Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа"

005014154

На гтавзоГрукописй

РАЙКОВ Игорь Александрович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ МЕЖВИДОВЫХ ФОРМ СМОРОДИНЫ ЧЁРНОЙ И МАЛИНЫ РЕМОНТАНТНОГО ТИПА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

15 мдр та

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Брянск-2012

005014154

Работа выполнена в 2009-2012 годах в Научно-образовательном центре биотехнологии ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия».

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, академик

РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор |Казаков Иван Васильевич

доктор сельскохозяйственных наук Евдокименко Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук

Канышша Майна Владимировна

кандидат сельскохозяйственных наук Андронов Виктор Иванович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции плодовых культур

Защита состоится « 23 » марта 2012 г. в 14- часов на заседании диссертационного совета Д 220.G05.01 при ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 243365, с. Кокино, Выгоничского района, Брянской области, ул. Советская 2а, учебный корпус № 4, конференц-зал. E-mail :torikov@bgsha.com, факс (8-483-41) 24-721

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Брянской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан «21» февраля 2013Lr. и размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ http: // mon.gov.ru и www.bgsha.com

Просим принять участие в работе совета или прислать свой отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор с.-х. наук, профессор

Дронов A.B.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. В условиях ухудшения климата, участившихся вспышек развития грибных болезней и вредителей, возросших требований к качеству продукции растениеводства возникает острая необходимость в проведении масштабной селекционной работы с целью создания сортов, отвечающих современным требованиям.

Создание ягодных растений очень длительный и сложный процесс. От начала селекционной работы до внедрения нового сорта в производство может пройти несколько десятилетий. Период от гибридизации до передачи сорта в государственное сортоиспытание у ягодных культур длится 10-15 и более лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю. Ещё более длительным оказывается путь создания сортов с использованием межвидовой гибридизации, которые нередко имеют трудности с размножением.

В случае клонального микроразмножения появляется уникальная возможность быстро тиражировать даже растения, плохо размножающиеся традиционными способами, создавать «банк» ценных генотипов. Этот метод позволяет полнее всего реализовать потенциал растительного организма к размножению.

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП и кафедре плодоовощеводства Брянской госсельхозакадемии ведется активная работа по созданию новых высокопродуктивных сортов ягодных культур. Наши исследования являются составной частью этой работы.

Цель исследований - провести оптимизацию методов клонального микроразмножения межвидовых форм смородины черной и малины ремонтантной в соответствии с их генотипическими особенностями.

Решались следующие задачи:

1. Оценить действия цитокининов различной природы на пролиферацию микропобегов из первичных эксплантов смородины чёрной при введение в культуру in vitro.

2. Оптимизировать условия клонального микроразмножения применительно к генотипическим особенностям межвидовых сортов и элитных форм растений смородины чёрной

3. Изучить влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины ремонтантной в культуре in vitro.

4. Оптимизировать процессы ризогенеза и адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям выращивания.

Научная новизна и практическая значимость. Определены оптимальные концентрации регуляторов роста при клональном микроразмножении растений смородины чёрной, доказана эффективность производных дифенилмоче-вины при введении в культуру первичных эксплантов. Изучено влияния минерального состава и кислотности питательной среды на процессы пролиферации побегов малины ремонтантной. Оптимизированы условия культивирования и адаптации растений к не стерильным условиям выращивания.

Усовершенствованная методика клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа позволяет быстро ти-

ражировать их для использования в селекционной программе Кокинского опорного пункта ВСТИСП и кафедре плодоовощеводства Брянской госселвхозакаде-мии, а так же в производстве.

Положения выносимые на защиту.

• Оптимизированные концентрации регуляторов роста на этапе введения в культуру in vitro смородины чёрной.

• Минеральный состав питательных сред при введении в культуру in vitro растений ремонтантной малины. - "

• Ускорение процессов ризогенеза и адаптации растений к нестерильным условиям.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на заседаниях кафедры плодоовощеводства, технологии хранения и переработки продукции растениеводства Брянской госсельхозакадемии, а также на научных конференциях: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Рязань, 2009); VI, VII, VIII Международных научных конференциях «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2009, 2010, 2011); Всероссийском инновационном форуме аграрной молодежи (Орел, 2010); Международной научной конференции «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск, 2010); Международных научно-практических конференциях «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология» (Брянск, 2010); «Пути повышения устойчивости растениеводства к негативным природным и техногенным воздействиям» (Орел. 2011); "Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве" (Москва, 2011). Научных чтениях посвященным выдающимся ученым академику Николаю Ивановичу Вавилову и селекционеру Константину Ивановичу Саввичсву (Брянск, 2011).

Результаты исследований были отмечены дипломами победителя Всероссийского конкурса научных работ студентов, аспирантов и молодых учёных аграрных вузов (Брянск, 2010, Краснодар, 2010, Курск, 2011, Орел, 2011), а также поддержаны грантами: «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») в 2009 г. и «Молодые новаторы аграрной России» по номинации «Агрономия» 2010 г.

Личное участие автора в получении научных результатов. Научные результаты, изложенные в диссертации, получены соискателем самостоятельно. Участвовал в разработке программы исследований, выборе методов ее выполнения, подборе исходного материала, обсуждении результатов исследований.

Публикации/ По теме диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе две в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и рекомендаций для производства селекции. Работа содержит 22 таблицы и 27 рисунков. Список использованной литературы включает 163 наименований, в том числе 52 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

В первой главе проведен анализ зарубежной и отечественной литературы по вопросам, касающимся применения биотехнологических методов в селекционном процессе плодово-ягодных культур.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Работа проводилась в 2009-2012 годах в научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА. Объектами исследований являлись сортообразцы смородины чёрной и малины ремонтантной сложного межвидового происхождения, которые отличались большим генотипическим разнообразием. Формы смородины чёрной были получены с использованием потомков сибирского и европейского подвидов смородины чёрной, смородины дикуши, клейкой и уссурийской; сорта малины ремонтантной с участием малины европейской красной, американской щетинистой, чёрной, душистой, боярышниколистной, замечательной и поленики (Евдокименко, 2009, Сазонов, 2011). Эксперименты проводились в соответствии с общепринятыми методиками (Бутенко, 1964; Жуков, 1994; Тюленев, 1996; Джигадло, 2005; Муратова, 2008; Савельев,2009).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Введение в культуру in vitro смородины чёрной

Успех работы по размножению растений методом культуры тканей во многом зависит от реакции первичных эксплантов, а в последующем и микрорастений на применяемые регуляторы роста. Наолюдения, проводимые за мир-фобиологическим состоянием первичных эксплантов позволили определить их реакцию на различные регуляторы роста.

Показатель инфицированности первичных эксплантов был относительно низким. Необходимо отметить, что при весеннем введении в культуру in vitro эксплантов смородины чёрной их контаминация патогенной микрофлорой была все же выше, чем при осеннем введении. Мы полагаем, это связано с морфо-биологическим различием состояния почек растений в различные периоды времени года. Так при осеннем введении почки были значительно крупнее по размеру, имели защитные почечные чешуи, которые при весенней закладке опыта отсутствовали.

Наблюдения, проводимые, за состоянием первичных эксплантов с целью изучения эффективности применения регуляторов роста различной природы на этапе введения в культуру in vitro растений смородины сорта Стрелец позволили установить оптимальные концентрации различных веществ, проявляющих цитокининовую активность.

Через неделю после изолирования меристем было отмечено увеличение размера большинства эксплантов, однако некоторая часть из них не тронулась в рост и погибла. Наибольшие выпады растительного материала наблюдались в вариантах с использованием цитокинина 6-БАП, а наименьшие - с применением CPPU в различных концентрациях.

