Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регенерация и трансформация ремонтантных форм малины

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Регенерация и трансформация ремонтантных форм малины"

На правахрукописи

СОБОЛЕВА Анна Геннадьевна

РЕГЕНЕРАЦИЯ И ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕМОНТАНТНЫХ ФОРМ МАЛИНЫ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и в лаборатории биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии

Научный руководитель -

Академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор В. С. Шевелуха

Официальные оппоненты -

Доктор биологических наук Голденкова И.В. Кандидат биологических наук Ралдугина Г. Н.

Ведущая организация -

Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится 30 2004 г. в ^^часов на заседании диссертаци-

онного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

МСХА.

Автореферат разослан <Л?» -^"Ят 2004

г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время сильно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано с увеличением роли клеточных культур в фундаментальных исследованиях и с возможностью применения клеточных технологий в растениеводстве, селекции растений и в генетической инженерии.

Ремонтантные формы малины (/?и6и5 1йаеи£) отличаются способностью формировать урожай на однолетних побегах. Технология их предусматривает осеннее скашивание отплодоносивших побегов, что позволяет решать проблемы зимостойкости, морозоустойчивости и препятствует перезимовке и размножению патогенов и вредителей. Но физиологические особенности развития ремонтантных форм обуславливают крайне низкую способность к вегетативному размножению. Разработка эффективной системы регенерации позволит решить проблемы размножения. А использование методов генетической инженерии может позволить решить ряд других проблем актуальных для ремонтантных форм: повысить вкусовые и технологические качества ягод, скороспелость и продуктивность растений; решить проблему устойчивости к вирусным болезням; создание сортов, устойчивых к экологически чистым гербицидам, позволит существенно снизить трудоемкость возделывания малины.

Для плодовых и ягодных культур возможности генной инженерии используются недостаточно из- за отсутствия эффективных методов регенерации растений из различного рода эксплантов.

Регенерация малины в большинстве работ получена на культуральных средах, где в качестве источника цитокининов использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП) (например Упадышев М. Т. и др., 1995). Существуют отдельные сообщения о возможности улучшения регенерации при использовании других типов цитокининов ^юЫ J. A. et э1., 1990; Millan-Mendoza В. et э1., 1999). Однако для малины до сих пор не разработана эффективная универсальная система регенерации и генетической трансформации растений, пригодная для широкого круга генотипов. Регенерационная способность ремонтантных форм малины совсем не изучена. Поэтому работа в данном направлении является актуальной.

Цель исследований: определение оптимальных условий для проявления наибольшего регенерационного потенциала листовых эксплантов ремонтантной малины и подбор условий для генетической трансформации.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

-Исследовать воздействие различных фитогормонов в системе in vitro и подобрать их оптимальные концентрации для получения побегов - регенерантов-регенерации.

-Изучить влияние внешних условий, типа экспланта, его физиологического состояния на проявление регенерационного потенциала различных генотипов. Проверить с помощью ISSR-PCR наличие генетических изменений в полученных регенератах.

-ВЫЯВИТЬ влияние агробактерии на регенерацию и подобрать оптимальные способы инокуляции листовых эксплантов.

-Подобрать условия для селекции трансформантов с помощью канамицина.

-Получить трансгенные растения малины, содержащие селективные и ре-портерные гены и доказать присутствие вводимых генов в полученных растениях.

Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований установлено:

-Регенерационный потенциал эксплантов малины ремонтантной, полученной с участием межвидовой гибридизации, активно реализуется только в присутствии цитокининов структурного ряда дифенилмочевины, в частности ти-диазурона, а в присутствии 6-БАП (производное аденина) морфогенез практически отсутствует. Другие фитогормоны, ауксины, АБК, существенно не влияют на процессы регенерации из листовых эксплантов.

- В полученных регенерантах малины не обнаружено генетических отклонений от исходных форм при анализе методом ISSR-PCR с 9 праймерами, дающими наибольший полиморфизм на изучаемых генотипах ремонтантной малины.

- В подобранных условиях стеблевой органогенез на листовых эксплантах малины идет двумя путями- как регенерация из субэпидермальных тканей без видимого каллусообразования (прямая регенерация) и как регенерация из первичного каллуса.

- Ингибирующее действие, которое оказывает инокуляция

при регенерации из листовых эксплантов малины, зависит от способа инокуляции и может быть существенно снижено при включении в регенерационную среду АБК,

- При использовании штамма A. tumefadens GANE 7, содержащего ген b6, влияющего на регенерацию, наблюдается значительное (полуторакратное) увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины по сравнению с контролем без инокуляции.

- Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

- Определены селективные концентрации канамицина для использования на этапе регенерации из листовых эксплантов и для селекции полученных регенератов.

- Впервые получены трансформанты малины, содержащие экспрессирую-щиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихеназы (lie Б) вместе с геном устойчивости к антибиотику канамицину (nptll).

Практическая значимость работы. Разработанная система регенерации, позволяет получать регенераты широкого спектра генотипов ремонтантной малины, где степень регенерации варьирует от 3,3 до 81 %. В силу отсутствия генетических отклонений эта система может использоваться для ускорения размножения ценных форм ремонтантной малины. Подобранные условия трансформации могут быть использованы для введения новых генов как с целью изучения генома и регуляторных элементов экспрессии, так и для придания малине новых хозяйственно ценных признаков.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на Международных научно-практических конференциях: «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001); «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харьков, 2003); V съезде общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003) и 4 региональных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста, включая_таблиц и_рисунков.

Список цитируемых литературных источников включает наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Объектом исследований является ремонтантная малина сложного межвидового происхождения, характеризующаяся плодоношением на побегах первого года, большой зоной плодоношения, ранней отдачей основного урожая, сниженной способностью к образованию корневой поросли, вследствие чего эти формы ремонтантной малины имеют низкий коэффициент вегетативного размножения.

Культивирование ремонтантной малины проводили на питательных средах на основе минеральной части среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т., Skoog F, 1962) с увеличенной в три раза концентрацией хелата железа.

Клональное микроразмножение проводили по методу, разработанному ранее для ремонтантной малины (Вовк В. В., 2000), на среде МС, содержащей 2 мг/л 6-БАП, укоренение побегов проводили на среде МС, содержащей ИМК 0,5 мг/л.

В опытах по регенерации изучали влияние гормональных факторов (тип цитокинина и его концентрация), влияние темновой прединкубации, а также физиологического состояния листового экспланта на регенерационную способность.

Источником эксплантов служили листья и черешки, изолированные от укорененных in vitro растений. Для повышения выхода регенерантов экспланты первые 10 дней выдерживали в темноте с последующим переносом на свет. Спустя 1,5-2 месяца определяли конечное число образовавшихся побегов и количество эксплантов, давших регенерацию.

Отсутствие нарушений генома в полученных регенерантах доказывали, используя метод ISSR- PCR.

Для трансформации использовали штаммы A. tumefaciens, любезно предоставленные лабораторией генетической инженерии растений ИОГен, Е 35S -

Использованные вектора содержали ген устойчивости к канамицину под опиновым nos-промотором, ген репортерного белка ли-хеназы под промотором 35S. Эта репортерная система основана на высокой термостабильности бактериального фермента лихеназы lum (МусийчукК.А. 2001).

Кроме того, в опытах использовали штамм агробактерии GANE 7 содержащий ген предоставленный институтом клеточной биологии и генетической инженерии национальной академии наук Украины. Ген b6 участвует в тонкой регуляции действия цитокининов на растения, и способен приводить к увеличению регенерационной способности у табака (Кучук Н. В., 1997).

Для снижения негативного действия агробактериальной трансформации на органогенез регенерационную среду дополняли АБК (3 мг/л). Опыты проводили в трехкратной повторности. Трансгенную природу полученных растений доказывали методом PCR, в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, соответствующие последовательности гена длина амплифицируемого

фрагмента 791 п.н.

При демонстрации экспрессии в растениях генов lie b, кодирующих лихе-назу, использовали методику чашечного теста (Голденкова И. В., 2002).

За частоту регенерации принимали отношение количества регенерирующих эксплантов к общему числу эксплантов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода регенерация на листовых эксплантах ремонтантной малины. Регенерация растений зависит от генетических особенностей выбранной культуры, сорта или формы, исходных органов и тканей для взятия -их возраста и физиологического состояния, используемых фитогормонов и их синтетических аналогов, концентраций выбранных гормонов, и условий, в которых культивируются экспланты - освещенности, температуры и т.д. На малине ремонтантной подобные исследования не проводились, а на малине обычных неремонтантных сортов регенерация наблюдалась лишь на некоторых сортах, и средний уровень регенерации был невысок (Хамукова Ф.Н., 1999).

Для определения оптимального гормонального состава среды для регенерации была выполнена серия опытов, в которых изучалась эффективность различных концентраций цитокининов аденинового структурного ряда (6-БАП) и ряда дифенилмочевины (тидиазурон и 4-пиридилфенилмочевина), их сочетание с индолилуксусной кислотой (ИУК) (Табл. 1), а также в других опытах и с ин-долилмасляной кислотой (ИМК).

Таблица 1

Влияние 6-бензиламинопурина и индолилуксусной кислоты на проявляемую регеперациоиную способность листовых эксплантов ремонтантной малины сорта Бабье лето-2.

