, 9 х 10 75 М 6800 ± 950 91 78000 ±310 83

Таким образом, модельная система на основе изолированных семядолей люпина может применяться для изучения участия 6-БАП и АБК в регуляции начальных этапов прорастания - роста семядолей и формирования фотосинтетического аппарата, а также для исследования влияния стрессорных факторов внешней среды. При этом действие гормонов может исследоваться на уровне регуляции активности отдельных ферментов, а также транскрипции in vitro.

В целом можно сделать вывод, что разработанные модельные системы на основе изолированных зародышей созревающих и семядолей прорастающих семян люпина позволяют исследовать гормональную регуляция процессов созревания и прорастания, при этом изучение действия фитогормонов может проводиться на уровне регуляции экспрессии генетических программ.

Разработка методов применения регуляторов роста для повышения продуктивности растений огурца в защищенном грунте.

Применение регуляторов роста и развития растений является одним из наиболее перспективных направлений для высокорентабельных производств с высокой урожайностью возделываемых культур При выращивании огурца в защищенном фунте в современных тепличных комплексах используются интенсивные высокоэффективные технологии (Нурметов РД, 2001) Для дальнейшего повышения урожайности этой культуры требуется внедрение новых наукоемких подходов (Жученко А А , 2002), в связи с чем перспективна разработка применения регуляторов роста и развития растений Согласно литературным данным, применение фитогормонов стимулирующего действия для предпосевной обработки семян огурца не дает стабильной прибавки урожая Поэтому для активизации роста и развития растений в це гом полезными могут оказаться препараты негормональной природы общестимулирующего характера с широким спектром действия К таким веществам относятся созданные в 90-х годах экологически чистые препараты эмистим, жост-ГФ, кавказ и Краснодар-1 и ивин Это синтетические регуляторы роста различной химической природы Эмистим получен из экстракта энлофитных микоризообразующих фибков. развивающихся в межклетниках корней женьшеня, кавказ и Краснодар являются производными фурфурола Однако для >тих регуляторов роста недостаточно изучены физиологические механизмы действия на развитие растений разных культур и формирование их продуктивности Для сравнения в опыты был включен синтетический препарат ивин (производное \'-окиси лутидина), применяющийся на огурце в защищенном фунте

При разработке метода применения фиторегуляторов на огурце нами изучено их влияние на разные этапы онтогенеза прорастание семян, формирование и рост проростка, цветение и плодоношение, накопление нитратов в плодах, а гакже на устойчивость к стрессам

Исследования проводили в лабораторных условиях и в защищенном

фунте

Влияние РРР на прорастание семян огурца в лабораторных условиях В лабораторных опытах на гибридах НИИОХ-412 и Королек изучено влияние регуляторов на динамику прорастания семян, развития корневой системы, рост гипокотиля, был определен диапазон действующих концентраций Показано, что все изученные препараты стимулируют прорастание семян огурца НИИОХ-412 (табл 11), для них получены концентрационные кривые действия на этот процесс При этом установлено, что оптимумы концентраций препаратов.

ускоряющие появление корешка, замедляют появление семядолей; в то же время супероптимальные концентрации регуляторов, производя меньший эффект на развитие корешка, ускоряют появление семядолей и рост гипокотилей.

• Таблица 11

Влияние регуляторов роста растений на прорастание семян огурца НИИОХ-412 (через 55 часов) и появление семядолей (через 96 часов)

№ Вариант Проросшие семена (55 час.) Появление семядолей (96 час.)

наклюнув, семян, % Кол-во, % Кол-во, % %к контр.