В дальнейшем рост и развитие растений из меристем в зависимости от варианта опыта происходили по-разному (табл. 1). В контрольном варианте без применения регуляторов роста, несколько увеличенные в размерах меристемы, со временем погибали.

Показатель приживаемости эксплантов, который учитывали после месяца культивирования, был существенно выше в вариантах с использованием СРРи во всех концентрациях (0,2, 0,5 и 1 мг/л) и ТОХ в концентрациях 0,1 и 0,2 мг/л. Среди изученных концентраций 6-БАП оптимальной оказалась 0,5 мг/л - приживаемость эксплантов составила 33,3%. Однако эффективность его применения была в несколько раз ниже, чем в лучших вариантах с добавлением СРРи. В зависимости от изучаемого цитокинина регенерировавшие растения отличались также и по размеру. Как и по предыдущему показателю, наибольшим размером характеризовались растения, культивируемые на средах с добавлением цитокининов ряда дифенилмочевины, из которых преобладали регенераты, полученные с использованием СРРи. Размер растений в вариантах с цитокини-ном 6-БАП составил 4,6 мм, Тйг- 6,7 мм, а СРРи- 8,8 мм.

Таблица 1 - Некоторые морфобиологические особенности первичных _ эксплантов растений смородины чёрной _

Вариант Количество не тронувшихся в рост эксплантов, шт. Приживаемость эксплантов, % Размер эксплантов после 1 месяца культивировании, мм

Без гормонов 14,8±3,7 14,8±7,2 2,8±0,1

6-БАП 0,2 мг/л 32,2±5,4 22,0±7,7 3,9±0,2

6-БАП 0,5 мг/л 37,1±21.8 33,3±11,7 3,7±0,4

6-ЬАП 1 мг/л 22,3±11,1 29,1±5,5 4,6±0,4

ТШ 0,05 мг/л 26,8±3,3 3,7±3,7 4,3±0,1

'ШZ 0,1 мг/л 34.4±8.7 36,5+5,9 — 5Д±0 2

Ш/. 0,2 мг/л 20±5.8 63,3±6,7 6 7±1 0

СРРи 0,2 мг/л 11,1±0 81,5±3,7 8,4±0,6

СРРи 0,5 мг/л 3,3±3,3 71,7±1,6 8,4±0.8

СРРи 1 мг/л 10±5,8 83,3±3,3 7Д±0,2

При оценке форм выращенных на средах с ТШ и СРРи было отмечено, что тидиазурон у многих растений вызывает эффект гипероводненности тканей^ что может привести к гибели полученного материала при пересадке его на новую среду для размножения. СРРи в этой связи оказывал более «мягкое» действие на растительные ткани.

Оценивая воздействие 6-БАП на пролиферацию растений смородины не- ' обходимо отметить их низкий регенерационный потенциал.

В процессе изучения воздействия тидиазурона на пролиферацию побегов из первичных эксплантов смородины чёрной отмечена его большая эффективность в сравнении с 6-бензиламинопурином. Оптимальной концентрацией по изучаемым показателям оказалась 0,2 мг/л. Однако регенеранты имели морфобиологические нарушения, проявляющиеся в виде четко выраженной гипероводненности тканей и непропорциональности роста отдельных органов и тканей растений. Происходит не регенерация, а изростание эксплантов, которые через непродолжительное время погибают.

Исходя из вышесказанного целесообразнее применение тидиазурона в

концентрации 0,1 мг/л. Растения при такой концентрации имеют более типичный габитус и обладают большим жизненным потенциалом, чем растения, регенерировавшие при концентрации TDZ 0,2 мг/л.

При изучении влияния CPPU на пролиферацию побегов смородины чёрной, было отмечено более мягкое воздействие этого регулятора роста на развитие эксплантов и их регенерационный потенциал. В выбранном диапазоне концентраций CPPU (0,2-1 мг/), по таким изучаемым показателям как количество тронувшихся в рост эксплантов, их приживаемость, а-также размер, все варианты характеризовались высокими значениями. Однако, при повышенных концентрациях CPPU (0,5 - 1 мг/л) у растений наблюдались морфологические нарушения, проявлявшиеся в виде утолщений и деформации органов.

Установив, что успешный результат можно получить, применяя CPPU в концентрации 0,2 мг/л, было принято решение использовать этот регулятор роста при введении в культуру in vitro 12 ценных элитных форм и сортов смородины чёрной.

При использовании CPPU в качестве регулятора роста приживаемость в среднем по генотипам составила 64,5%. Самой низкой приживаемостью обладали экспланты сортов Чародей и Стрелец, у которых этот показатель составил 12 и 17% соответственно. Абсолютной приживаемостью характеризовались экспланты элитной формы Х-10-3 (табл. 2).

Таблица 2 - Эффективность введения в культуру in vitro новых сортов и __элитных форм смородины чёрной __

Сорт, Форма Приживаемость эксплантов*, % Высота регенерантов, через 1 мес., мм Регенератов на эксплант, шт.

Чародей 12 6,33±1,5 2,08±0,5

Стрелец 17 6,17±1,9 1,171.0,4

Исток 55,6 4,88±1,7 i,14±0,4

10-38-1/01 56,8 4,90±!,7 1,90±0,7

Брянский агат 61,5 10,87±3,0 1,58±0,7

Дебрянск 65,1 8,94±3,1 1,26±0,5

Гамаюн 70 5,51±1,8 1,27±1,0

8-4-5 75 5,УЗ±2,0 1,84±0,8

39-03-1 79,6 5,32±1,3 1,20±1,0

9-36-1/02 87,1 4,48±1,6 1,59±1,1

Бармалей 94,8 7,27±6,4 1,57±1,4

Х-10-3 100 4,17±1,2 1,79±0,7

Примечания* - приживаемость представлена без учета контаминированныхэксплантов.

Для подтверждения полученных результатов и оценки воздействия рекомендованного цитокинина (СРРи 0,2 мг/л) на пролиферацию побегов из первичных эксплантов смородины чёрной в весенний период 2009 года был заложен опыт на четырёх сортообразцах. Необходимо отметить четко выраженную дифференцировку почек - все почки имели хорошо развитые цветочные зачатки, по периферии которых имелись меристематические образования.

Через 2 недели после изолирования было отмечено увеличение размера всех эксплантов. Большинство из них образовали регенеранты, которые в период учета уже были готовы к пересадке на среду размножения.

Показатель приживаемости эксплантов (табл.3), который учитывали через

2 недели, а не через месяц составил 100%. Возможно, абсолютная приживае-' мость и более интенсивный рост и развитие регенерантов обусловлены более низким содержанием в их тканях ингибиторов роста, так как почки в период выделения переходили в фазу роста.

Размер эксплантов в весеннем эксперименте через 2 недели культивирования на изучаемой концентрации CPPU 0,2 мг/л незначительно отличался от размера эксплантов в осеннем опыте при такой же концентрации, который учитывался после месяца культивирования. - -

В связи с тем, что реакции гибридов и сортов на действие регуляторов роста индивидуальна, в некоторых случаях мы предлагаем использовать градиент рекомендованной концентрации, который устанавливается эмпирически по ряду морфобиологических показателей.

Высокий выход жизнеспособных эксплантов у большинства изучаемых генотипов позволяет рекомендовать на этапе введения в культуру in vitro смородины чёрной в питательную среду вводил, цигокинин CPPU в концентрации 0,2 мг/л.