Гормональный состав среды Частота регенерации, %

БАП 1,0мг/л 4,4 ± 3,8

БАЛ 3,0 мг/л 6,7 ±6,7

БАП 5,0 мг/л 4,4 ±7,7

БАП 3,0 мг/л + ИУК 0,1 мг/л 4,4 ±7,7

БАП 3,0 мг/л + ИУК 0,5 мг/л 2,2 ± 3,8

4-Ри 1,0 мг/л 35 ±10

4-Ри 2,0 мг/л 18,3 ±10,4

ТШ 1,0 мг/л 16,7 ± 5,8

1Ш 2,0 мг/л 8,3 ± 5,8

Наибольший выход регенерантов (35 %) наблюдался в варианте с 4-Ри 1,0 мг/л. Включение в регенерационную среду 6-БАП было малоэффективно при стимулировании регенерации из листовых эксплантов ремонтантной малины. Включение в состав регенерационной среды ауксина ИУК не оказывало положительного влияния на проявляемую регенерационную способность. ТО/ в концентрации 1,0 мг/л способствовал регенерации на 16,7 % эксплантов, что в два раза ниже в сравнении с аналогичной концентрацией у 4-Ри. Повышение концентрации тидиазурона способствовало уменьшению количества регенерирующих эксплантов, в последующих опытах сочетание ауксинов с тидиазуро-ном не повышало регенерацию. В дальнейшей работе опыты проводили с ТО/, как с более доступным препаратом.

Подобранная оптимальная концентрация тидиазурона составляла 0,1-0,2 мг/л (табл. 2). При повышении концентрации наблюдалась витрификация и морфологические нарушения у регенерантов.

Таблица 2

Влияние различных концентраций ТО/ на образование регенерантов на сорте Геракл в зависимости от физиологического состояния листа

Концентрация цитокшшна Частота регенерации, %

1 лист 2 лист 3 лист

ТОг 0,05 мг/л 13±3 3 ±4 0

ТОг 0,1 мг/л 47 ±4 21 ±1 1 ±4

тог 0,2 мг/л 63 ±5 20 ±5 0

Изучение зависимости регенерации от типа и физиологического состояния листового экспланта показало, что наибольшим регенерационным потенциалом обладали экспланты, высеченные из самых молодых листьев (табл.2,3).

Таблица 3

Влияние физиологического возраста листьев на способность к регенерации на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 (ТО/ -0,1 мг/л)

Вид экспланта Регенерация побегов, %

1 лист (самый молодой) 81 ±11

Черешок 1 листа 62 ±4

2 лист- 20 ± 1

Черешок 2 листа 7 ± 5

3 лист 3 ±2

Наибольшей регенерационной способностью обладали самые молодые листья. На 81 % таких эксплантов образовывались регенеранты. Уже после 5 дней культивирования на свету на жилках эксплантов формировался каллус, который спустя еще 7 дней дал первые регенеранты. На 62 % черешков первых листьев образовались побеги. Второй лист обладал существенно более низким ре-генерационным потенциалом - 20 %. Использование третьего листа в опытах для получения регенерантов является нецелесообразным, так как регенерация побегов на эксплантах происходит на очень низком уровне - 3%.

Обнаруженная зависимость, по видимому, объясняется тем, что самые молодые листья не закончили или только закончили рост, и в них еще остались фитогормоны, стимулирующие их развитие и положительно влияющие на регенерацию, кроме того, в этих листьях клетки делятся более активно и не полностью прошли процесс дифференцировки.

Большинство авторов говорят о положительном влиянии периода темновой прединкубации эксплантов на проявляемую ими регенерационную способность. Хамукова Ф. Н. советует выдерживать экспланты малины и земляники в темноте в течение 12-15 суток (Хамукова Ф. Н., 1994). Две недели в темноте выдерживали экспланты ежевики, стимулируя регенерацию на сорте ТауЬеггу ^ууайг Н. J. et а1., 1990). Однако американские ученые нашли отрицательным влияние темновой прединкубации на регенерационную способность эксплантов малины красной ^ю1а J. А. et а1., 1990).

В результате опытов, проведенных в нашей лаборатории, мы выявили, что прединкубация листовых эксплантов ремонтантной малины в темноте первые десять дней понижает каллусообразование и повышает побегообразование на эксплантах ремонтантной малины (табл. 4).

Таблица 4

Влияние темновой прединкубациии на частоту регенерации побегов на листовых эксплантах ремонтантного сорта малины Бабье лето-2 (на среде с ТБ2 0,1 мг/л)

Количество эксплантов, образующих каллус, при 10-дневной инкубации в темноте снижается с 50% до 31,3%, в то время как побегообразование возрастает более чем в 3 раза.

Возможно, повышение частоты регенерации вследствие темновой предин-кубации эксплантов порисходит за счет уменьшения фоторазрушения ауксинов, которые необходимы для индукции процессов деления клеток (Хамукова Ф. Н., 1994).

Анализ срезов, сделанных на полученных регенерантах ремонтантной малины, свидетельствует о наличии двух типов регенерации в подобранных условиях. В первом случае регенерант развивался из субэпидермальных тканей, без видимого слоя каллусных клеток (прямая регенерация). В других случаях на массе образовавшихся каллусных клеток отчетливо видны обособившиеся эм-бриоидоподобные структуры. При разработке методики регенерации предпочтение следует отдавать регенерации без образования каллуса, так как в этом случае более вероятно получение генетически однородного материала.

Отработанная нами методика регенерации была использована для получения регенерантов 10 различных образцов ремонтантной малины. Поскольку наблюдались существенные генотипические различия в отзывчивости на уровень гормонов в средах, в опытах использовали 4 различных концентрации гормона (табл. 5).

Таблица 5

Частота регенерации из листовых эксплантов различных форм ремонтантной малины

№ Частота регенерации, %

п.п Генотип тиг 0,05г/л тог о,1мг/л тог 0,2мг/л ТШ 0,5г/л

1 19-99-1 13,3 ±4,1 16,7 ±4,1 0 0

2 17-60-1 13,3 ± 8,2 6,7 ±4,1 0 0

3 №24 16,7 ± 3,7 3,3 0 0

4 4-43-2 0 3,3 0 0

5 2-205-1а 0 4,5 8,3 -

6 2-85-1 3,3 6,7 0 -

7 21-232-2 - 68,5 ± 8,8 46,7 ± 8,3 -

8 9-35-10 - 25,9 ±9,2 - -

9 1-98-10 - 6,7 ±4,1 - -

10 18-65-10 - 3,3 ±4,1 - -

11 Бабье лето-2 8,3 ±3,4 81 ±1,0 46,7 21

12 Геракл 13 ±3,3 47,0 ±4,3 63 ± 5,2 -

13 8-79-2 - 72,5 ± 5,1 - -

14 14-205-27 25 ±3,2 47,0 ±7,5 32 ±4,2 -

15 5-253-1 - 9,3 ±1,4 - -

Для большинства генотипов оптимальной является концентрация TDZ 0.1 мг/л. При этом экспланты 33 % испытанных генотипов показали регенерацию более 47 %. Экспланты 20 % образцов регенерировали с частотой от 16 до 47 % и 47 % испытанных форм регенерировали с частотой от 3,3 до 16%.

Таким образом, в результате проведенной работы нами предлагаются следующие рекомендации для получения растений - регенерантов ремонтантной малины: в качестве эксплантов следует использовать молодые листья от укорененных in vitro растений с надрезанной центральной жилкой, помещая их на среду, содержащую тидиазурон в концентрации 0,1 мг/л; первые 10 дней экспланты следует выдержать в темноте. После регенерации побегов, последние переносят на среду для размножения, содержащую 2 мг/л 6-БАП, или же 2-3 недели выдерживают на безгормональной среде для повышения жизнеспособности.

Выявление генетических изменений у полученных регенерантов ремонтантной малины. Изменчивость среди растений, регенерированных in vitro из соматических клеток, бывает очень высокой (R.M.Skirvin,1978). Наиболее вероятными источниками генетической вариабельности могут быть мутации, хромосомные нарушения, а также возникновение полиплоидных клеток (F.D'Amato, 1977). Эти нарушения накапливаются при культивировании кал-лусных тканей (N.Sunderland, 1977). При определении оптимальных условий получения регенерантов ремонтантной малины немаловажным условием является сохранение целостности генотипа полученных побегов. Следует отметить, что в наших условиях побеги регенерировали главным образом из субэпидер-мальных клеток без видимого образования каллуса или же из первичного каллуса. Таким образом, этап культивирования каллуса, при котором наблюдается накопление генетических отклонений, был сведен до минимума. Для подтверждения генетической идентичности полученных регенерантов с исходными генотипами мы провели сравнение продуктов ISSR-PCR полученных регенерантов с продуктами ISSR-PCR исходных генотипов.

По результатам работ, ранее проведенных в нашей лаборатории, были отобраны олигонуклеотидные праймеры, дающие наибольший полиморфизм на различных генотипах малины.

При сравнении продуктов PCR полученных регенерантов с продуктами PCR исходных форм различий найдено не было, что может служить доказательством генетической идентичности полученных регенерантов. Таким образом, разработанная система регенерации может использоваться для получения генетически однородных побегов широкого спектра генотипов ремонтантной малины.

Подбор оптимальных условий для трансформации листовых эксплан-тов ремонтантной малины. Для трансформация растений кокультивацией с А. Штв/аеЫт использовали различные модификации этого метода: 1. инкубация растительных эксплантов в жидкой бактериальной культуре; 2. нанесение капель жидкой культуры бактерии на листовые экспланты; 3. использование газона ночной культуры, куда помещают экспланты. При этом в каждом случае было подобрано оптимальное время кокультивации эксплантов с бактерией. В табл. 6 приведены результаты опыта, в котором проводилось сравнение различных способов инокуляции.