1 Контроль 40.0± 2.0 100 42.016.0 100

2 Эмистим, 5 мкл/л 79.0±3.0 198 43.0+6.7 102

3 Ивин,' 1 мг/л 80.0±3.8 200 34.013.0 81

4 Ивин, 3 мг/л 87.0±2.2 218 41.012.9 98

5 Ивин, 6 мг/л 55.0±2.9 138 43.0+4.9 102

6 Эмистим + ивин 1 мг/л 89.0±2.2 223 35.013.5 83

7 Эмистим + ивин 3 мг/л 83.0±2.2 208 32.014.2 76

8 Эмистим + ивин 6 мг/л 45.0±4.5 113 49.015.8 117

9 Краснодар-1, 25 мг/л 76.0±5.0 190 37.016.0 88

10 Краснодар-1, 75 мг/л 83.0±2.2 208 41.014.8 98

11 Краснодар-1,125 мг/л 84.0+5.1 210 27.013.9 64

12 Краснодар-1, 500 мг/л 59.0±3.5 148 66.014.0 157

13 Кавказ, 10 мкл/л 84.0±3.8 210 58.019.5 114

14 Кавказ, 25 мкл/л 91.012.2 228 43.015.1 102

15 Кавказ, 50 мкл/л 70.0±3.0 175 42.012.0 100

16 Кавказ, 75 мкл/л 69.0 ±3.5 173 54.016.7 129

17 Кавказ, 100 мкл/л 70.013.0 175 63.012.2 150

Все испытанные регуляторы роста стимулируют рост корней, вызывая более раннее образование корневых волосков и формирование боковых корней. Особенно выделялись Краснодар и кавказ, стимулировавшие рост боковых корней более чем в 2 раза по сравнению с контролем.

Все регуляторы роста, кроме эмистима, изменяли морфофизиологические характеристики проростков, стимулируя более активное развитие корневой системы по сравнению с гилокотилем. Опыты, проведенные на гибриде Королек, показали аналогичные результаты. Результаты проведенных лабораторных исследований позволили выбрать наиболее эффективные

концентрации препаратов, стимулирующие прорастание семян и развитие проростков огурца для ивина - 3 мг/л, кавказа - 25 мкл/л, для Краснодара-1 -125 мг/т

Влияние РРР на рост, развитие и продуктивность огурца в защищенном фунте Для разработки метода применения РРР на огурце в защищенном грунте в опытах на гибриде НИИОХ-412 было изучено действие регуляторов роста на динамику появления всходов и развития проростков огурца, формирование лчстового аппарата раскрытие и размер семядольных и появление настоящих листьев, рост растений, цветение, образование завязей, а также продуктивность растений и содержание нитратов в плодах

Показано, что изученные препараты влияют на появление всходов и развитие проростков по-разному чмистим, ивнн и их композиции существенно ускоряют появление всходов и раскрытие семядольных листьев, а также рост семядольных и настоящих листьев по сравнению с контролем В то же время препараты Краснодар-1 и кавказ явно замедляют появление всходов и раскрытие семядолей по сравнению с контролем

Можно предположить, что в защищенном грунте змистим и ивин активизируют развитие проростка в целом, как корневой части, так и гипокотиля, чго наблюдается и в "абораторных опытах В то же время Краснодар-1 и кавказ вызывают формирование более мошной корневой системы, вызывая более активный рост и развитие боковых корней При >том рост I ипокотиля и появление семядолей на поверхности ¡амедляегся что со« ласуется с результатами, полученными в лабораторных опытах

Все использованные в опытах регуляторы роста и развития стимулируют цветение огурца (табл 12) Дифференциальный учет бутонов, цветков и завязей показал, что регуляторы способны ускорять начало плодоношения и увеличивать общее количество плодоэлементов

Согласно многолетним данным (табл 13), использованные в работе препараты увеличивали как выход ранней продукции, так и общую урожайность ивин повысил раннюю продуктивность в среднем за 3 года на 10 %, а общую отдачу ¡еленцов на 9%, но действие его нестабильно по годам Краснодар-1 и кавказ увеличили урожай ранней продукции в среднем на 1516%, общий эффект от обработки семян Краснодаром-1 был 13%, а кавказом -16%, действие по годам было стабильным Эмистим в среднем за 3 года увеличил раннюю и общую продуктивность на 7% и 9% соответственно Содержание нитратов в зеленцах находится в допустимых пределах Поскольку работа проводилась в производственных условиях, в ряде случаев растения подвергались воздействию стрессорных факторов

Таблица 12

Влияние регуляторов роста на цветение растений огурца НИИОХ-412 (опыт 1996-1997 гт.)