Таблица 3 - Морфобиологические особенности эксплантов смородины чёрной

при весеннем введении в культуру in vitro

Вариант Количество не тронувшихся в рост эксплантов, шт. Приживаемость эксплантов*, % Размер эксплантов после 2 недели культивировании, мм

135 0 100 8,3 ±0,3

Гамаюн 0 100 6,5±0,3

Дебрянск 0 100 8,8 ± 1,7

Исток 0 100 6,3 ± 0,8

* Без учета иш тцированпых

Влияние ИМК и ГК на регенерационный потенциал первичных эксплантов растений смородины чёрной

Применение на этапе введения в культуру in vitro первичных эксплантов смородины чёрной производных дифенилмочевины позволило увеличить выход жизнеспособных эксплантов. Однако получаемые регенеранты характеризовались наличием удлиненных и утолщенных черешков и практически полным отсутствием листовой пластинки, что снижает их приживаемость при пересадке на новую среду, а так же увеличивает период культивирования.

Для получения регенерантов, обладающих нормально развитой листовой пластинкой мы провели исследования по влиянию ИМК и гибберелловой кислоты на регенерационные процессы у первичных эксплантов при инициализаций культуры in vitro. Контролем была питательная среда, содержащая CPPU в концентрации 0,2 мг/л. В опытные варианты помимо CPPU вводили ИМК и гибберелловую кислоту в различных концентрациях. Регенеранты полученные в контрольном варианте опыта характеризовались слабым развитием листовой пластинки расположенной на непропорционально удлиненных черешках. Регенерация побегов происходила по внешней стороне почки. В центре наблюдался рост цветочных зачатков, размер которых у отдельных эксплантов превосходил размер регенерантов.

Эксплаты, культивируемые на питательной среде с добавлением ИМК в различных концентрациях, образовывали от 1,5 до 2 дополнительных побегов. При этом их размер варьировал от 3 до 6 миллиметров в зависимости от варианта опыта.

Наиболее полно реализовать свой регенерационный потенциал смогли эксплангы культивируемые на питательной среде с добавлением ИМК в концентрации 0,05 мг/л. Образованные побеги обладали хорошо сформированной листовой пластинкой. Рост и развитие цветочных зачатков был ингибирован, вследствие чего они не мешали пролиферации побегов.

Регенераты, образованные на питательных средах с добавлением ИМК r концентрации 0,01 мг/л имели более мелкие листовые пластинки. На эксплан-тах наблюдался рост цветочных зачатков, которые увеличивались в размерах и распускались, ингибируя рост побегов.

При добавление в среду ИМК в концентрации 0,005 мг/л у основании первичных эксплантов было отмечено образование каллусной ткани.

Регенерационные процессы у эксплантов смородины на питательных средах содержащих ИМК в концентрации 0,001 мг/л проходили, как и в предыдущем варианте с образованием каллусной ткани.

Сопоставив полученные результаты можно рекомендовать при введении в культуру in vitro первичных эксплантов смородины помимо CPPU вводить в состав питательной среды ИМК в концентрации 0,05 мг/л.

Экспланты культивируемые на средах с добавлением гибберелловой кислоты в различных концентрациях так же не проявляли существенных различий в количественных показателях в зависимости от варианта опьгга. В процессе регенерации из первичных эксплантов образовывалось от 1,5 до 2 дополнительных побегов на эксплант. Образовавшиеся регенераты имели размер от 4,5 до 6 миллиметров.

Существенных различий по количественным показателям у эксплантов культивируемых на средах с полной и разбавленной минеральной основой не наблюдалось.

Сравнивая регенераты, образованные при различных концентрациях ГК в питательной среде, было отмечено, что процессы роста и развития у эксплантов идут по-разному, в зависимости от концентрации гиббереллина в питательной среде.

На питательных средах с добавлением ГК в концентрации 0,5 мг/л образовывались регенераты с нормально сформированной листовой пластинкой. Листья регенерантов бьши подогнуты и характеризовались складчатым строением, как у взрослых растений.

Образованные регенераты имели розеточное строение, что затрудняло их пассирование на новую питательную среду. •

Регенераты, образованные на питательных средах содержащих гибберел-лин в концентрации 0,2 мг/л характеризовались менее развитой листовой пластинкой. Образованные растения имели непропорционально утолщенные черешки. На некоторых эксплантах можно было наблюдать незначительный рост и развитие цветочных зачатков.

При добавлении в питательную среду гиббереллина в концентрации 0,05 мг/л у эксплантов наблюдался рост и развитие цветочных зачатков, которые превосходили по размерам регенераты. Образовавшиеся побеги отличались непропорциональным ростом и утолщением отдельных органов и тканей.

Анализируя результаты проведенного эксперимента по влиянию гиббереллина на первичные экспланты растений смородины чёрной, следует отметить,

что самыми хорошими показателями роста и развития обладали регенеранты образованные на питательной среде с содержанием гиббереллина 0,5 мг/л. Растения в этом варианте обладали наиболее характерным габтусом.

Этап размножения растений смородины in vitro

Этап пролиферации в культуре in vitro заключается в получении новых растений за счет черенкования образующихся под действием цитокининов побегов. Одно субкультивирование длится в среднем 3 недели. В сравнении с традиционным способом размножения это дает методу клонального микроразмножения существенные преимущества по скорости получения новых растений.

При выращивании растений in vitro очень четко проявляются различия в регенерационной способности каждого генотипа. Иногда эта биологическая особенность является главным лимитирующим фактором при размножении ценных сортообразцов. Из представленных в исследовании элитных форм смородины выделились генотипы с низким коэффициентом размножения, например сорт Исток, который на протяжении нескольких лет демонстрировал низкую способность к пролиферации дополнительных побегов.

Морфобиологические показатели роста и развития растений смородины на этапе размножения представлены в таблице 4. Среди генотипов можно выделить представителей как с низким (Дебрянск, 39-03-1), так и высоким (Бармалей, 8-4-5,9-36-1/02) коэффициентом размножения.

Таблица 4 - Коэффициенты размножения у различных сортов

смородины черной на питательной среде с добавлением 6-БАП 1 мг/л

Генотип Коэффициент размножения Высота растений, мм

Дебрянск 1,09±0,3 5,46±2,0

Исток 4,8б±1,6

39-03-1 1,36±0.6 6,50±2.3

л-ю-З 1,53±0,7 6,24±1.8

Чародей i,55±i,l У,6б±2,8

Стрелец 1,78±0,9 5,9Ш2,4

Гамаюн 1,94±1,3 7,41 ±3,5

8-1-5 2,49±U 6,32±2,8

Брянский агат 2,8±1,5 13,72±3,3

9-36-1/02 2,80±1.5 6,22±3,1

10-38-1/01 3,5±1,2 6,1/±1,1

Бармалей 3,90±3,0 5,82±2,1

Растения смородины, культивируемые in vitro, имеют характерные особенности в сравнении с другими ягодными культурами (например, малиной). Таким отличием является формирование коротких побегов на этапе собственно размножения, при культивировании растений на питательной среде с цитоки-нинами. В наших исследованиях высота растений у изучаемых сортов не превышала одного сантиметра и варьировала от 5,8 до 7,4 миллиметров.

Междоузлия образуемых побегов были очень короткими, а иногда растения имели и вовсе розеточное строение. Некоторые исследователи при описании культур смородины in vitro используют термин «клубочки» (Пронина, 1989), который в полной мере соответствует габитусу миниатюрных растений смородины in vitro.

Малый размер растений смородины вызывает определенные технологические трудности при черенковании побегов. Кроме того, жизнеспособность таких растений всегда ниже, чем у более крупных экземпляров.