Таблица 6

Влияние способа трансформации штаммом агробактерии ЕЗ 5 И-^-НсВ листовых эксплантов малины сорта Бабье лето-2 на их регенерационную способность

Способ обработки эксплантов агробактерией. Количество зеленых эксплантов (через 14 суток), % Частота регенерации, (через 30 суток), %

Инкубация с жидкой культурой, 4 часа 31,76 ±4,2 0

Капли ночной культуры 95,94 ±1,5 66,46 ± 3,1

Газон ночной культуры 97,89 ±1,2 75,06 ± 2,3

Вакуумная инфильтрация 93,77 ±1,9 0

Из приведенной таблицы видно, что наиболее щадящими способами ко-культивации являются нанесение капель ночной культуры на листовые экс-планты и помещение листовых эксплантов на агробактериальный газон. Важно, что при этих способах кокультивации сохраняется высокий уровень регенерации побегов - 66% - 75%.

Как отмечалось ранее, регенерационная способность испытываемых форм ремонтантной малины во многом определяется особенностями генотипа. Таблица 7 демонстрирует, что снижение уровня регенерации после кокультивации с агробактерией также имеет сортоспецифичный характер.

Инкубация с агробактерией незначительно снижает проявление регенера-ционного потенциала эксплантов сорта Геракл, существенно снижает способность к образованию побегов у сорта Бабье лето-2 и форм 14-205-27 и 8-79-2.

Таблица 7

Влияние агробактерии штамма Е358-Ь-Цс Ь на регенерационную способность, проявляемую различными генотипами ремонтантной малины

Генотип Регенерационная способность листовых эксплангов

Без кокультивации с агробакгерией После кокультивации с агробактерией

Бабье лето-2 95,57 ±5,31 54,00 ±5,35

Геракл 95,00 ±7,00 81,00 ±1,22

14-205-27 87,00 ± 7,53 56,33 ± 6,53

8-79-2 72,57 ±5,19 57,00 ±7,19

5-253-1 9,33 ± 1,47 3,93 ± 1,27

В литературных источниках встречаются данные о положительном влиянии абсцизовой кислоты на регенерационную способность при трансформации некоторых культур (Белоногова М. А. и др, 2003). С целью повышения выхода регенерантов мы также включали АБК в питательные среды, испытывая ее влияние на 4 образцах.

АБК (3 мг/л) добавляли в состав регенерационной среды непосредственно после этапа кокультивации с культурой агробактерии. После двух недель ее исключали из состава сред, так как дальнейшая культивация приводила к гибели эксплантов. Из результатов проведенных опытов мы сделали вывод о положительной роли АБК, которая снижает отрицательное влияние агробактерии на регенерационную способность после этапа кокультивации, хотя и не повышает степень регенерации в вариантах без инокуляции.

Ряд форм ремонтантной малины обладают пониженным регенерационным потенциалом. Мы провели опыт, в котором изучали возможность повышения регенерации из эксплантов малины при использовании штамма агробактерии GANE 7 (рис. 1).

Результаты показывают, что использование данного вектора может значительно повысить частоту регенерации на листовых эксплантах форм, обладающих низким регенерационным потенциалом.

Рис.1. Регенерация на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 после кокульти-вации со штаммом A. tumefaciens GANE 7.

Получение трансформированных растений очень облегчается при использовании селективных агентов. Используемые нами штаммы содержали nptII -ген устойчивости к канамицину (Км), позволяющий проводить селекцию. В литературных источниках встречаются данные о возможности использования Км в концентрации 25-50 мг/л для отбора растений - трансформантов рода Rubus. При помещении листовых эксплантов ремонтантной малины на такие концентрации антибиотика в наших опытах наблюдалась слишком быстрая гибель эксплантов. Это может препятствовать образованию регенерантов даже из трансформированных устойчивых клеток. Поэтому нами были проведены опыты по подбору концентраций канамицина, эффективно подавляющих регенерацию из нетрансформированных клеток, но обеспечивающих достаточно длительное выживание эксплантов (табл. 8).

Таблица 8

Регенерация на листовых эксплантах сорта Бабье лето-2 после контакта со штаммом агробактерии Е358-Ь-Нс Ь, в присутствии канамицина.

Концентрации канамицина, мг/л. Частота регенерации (через 32 суток), %

0,5 56 ±2

1 48 ±3,5

1,5 42 ±4,5

2 30 ±4,0

2,5 9 ±2,5

На основании полученных данных, для селекции трансформантов на этапе регенерации мы выбрали концентрацию канамицина 3 мг/л.

Дополнительно можно проводить селекцию с помощью канамицина уже образовавшихся регенерантов. Их чувствительность к антибиотикам значительно ниже. В специальном опыте было установлено, что при концентрации 15 мг/л выживает 18,36±2,6 % регенерантов, полученных без селективного фактора на стадии регенерации при инокуляции с геном Все растения были зелеными и хорошо росли. При использовании более низких концентраций канамицина хлоротичные побеги сохранялись в течение длительного времени.

Таким образом, для получения максимального выхода трансформантов у ремонтантной малины мы предлагаем двухэтапную схему селекции: на этапе регенерации 3 мг/л канамицина, а затем 15 мг/л для селекции образовавшихся побегов.

Отобранные растения были протестированы на присутствие в них гена npt II методом PCR анализа. После разделения продуктов PCR в агарозном геле, с помощью электрофореза, мы наблюдали присутствие последовательности гена npt II в составе ДНК полученных побегов. Рассчитанная по нуклеотидной последовательности длина амплифицируемого фрагмента 791 п.н. соответствовала экспериментальным результатам при использовании маркера молекулярных весов.

Трансгенная природа полученных регенерантов была доказана также на чашечном тесте, где растительные экстракты некоторых побегов обладали ли-хеназной активностью.

В литературных источниках имеются данные о трансформации малины вектором на основе А. rhizogenes (Бурдейная Т. В. 2003). Некоторые генотипы ремонтантной малины отличаются низким коэффициентом укоренения при использовании методов укоренения разработанных в лаборатории биотехнологии. Поэтому они служили модельным объектом при анализе компетентности ремонтантной малины к заражению Использование позволило повысить укореняемость в 3-4 раза. Таким образом, клетки ремонтантной малины также компетентны для инокуляции Практическое значение этого приема будет изучено позднее.

Выводы

1. Разработана система регенерации из листовых эксплантов ремонтантной малины, которая позволяет получать от 3,3 до 81 % стеблевого морфогенеза в зависимости от генотипа.

2. показано, что использование Тидиазурона (цитокшшн ряда дифенилмо-чевины) в 2-3 раза усиливает регенерацию ремонтантной малины по сравнению с действием 6- БАП. Присутствие ауксинов существенно не влияет на процесс регенерации.

3. Выявлено два типа стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины: регенерация из субэпидермальных тканей без существенного каллусооб-разования (прямая регенерация) и развитие побегов из первичного каллуса.

4. С помощью метода ISSR- PCR с 9 различными праймерами показано, что побеги полученные при регенерации из листовых эксплантов не имеют генетических отклонений.

5. Установлено, что A. tumefaciens в значительной степени подавляет процессы регенерации, степень подавления зависит от генотипа и варьирует в пределах от 14 до 42 %. Оптимальными способами обработки эксплантов A. tumefaciens являются- использование газона ночной культуры или нанесение капель жидкой культуры на экспланты.

6. Абсцизовая кислота достоверно не увеличивает степень регенерации, но отмечено, что АБК уменьшала ингибирующее действие агробактерии на процесс регенерации.

7. Значительное увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплан-тах ремонтантной малины наблюдается при использовании штамма

CÍens GANE 7, содержащего ген Ь6 (влияющего на регенерацию).

8. Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

9. Получены трансформированные растения малины с генами

Факт трансформации подтверждается устойчивостью растений к канамицину, анализом активности термостабильной лихеназы, PCR анализом на наличие гена nptll.

Практические рекомендации -разработанную методику регенерации можно использовать для размножения ценных образцов ремонтантной малины.

- для селекции трансформантов ремонтантной малины предлагается использовать двухэтапную схему, 3 мг/л канамицина на этапе регенерации и 15 мг/л для образовавшихся побегов.

-для повышения регенерационного потенциала некоторых образцов ремонтантной малины использовать штамм агробактерии GANE 7.

-предложенная схема трансформации с помощью кокультивирования листовых эксплантов с культурой агробактерии может быть использована для получения трансгенных форм малины.

Перечень работ опубликованных по теме диссертации

1. Соболев В. В., Сковородников Д. Н., Шматова А. Г.. Заякин В. В. Подбор оптимальных сред для размножения различных генотипов ремонтантной малины. // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых: «молодые ученые - возрождению сельского хозяйства Росси в XXI веке». - Брянск, 2000. - С. 69-71.

2. Сковородников Д. Н., Соболева А. Г., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка системы регенерации адвентивных побегов применительно к ремонтантной малине // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». - Брянск, 2002. - С. 55-56.

3. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты // Материалы Международной научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». - Брянск, 2002. - С. 56-57.

4. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Подходы к разработке метода трансформации ремонтантных форм малины через листовые экс-планты // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». - Санкт-Петербург, 2001. - С. 72-74.

5. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты // Материалы II международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений». Харьков, 2003.- С. 8990.

6. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Регенерация и трансформация ремонтантной малины // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». -Пенза,2003.-С. 524.

7. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В. В., Нам И. Я. Влияние разных факторов на регенерацию ремонтантной малины из листовых эксплантов // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков». - Ярославль, 2003. - С. 51.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю академику РАСХН Шевелухе Виктору Степановичу за поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы. Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии, д.б.н. Заякину Владимиру Васильевичу и заведующей лабораторией биотехнологии БГСХА, к.б.н. Нам Ирине Яновне за огромную помощь при проведении исследований, обсуждении результатов, изложенных в диссертационной работе, и ее подготовке. Автор выражает благодарность аспирантам Соболеву Владимиру, Белоноговой Марине за помощь в работе и за участие в обсуждении полученных результатов; всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БГСХА, а также Шматовой Марии Павловне и Ясинской Валентине Павловне за понимание и поддержку.