№ Вариант Количество на растении

бутонов цветков Молодых завязей Всего

штук % штук % штук % Штук %

1 Контроль 7.811.8 100 19.8+3.3 100 24.316.4 100 51.917.5 100

2 Эмистим, 5 мкл/л 13.8±3.1 177 23.5+2.4 119 25.011.1 103 72.315.5 139

3 Ивин, 1 мг/л 11.8±0.9 151 15.011.3 76 23.812.6 98 50.6 ±4.8 98

4 Ивин, 3 мг/л 14.013.4 190 17.011.6 86 15.814.1 65 46.819.1 90

5 Ивин, 6 мг/л 11.811.9 151 18.512.2 93 31.514.1 130 61.8 + 8.2 119

6 Эмистим + ивин, 1 мг/л 13.011.5 167 20.812.0 105 26.312.9 108 60.1 + 5.9 116

7 Эмистим + ивин, 3 мг/л 14.312.0 183 20.511.0 104 20.812.2 86 55.6 + 5.2 107

8 Краснодар-1,125 мг/л 14.511.8 186 21.811.0 110 20.512.5 84 56.815.3 109

9 Краснодар-1,250 мг/л 15.011.5 192 24.311.9 123 29.512.0 121 68.815.4 133

10 Кавказ, 25 мклУл 14.811.5 190 19.310.7 97 21.013.0 86 55.115.2 105

Таблица 13

Влияние регуляторов роста на выход продукции огурца НИИОХ-412 в защищенном грунте

Выход продукции (кг/кв м)

1 Вариант 1996-1997 гг 1998- 1999 гт 1998-1999 гт Среднее

| блок .Чаї блок №3 за 3 года

| ранняя всего ранняя всего ранняя всего ранняя| всего

I Контроль 10 9 22 4 13 5 21 3 12 0 21 8 12 1 , 21 8

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% , 100%

1 Эмистим, 12 3 24 6 13 6 22 3 13,2 24 4 13 0 23 8

5 мкл/л 113% 110% 101% 105% 110% 112% 107% 1 109%

1 Ивин, 1 мг/л 12 6 25 2 14 3 22 9 13,0 23 4 13 3 і 23 8

1 116% 113% 106% 108% 108% 107% 110% | 109%

| Ивин, 3 мг/л 13 0 25 8 123 20 3 11,5 22 1 123 j 22 7

| 119% 115% 92% 95% 96% 101% 102% | 104%

| Эмистим - 134 26 2 13 5 216 12,4 22 9 13 1 I 23 6

| ивин.1 мг/т 123% 117% 101% 102% 103% 105% 108% і 108%

1 Краснодар-1, 13 1 20 8 11,8 22 3 125 1 21 6

■ 75 г/л 97% 98% 98% 102% 98% 1 100%

1 Краснодар-1, 13 1 26 0 14 8 23 2 13,7 24 7 139 1 24 6

1 125 мг/л 120% 116% 110% 109% 114% 113% 115% 1 113%

1 Кавказ, 13 3 26 1 153 23 9 13,4 25 7 140 j —' ~

| 25 мкл/л 122% 117% 114% 112% 112% 118% 116% | 116%

1 Кавказ, 146 23 4 13,1 23 6 13 9 23 5

1 50 мкл/л 108% 110% 109% 108% 109% ! 109%

Сделанные при этом наблюдения позволили предположить наличие у изучаемых препаратов защитных свойств, противодействующих стрессу и стабилизирующих продуктивность растений огурца

Так, при воздействии на рассаду низкой положительной температуры из-за сбоев в отоплении теплицы ее развитие и начало плодоношения резко замедлились Однако к середине вегетации растения, полученные из семян, обработанных эмистимом, сравнялись по отдаче урожая с контролем, а в целом их продуктивность была даже выше

В другом стучае, вследствие задержки посева семян, обработанных регупяторами роста, в течение суток проростки испытывали кислородное голодание Опытные растения по развитию сначала существенно отставали от контроля, но к фазе цветения выровнялись с ним В конечном счете, по отдаче

урожая они были выше контроля на 16-17%, что может свидетельствовать об антистрессовом действии препаратов.