Преодоление этих биологических проблем со смородиной в культуре in vitro удалось достичь, используя в качестве дополнительного питательного компонента в среде MS витаминно-минерального комплекса «Компливит». Этот препарат в сочетании с 6-БАП в концентрации 1 мг/л вызывал увеличение коэффициента размножения и высоты у пяти испытанных генотипов (табл. 5). Растения приобретали вытянутые побеги, что давало возможность применять черенкование по междоузлиям, листья увеличивались в размере и приобретали интенсивно зеленую окраску.

Таблица 5 - Оценка влияния витаминно-минерального комплекса _«Компливит» на растения смородины черной_

Генотип Побегов на эксплант, шт Высота растений, мм

Контроль* «Компливит» Контроль «Компливит»

Брянский агат 2,8±1,5 4,2±1,6 13,7*3,3 28,0±4,5

Бармалей 3,9±2,0 4,8±2,6 5,8±2,1 15,3 ±4,8

8-4-5 3,3±1,8 8,1±2,4 3,7±1,6 10,3±2,5

Х-10-3 1,5±0,7 3,5±1,1 6,2±1,8 8,2±3,4

9-36-1/02 2,4±0,9 3,6±1,7 б,4±2,2 14,5±3,0

♦Примечание - в качестве контроля использовали среду MS в сочетании с 6-БАП 1 мг/л.

Полученные результаты свидетельствуют об имеющихся возможностях манипуляций с составом питательной среды с целью увеличения морфобиоло-гических параметров растительных культур in vitro. Однако в связи со сложным составом нельзя точно установить, какова роль комплекса витаминов и минералов в данном препарате и какое вещество является главным индуктором подобных положительных эффектов.

Для увеличения размеров растений и формирования у них более типичного габитуса, особенно перед этапом укоренения, концентрацию цитокининов в среде понижают до 0,2 мг/л, вследствие чего побеги вытягиваются.

Особенности ¡атонального микроразмножения растений смородины чёрной в зависимости от генотипа и применяемого цитокинина

Наблюдения за морфобиологическим состоянием культивируемых растений позволили определить сортоспецифическую реакцию каждого генотипа на действие различных регуляторов роста. В зависимости от изучаемого цитокинина, образовавшиеся конгломераты отличались по размеру и количеству сформированных дополнительных побегов. Самыми крупными побегами характеризовался сорт Гамаюн, у которого их высота на среде содержащей кине-тин составила 12,67 мм. Сорт Дебрянск обладал самыми мелкими регенератами. Наиболее мелкая поросль образовывалась при культивировании на среде содержащей 6-БАП, где их размер достигал 2,63 мм (табл. 6).

Выполненный дисперсионный анализ подтверждает, что размер культивируемых в условиях in vitro растений смородины чёрной определяется генотипом исходного растения и выбранным для культивирования регулятором роста. При этом наибольшим размерам обладают растения, культивируемые на среде с содержанием кинетина, а наименьшими - с добавлением 6-БАП.

Таблица 6 - Длинна побегов смородины чёрной при культивировании на средах с добавлением различных цитокининов в условиях in vitro

Гибридные формы Длинна побегов, мм

б-БАП зеагин кинегин

Гамаюн 6,93±0,85 10,23 ±0,55 12,67±1,07

3-37-2/02 3,63±0,22 б,8±0,55 12,17±0,74

Дебрянск 2,63±0,18 4,53±0,35 5,83±0,41

Оценивая Влияние регуляторов роста и генотипа растений на пролиферацию-дополнительных побегов установлено, что наибольшей активностью обладает 6-БАП. При культивировании на средах содержащих этот цитокинин на всех сортах было отмечено наиболее высокое количество вновь образовавшихся побегов. Растения, культивируемые на среде с добавлением кинетина отличались наименьшим количеством дополнительных побегов на всех изучаемых формах.

Установлено, что наиболее отзывчивым на действие регуляторов роста оказался сорт Дебрянск, который на среде с б-БАП образовывает 4 дополнительных побега, а сорт Гамаюн и элитный отбор 3-37-2/02 проявляли меньшую активность (табл.7).

Таблица 7 - Влияние различных цитокининов на пролиферацию побегов смородины чёрной в культуре in vitro

Гибридные формы Количество побегов, штук

б-БАП зеатин кинетин

Гамаюн 2,77±0,31 1,56±0,85 1,07±0,05

3-37-2/02 1,93±0,20 2,2±0,26 1,1±0,06

Дебрянск 4,03±0,44 2,13±0,21 1,07±0,05

Проведенный дисперсионный, анализ показал, что пролиферация дополнительных побегов растений смородины чёрной в условиях in vitro не определяется генотипом исходного растения и выбранным для культивирования регулятором роста. Причиной такого неожиданного результата может быть то, что каждый сортообразец по-разному реагирует на действие различных регуляторов роста в определенных концентрациях.

Известно, что для действия цитокинина необходимо присутствие ауксина. Тесное взаимодействие между цитокинином и ауксином характерно для процессов дифференцировки.

Возможно, способность растения к. пролиферации дополнительных побегов в культуре in vitro зависит от содержания эндогенных ауксинов, которые определенным образом взаимодействуют с экзогенными цитокининами и индуцируют образование дополнительных побегов.

Влияние минерального, состава питательных сред на рост и развитие растений малины в культуре in vitro

В зависимости от используемой минеральной среды, развитие первичных эксплантов малины происходило по разному, регенерировавшие растения отличались по ряду количественных и качественных показателей.

Наибольшее количество образовавшихся побегов было отмечено при культивировании первичных эксплантов малины на питательной среде по прописям Мурасиге-Скуга и Ли-Фоссарда.

Число дополнительно образовавшихся побегов на эксплант достигало 3,23,5 соответственно на каждой из перечисленных сред, минимальное число дополнительных побегов наблюдалось при культивировании апексов на среде Андерсона (табл. 8).

Таблица 8 - Развитие первичных эксплантов ремонтантной малины сорта Жар

Питательная среда Число образовавшихся побегов на эксплант, шт. Высота растений, мм

Мурасиге-Скуга 3,2±0,4 15,0±1,3

Андерсона 1,5±0,2 8,4±0,8

Ли-Фоссарда 3,5±0,5 13,9±1,6

Неодинаковыми также оказались и размеры полученных растений. Так, через месяц культивирования регенераты на питательной среде МС достигали высоты 15 мм и на среде ЛФ 13,9 мм. Самые маленькие по размеру растения были получены на среде Андерсона, высота которых составила 8,4 мм.

Качественным отличием растений выращенных на среде Ли-Фоссарда было наличие желтых, хлоротичных листьев. Эту особенность можно объяснить нехваткой железа, количество которого в среде ЛФ в 6 раз меньше чем в модифицированной среде МС.

Регенерационный потенциал растений малины проявлялся в зависимости от используемой питательной среды и на этапе собственно размножения. Так высокий коэффициент размножения был, достигнут на питательных средах, приготовленных по прописям МС и ЛФ, который составил 3 и 2,4 соответственно (табл. 9).

Таблица 9 - Морфобиологические показатели растений малины

Питательная среда Коэффициент размножения Высота растений, мм

Мурасигс-Скуга 3,0±0,3 1б,3±1Д

Андерсона 1,5±0Д 13,6±1,5

Ли-Фоссарда 2,4±0,3 16,5±2,0

Высота полученных растений на этих средах достигала 16 мм. На среде Андерсона изучаемые показатели были существенно ниже: коэффициент размножения составил 1,5 и высота растений 13,6 мм. Хлоротичность растений культивируемых на среде ЛФ сохранялась.