Усл. п.л. 1,16

Тираж 100 экз.

Зак. 259

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

«2 12 8 27

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соболева, Анна Геннадьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Литературный обзор по проблеме исследований

1.1. Методы получения трансформированных растений.

1.2. Краткая характеристика агробактериальных векторных систем

1.2.1. Структурно- функциональная организация Ti - плазмид

1.2.2. Методы агробактериальной трансформации растений

1.3. Методы прямого переноса генов в растения

1.4. Селекция трансформированных тканей растений

1.5. Экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в трансгенных растениях

1.6.1. Регенерация растений плодовых культур

1.6.2. Агробактериальная трансформация растений плодовых культур 32 1.7. 1. Регенерация растений рода Rubus

1.7. 2. Трансформация растений рода Rubus с помощью Agrobacterium tumefaciens

1.8. Генетическая стабильность регенерирующих побегов

ГЛАВА II. Методика и условия исследований

2.1. Характеристика объекта исследований

2.2. Методика трансформации табака 5 0 2.3 Строение используемых генетических конструкций

2.4. Методика получения регенерантов ремонтантной малины

2.5. Агробактериальная трансформация листовых эксплантов ремонтантной малины

2.6 Методика выделения ДНК малины

2.7. Методика выделения плазмидной ДНК из агробактерии

2.8 Условия проведения полимеразной цепной реакции для анализа полученных регенерантов

2.9. Методика постановки чашечного теста для определения экспрессии гена лихеназы 60 2.10 Методика выделения ДНК и РНК малины

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка условий регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины

3.2. Изучение генетической однородности полученных регенерантов ремонтантной малины

3.3. Разработка метода трансформации ремонтантной малины 89 3.3.1.Освоение методики трансформации на табаке 89 3.3.2. Подбор оптимальных условий агробакгириальной трансформации ремонтантной малины

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регенерация и трансформация ремонтантных форм малины"

В настоящее время сильно возрос интерес к методам культуры тканей и клеток. Это связано с увеличением роли клеточных культур в фундаментальных исследованиях и с возможностью применения клеточных технологий в растениеводстве, селекции растений и в генетической инженерии.

В частности, регенерация растений из соматических клеток является одним из методов ускоренного размножения растений in vitro, что используется для ускорения определенных этапов селекции и получения посадочного материала (Шевелуха В. С. и др., 1998).

Способность растения к регенерации из соматических тканей - необходимое условие агробактериальной трансформации, это определяет успех техники переноса генов в генетической инженерии многолетних культур (Dandekar А. М., 1992; Schuerman Р. L. et al., 1993). Использование arpo бактерии и селективного отбора на канамицине, по сообщениям различных авторов, ослабляет регенерацию растений (Fióla J. A. et al., 1990; Hassan M A. et al., 1993). Для плодовых и ягодных культур возможности генной инженерии используются недостаточно из- за отсутствия эффективных методов регенерации растений из различного рода эксплантов.

На малине (Rubus idaeus) обнаружены единичные генотипы с высокой регенерационной способностью, дающие регенеранты даже на безгормональной среде, при очень низкой регенерации других форм (Высоцкий В. А., 1995). Большая часть работ по регенерации малины выполнена с использованием в качестве источника цитокининов 6-бензиламинопурина (6-БАП) (Упадышев М. Т. и др., 1995). Существуют отдельные сообщения о возможности улучшения регенерации при использовании других типов цитокининов (Fióla J. A. et al., 1990; Millan-Mendoza В. et al., 1999). Однако для малины до сих пор не разработана эффективная универсальная система регенерации и трансформации растений, пригодная для широкого круга генотипов.

Регенерационная способность ремонтантных форм малины совсем не изучена. Поэтому работа в данном направлении является актуальной.

Объектом исследований в настоящей работе были ремонтантные формы малины, полученные с использованием межвидовой гибридизации на Кокинском опорном пункте ВСТИСП чл.- корр. РАСХН И. В. Казаковым, Ремонтантные формы отличаются способностью формировать урожай на однолетних побегах в конце лета - начале осени, при этом они не повреждаются основными вредителями и болезнями. При использовании их на производственных плантациях осенью проводят скашивание отплодоносивших побегов, что позволяет решать проблему зимостойкости и морозоустойчивости и избежать сохранения патогенов и вредителей на зимующих побегах. Выращивание ремонтантных сортов позволяет продлить период потребления свежих ягод на 1,5-2 месяца и требует меньших экономических затрат (Казаков И. В., 1995).

Физиологические особенности развития ремонтантных форм малины обуславливают низкий коэффициент вегетативного размножения, растения практически не образуют поросли, получение генетически однородных ре-генерантов позволит решить эту проблему. Наряду с положительными свойствами ремонтантные формы имеют ряд недостатков, которые можно преодолеть, используя методы генетической инженерии: повысить вкусовые и технологические качества ягод, повысить скороспелость и продуктивность растений, решить проблему устойчивости к вирусным заболеваниям. Малина является очень трудоемкой культурой, создание форм с устойчивостью к экологически чистым гербицидам позволит снизить трудоемкость ее возделывания.

Целью данной работы была разработка системы регенерации и подбор условий для трансформации ремонтантных форм малины.

В ходе диссертационной работы решались следующие задачи:

1. Исследовать воздействие различных фитогормонов на регенерацию ремонтантной малины и подобрать их оптимальные концентрации.

2. Изучить влияние внешних условий, типа экспланта, его физиологического состояния на проявление регенерационного потенциала различных генотипов.

3. Проверить с помощью метода молекулярных генетических маркеров (КБИ-РСЯ) наличие генетических изменений в полученных растениях регенерантах.

4. Выявить влияние агробактерии на регенерацию и подобрать оптимальные способы инокуляции листовых эксплантов.

5. Подобрать условия для селекции трансформантов с помощью ка-намицина.

6. Получить трансгенные растения малины, содержащие селективные и репортерные гены.

7. Доказать трансгенную природу полученных/регенерантных;расте- . ний.

Научная новизна В результате проведенных исследований:

Впервые показано, что регенерационный потенциал эксплантов малины ремонтантной, полученной с участием межвидовой гибридизации, активно реализуется только в присутствии цитокининов структурного ряда дифенилмочевины, в частности, тидиазурона, а в присутствии 6-бензиламинопурина морфогенез практически отсутствует. Другие фито-гормоны - ауксины, абсцизовая кислота - существенно не влияют на процессы регенерации из листовых эксплантов.

Обнаружено, что стеблевой морфогенез на листовых эксплантах ремонтантной малины может происходить двумя путями - как регенерация из субэпидермальных тканей без существенного каллусообразования и как регенерация из первичного каллуса.

Не найдено генетических отклонений у регенерантов малины при анализе методом ISSR-PCR с 9 праймерами.

Установлено, что ингибирующее действие, которое оказывает инокуляция Agrobacterium tumefaciens на регенерацию из листовых экс-плантов ремонтантной малины, зависит от способа инокуляции и может быть существенно снижено с помощью абсцизовой кислоты (АБК).

Обнаружено, что при использовании штамма Л. tumefaciens GANE7, содержащего ген А б, влияющий на регенерацию, наблюдается значительное (в полтора раза) увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины по сравнению с контролем без инокуляции.

Инокуляция Agrobacterium rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

Найдены селективные концентрации канамицина для использования на этапе регенерации из листовых эксплантов и для селекции регенерантов, образовавшихся в отсутствие антибиотика.

Впервые получены трансформанты малины, содержащие экспрес-сирующиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихена-зы, а также гены устойчивости к антибиотику канамицину nptll.

Положения выносимые на защиту.

1. Разработка универсальной системы регенерации на листовых эксплантах ремонтантной малины сложного гибридного происхождения-степень регенерации колеблется от 3.3 до 81 %, причем около половины форм проявляют степень регенерации более 15%. Система включает следующие элементы: использование в качестве эксплантов верхних (самых молодых) листьев, обладающих наибольшим регенерационным потенциалом; включение в состав регенерационной среды тидиазурона в концентрации 0,1-,2 мг/л; темновая прединкубация в течение 10 дней, которая способствует снижению каллусообразования и повышению выхода регенерантов.

2. Элементы системы трансформации малины, которая включает способ инокуляции А. Ште/ааепя и повышение степени регенерации с помощью абсцизовой кислоты (АБК), подходы для селекции трансформантов и их анализа.

3. Получение трансформантов ремонтантной малины, содержащих экспрессирующиеся репортерные гены термостабильной бактериальной лихеназы, а также гены устойчивости к антибиотику канамицину прШ.

В ходе проведенных исследований было показано, что с учетом оптимизации влияния внешних условий и физиологического состояния экс-плантов, выбора оптимальных концентраций фитогормонов, в присутствии в качестве цитокинина возможна регенерация практически всех: изученных генотипов малины, несмотря на их сложное гибридное происхождение с участием межвидовой гибридизации. Между тем, в ряде публикаций отмечалось, что к регенерации способны только некоторые генотипы. Результаты данной работы позволяют заключить, что практически все генотипы малины обладают способностью к регенерации, хотя и в различной степени. Требуется только подобрать условия для её проявления.

Разработка такой системы регенерации имеет не только научное, но и практическое значение. Поскольку показано отсутствие значительного уровня генетических изменений при регенерации побегов на листовых эксплан-тах, этот процесс может быть использован в качестве вспомогательного метода для ускоренного размножения некоторых образцов, при обязательном контроле генетической стабильности, особенно для каждой новой формы.