Важно также; отметить, что при применении регуляторов роста наблюдалась тенденция к снижению поражения растений болезнями.

Нами также испытывалась схема двукратного применения препаратов -обработка семян и опрыскивание вегетирующих растений перед началом цветения. Обработка растений во время вегетации была малоэффективной и почти не дала прибавки урожая.

Полученные результаты позволяют предложить для предпосевной обработки семян огурца препараты кавказ (25 мкл/л), Краснодар-1 (125 мг/л) и эмистим (5 мкл/л). Производственные опыты, проведенные на гибридах огурца НИИОХ-412, Аэлита, Королек и Московский юбилейный, показали эффективность предпосевной обработки семян препаратами эмистим и кавказ, . в них наблюдалась прибавка урожая до 22.2%.

Таким образом, нами разработан метод применения регуляторов роста при возделывании огурца в защищенном грунте и показано, что эмистим, кавказ и краснодар-1 обладают стимулирующим действием на рост, развитие и плодоношение растений этой культуры, обеспечивая существенную прибавку урожая и увеличение рентабельности производства более чем на 10%.

Выводы.

1. Разработана технология клонального микроразмножения и регенерации растений ремонтантной малины in vitro, применение которой обеспечивает ускорение создания высокопродуктивных и устойчивых сортов этой культуры. Технология оптимизирована для ремонтантных гибридов малины сложного межвидового происхождения на этапах введения эксплантов в культуру in vitro, размножения, укоренения и длительного сохранения пробирочных растений. Ее высокая эффективность основана на применении цитокининов ряда дифенилмочевины - тидиазурона и >Ц4-пиридил)-Ы-фенилмочевины; подборе эксплантов различного происхождения; возможности круглогодичного введения эксплантов в культуру in vitro; дифференцированной оптимизации условий размножения элитных сортообразцов малины.

2. Применение разработанной технологии позволяет сократить на 4 - 5 лет сроки создания сортов и гибридных образцов ремонтантной малины. За период с 1993 по 2004 годы получено, размножено и передано селекционерам более 15 тысяч растений 130 гибридных образцов. На их основе создано 8 новых сортов этой культуры.

3 Использование тидиазурона и Ы-(4-пиридил)-М-фенилмочевины обеспечило введение в культуру in vitro более 145 новых форм ремонтантной малины, а также индукцию стеблевого морфогенеза из цветковых почек, что позволило вводить материал в культуру in vitro в течение всего года

4 На этапе собственно микроразмножения m vitro для большинства ремонтантных образцов наиболее эффективным оказался препарат 6-БАП в концентрации 2 мг/л, а для трудно размножаемых форм - препараты 4-PU и TDZ в концентрациях О 4 мг/л и 0.1 мг/л, соответственно Лучшему укоренению побегов способствуют ауксины ИУК и ИМК в концентрации 0 5 - 0 75 мг/л, а для слабо укореняемых генотипов преимущество имеет обработка побегов раствором ИМК, 1 г/л с дальнейшим перенесением на безгормональную питательную среду или в песок

5 Полученные in vitro растения при выращивании их в полевых условиях имеют более высокий коэффициент вегетативного размножения и обладают повышенной продуктивностью Указанный эффект постепенно снижается в течение 4-5 лет

6 При регенерации растений из листьев, листовых дисков и листовых черешков различных генотипов m vitro стеблевой морфогенез индуцируется у всех исследованных форм в широком диапазоне - от 3 3 до 96 0% Показано, что регенерационная способность ремонтантной малины зависит от генотипа, происхождения эксплантов, концентрации используемых регуляторов роста, условий культивирования

7 Впервые для ремонтантной малины применен метод молекулярно-генетического анализа с использованием ISSR-PCR С его помощью показана генетическая однородность растений - регенерантов малины и их идентичность исходному образцу, а также проведена генетическая паспортизация и построены дендрограммы генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины

8 Для ремонтантной малины разработан метод генетической трансформации с помощью кокульгивирования листовых дисков с А tumefaciens, получены трансформированные растения с генами nptll и термостабильной бактериальной лихеназы, что доказано методом PCR и тестом на наличие лихеназной активности

9 Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого, культивируемых in vitro Эти системы могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян этой культуры

10. Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирования. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II. Показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.

11. Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых регуляторов роста: кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ,- на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта. Препараты стимулируют прорастание семян, рост, цветение и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9-17%. Наибольшую прибавку продукции, в среднем на 16% за три года, обеспечил препарат кавказ в концентрации 25 мкл/л, рентабельность в производственных опытах возросла при этом на 5.5% - 11.9%.

Практические рекомендации.

1. Разработанная технология клонального микроразмножения ремонтантных форм малины может быть применена для ускорения селекции и для производства посадочного материала новых сортов этой культуры.

2. Метод ISSR-PCR рекомендуется использовать для молекулярно-генетического анализа малины при селекции, в частности для поиска молекулярных маркеров на хозяйственно-ценные признаки, при уточнении схем селекции и для установления родства различных образцов.

3. Генетическая паспортизация с помощью ISSR-PCR позволяет различать между собой сорта малины и может быть рекомендована для оценки сортовой чистоты при производстве и внедрении новых сортов.

4. Разработанные методы регенерации и трансформации in vitro ремонтантной малины могут быть использованы в работах по созданию трансгенных форм этой культуры.

5. Модельные системы на основе семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого рекомендуются для изучения механизмов действия фитогормонов и регуляторов роста.

6. Для повышения эффективности производства огурца в защищенном грунте перспективным является использование препаратов кавказ в концентрации 25 мкл/л и краснодар-1 в концентрации 125 мг/л.

7. Полученные результаты рекомендуется использовать в учебных курсах по физиологии и биохимии растений при обучении студентов в вузах.

Список опубликованных работ

1. Нам ИЛ, Заякин В В, Кулаева О Н Изучение роли абсцизовой кислоты в процессе формирования генеративных органов люпина // Тез II Всесоюзн конф по регуляторам роста и развития растений Киев, 1988 С 267

2 Заякин В В , Нам И Я, Кулаева О Н Изучение молекулярного механизма действия цитокинина на модели изолированных семядолей люпина стимуляция цитокинином протеинкиназной активности, ассоциированной с РНК-полимеразой // Тез II Всесоюзн конф по регуляторам роста и развития растений Киев, 1988 С 222.

3 Нам ИЛ, Заякин В В. Влияние абсцизовой кислоты на развитие зародышей желтого люпина в культуре in vitro // Тез Междунар конф "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988, С 237

4 Нам И Я, Заякин В В , Кулаева О Н Динамика содержания абсцизовой кислоты в созревающих семенах желтого люпина // Физиол раст, 1989,Т 36, N6, С 1133-1139

5 Заякин В В, Нам И Я, Кулаева О Н Регуляция автокиназной активности, связанной с РНК-полимеразой люпина, - возможный механизм действия фитогормонов // Тезисы V междунар конф. по люпину Познань, 1988, С В36 (на англ языке)

6 Заякин В В, Нам И Я, Кулаева О Н. Влияние цитокинина на протеинкиназную активность, ассоциированную с РНК-полимеразой в семядолях люпина //Физиол раст , 1989, Т 36, N1.C 11-17

7 Нам И Я , Заякин В В , Шутов Г.К , Кулаева О Н Роль абсцизовой кислоты при созревании и прорастании семян люпина желтого // Тез Всесоюзн конф "Физиология семян". Душанбе, 1988, С 214-217

8 Заякин В В , Нам И Я Возможное участие протеинкиназной реакции в реализации действия цитокинина на изолированные семядоли люпина желтого // II съезд Всесоюзн общ физиол раст. Минск, 24-29 сент 1990, Тез докл , ч 2 , 1992, С 78

9 Нам ИЛ, Заякин В В Роль абсцизовой кислоты в эмбриогенезе люпина // Тез XI Междунар симп "Эмбриология и семенное размножение" Ленинград, 1990, С 108

10 Нам ИЛ, Заякин ВВ, Шутов ГК, Кулаева ОН Содержание абсцизовой кислоты и накопление запасного белка в созревающих семенах желтого люпина // Физиол и биохимия культ растений, 1990, Т 22, N 4, С 349 - 354

11. Заякин В.В., Нам И.Я. РНК полимеразы I и II и цитозольный фактор регуляции транскрипции в семядолях люпина желтого. // Физиол. раст., 1992, Т. 39, N1, С. 48-54.