Минеральный состав питательной среды повлиял и на способность растений ремонтантной малины к ризогенезу, а также на ряд морфобиологических показателей, таких как длина корней и их количество, высота растений и число листьев. Так на среде МС доля укорененных растений составила 97,5%, на среде ЛФ этот показатель несущественно уступал лучшему варианту и составил 87,2%. На среде Ацдерсона корни образовались у 77,5% микрочеренков (табл. 10).

Для всех биометрических показателей, кроме длины корней в варианте МС, учитываемые показатели расположились по вариантам в следующем убывающем порядке: среда Мурасиге-Скуга, Ли-Фоссарда и Андерсона.

Полученные результаты свидетельствуют, что на рост культивируемых растений малины in vitro значительно влияет минеральный состав питательной среды.

Таблица Ю - Укореняемость микрочеренков ремонтантной малины in vitro в _зависимости от минерального состава питательной среды_

Питательная среда Укореняемость, % Длина корней, мм Количество корней, шт. Высота растений, мм Количество листьев, шт.

Мурасиге-С куга 97,5±2,3 1б,2±0,9 5,3±0,6 29,9±2,1 11,5±0,б

Андерсона 77,5±5,5 14,8±0,5 2,0±0,2 24,4±3,0 9,0±0,7

Ли-Фоссарда 87,2±10,9 19,6±1,0 4,2±0,2 26,7±2,7 9,5±1,0

Предпочтение должно отдаваться питательным средам Мурасиге-скуга и Ли-Фоссарда.

Особенности ризогенеза растений малины в песке

Укоренение растений после периода размножения является наиболее трудоемким этапом, от которого зависит успех клонального микроразмножения в целом. Для индукции ризогенеза уменьшают минеральную основу питательной среды и количество сахара, а так же исключают цитокинин и вводят ауксин.

Часто перед индукцией ризогенеза необходимо провести дополнительный пассаж элонгации на питательной среде без добавления фитогормонов. Это способствует вытягиванию растений, а так же снижению концентрации экзогенных цитокининов, которые растения накопили на этапе пролиферации побегов. При этом доля укоренившихся in vitro растений у многих сортообразцов мала.

Для увеличения выхода укоренившихся растений был проведен эксперимент по индуцированию процессов ризогенеза в песке при импульсной обработке в растворе ИМК.

Наибольшим количеством укорененных растений характеризовался вариант с концентрацией ИМК 5 мг/мл, где укоренились 67 растений. Немного хуже проходили процессы ризогенеза при обработке ИМК в концентрации 7,5 мг/мл. В этом варианте укоренилось 55 растений. Остальные варианты опыта характеризовались более низкими показателями укореняемости высаженных растений (рис, 1).

Слишком низкие или высокие концентрации ИМК не способствовали индуцированию процессов ризогенеза, в результате чего не укоренившиеся растения погибали. Сравнивая габитус полученных растений, следует отметить, что растения, обработанные ИМК в концентрациях 5 и 7,5 мг/мл отличались крупным размером и имели хорошо сформированные ярко окрашенные листовые пластинки. Растения которые были обработаны раствором ИМК в концентрации 10 мг/мл-обладали немного меньшими размерами.

Й§

у .............

...... шю........ 14

. .......* <... U —-;; ШЩ<ШШ

1 2.s & т-.з го ia,s is

кч>iitir.ii |j:<ii„ч имк, мг/мя

Рис. 1 Приживаемость растений малины сорта Евразия в песке в зависимости от концентрации ИМК в растворе для обмакивания

Самые мелкие растения были получены при обработке ИМК в концентрациях 1; 2, 5; 12,5 и 15 мг/мл. В этих вариантах листовые пластинки некоторых растений были бледно окрашены с проявлением морфобиолошческих нарушений.

Влияние кислотности питательной среды на пролиферацию дополнительных побегов малины ремонтантной

Помимо основного состава питательной среды и регуляторов роста лимитирующее воздействие на культивируемые растения оказывает концентрация ионов водорода, определяя доступность элементов питания и темпы роста культивируемых растений.

Оценивая морфобиологические показатели культивируемых растений, следует отметить, что коэффициент размножения в зависимости от варианта опыта варьировал в незначительных пределах. Наиболее высокой способностью к пролиферации дополнительных побегов обладали регенераты при культивировании на питательной среде с показателем кислотности 6,0. Худшую побегообразова-тельную способность проявляли растения, в культуральной среде которых величина рН была равна 3,5. В таблице 11 прослеживается динамика изменения коэффициента размножения растений малины в зависимости от кислотности питательной среды. Так с увеличение рН растет и коэффициент размножения. Изменения показателей в соседних вариантах в основном варьируют в пределах ошибки опыта, однако можно выделить две выраженные группы с четко наблюдаемыми различиями. Так регенераты в вариантах опыта с показателями кислотности от 3,5 до 4,5 включительно характеризуются более низким коэффициентом, чем растения, культивируемые на средах с кислотностью более 5.

Высота полученных растений изменялась в зависимости от варианта опыта. Самые копоткий гтпбрги ляпятимоапил! г» ттптг-пv л п е ..

л ' -------- " ми^пишил v 5 j и

4.0, где их размер составил немного более 3 миллиметров.

На питательных средах с показателем кислотности от 5,0 до 6,0 регенеран-ты достигли высоты более 5 миллиметров.

Таблица 11 - Морфобиологические показатели растений малины элитной формы 3-238-10 в зависимости от кислотности питательной среды

i/ т»л ^ч м г г г г. _ 1 i " ■"ii 1 г

Кислотность, рН 3,5 4,0 4,5 5,0

6,0

Коэффициент размножения I Высота растений,"мм"

2,13*0,16 3,3*0,19

2,20*0,15 1 ЗД±о!24~

2,43*0,16__5,2*0,32

2£7±0,27 ■ 5.(ШШ~

2,80*0,26 5,4*0,31"

3,30*0,21 5.3ЯЙ8~

Сравнивая растения, культивируемые при разной кислотности следует отметить, что растения, растущие на среде со значением рН менее 4,5 отличаются не только слабым ростом, но и имеют морфобиологические нарушения. Листовые пластинки у них слабо развиты и имеют хлоротичную окраску, что свидетельствует о нарушении минерального питания.

Совмещение процессов ризогенеза и адаптация растений к нестерильным условиям выращивания

Наиболее ответственным периодом при клональном микроразмножении является перевод растений из пробирок в нестерильные условия.

При этом растения, которые выращивались в асептических условиях с контролем практически всех параметров культивирования попадают под довлеющее воздействие комплекса биотических и абиотических факторов. Перенесенный стресс и слаборазвитые защитные механизмы растений могут стать причиной гибели практически всего материала. В среднем показатель гибели растений при адаптации составляет 50%. На показатель приживаемости в первую очередь оказывали влияние генотип и исходное состояние высаживаемых растений.

Для увеличения количества выживших при адаптации растений нами были проведены опыты, в результате которых было установлено, что наибольшее влияние на проявление адаптивного потенциала растений оказывает генотип культивируемых элитных форм.

Традиционная схема адаптации, когда укорененные in vitro растения высаживали в пакеты, наполненные стерильным песком является очень трудоемкой и требует постоянного контроля за влажностью песка и общим состоянием растений. Не менее важным является и подготовка песка, который используется в качестве субстрата. Песок промывали, корректировали его кислотность, а затем стерилизовали прокаливанием в сушильном шкафу. Растения, высадка которых проходила по вышеописанной схеме, несмотря на колоссальные усилия, затраченные на их адаптацию, обладали низкой приживаемостью, а также отличались ингибированием ростовых процессов и бледной окраской.