Кроме того, разработка стабильной и высокоэффективной системы регенерации является необходимым этапом для применения к малине методов генетической инженерии. В данной работе были выполнены исследования по оптимизации некоторых этапов генетической трансформации малины. Получены трансгенные растения ремонтантной малины с селективными и репортерными генами. Введение последних, в частности гена, кодирующего термостабильную бактериальную лихеназу, позволяет при массовом получении регенерантов на начальных этапах их отбора и изучения обходиться без сложных молекулярно-биологических методов.

Использование методов генетической инженерии занимает важное место в современных подходах физиологии растений. Малина вообще и ремонтантная малина в особенности очень плохо изучены в физиологическом отношении. Освоение методов получения трансгенных растений малины открывает возможность изучать функции, строение и регуляцию экспрессии отдельных генов, организацию генома, модифицировать активность генов с помощью технологии антисмысловых нуклеиновых кислот и т.д. Вместе с тем, получение трансгенных растений малины может иметь также практическое значение — для повышения продуктивности и улучшения качества продукции, повышения устойчивости к болезням, применения более эффективных и экологически безопасных гербицидов и т.д.

Таким образом, можно заключить, что полученные результаты имеют существенное научное значение, а также практическую ценность для разработки новых методов производства посадочного материала ремонтантной малины и селекции новых сортов. Данные, представленные в диссертационной работе, используются в курсе лекций и для практических занятий по биотехнологии в Брянской государственной сельскохозяйственной академии.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Соболева, Анна Геннадьевна

Выводы

1. Разработана система регенерации из листовых эксплантов ремонтантной малины, которая позволяет получать от 3,3 до 81 % стеблевого морфогенеза в зависимости от генотипа.

2. показано, что использование Тидиазурона (цитокинин ряда дифенил-мочевины) в 2-3 раза усиливает регенерацию ремонтантной малины по сравнению с действием 6- БАП. Присутствие ауксинов существенно не влияет на процесс регенерации.

3. Выявлено два типа стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах малины: регенерация из субэпидермальных тканей без существенного каллу-сообразования (прямая регенерация) и развитие побегов из первичного каллуса.

4. С помощью метода ISSR- PCR с 9 различными праймерами показано, что побеги полученные при регенерации из листовых эксплантов не имеют генетических отклонений.

5. Установлено, что A. tumefaciens в значительной степени подавляет процессы регенерации, степень подавления зависит от генотипа и варьирует в пределах от14 до 42 %. Оптимальными способами обработки эксплантов А. tumefaciens являются- использование газона ночной культуры или нанесение капель жидкой культуры на экспланты.

6. Абсцизовая кислота достоверно не увеличивает степень регенерации, но отмечено, что АБК уменьшала ингибирующее действие агробактерии на процесс регенерации.

7. Значительное увеличение стеблевого морфогенеза на листовых эксплантах ремонтантной малины наблюдается при использовании штамма А. tumefaciens GANE 7, содержащего ген Ь6 (влияющего на регенерацию).

8. Инокуляция A. rhizogenes дикого типа в несколько раз увеличивает процент укоренения у трудноукореняемых форм ремонтантной малины.

9. Получены трансформированные растения малины с генами nptll, lie В. Факт трансформации подтверждается устойчивостью растений к канами-цину, анализом активности термостабильной лихеназы, PCR анализом на наличие гена nptll.

Практические рекомендации

-разработанную методику регенерации можно использовать для размножения ценных образцов ремонтантной малины.

- для селекции трансформантов ремонтантной малины предлагается использовать двухэтапную схему, 3 мг/л канамицина на этапе регенерации и 15 мг/л для образовавшихся побегов.

-для повышения регенерационного потенциала некоторых образцов ремонтантной малины использовать штамм агробактерии GANE 7.

-предложенная схема трансформации с помощью кокультивирования листовых эксплантов с культурой агробактерии может быть использована для получения трансгенных форм малины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соболева, Анна Геннадьевна, Москва

1. Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Дж. Агробактериальные трансформирующие векторы растений. // Генная инженерия растений., М.: Мир, 1991, с. 11-83.

2. Белоногова М. А., Ралдугина Г. Н., Кубрак С. А. Побегообразование на семядольных эксплантах различных генотипов льна обыкновенного {Linum usitatissimum) Тезисы докладов V Съезда общества физиологов растений России. Пенза 2003.

3. Бурдейная Т. В. Агробактериальная трансформация малины красной (Rubus ideus). Сборник тезисов. Саратов 2003, с. 59.

4. Бутенко Р. Г Состояние и перспективы изучения морфогенеза растений // В Сб. Всесоюз. Общества физиологов растений. 1990. Вып.8 С. 5-8

5. Бутенко Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М., 1975. С.48-65

6. Бутенко Р. Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro II1 Чайлахян. Чтения. Пущино: Пущинский Н Ц, 1994. С.7-26.

7. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.

8. Бутенко Р. Г. Использование культуры тканей растений в сельскохозяйственной науке и практике. // Сельскохозяйственная биология. 1979, Т. 14, №3, С. 306-315.

9. Вовк В В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro II Дисс. Канд. с.-х. наук. Брянск., 2000.

10. Высоцкий В. А., Упадышев М. Т., Соломонова Ф. Н. Особенности регенерации растений изолированными пыльниками и листовыми дисками ягодных культур in vitro II Сельскохозяйственная биология. 1998, № 3, С. 44-50.

11. Высоцкий В. А. особенности клонального микроразмножения некоторых форм ремонтантной малины // плодоводство и ягодоводство России / Сб. научных трудов ВСТИСП. М., 1996. ТЗ.С. 90-95

12. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта.- М.: Колос, 1979,416 с.

13. Казаков И. В. Проблемы и перспективы создания сортов малины ремонтантного типа // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России. Мичуринск. 1995. с. 26-29

14. Казаков И. В. Проблемы и перспективы создания сортов малины ремонтантного типа. // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России. Мичуринск. -1995. с. 26-29.

15. Казаков И. В., Рожнов Н. И., Евдокименко С. Н. Совершенствование исходных форм малины ремонтантного типа. // Генетика и наследование важнейших хозяйственных признаков плодовых растений. Мичуринск.-1994, с. 64-69

16. Казаков И. В. Перспективное направление селекции малины // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых Брянск 2001 С. 85

17. Каляева М. А., Захарченко Н. С., Бурьянов Я. И. Способность однодольных растений индуцировать процессинг агробактериальной Т-ДНК. // Физиология и биохимия культурных растений. 2000. Т. 32. № 3. С. 209-218.

18. Колесниченко В. М. Генетическая инженерия древесных растений. // Лесоведение. 1989. № 6. С. 73-83.

19. Кучук Н. В. Генетическая инженерия высших растений. Киев. Науко-ва думка. 1997.

20. Лутова Л. А., Бондаренко Л. В., Бузовкина И. С., Левашина Е. А., Тихо деев О. Н., Ходжайова Л. Т., Шарова Н. В., Шишкова С. О., Влияние генотипа растения на регенерационные процессы. // Генетика. Т. 3, №8, с. 1065-1074.

21. Матвеева Т. В., Лутова Л. А., Нестер Ю. Опухолеобразование у растений. // Генетика. 2001. Т. 32. № 9. с. 1188-1197.

22. Машкина О. С., Буторина А. К. Генетическая инженерия лесных древесных растений. // Генетика. 2003. Т. 39. № 3. С. 309-317.

23. Меркулов СМ. Разработка методов генетической трансформации груши (Pyrus communis L.) с использованием обезоруженных штаммов Agrobacterium tumefaciens II II Росс. Симп. «Новые методы биотехнологии растений», 18-20 мая 1993 г. Пущино-на-Оке, 1993. С. 32.

24. Меркулов С. М., Бартиш И. В., Глеба Ю.Ю. Регенерация адвентивных побегов из листовых тканей груши (Pyrus communis L.) II Физиология и биохимия культурных растений. 1993. Е. 25. № 4. С. 375-380.

25. Меркулов С. М., Бартиш И. В., Долгов С. В., Пастернак Т. П., Мак-хьюген А. Генетическая трансформация груши (Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens. II Генетика. 1998, Т. 34, № 3, с. 373-378.

26. Монзави- Карбасси Б., Голденкова И. В., Дарбинян Н. С., Василенко

27. B. Т., Кобец Н. С., Пирузян Э. С., Эффективная секреция бактериальной {3- глюканазы в межклеточное пространство трансгенных растений табака Nicotiana tabacum // Генетика. 1998. Т. 34. С. 475-479.

28. Монзави- Карбасси Б., Голденкова И. В., Кобец Н. С., Мусийчук К. А., Волкова Л. В., Пирузян Э. С. Гетерологическая экспрессия гена licB Clostridium thermocellum в протопластах табака//Генетика. 1997. Т. 33.1. C. 904-910.

29. Муратова С. А. Регенерация адвентивных побегов из листовых экс-плантов сливы (Prunus domestica). Сборник тезисов. Саратов 2003.с. 219.

30. Мусийчук К. А. Бифункциональные репортерные системы для про- и эукариот на основе делеционного варианта термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum. Автореферат дисс. М.: 2001.

31. Муромцев Г. С., Чкаников Д. И., Кулаева О. Н., Гамбург К. 3. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агро-промиздат, 1987,383 с.

32. Новоселя Т. В, Дейнеко Е. В., Шумный В. К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum) с множественными инсерциями Т-ДНК. // Генетика. 2000 Т. 36. № 3. с. 427.

33. Пирузян Э. С., Андрианов В. М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. // М. Наука. 1985. 279 с.

34. Ралдугина Г. Н., Малышенко С. И. Тюлькина Л. Г., Зверева С. Д. Ген GFP в качестве маркерного гена при создании трансгенных растений Brassica campestris L .Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. Санкт-Петербург. 2001.

35. Сковородников Д. Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины Дисс. Канд. с.-х. наук. Брянск., 2004

36. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений. // В кн.: Биотехнология растений: культура клеток. М., 1989. С. 97-127.