12. Заякин В.В., Нам ИЛ., Кулаева О.Н. Возрастные различия в компетентности изолированных семядолей люпина к абсцизовой кислоте. // Физиол. и биох. культ, раст., 1992, Т. 24, N. 5, С. 461 - 467.

13. Нам И.Я., Заякин В.В., Кулаева О.Н." Влияние абсцизовой кислоты на рост зародышей незрелых семян люпина желтого. // Физиол. и биох. культ, раст., 1992., Т.24, N.5, С.467-472.

14. Нам И.Я., Заякин В.В. Гормональная регуляция экспрессии генов запасных белков в зародышах люпина (Lupinus luteus (L.). // Тез. II Всеросс. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993, С.86.

15. Нам ИЛ., Заякин В.В. Абсцизовая кислота как стимулятор развития и накопления запасных белков в семенах люпина желтого. // Тез. Междунар. симп. "Физиология абсцизовой кислоты". Пущино, 1993, С. 41.

16. Нам ИЛ., Заякин В.В., Казаков И.В. Совершенствование метода микроклонального размножения ремонтантной малины. // Матер, межвузовской научно-практ. конф. «Достижения науки и передовой опыт в производство и учебно-воспитательный процесс». Брянск, 1995, С. 93.

17. Нам И.Я., Заякин B.C., Шевелуха B.C. Гормональная регуляция развития семян люпина желтого (Lupinus luteus (L.). // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 100 (на англ. языке).

18. Нам И.Я., Заякин В.В. Использование метода эмбриокультуры для получения гибридов от скрещивания видов люпина с разным числом хромосом. // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 101 (на англ. языке).

19. Заякин В.В., Нам ИЛ. Экспрессия генетической программы прорастания у созревающих семян люпина желтого (Lupinus luteus (L.). // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 177 (на англ. языке).

20. Заякин В.В., Нам ИЛ, Шевелуха B.C. Фитогормональная регуляция опадения генеративных органов люпина. // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 178 (на англ. языке).

21. Миненко А.И., Нам ИЛ. Применение экологически чистого биопрепарата эмистим в условиях закрытого грунта на огурце. // Матер. Научно-метод. конф."Внедрение достижений науки и передового опыта в с/х производство и учебный процесс". Ярославль, 1996, С. 73.

22. Заякин В.В., Нам ИЛ., Шевелуха B.C. Гормональная регуляция

поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу на модельной системе люпина желтого (Ьиршиэ ІШеи.ч Ь) // Матер 4 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1997, С 124

23 Миненко А И, Заякин В В, Нам ИЛ Применение новых регуляторов роста для увеличения урожайности огурцов и томатов в закрытом грунте И Матер 4 Междунар. конф "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1997, С 251

24 Заякин В В , Нам ИЛ Фитогормоны - прямое звено в механизме регуляции опадения генеративных органов люпина желтого // Мат межвузовской научно - практ конф Брянск, 1997, С 46

25 Нам И Я , Заякин В В Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке систем трансформации // Мат межвузовской научно - практ конф Брянск, 1997, С 47.

26 Заякин В В, Нам ИЛ Экспрессия гена синтетазы 1 -аминоциклопропанкарбоновой кислоты в цветках люпина перед цветением // Тезисы 3 ежегодного симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" Москва, 1997, С. 127

27 Вовк В В , Нам И Я , Казаков И В , Заякин В В Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции ремонтантных форм малины //Мичуринское чтение Мичуринск, 1997, С 78.