Предлагаемый метод адаптации растений в мини парниках для рассады позволяет существенно сократить затраты времени на высадку и последующий уход за растениями, а так же увеличить приживаемость до 100%.

Мини парники для рассады набивались смесью торфяного грунта и песка в соотношении 3:1. Стерилизация субстрата и корректировка кислотности не проводи-

i) , rnn.i.tnioaiitia ппмшттттл n^itm.imnn» yi nnfvkn/>n iл \ Л V Tt t'amrni« 1 и

Jtribo. uc^diluicuvlvu«^ [im-iwmu vwivlttluiatulfi £> pfiwlcu^ i ».v 1 ;v 1> ^-n^wni^au^lii^uijaiil.

Сравнивая растения, культивируемые no традиционной и предложенной схеме адаптации, следует отметить, что растения культивируемые по новой схеме через месяц после высадки были заметно крупнее, а так же имели более темную окраску. Морфометрические показатели растений, культивируемых по традиционной схеме через месяц культивирования соответствовали морфометриче-ским показателям растений в мини парниках через 2 недели культивирования.

При сравнении по нескольким генотипам выпады материала в основном не превышали 15-20%. Необходимо так же отметить что, исключая стадию культивирования в песке мы сокращаем период адаптации в среднем на 1 - 2 месяца в зависимости от генотипа. Сравнивая растения, культивируемые по традиционной и предлагаемой схеме следует отметить, что культивируемые по новой схеме в большей степени реализуют свой адаптивный потенциал. Это подтверждается наличием характерного габитуса и темной окраской листьев.

Гибель растений при адаптации к нестерильным условиям выращивания во многом обусловлена тем, что у растений культивируемых in vitro нарушена деятельность устичного аппарата вследствие чего происходит большая потеря воды растениями (Трушечкин и др., 1992).

Оценить потерю воды растениями можно по интенсивности транспирации. Основной метод определения интенсивности транспирации - весовой, основан на учете потери воды при испарении.

Для определения интенсивности транспирации мы использовали модифи-' цированный метод Л.И. Иванова (Иванова, 2003).

Интенсивность транспирации у растений in vitro составила 2823,5 мг/гчас, а через сутки после снятия крышек культуральных сосудов 2158,7 мг/гчас. Растения культивируемые в мини парниках характеризовались интенсивностью транспирации 1911,3 мг/г-час (табл. 12).

Таблица 12 - Сравнительная оценка интенсивности транспирации у растёний смородины сорта Стрелец, полученных in vitro и in vivo * '

Вариант Суммарная масса листьев, мг Потеря воды листьями через 5 мин, мг (%) Интенсивность транспирации, мг/гчас

Растения in vitro 154,7 36,4 (23,5%) 2823,5

Растения in vitro через 24 часа после снятия крышек 146,2 26,3 (18%) 2158,7

Растения в мини-пар ничках (in vivo) 205,3 32,7(15,9) 1911,3

Растения в ящиках (in vivo) 1580,9 143,6 (9,1) 1090,0

Снижение интенсивности транспирации у растений на разных этапах культивирования свидетельствует об их постепенной адаптации к влажности воздуха в культуральном помещении. Проведение поэтапной адаптации растения к условиям in vivo позволяет уменьшить стрессовую нагрузку на адаптируемые растения и как следствие увеличить выход адаптированных растений.

Анализируя результаты проведенного эксперимента можно рекомендовать проводить ризогенсз с одновременной адаптацией растений к нестерильным условиям выращивания непосредственно в субстрате.

ВЫВОДЫ

1. При культивировании растений in vitro установлено, что реакция сорто-образцов на действие регуляторов роста индивидуальна и определяется их ге-нотипическими особенностями на всех этапах клонального микроразмножения.

2. Введение в культуру in vitro первичных эксплантов смородины чёрной с применением CPPU в концентрации 0,2 мг/л увеличивает выход жизнеспособных регенерантов.

3. Культивирование первичных эксплантов целесообразно проводить на питательной среде, содержащей помимо цитокинина ауксин и гибберелловую кислоту. Положительное влияние на развитие побегов наблюдается при добавлении ИМК в концентрации 0,05 мг/л. Для гиббереллина наиболее эффективна концентрация 0,5 мг/л.

4. Положительное влияние на пролиферацию дополнительных побегов ока- ■ зывает вигаминно-минеральный комплекс «Компливит» в концентрации 2 г/л.

5. Среда Мурасиге-Скуга увеличивала показатели приживаемости первичных эксплантов, коэффициент размножения и высоту растений малины в культуре in vitro в сравнении с питательными средами Ли-Фоссарда и Андерсона.

6. Применение импульсной обработки не укорененных растений в растворе ИМК с диапазоном концентраций от 5 до 7,5 мг/мл для индукции ризогенеза позволило увеличить выход укорененных растений.

7. Культивирование растений малины целесообразно проводить на питательной среде с показателем кислотности 5,0-6,0.

8. Укоренение растений с одновременной адаптацией к нестерильным условиям культивирования целесообразно проводить в мини парниках на торфяном субстрате с добавлением песка в соотношении 1:3.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ

1. При введении первичных эксплантов смородины черной использовать CPPU в концентрации 0,2 мг/л. Для увеличения выхода жизнеспособных эксплантов помимо CPPU вводить в состав питательной среды ИМК в концентрации 0,05 мг/л.

2. Культивирование растений малины ремонтантной проводить на питательной среде MS. Показатель кислотности питательной среды может варьировать от 5 до 6.

3. Проводить укоренение пробирочных растений путем их обмакивания в растворе ИМК с концентрацией 5-7,5 мг/мл с последующей высадкой в питательный субстрат.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Сковородников Д. Н. Некоторые аспекты использования цитокининов различной природы на этапе введения в культуру in vitro эксплантов смородины чёрной / Сковородников Д.Н., Райков И.Л. //Плодоводство и ягодоводство России Сборник научных работ. T.XXII. -4.2 - 2009. - С. 292-296.

2. Райков И.А. Особенности клепального микроразмножения растений смородины чёрной в зависимости от генотипа и применяемого цитокшгина / Райков И.А. // Плодоводство и ягодоводство России. Сборник научных работ. Т.XXVI. -2011. - С. 368-374.

В сборниках научных трудов:

3. Райков И.А. Сравнительная оценка эффективности цитокининов различной природы на этапе введения в культуру in vitro/ Райков И.А., Сковородников Д.Н. // Материалы VI Международной научной конференции «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК». Брянск. 2009. - С. 206-208.

4. Райков И.А. Особенности реакции первичных эксплантов растений смородины чёрной на регуляторы роста цитокининовой природы / Райков И.А., Сковородников Д.Н., Сазонов Ф.Ф. // Материалы Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в питомниководстве»:, нос. Самохваловичи, 15 июня - 31 июля 2009 г. / РУП «Ин-т плодоводства»; ред-кол.: В.А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. - Самохваловичи, Беларусь, 2009. - С. 23-27.

5. Райков И.А. Использование фитогормонов цитокининовой и ауксиновой природы в культуре in vitro и ex vitro при размножении ценных сортов ремонтантной малины / Райков И.А. //Приоритетные направления современной российской науки глазами молодых ученых: Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов, 4-6 ноября 2009 г. - Рязань, 2009. - С. 27-30.

6. Райков И.А. Андроклиния ремонтных форм малины / Райков И.А., Сковородников Д.Н. // Материалы VII Международной научной конференции «Агро-экологические аспекты устойчивого развития АПК». Брянск. 2010. - С. 10S-111.

7 Райков И.А. Оптимизация размножения смородины чёрной в условиях in vitro / Райков И.А., Сковородников Д.Н., Сазонов Ф.Ф. // Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России», посвященный 30-летию Брянской ГСХА и 70-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, д. с.-х. наук, проф. В.Ф. Мальцева/Брянск: Изд-во БГСХА, 2010. -С. 314-319.

8. Сковородников Д.Н. Опыт использования клонального микроразмножения смородины чёрной в селекционном процессе / Сковородников Д.Н, Сазонов Ф.Ф., Райков И.А. И Интенсификация плодоводства Беларуси: традиции, достижения, перспективы: материалы междунар. науч. конф., пос. Самохваловичи, 1 сентября - 1 октября 2010 г. /РУП "Ин-т плодоводства"; ред. кол.: В.А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. - Самохваловичи, 2010. С. 128-131.

9. Райков И.А. Адаптация растений rubus и ribes к среде для пролиферации дополнительных побегов при смене гормонального фактора в культуре in vitro / Райков И.А. // Материалы Международной научно-практической конференции «Пути повышения устойчивости растениеводства к негативным природным и техногенным воздействиям». Орёл. 2011. - С. 281-283.

10. Райков И.А. Каллусогенез в культуре пыльниковремонтантных форм малины / Райков И.А. // Материалы Международной научно-практической конференции «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология». Брянск. 2010. - С. 98-102.

11. Райков И.А. Адаптация растений ремонтантной малины после культивирования в условиях in vitro I Райков И.А. И Научные чтения, посвященные выдающимся «ченым'академику Николаю Ивановичу Вавилову и селекционеру Константину Ивановичу Саввичеву: Сб. науч. ст.- Брянск: Изд. Брянской ГСХА, 20П. -С. 100-102.

12 Райков И.А. Влияние цитокинипов на пролиферацию побегов растении рода ribes в культуре in vitro / Райков И А. // Материалы VIII Международной научной конференции «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК». Брянск. 2011.-С. 363-365.

Подписано к печати 21.02.2012. Формат 60x84. Бумага печатная.

_Усл-П.л. 1. Тираж 100. Изд.№ 2132._

Издательство Брянской государственной сельскохозяйственной академии 243365 Брянская обл., Выгоничский р-н, с.Кокино, Брянская ГСХА

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Райков, Игорь Александрович, Брянск

61 12-6/316

БРЯНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

I На правах рукописи

\

^УДК 634.7:581.1:581.143

РАЙКОВ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ МЕЖВИДОВЫХ ФОРМ СМОРОДИНЫ ЧЁРНОЙ И МАЛИНЫ

РЕМОНТАНТНОГО ТИПА

06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научные руководители -заслуженный деятель науки РФ, академик РАСХН, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Казаков И. В.

доктор сельскохозяйственных наук, Евдокименко С. Н.

БРЯНСК 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................................3

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ...............................................................................................................8

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА......................37

Место проведения и объекты исследования.........................................................................37

Методы исследования.............................................................................................................42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................................................55

3.1. Введение в культуру in vitro смородины чёрной...........................................................55

3.1.1 Контаминация первичных эксплантов сопрафитной микрофлорой....................67

3.2. Влияние ИМК и ГК на регенерационный потенциал первичных эксплантов растений смородины чёрной..................................................................................................72

3.3. Этап размножения растений смородины in vitro...........................................................80

3.4. Адаптация к среде размножения.....................................................................................87

3.5. Особенности клонального микроразмножения растений смородины чёрной в зависимости от генотипа и применяемого цитокинина.......................................................90

3.6. Влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины в культуре in vitro......................................................................................................93

3.7. Влияние кислотности питательной среды на пролиферацию дополнительных побегов малины ремонтантной..............................................................................................98

3.8. Андроклиния малины ремонтантной...........................................................................101

3.9. Особенности ризогенеза растений малины в песке....................................................103

3.10. Совмещение процессов ризогенеза и адаптация растений к нестерильным условиям выращивания.........................................................................................................105

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................109

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ...............................................110

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................111

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................................................................129

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

6-БАП - 6-бензиламинопурин ГК - гибберелловая кислота ИМК - индолилмасляная кислота ИУК - индолилуксусная кислота СРРи - N-(2 хлор-4-пиридил)-Ы-фенилмочевина - тидиазурон

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. Ягодные культуры - одни из основных источников поступления биологически активных веществ (витаминов, ферментов, минеральных солей и др.). В организме человека благодаря этим компонентам повышается иммунитет к различным заболеваниям, обеспечивается высокая работоспособность и долголетие людей. Особая роль принадлежит витаминам, которые регулируют обмен веществ в организме. Новейшие исследования в области молекулярной биологии свидетельствуют, что причина большинства человеческих болезней связана с нехваткой витаминов. Установлено, что 70% населения России страдает авитаминозом и нарушением многих физиологических процессов.

В условиях ухудшения климата, участившихся вспышек развития грибных болезней и вредителей, возросших требований к качеству продукции растениеводства возникает острая необходимость в проведении масштабной селекционной работы с целью создания сортов, отвечающих современным стандартам.

Создание ягодных растений очень длительный и сложный процесс. От начала селекционной работы до внедрения нового сорта в производство может пройти несколько десятилетий. Период селекционной работы у ягодных культур от гибридизации до передачи сорта в государственное сортоиспытание длится 10-15 и более лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю. Ещё более длительным оказывается путь создания сортов с использованием межвидовой гибридизации, нередко необходимой для радикального совершенствования исходного материала.

В реализации генетического потенциала ягодных растений важная роль отводится методам биотехнологии, которые существенно ускоряют селекционный процесс. Метод размножения растений с использованием техники культуры изолированных тканей позволяет полнее всего реализовать потенциал растительного организма к размножению.

Клональное микроразмножение в сочетании с термо- и хемотерапией нашло широкое применение в системе производства оздоровленного посадочного материла плодово-ягодных, культур. В настоящее время во многих селекционных программах этот метод рутинно используется для ускоренного размножения ценных генотипов (Hall, 2009). Особенно актуально этот способ использовать для растений, обладающих низким коэффициентом размножения традиционными способами, например, ремонтантных форм малины.

Важным условием клонального микроразмножения является использование объектов и методологических подходов, полностью сохраняющих генетическую стабильность размножаемых сортов на всех этапах процесса от эксплантата до растений в поле.

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП и кафедре плодоовощеводст-ва Брянской госсельхозакадемии ведется активная работа по созданию новых высокопродуктивных сортов ягодных культур. Наши исследования являются составной частью этой работы.

Цель исследования. Провести оптимизацию методов клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантной в соответствии с их генотипическими особенностями. Решались следующие задачи:

1. Оценить действия цитокининов различной природы на пролиферацию микропобегов из первичных эксплантов смородины чёрной при введение в культуру in vitro.

2. Оптимизировать условия клонального микроразмножения применительно к генотипическим особенностям межвидовых сортов и элитных форм растений смородины чёрной

3. Изучить влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины ремонтантной в культуре in vitro.

4. Оптимизировать процессы ризогенеза и адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям выращивания.

Научная новизна и практическая значимость. Определены оптимальные концентрации регуляторов роста при клональном микроразмножении растений смородины чёрной, доказана эффективность производных ди-фенилмочевины при введении в культуру первичных эксплантов. Изучено влияние минерального состава и кислотности питательной среды на процессы пролиферации побегов малины ремонтантной. Оптимизированы условия культивирования и адаптации растений к нестерильным условиям выращивания.

Усовершенствованная методика клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа позволяет быстро тиражировать их для использования в селекции и производстве. Положения выносимые на защиту.

• Оптимизированные концентрации регуляторов роста на этапе введения в культуру in vitro смородины чёрной.

• Минеральный состав питательных сред при введении в культуру in vitro растений ремонтантной малины.

• Ускорение процессов ризогенеза и адаптации растений к нестерильным условиям.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на заседаниях кафедры плодоовощеводства, технологии хранения и переработки продукции растениеводства Брянской госсельхозакадемии, а также на научных конференциях: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Рязань, 2009); VI, VII, VIII Международных научных конференциях «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2009, 2010, 2011); Всероссийском инновационном форуме аграрной молодежи (Орел, 2010); Международной научной конференции «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск, 2010); Международных научно-практических конференциях «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и био-нанотехнология» (Брянск, 2010); «Пути повышения устойчивости растение-

водства к негативным природным и техногенным воздействиям» (Орел, 2011); "Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве" (Москва, 2011), научных чтениях, посвященным выдающимся ученым академику Николаю Ивановичу Вавилову и селекционеру Константину Ивановичу Саввичеву (Брянск, 2011).

Результаты исследований были отмечены дипломами победителя Всероссийского конкурса научных работ студентов, аспирантов и молодых учёных аграрных вузов (Брянск, 2010, Краснодар, 2010, Курск, 2011, Орел, 2011), а также поддержаны грантами: «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») в 2009 г. и «Молодые новаторы аграрной России» по номинации «Агрономия» 2010 г.

Личное участие автора в получении научных результатов. Научные результаты, изложенные в диссертации, получены соискателем самостоятельно. Участвовал в разработке программы исследований, выбора методов ее выполнения, подборе исходного материала, обсуждении результатов исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе две в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и рекомендаций для производства и селекции. Работа содержит 22 таблицы и 27 рисунков. Список использованной литературы включает 163 наименований, в том числе 52 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

(обзор литературы)

Важнейшим звеном комплексной системы производства ягодной продукции является сорт. Установлено, что вклад сорта в повышении величины и качества урожая может достигать 50-80%, и что роль селекционного улучшения растений будет непрерывно возрастать (Жученко, 2003).

Сортом у плодовых и ягодных культур принято называть вегетативное потомство от одного растения, которое характеризуется одинаковым генотипом. Этот генотип стабилен многие годы, а проявление спонтанных мутаций происходит редко. В отличие от растений, размножающихся семенами, сорта плодовых культур не могут быть самовоспроизводящейся системой, способной воспроизводить себя семенами. Природные и генетические различия сорта у этих двух групп растений приводит к различиям в технологии их выведения (Кичина, 2011).

Одной из основных предпосылок увеличения продуктивности ягодных насаждений является производство сертифицированного, чистосортного, свободного от комплекса наиболее опасных вредителей и болезней посадочного материала. Для быстрого и эффективного размножения плодовых и ягодных растений закладывают маточные насаждения, которые при использовании определенных приёмов должны обеспечить достаточно большое количество черенков или отводков (Еремин, 2004).

Значительно тормозит селекционный процесс и внедрение новых сортов в производство ограниченная способность растений к вегетативному размножению. Размножение единичного растение до необходимого для изучения и последующей передачи в государственное сортоиспытание количества может занимать несколько лет.

Существенно ускорить процесс селекции ягодных растений можно используя методы биотехнологии, которые Р. Г. Бутенко условно разделила на две группы:

> облегчающие и ускоряющие традиционный процесс, т.е. технологии, которые не подменяют селекционный процесс, а служат ему;

> создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками - это самостоятельные от обычной селекции технологии.

К первой группе технологий относят: оплодотворение in vitro, эмбрио-культуру, регенерацию растений из тканей летальных гибридов, получение гаплоидных растений путем андрогенеза и гиногенеза, клональное микроразмножение растений, криосохранение генофонда. Во вторую группу входят следующие клеточные технологии: индукция сомаклональных вариантов, клеточная и тканевая селекция на устойчивость к стрессам, культура протопластов и соматическая гибридизация (Бутенко, 1964; Артамонов, 1989).

Наиболее ранними работами, в которых сделаны первые успехи по выращиванию изолированных от растения тканей, были исследования, проведенные немецкими учеными Н. Vochting, С. Rechinger, G. Haberlandt в период с 1892 по 1902 годы.

Н. Vochting делил растения на мелкие части и культивировал их в растворе сахарозы для изучения явления полярности. Он показал, что полярность - это свойство, присуще каждому фрагменту ткани независимо от его размера, в том числе и отдельным клеткам растений. С. Rechinger поставил опыты по определению «минимального предела» делимости растительных тканей. Помещая сегменты стеблей ясеня и тополя, корней свеклы и турнепса на поверхность влажного песка без соблюдений условий асептики он пришел к заключению, что ткани размером менее 20 мм иногда были способны продуцировать каллус и даже почки. С уменьшением толщины среза эта способность падала, а экспланты тоньше 1,5 мм не росли (Расторгуев, 2009).

Эксперименты в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения - клонального микроразмножения.

Метод клонального микроразмножения растений имеет ряд преимуществ перед общепринятыми методами размножения растений (Бутенко, 1979, Еремин, 2004, Шевелуха, 1998):

получение генетически однородного материала; сокращение продолжительности селекционного периода; ^ ускорение перехода от ювенильной к репродуктивной фазе развития; ^ высокий коэффициент размножения (сотни тысяч растений от одной

меристемы); ^ освобождение растений от вирусов;

^ размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

^ возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; возможность автоматизации процесса выращивания Выделяют несколько типов клонального микроразмножения:

1) размножение пазушными побегами при различных способах снятия апикального доминирования - путем простого черенкования (удаления верхушки), применения повышенных концентраций цитокинина или ингибиторов транспорта ауксинов;

2) размножение путем образования адвентивных почек, побегов или эмбриондов непосредственно в тканях эксплантов. Вариантом этого типа размножения является также закладка микроклубней и микролуковичек;

3) регенерация растений из каллусной или суспензионной культур путем образования стеблевых почек или эмбриоидов.

Основой методов культуры изолированных клеток и тканей растений является тотипотентность растительных клеток. Под тотипотентностью подразумевается уникальная способность растительной клетки при определенных условиях вторично дифференцироватся и под влиянием внешних факторов выбирать путь морфогенеза (Бутенко, 1964; Бурдасов, 1998).

Морфогенез является сложным процессом, который регулируется на клеточном, тканевом и организменном уровнях. В нем принимают участия взаимозависимые факторы, определяющие процессы деления, растяжения,

дифференциации, старения и гибели клеток. В ходе морфогенеза возникают сформированные заново ткани и органы (Бутенко, 1999).

Способ размножения растений пазушными побегами основан на снятии апикального доминирования. Этот метод широко используется при промышленном производстве посадочного материала некоторых культур и является наиболее надежным в отношении размножения плодовых и ягодных культур (Высоцкий, 1989).

Снятие апикального доминирования позволяет добиться активации роста пазушных меристем. Это может быть достигнуто двумя путями:

> удалением верхушки стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro;

> добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие пазушных побегов: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентиладенин (2ip) и зеатин (Бутенко, 1964).

Второй тип микроразмножения связан с образованием адвентивных почек и побегов. Регенерация придаточных побегов на изолированных органах может быть получена in vitro у многих растений.

Процесс образования адвентивных почек, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один ци