37. Туровская Н. И. Микроклональное размножение яблони и груши in vitro II Садоводство и виноградарство.- 1994.- N 1,- С. 10-12.

38. Туровская Н. И., Стрыгина О. В., Формирование адвентивных почек на эксплантах малины. // Сортоизучение и селекция плодовых и ягодных культур. Сборник научных трудов НИИ им. И. В. Мичурина. Мичуринск. 1992. с. 82-84.

39. Упадышев М. Т. Высоцкий В. А. Регенерационная способность экс-плантов рода Rubus в зависимости от длительности культивирования in vitro. И Сельскохозяйственная биотехнология. 1995. № 1. С. 85-88.

40. Упадышев М. Т. Клональное микроразиножение некоторых нетрадиционных культур рода Rubus. И Ягодоводство в Нечерноземье. 1993.

41. Хамукова Ф. Н. Регенерация растений земляники и малины из экс-плантов различного происхождения. // Автореф. Дисс. Канд. с. -х. наук. М., 1994. 22с.

42. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro. IIВ кн.: Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., 1987. С. 105-133.

43. Шевелуха В. С., Калашникова Е. А., Дегтярев С. В., Кочиева Е. 3., Прокофьев М. И., Новиков Н. Н., Ковалев В. М:, Калашников Д. В. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа. 1998. 416 с.

44. Юсуфов А. Г. Регенерация высших растений М., 1982. с. 176

45. Яцина А. А., Концевая И. И. Культура тканей трех видов рода Rubus. // Абстракты VIII интернациональной конференции. Биология растительных клеток in vitro и биотехнология. Саратов 9-13 сентября 2003 г.

46. Abhaya M. Dandekar, Gale h. McGranaham et al. Engineering for apple and walnut resistance to codling moth. // Brighton crop protection conference. 1992.

47. AmbroziS Turc B., Swartz H. J., Zimmerman R. H. Adventitious shoot regeneration from in vitro-cultured leaves of Rubus genotypes. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. V.38. P. 11-17.

48. An G. Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells. // Plant Physiology. 1986. V. 81. P. 86-91.

49. Anderson W. C. Tissue culture propagation of red and black raspberries, Rubus ideus and Rubus occidentalis. /7 Acta Horticulturae. 1980. N. 112. P. 13-20.

50. Bagyan I. L., Revenkova E. V., Pozmogova G. E. 5-Regulatory region of Agrobacterium tumefaciens T-DNA gene 6b direct organ-specific, wound-inducible and auxin-inducible expression in transgenic tobacco. // Plant Mol. Biol. 1996.V. 29. P. 1299-1304.

51. Baker B. S., Bhatia S. K. Factors affecting adventitious shoot regeneration from leaf explants of quince (Cydonia oblonga) II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. N.35 P. 273-277.

52. Barcelo M., El-Mansouri I., Mercado J. A., Quesada M. A., Alfaro F. P. Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1998. N. 54 P. 29-36.

53. Bartish I. V., Merkulov S. M., Korchovoy V. I. Genetic transformation of apple and pear cultivars mediated by Agrobacterium tumefaciens, strain A281 // Idid. Kiev, 1994. P. 42.

54. Billings S. G., Chin C. K., Jelenkovic G. Regeneration of blueberryplant-lets from leaf segments // Horticular Science. 1988. N. 23 P.763-766

55. Binns A. N., Thomashow M. F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants. // Ann. Rev. Microbiol. 1988. V.42. P.575-606.

56. Brishbane P. G., Kerr A. Selective media for three biovars of Agrobacte-rium II J. Appl. Bacteriol. 1983. V. 54. P. 425-431.

57. Caplan A., Herrerra-Estrella L., Inze D., Van Haute E., Van Montagu M., Schell J., Zambryzki P. Introduction of genetic material into plant cells. // Science. 1983. N. 222. P. 21-815.

58. Cassells A. C., Morrish F. M. Growth measurement of Begonia rex Putz 'Lucille Closon' as a consequence cell ontogeny, callus ageing, recycled ax-enic leaves and callus. // Scientia Hort. 1985. V. 27. P. 113-121.

59. Chevreau E., Skirvin R., Abu-Qaoud H. A., Korban S. S., Sullivan J. G., Adventitious shoot regeneration from leaf tissue of three pear (Pyrus sp.) cultivars in vitro. II Plant Cell Reports., 1989 V. 7 P.688-91.

60. Cousineau J. C., Donnely D. J. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of tissue cultured and greenhouse-grown raspberry. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. N.27 P. 249-255.

61. D'Amato F. Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants. In: T. A. Thorpe (Ed.) Frontiers of plant tissue culture, International Association of Plant Tissue Culture, U. of Calgary, Canada. 1987. p. 278-295.

62. Dandekar A. M. Transformation. In: Hammerschlag FA & Litz RE (Eds) Biotechnology of Perennial Fruit Crops 1992. P. 141-168. C. A. B International, Wallingford, UK

63. Dandekar A. M., Martin L. A., McGranahan G. H Genetic transformation and foreigh gene expression in walnut tissue. // Am. Soc. Horticular Science., 1988. V. 113. P. 945-949.

64. De Block M. Factors influencing the tissue culture and the Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of hybrid aspen and poplar clones. // Plant Physiology. 1990. N.93. P.l 110-1116.

65. De Bondt A., Eggermont K., Penninckx I. et al. Agrobacterium-mediated transformation of apple (Malus domestica Borkh.): an asessement of factorsaffecting regeneration of transgenic plants. // Plant Cell Reports. 1996. V. 15. №7. p. 549-554.

66. Deca P. C., Sen S. K. Differentiation in calli originated from isolated protoplasts of rice (Oryza sativa L.) through plating technigue. // Molec. Gen. Genet. 1976. V. 145. P.239.

67. DeFaria M. J. S. S., Donnelly D. J., Cousineau J. C. Adventitious shoot regeneration and Agrobacterium — mediated transformation of red raspberry. Arquivos de biologia Etechnicologia. 1997. N. 40(3). P. 32-529.

68. Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H. Nopaline synthase transcript mapping and DNA sequence. // Mol. Appl. Genet., 1982. V. l.P. 561.

69. Drummond M. H., Gordon M. P., Nester E. W., Chilton M. D. Foreigh DNA of bacterial plasmid origin is transcribed in crown gall tumors. // Nature. 1977. V. 269. P. 535.

70. Economou A. S., Read P. E. Effect of benzyladenine pretreatments shoot proliferation from Petunia leaf segments cultured in vitro. // Proc plant Growth regulators working Group. 1980 N.7 P. 96-103.

71. Elobeidy A., Korban S. S. The effect of thidiazuron on shoot regeneration from apple leaf discs. // Horticular Science. 1988. N. 23 P.755

72. Engler G., Depicker A., Maenhaut R. et al Physical mapping of DNA base sequence homologies between an octopine and nopaline tiplasmid of Agro-bacterium tumefaciens. // Mol. Biol. 1981. V. 152. P. 183-208.

73. Eriksson O., Bremer B. Genet dynamics of the clonal plant Rubus saxatilis. II Journal of Ecology. 1993. V. 81. P.41-533.

74. Fasolo F., Zimmermann R. H., Fordham I. Adventitious shoot formation on excised leaves of in vitro grown shoots of apple cultivars. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989 V. 16 P.75-87.

75. Feldmann K. A., Marks M. D. Agrobacterium-medited transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: A non-tissue culture approach. // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

76. Fiola J. A., Hassan M., Swartz H. J., Bors R., McNicol R. J. The effect of thidiazuron, light fluence rate and kanamycin on shoot regeneration from excised Rubus cotyledons and in vitro leaves. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture (in press) 1989.

77. Fiola J. A., Swartz H. J. Somatic embryogenesis, organogenesis and proliferation In vitro from Rubus embryos. // Acta- Horticulturae 1986. N. 183. P. 91-98.

78. Gasser C. S., Fraley R. T. Genetically engineering plants for crop improvement. // Science. 1989 244. 1293-1299.

79. Gingas V. M., Stokes B. D. Rubus plant regeneration via asexual embryogenesis. // Horticular Science. 1993. N. 28. P. 58.

80. Glenn T. Howe, Barry Goldfarb & Steven H. Strauss. Agrobacterium-mediated transformation of hybrid poplar suspension cultures and regeneration of transformed plants. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. V.36. P.59-71.

81. Godwin I., Gordon T., Ford-Lloyd B., John Newbury H. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterrium-mediated transformation vary according to plant species.// Plant Cell Reports., 1991 V. 9 P.671-675.

82. Graham J., Gordon S. C., McNicol R. J. The effect of the CpTi gene in strawberry against attack by vine weevil (Otiorhynchus sulcatus F. Coleóptera: Curculionidae). // Ann. appl. Biol., 1997 N.131. P. 133-139.

83. Graham J., Iasi L., Millam S. Genotype- specific regeneration from a number of Rubus cultivars. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. N. 48 P. 167-173.

84. Graham J., McNicol R. J. An examination of the ability of RAPD markers to determine the relationships within and between Rubus species. // Theor. Appl. Gen. 1995. N. 90. P. 1128-1132.

85. Graham J., McNicol R. J., Greig K. Towards genetic based insect resistance in strawberry using the Cowpea trypsin inhibition gene. // Ann. appl. Biol., 1995 N.127 P. 163-173.

86. Graham J., McNicol R. J. An examination of the ability of RAPD markers to determine the relationships within and between Rubus species. // Theoretical and Applied Genetics. 1995. V. 90. P. 32-1128.

87. Graham J., McNicol R. J., Kumar A. Use of the GUS gene as selectable marker for Agrobacterium- mediated transformation of Rubus. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. N.20 P. 9-35.

88. Haccius B. Question of unicellular origin of nonzygotic embryos in callus cultures. // Phytomorphology. 1978. V. 28.P. 47-81.

89. Hall H. K., Quazi M. H., Skirvin R. M. Isolation of a pure thornless Lo-ganberyy by meristem tip culture. // Euphytica. 1986. N. 35. P.44-1039.

90. Hammerschlag F. A., Bauchan G., Scorza R. Regeneration of peach plants from callus derived from immature embryos. // Theor Appl Genet. 1985. V. 70. P. 248-251.

91. Hassan M. A., Swartz H. J., Inamine G. Mullineaux P. Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of several Rubus genotypes and recovery of transformed plants. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. N. 33 P. 9-17.

92. Hess K. M., Lynn M. W., Joerger R. D., Binns A. N., Mechanism of phenolic activation of Agrobacterium virulence genes: Development of aspecific inhibitor of bacterial sensor | respons systems. // Plant Mol. Biol., 1991. V.17., 1013-1021

93. Hoepfher A. S., Nestby R., Nybom H. Genetic deviation initiated by adventitious shoot regeneration from tissue cultured raspberry. // Horticular Science. 1996. V. 71. P. 71-9.

94. Horsch R. B., Fry J., Hoffmann N., Rogers S. G., Fralev R. T., A simpl and general method for transferrung genes into plants. // Science. 1985. V.227. P.1229-1231.

95. Howard E., Citovsky V. The emerging structure of the Agrobacterium T- DNA transfer complex. // Bio. Essays. 1990. V. 12. P. 103-108.

96. James D. J., Passey A. J., Barbara D. J., Bevan M. W. Genetic transformation of apple (Malus pumila Mill.) using a disarmed Ti-binary vector. // Plant Cell Reports 1989 V. 7, P. 658-661.

97. James D. J., Passey A. J., Rugini E. Factors affecting high frequency plant regeneration from apple leaf tissues cultured in vitro. // Plant Physiology. 1988. N. 132. P.148-154.

98. James D.J., Mackenzie KAD, Malhotra S. B. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstocks // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1984. V.3. P.333-341.

99. James D.J., Mackenzie KAD, Malhotra S. B., The induction of hexap-loidy in cherry rootstocks using regeneration techniques. // Theor Appl Gen 1987. V. 73. P. 589-594.

100. James D.J., Passey A. J., Barbara D.J., Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa Duch) using disarmed binary vector. // Plant Science. 1990. N. 69. P. 79-94.

101. Kado C. I. Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. // Grit. Revs. Plant Science. 1991. V. 10N. 1 P. 1-32.

102. Kerns H. R:, Meyer M. M., Tissue culture propagation of Acer x-Freemanii using thidiazuron to stimulate shoot tip proliferation. // Horticular Science. 1986. N. 21. P. 1209-1210.

103. Klee H. J., Gordon M. P., Nester E. W. Complementetion analysis of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid mutation affecting oncogenicity. // Bacteriol. 1982 V. 150. P. 327-331.

104. Korban S. S., O'Connor P. A., Elodeidy A. Effects of thidiazuron, naphthaleneacetic acid, dark incubation and genotype on shoot organogenesis fromMalus leaves. // Horticular Science. 1992. N. 67. P. 341-349.

105. Kouider M., Skirvin R. M., Korban S. S. Widholm J. M. Hauptmann R. Adventitious shoot formation from Red Delicious apple cotyledons in vitro II Horticular Science. 1984. N. 59. P. 295-302

106. Lane W. D., Cossio F. Adventitious shoots from cotyledons of immature cherry and apricot embryos. // Can J. Plant Science. 1986. N. 66. P. 953-959.

107. Larkin P. M., Scowcroft W. R. Somaclonal varion — a novel source of variability from cell culture for plant improvement. // Theor. Appl. Genet. 1981. V. 60. P. 197-214.

108. Leblay C., Cheveau E., Raboin L. M. Adventitious shoot regeneration from in vitro leaves of several pear cultivars (Pyrus communis L.J. II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. V.25. P.99-105.

109. Leemans J., Deblaere R., Willmitzer L., De Greve H., Hernalsteens J. P., Van Montagu M., Schell J. Genetic identification of functions of Tl-DNA transcripts in octopine crown galls. // EMBO 1982. V. 1. P.147.

110. Lindsey K., Jones M. G. K., Elektroporation of cells. // Physiol. Plant., 1990. V. 79. P. 168-172.

111. Liu J. R., Sink K. C., Dennis F. G. Plant regeneration from apple seedling explants and callus culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1983. V.2. P.293-304.

112. Lui Z. R., Sanford J. C., Plant regeneration by organogenesis from strawberry leaf and runner tissue. // Horticular Science. 1988 23. P. 10571059.

113. Machado da Camara M. L., Machado C. A. Regeneration of transgenic plants of Prunus armeniaca containing the coat protein gene of Plum Pox Virus // Plant Cell Reports. 1992. V. 11.1 P. 25-29.

114. Maheswaran G., Williams E. G. Uniformity of plants regenerated by direct somatic embryogenesis from zugotic embryos of Trifolium repens. // Annals of Botany. 1987. V. 59. P. 93-97.

115. Mante S., Cornell U., Morgens P., Scorza R., Cordts J., Callahan A. Agrobacterium -mediated transformation of plum (Prunus domestica) hypo-cotul segments and regenetation of transgenic plants. // Bio. Technology. 1991. V. 9. P.853-857.

116. Mante S., Scorza R., Cordts J. M. Plant regeneration from cotyledons of Prunus persica, Prunus domestica, and Prunus cerasus. II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989. N. 19 P. 1-11.

117. Mante S., Scorza R., Cordts J. Plant regeneration from mature plum (Prunus domestica) cotyledons. In vitro cellular dev. // Boil. 1988. N. 24. P. 39.

118. Mathews H., Wagoner W., Cohen C., Kellogg J., Bestwick R. Efficient genetic transformation of red raspberry, Rubus ideus. I I Plant Cell Reports., 1995 V. 14 P.6-471.

119. McGranahan G. H., Leslie C. A., Uratsu S. L., Dandekar A. M. Im-pruved efficiency of the walnut somatic embrio gene transfer system. // Plant Cell Reports. 1990. V. 8. 10. P. 512-516.

120. McGranahan G. H., Leslie C. A., Uratsu S. L., Martin L. A., Dandekar A. M. Agrobacterium- mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic plants. // Bio technology, 1988. V. 6. P. 800804.

121. McNicol R. J., Graham J. Genetic manipulation in Rubus and Ribes. // Acta- Horticulturae. 1989. N. 262. P. 41-46.

122. McNicols R. J., Graham J. In vitro regeneration of Rubus from leaf and stem segments. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. N. 21 P. 45-50.

123. Meins F. Heritable variation in plant cell culture. // Ann. Rev. Plant Physiology. 1983. V. 34. P. 327-343.

124. Millan-Mendoza B. Regeneration of Rubus in vitro using forchlor-fenuron (CPPU). // Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1998. V. 15. P. 242-248.

125. Millan-Mendoza B., Graham J. Organogenesis and micropropagation in red raspberry using forchlorfenuron. // Horticultural science & biotechnology. 1999. N. 74(2). P. 219-223.

126. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assay with tobacco tissue cultures. // Physiologia plantarum. 1962. N 15. P. 473-497.

127. Nehra N. S., Chibbar R. N., Kartha K. K., Datla R. S., Crosby W. L., Stushnoff C. Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system. // Plant Cell Rep., 1990, N.9., P.293-289.

128. Nehra N. S., Chibbar R. N., Kartha K. K., Datla R. S. S., Crosby W. L., Stushnoff C. Agrobacterium- mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants. // Plant Cell Rep.,1990. V. 9. P. 10-13.

129. Nieuwkirk K., Fordham I., Zimmerman R.H. Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro. // Horticular Science. 1987. N. 21. P. 516-518.

130. Nishi S., Ohsawa K. Mass production method of virufree strawberry plants through meristem callus. JARQ. 1973. V. 7, P. 3

131. Nyman M., Wallin A., Improved culture technique for strawberry (Fragaria *ananassa Duch.) protoplasts and the determination of DNA content in protoplast derived plants. // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1992. V. 30. P. 127-133.

132. Ochatt S. J., Caso O. H. Shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of wild pear (Pyrus communis var. pyraster L.) // Plant Physiology. 1986. V. 122., P. 243-249.

133. Ochatt S. J., Power J. B. An alternative approach to plant regeneration from protoplasts of sour cherry (Prunus cerasus L.). // Plant Science, 1988. V. 56. P. 75-79.

134. Owens C.Y De Novoa. Empirical evaluation of in vitro media components for cell growth and shoot regeneration from rubus explants. // New Zealand Natural Sciences. 1992. N. 19. P. 79-86

135. Owens y de Novoa C., Conner A. J., Comparison of in vitro shoot regeneration protocol from Rubus leaf explants. // N. Z. J. Crop. Horticular Science. 1992. N. 20 P. 471-476.

136. Parent J. G., Fortin M. G., Page D. Identification of raspberry cultivars by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. // Plant Science. 1993. V. 73. P. 22-1115.

137. Patat-Ochatt E. M., Ochatt S. J., Power J. B., Plant regeneration from protoplasts of apple rootstocks and scion varieties (Malus *dom estica Borkh.).// Plant Physiology 1988. V. 133. P. 460-465.

138. Pena A., Lozz H., Shell J. Transgenic rye plants obtained by injection DNA into young floral tillers. // Nature. 1987. V. 325. P.274-276.

139. Petersen S., Stummann B., Olesen P., Henningsen K. Structure and function of root-inciding (Ri) plasmids and their relation to tumour inducing (Ti) plasmids // 1989. V. 77. P. 427-435.

140. Pierik R. L. M. In vitro culture of higher plants. Dordrecht etc.; Ni-jhoff., 1987. V.5.P.344.

141. Piruzian E. S., Monzavi- Karbassi B., Darbinian N. S., Goldenkova I. V., Kobets N. S., Mochulsky A. V., The Use of Termoactive p-Glucanase Gene from Clostridium thermocellum as a Reporter Gene in Plant. // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 257. P. 561-567.

142. Pollock K., Bartield D. G., Robinson S. J., Shields R. Transformation of protoplast-derived cell colomies and suspension cultures by Agrobacte-rium tumefaciens. // Plant Cell Reports., 1985. V. 4 P. 202-205.

143. Predieri S., Malavasi F. F. F., Passey A. J., Ridont M. S., James D. J. Regeneration from in-vitro leaves of "Conference" and other pear cultivars (Pyrus communis L.). // Horticular Science., 1989 N.64. P.553-559.

144. Preece J. E., Huetteman C. A., Puello C. H., Neuman M. C., Influence of thidiazuron on in vitro culture of woody plants. // Horticular Science. 1988. V. 22. P.1071.

145. Read P. E., Yang G., Auko C. O. Effectiveness of thidiazuron and CPPU as cytokinin-like compounds. In Vitro. 1992. V. 28 (2). P. 57.

146. Rout G. R., Debata B. K., Das P. In vitro regeneration of shoots from callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora. // Indian Journal of Experimental Biology. 1992. N. 30 P. 15-18.

147. Rubluo A., Kartha K. K., Mroginski L. A., Dyck J. Plant regeneration from plant pea leaflets cultured In vitro and genetic stability of regenerants. // Plant Physiology 1984. V. 117. P.l 19-130.

148. Rubos A. C., Pryke J. A. Morphogenesis in embryonic tissue cultures of apple. // Horticular Science., 1984 N.59. P.469-475.

149. Salomon F., Deblaere R., Leemans J., Hernalsteens J. P., Van Montagu M., Schell J. Genetic identification of functions of Tr-DNA transcripts in octopine crown galls. // EMBO 1984.V. 3. P.141.

150. Schuerman P.L., Dandekar A. M. Transformation of temperate woodycrops: progress and potentials. // Scientia Horticulturae. 1993. V. 55 P. 101-124.

151. Scott R. J., Draper J. Transformation of carrot tissues derived from proembryogenie suspension cells: A useful model system for gene expression snudies in plats. // Plant. Mol. Biol. 1987. V.8. P.265-274.

152. Sheikholeslam S.N.,Weeks D.P., Acetosyrengone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens. II Plant. Mol. Biol. 1987. V.8. P.291-298;

153. Skirvin R. M. Natural and induced variation in tissue culture. // Euphytica. 1987. V. 27. P. 66-241

154. Skirvin R.M. Natural and induced variation in tissue culture. // Euphytica.- 1978.- V.27.- P. 241-66.

155. Sorvari S., Ulvinen S., Hietaranta T., Hiirsalmi H. Preculture medium promotes direct shoot regeneration from micropropagated strawberry leaf disks. // Horticular Science. 1993 N.28(1). P. 55-57.

156. Spencer P. A., Towers G. H. N. Specificity of signal compounds detected by Agrobacterium tumefaciens. // Phytochemistry. 1988. N. 27. P. 2933-2937.

157. Sriskandarajah S., Goodwin P. B., Speirs J. Genetic transformation of the apple scion cultivar "Delicious" via Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. V.36. P.317-329.

158. Stachel S. E., Messens E., Van Montagu M., Zambryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. II Nature. 1985 N.318 P.624-629.

159. Stachel S. E., Zambrysky P. C. Vir A and VirG controlthe plant-induced activation of the T-DNA transfer process of A. tumefaciens. II Cell. 1986. V. 46. P. 325-333.

160. Sunderland N. Nuclear cytology. In Plant Tissue and Cell Culture, ed. H. E. Street, 1977.- P. 177-205. London: Blackwell Scientific Publications.

161. Swartz H. J., McNicols R., Hyman B. The use of Agrobacterium as a genetic vector in Rubus. // Annu Rep Scottish Crop Rep Inst 1987 V. 7. P. 85-86.

162. Swartz H. J., Bors R., Mohamed F., Naess K. The effect of in vitro pretreatments on subsequent shoot organogenesis from excised Rubus and Malus leaves. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. N. 21. P. 179184.

163. Swartz H.J., Galetta G.J., Zimmerman R.H. Field performance and phenotypic stability of tissue culture-propagated strawberries. // Am. Hor-ticular Science. 1981.-V. 106.-P. 667-675.

164. Taryono , Zoglauer K., Thiel J. Stable stage-specific expression of the

165. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: Sexual transmission of the genotype and phenotype. // Cell. 1984. V. 37. P. 959-967.

166. Theiler-Hedtrich C. & Theiler-Hedtrich R. Influence of TDZ and BA on adventitious shoot regeneration from apple leaves. // Acta- Horticulturae. 1990. N 280. P. 195-199.

167. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes. // Trend in plant science. 1996. V.l . P. 178-184.

168. Trifonova A., Madsen S., Olesen A. Agrobacterium- mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions. //Plant science. 2001. V.161. P. 871-880.

169. Turk B. A., Swartz H.J. & Zimmerman R. H. Adventitious shoot regeneration in vitro-cultured leaves of Rubus genotypes. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. N. 38 P. 11-17.

170. Van Nieuwkerk J. P., Zimmerman R. H., Fordham I. Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro. II Horticular Science. 1986. N. 21. P. 516-518.

171. Vansil V. Vasil I. K. The ontogeny of somatic embryos of Pennisetum americanum (L.) K. Schum. L. in cultured immature embryos. // Bot. Gaz. 1982. V. 143. P. 454-456.

172. Von Arnold S. & Eriksson T. Induction of adventitious buds on embryos of Norway spruce grown in vitro. // Physiologia Plantarum.- 1978.-V. 44.- P. 283-7.

173. Wabiko H., Minemura M. Exogenous phytohormone-independent growth and regeneration of tobacco plants transgenic for the 6b gene of

174. Agrobacterium tumefaciens AKE10. // Plant Physiology 1996. V. 112. p.939-951.

175. Wang D., Wergin W. P., Zimmerman R; H. Somatic embryo genesis and plant regeneration from immature embryos of strawberry. // Horticular Science. 1984. N. 19P.71-72.

176. Wang K., Herrera-Estrella L., Van Montagu M, Zambryski P. Right 25 bp terminus sequence the nopaline T-DNA is essential for and determines direction of DNA transfer from Agrobacterium to the plant genom. // Cell. 1984. V.38.P.455.

177. Welander M In vitro of culture of raspberry (R. ideus) for mass propagation // Horticular Science.- 1985.- V. 60, N 4.- P. 493-499.

178. Welander M. In vitro culture of raspberry (Rubus ideaus) for mass propagation. // Horticular Science. 1985. N. 60 (4). P. 493-499.

179. Welander M. Plant regeneration from leaf and stem segments of shoots raised in vitro from mature apple trees // Plant Physiology 1988. V 132. P. 738-744.

180. Welander M., Maheswaran G. Shoot regeneration from leaf explants of dwarfing apple rootstocks. // Plant Physiology. 1992 N.140 P.8-223.

181. Willmitzer L., Beukeller M. de, Lemmers M. et al. DNA from Ti-plasmid is present in the nucleus snd absens from the plastids of crown gall plant cells. // Nature. 1980 V. 287. P. 359-361.

182. Winans S. C. Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions 11 Microbiol. Rev. 1992. V.56. P. 12-31.

183. Winans S. C., Kerstetter R. A., Nester E. W., Transcriptional regulation of the vir A and vir G genes of Agrobacterium tumefaciens // Bacterid. 1988. V. 170. N. 9. P. 4047-4054.

184. Wooi K. C., Wong C. H. Y., Corley R. H. V. Genetic stability of oil palm callus cultures. In: A. Fujiwara (d). Plant tissue culture. The Japanese Association for Plant Tissue Culture. 1982. Tokyo. P. 794-750.

185. Yao J.-L., Cohen D., Atkinson R. et al. Regeneration of transgenic plants from the commercial apple cultivar Royal Gala // Plant Cell Reports. 1995. V. 14 № 7 P.402-412.

186. Zieg R. G., Outka D. A. The isolation, culture and callus formation of soybean pod protoplasts. // Plant Sciens Lett. 1980. V. 18. P. 105.

187. Zhou J. Y., Guo F. X., Luo X. T. Effect of Thidiazuron on somatic embryogenesis of Cayratia japonica. II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. N. 36 P. 73-79.

188. Zhu L. H., Welander M. Adventitious shoot regeneration of two dwarfing peat rootstocks and the development of a transformation protocol. // Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 2000 N.75 6 P. 745752.

189. Zong R. L., Sanford J. C. Plant regeneration by organogenesis from strawberry leaf and runner tissue. // Horticular Science. 1988. N.23(6) P. 1057-1059.

190. Cheveau E., Leblay C. The effect of mother plant pretreatment and explant choice on regeneration from in vitro pear leaves. // Acta Horticul-turae. 1993. V. 336. P. 6-263.

191. Chilton M. D., Drummond M. H., Merlo D. J. et al Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorgenesis. // Cell. 1977. V. 11 P. 263-271.

192. Uematsu C., Murase M., Ichikawa H., Imamura J. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of kiwi fruit. I I Plant Cell Rep., 1991 V. 10. P. 286-290.

193. Uratsu S. L., Ahmadi H., Bringhurst R. S., Dandekar A. M., Relative virulence of Agrobacterium strains on strawberry (Fragaria vasca). // Horticular Science. 1990. V. 26. P. 196-199.