28 Вовк В В , Заякин В В , Нам И Я, Казаков И В Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке систем трансформации // Матер научно-практической конференции агрофака БГСХА, 1997, С 145

29 Миненко А И, Нам И Я Применение экологически чистого биопрепарата эмистим в условиях закрытого грунта на огурце П Матер научно-практической конференции агрофака БГСХА, 1997, С 114

30 В В Заякин, И Я Нам Стимуляция абсцизовой кислотой поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу люпина (Ьиріпив Іщеив (Ь ) // Физиол раст, 1998, Т 45, N 1, С 100 - 107

31 Нам ИЯ, Заякин ВВ. Установление первичной структуры фрагментов одного из генов АЦК-синтазы желтого люпина, кодируемой олигогенным семейством // Сборник трудов агрон фак БГСХА, 1998. С 73

32 Нам И Я, Заякин В В , Вовк В В , ИЛ, Казаков И В Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции межвидовых ремонтантных форм малины // С/х биология, 1998, № 3, С 51-56

33 Нам И Я , Заякин В В , Заякина О В , Шевелуха В С Изучение

гормональной регуляции опадения плодоэлементов на модельных системах на основе соцветия люпина желтого. // конф."Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". Брянск, 1999, С. 343-347.

34. Нам ИЛ., Заякин В.В., Шевелуха B.C. Трансгенные растения - путь к экологически чистым технологиям XXI века. Подходы к созданию высокопродуктивных трансгенных форм люпина желтого (Lupinus luteus (L.). конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 340 - 343.

35. Заякин В .В., Вовк В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. Повышение эффективности клонального микроразмножения ремонтантной малины при использовании цитокининов ряда дифенилмбчевины. // конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 304-308.

36. Миненко А.И., Ковалев В.М., В.В. Заякин, Нам ИЛ. Влияние новых экологически чистых регуляторов роста на рост, развитие и продуктивность растений огурца в условиях закрытого грунта. // конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 336 - 340.

37. Нам И.Я., Заякин В.В., Заякина О.В., Шевелуха B.C. Применение упрощенных модельных систем на основе мутовчатого соцветия желтого люпина для изучения роли отдельных фитогормонов в регуляции опадения плодоэлементов. // 5 Междунар. конф. по регуляторам роста и разв. растений. Москва, 1999, С. 55.

38. Нам И.Я., Заякина О.В., Заякин В.В., Шевелуха B.C. Использование в модельных опытах глифосата как ингибитора биосинтеза ауксина в растениях. // Матер. IV съезда ВОФР. Москва, 1999, С. 649.

39. Нам И.Я., Заякин В.В., Шевелуха B.C.. Гормональная регуляция опадения генеративных органов люпина. // Матер. IV съезда ВОФР. 1999, С. 648.

40. Миненко А.И., Заякин В.В., Нам ИЛ., Ковалев В.М. Повышение урожайности огурца в защищенном грунте с помощью новых регуляторов роста растений. // 5 междунар. конф. по РРР. Москва, 1999, С. 217-218.

41. Нам И.Я., Вовк В.В., Казаков И.В., Заякин В.В. Использование цитокининов ряда дифенилмочевины при микроклональном размножении ремонтантной малины.//С/х биология, 1999, №5, С.52-56.

42. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В., Казаков И.В. Применение методов биотехнологии для ускорения селекции ремонтантной малины. // Сельскохоз. биотехнология. Избранные работы под ред. Шевелухи B.C. Т. 1, Москва, 2000, С.79-88

43. Заякин В.В., Нам ИЛ. Опадение органов плодоношения люпина

желтого как проявление интегральной системы регуляции развития растения // Всерос конф «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000, С. 11-15

44 Нам ИЛ , Заякин В В Специфическая индукция экспрессии генов АЦК-синтаз у разных видов растений // Всерос конф «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000, С. 15 - 19

45 Кравченко Д В , Антошкин А А , Миненко А И , Нам ИЛ Влияние регуляторов роста растений на развитие проростков томата и огурца // Всерос конф «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000, С 47-50

46 Сковородников Д Н , Бъядовский И А , Заякин В В , Нам И Я Изучение влияния ТГ)7, и темноты на регенерацию растений из листовых •жсплантоп межвидового ремонтантного сорта малины Бабье лето — 2 / Матер мждунар научно-практ конф «Биотехнология — возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» С-Петербург, 2001, С 68-71.

47 Соболева А Г, Соболев В В , Заякин В В , Нам И Я Подходы к разработке метода трансформации ремонтантных форм малины через листовые экспланты // Матер междунар научно-практ конф «Биотехнология -возрождению сечьского хозяйства России в XXI веке» С -Петербург, 2001, С 72-74

48 Соболев В В , Заякин В В , Нам ИЛ Молекулярное маркирование видов, сортов и гибридов малины с помощью микросатетлитных повторов // Матер междунар научно-практ. конф «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» Брянск, 2002, С 57-58

49 Соболева А Г , Соболев В В , Заякин В В , Нам И Я Разработка метода создания трансгенных растений ремонтантной малины // Матер междунар научно-практ. конфер «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» Брянск, 2002, С 56-57

50 Сковородников Д Н, Соболева А Г, Нам И Я Использование биотехнологических подходов в селекции ремонтантных форм малины // Матер междунар научно-практ конфер «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии» Брянск, 2002, С 55-56

51 Нам И Я, Миненко А И Применение новых экологически чистых регутяторов роста в технологии производства огурца в защищенном фунте // Тез конф «Физиол раст и экология на рубеже веков» Ярославль, 2003, С 114

52. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В.В., Нам И. Я. Влияние разных факторов на регенерацию ремонтантной малины из листовых эксплантов // Тез. конф. «Физиол. раст. и экология на рубеже веков». Ярославль, 2003, С. 51.

53. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты. // Материалы II международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений». Харьков, 2003, С. 89-90.

54. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Регенерация и трансформация ремонтантной малины. // Материалы V съезда общества физиологов растений России «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 524.

55. Сковородников Д.Н., Заякин В.В., Нам И.Я. Клональное микроразмножение и длительное хранение in vitro ремонтантной малины. // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 525.

56. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И .Я. Характеристика полиморфизма межвидовых ремонтантных гибридных форм малины по физиологическим признакам и ISSR-PCR молекулярным маркерам. // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 526.

57. Миненко А.И., Мищенко В.О., Нам И.Я. Влияние новых экологически чистых регуляторов роста на развитие огурца. // Материалы V съезда общества физиологов растений России «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 314.

58. Нам И.Я., Заякин В.В. Влияние цитокининов ряда дифенилмочевины на дедифференциацию цветковых почек ремонтантной малины. // Материалы Междунар. симпозиума по физиологии растений "Размножение растений -2002". Пенсильвания, США, 2002, С. 26 (на англ. языке)

59. Сковородников Д.Н., Заякин В.В., Нам ИЛ., Казаков И.В. Особенности начального этапа клонального микроразмножения ремонтантных форм малины in vitro. // Сельскохоз. биол., 2004, Т. 3, С. 109-114.

Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту акад РАСХН, профессору, доктору биологических наук Шенелухе Виктору Степановичу за помошь, поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы Автор выражает глубокую благодарность профессору, д б н Заякину Владимиру Васильевичу за многолетнее творческое содружество, понимание и всестороннюю помощь в работе, чл -корр РАСХН, профессору, д с -х н Казакову Ивану Васильевичу за интерес к работе и участие в обсуждении полученных результатов, д б н Голденковой Ирине Васильевне, д с -ч н Высоцкому Валерию Александровичу и кбн Ралдугнной Галине Николаевне за консуи.тации и методическую помощь в работе, сотрудникам кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К А Тимирязева за поддержку и неизменно дружеское отношение Автор благодарит сотрудников и аспирантов таборатории биотехнологии Брянской ГСХА за интерес и добросовестное отношение к работе

Объем 2 75 п 1

Зак 262

Издательство МСХА 1275^0, Москва, y i Тимирязевская, 44

Тир 10Q экз

Информация о работе

Нам, Ирина Ян-гуковна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы