Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации

Хоанг Тхи Жанг

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации"

На права» рукописи

ХОАЦГТХИЖАНГ

ИЗУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХ РАСТЕНИЙ BRASSICA NAPUS L. ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Специальности: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

«WOU06830

1 2 Я HB 2012

МОСКВА-2011

005006830

Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева и в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений имени К. А. Тимирязева РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Калашникова Елена Анатольевна

кандидат биологических наук, Ралдугина Галина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Поляков Алексей Васильевич

доктор биологических наук, профессор Чуб Владимир Викторович

Ведущая организация: Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита диссертации состоится "08" февраля 2012г. в 16й часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10. при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева, по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, тел./факс (499) 976-24-92, (499) 976-08-94

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан" и размещен на сайте \vww.ti;

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время трансформация растений является актуальным направлением исследований в биотехнологии и может быть практическим методом для улучшения растений. Она позволяет решать задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции. Однако при трансформации растений возникают определенные трудности, в том числе связанные с получением химер среди трансформантов.

При изучении наследования в растениях чужеродных генов для большинства трансгенных растений было показано, что трансгены, как правило, наследуются в потомстве самоопыленных трансгенных растений в отношении 3:1, как единый менделевский признак. Однако в некоторых случаях наблюдается наследование в других отношениях, например, только в 3 из 50 семян трансгенного табака содержался встроенный ген npííl (Schmülling, Schell, 1993). Это затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформантами. Поэтому, для создания генетически однородных растений-трансформантов очень важно знать причины подобного явления, одной из которых может быть образование химер, то есть организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток и чтобы исключить их формирование.

Химерность растений-трансформантов описывалась у некоторых видов, например, табака (Schmülling, Schell, 1993; Faize et al., 2010), сои (Christou, 1990), картофеля (Rakosy-Tican et al, 2007), риса (Christou, Ford, 1995), льна (Dong, McHughen, 1993), капусты (Berthomieu et al., 1994) и земляники (Mathews et al., 1995), а также у древесных плодовых растений, например, у яблони (Flachowsky et al., 2008), или у цитрусовых (Costa et al., 2002). Полученные в некоторых случаях химеры составляли до 90% растений-регенерантов. Авторы по-разному объясняют причины возникновения химерных растений: результатом происхождения растений не из одной клетки, а из группы клеток первичного экспланта (Poethig, 1989; Zhu et al., 2007); последствием защиты нетрансформированных клеток от действия селективного фактора трансформированными клетками (Park et al., 1998; Domínguez et al., 2004) или неэффективностью селективных агентов совместно с эндогенной толерантностью (Rakosy-Tican et al., 2007). Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждают причины этого феномена. Выяснение механизмов образования химерных растений позволило бы исключить условия их возникновения.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - изучить химерные растения Brassica napus, полученные при проведении генетической трансформации и выяснить причины их образования.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов при трансформации изучаемых сортов рапса.

2. Изучить образование химерных растений рапса после генетической трансформации.

3. Исследовать экспрессию встроенного гена gfp на этапах каллусообразования и морфогенеза.

4. Провести анализ растений-трансформантов рапса на наличие встроенного гена gfp.

5. Проверить потомство трансгенных растений на наследование встроенного гена gfp.

6. Провести биохимический анализ семян трансгенных и исходных растений рапса.

Научная новизна работы. Оптимизированы условия регенерации и трансформации разных сортов рапса с использованием семядольных и листовых эксплантов. Результаты по протоколу регенерации ярового рапса сорта Подмосковный являются оригинальными и проведены впервые. Получены трансформированные растения из листовых эксплантов сорта Westar и Подмосковный. Впервые проведена трансформация растений рапса без применения селективного фактора и определено его влияние на эффективность трансформации. Впервые установлено влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на дифференциацию побегов, полученных на листовых эксплантах рапса, а также на эффективность трансформации. Выявлены существенные различия в свечении белка GFP в зависимости от первичного экспланта и стадии развития растений-регенерантов. Анализ растений Ti показал, что у трансгенных растений наследование гена gfp зависит от типа исследуемого экспланта. Установлены факторы, оказывающие влияние на проявление неменделевского наследования встроенного гена у трансгенных растений рапса, которые, вероятно, связаны с образованием генотипических химер. Показано, что основным фактором проявления этого является тип первичного экспланта. Выявлено, что расхимеривание не зависит от расположения стручков на цветоносе, но зависит от числа черенкований растений-трансформантов.

Практическая ценность работы. Полученные трансгенные растения рапса с маркерным геном gfp, кодирующим зеленый флуоресцирующий белок,

являются модельным объектом для изучения образования химерных трансгенных растений. Разработанная система получения трансгенных растений рапса может применяться на других сельскохозяйственных растениях, а полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе в курсе дисциплины "Сельскохозяйственная биотехнология".

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 2009); Международной конференции "Molecular aspects of plant development" (Вена, Австрия, 2010); X молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва,

2010); Ш Всероссийском симпозиуме "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" (Москва, 2010); Международной конференции "Plant Transformation Technologies II" (Вена, Австрия, 2011); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2011); XI молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 2011); Международной конференции "Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" (Нижний Новгород, Россия,

2011); VIII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Россия, 2011); 2-й Международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород, Россия, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 статья опубликована в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на /^страницах, включает /J таблиц и /У рисунков. Список литературы содержит ¿ЭДЗисточников, в том числе^^и иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили два сорта ярового рапса (Brassica napus L.): Westar (канадской селекции) и Подмосковный (селекции ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса). В качестве экспланта использовали семядоли, изолированные от пятисуточных стерильных проростков и листовые сегменты, полученные от 6-ти недельных растений-регенерантов. Семена стерилизовали 70% спиртом и 20% раствором гипохлорита натрия, после чего промывали стерильной дистиллированной водой, а затем высаживали на безгормональную

агаризованную среду Мурасиге и С куга (МС) (Murashige, Skoog, 1962), и помещали на сутки в темноту, после чего переносили в световую камеру.

Для трансформации использовали агробактерию Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0, содержащую генетическую конструкцию с маркерным геном gfp под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и селективным геном nptïl, с использованием для обоих генов nos терминаторов (конструкция была получена от сотрудников кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова). Культуру агробактерий выращивали в течение суток при 25-26°С на шейкере в жидкой среде LB, содержащей 50 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина (Км).

Для получения трансгенных растений применяли метод совместного культивирования эксплантов с агробактерией, находящейся на поверхности агаризованной среды (Данилова и др., 2009) по ранее разработанному протоколу (Малышенко и др., 2003). После 2-х суток сокультивирования семядольные экспланты переносили на среду для морфогенеза (среда МС, 1% сахароза, 4 мг/л или 8 мг/л 6-бензиламинопурин (БАП), 0,5 мг/л или 1,0 мг/л нафтилуксусная кислота (НУК)), дополненную антибиотиком цефатоксим (Цф) (800 мг/л) и 3 мг/л абсцизовой кислотой (АБК) и помещали в световую камеру. По истечению двух недель, в одних экспериментах семядольные экспланты переносили на среду для морфогенеза без АБК, дополненную Цф 500 мг/л и без добавления Км. В других экспериментах семядольные экспланты переносили на такую же среду, но с добавлением 15 мг/л Км.

Листовые экспланты после сокультивирования переносили на среду для морфогенеза, содержащую 4, 5, 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, 3 мг/л АБК, 3 мг/л AgN03, 800 мг/л Цф, а также сахарозу: 1% или 0,7%. После двух недель культивирования листовые экспланты переносили на среду для морфогенеза без добавления АБК, но дополненную Цф 500 мг/л.

Через 2-3 недели сформировавшиеся побеги пересаживали на питательную среду для дальнейшего их укоренения и роста. В состав питательной среды на этих этапах был включен Цф в концентрациях 500 и 300 мг/л, соответственно.

Свечение зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдали при использовании флуоресцентного микроскопа или лупы при освещении синим светом (440-480 нм).

Трансгенные растения Т0 обоих сортов были дважды расчеренкованы и высажены в почву в условиях фитотрона для получения потомков Т,. Семена из каждого стручка высевали отдельно.

Трансформанты и потомки Ti проверяли на наличие гена gfp методом ПЦР-анализа с использованием праймеров: eGFP-FW 5'-

CCTGAAGTTCATCTGCACCAC-3'; eGFP-RV 5'-

ACTCC AGC AGGACC ATGTG AT-3' при амплификации по следующему протоколу: 94°С - 4 мин, 30 циклов (94°С - 60 сек, 64°С - 60 сек, 72°С - 60 сек), 72°С - 4 мин. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний. ДНК растений для ПЦР-анализа выделяли по методу Т.М. Fulton et al. (1995).

Амплифицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 0,8% агарозном геле, который окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Содержание белка и жирных кислот определяли в семенах трансгенных растений и исходного сорта Westar по методике В.М. Косолапова и др. (2011) и Г. А. Бережной и др. (1988), соответственно.

Все опыты оставлены в трехкратной биологической повторности. Частоту регенерации определяли в процентах как отношение числа эксплантов, образовавшие побеги, к общему числу эксплантов, помещенных на среду, инициирующую морфогенез. Результаты экспериментов обработаны с использованием программы Excel. Критерий х2 рассчитывали по методике A.B. Смиряева и A.B. Кильчевского (2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов изучаемых сортов рапса

Для успешной генетической трансформации растений на первом этапе необходимо было изучить факторы, влияющие на способность к регенерации семядольных и листовых эксплантов, с целью получения высокой частоты побегообразования.

Для растений вида Brassica napus многие исследователи наблюдали зависимость морфогенетического потенциала от генотипа, источника экспланта, применения регуляторов роста и их соотношения (Ono et al, 2000; Tang et al., 2003; Ben Ghnaya et al., 2008; Ravanfar et al., 2009; Khan et al., 2010). На начальном этапе исследований требовалось определить эффективные регуляторы роста и их концентрации для повышения морфогенетической активности изолированных эксплантов. В качестве цитокининов использовали 6-БАП в концентрациях 4, 5 или 8 мг/л, а в качестве ауксинов - НУК в концентрациях 0,5 или I мг/л.

Ранее было показано (Crouch, Sussex, 1981; Ghasemi et al., 2007; Haddadi et al, 2008), что АБК способствует усилению Побегообразования в каллусных тканях различных видов Brassica, поэтому было интересно проверить действие

АБК (3 мг/л) на регенерационную способность семядольных эксплантов изучаемых сортов рапса (табл.1).

Таблица 1. Влияние сорта и регуляторов роста на морфогенез изолированных эксплантов рапса

Концентрация регуляторов роста, мг/л Частота регенерации, %

семядольных эксплантов листовых эксплантов

БАЛ НУК АБК с. \Vestar с. Подмосковный с. \Уе$еаг с. Подмосковный

4,0 0 0 13,4 ±0,1 0 - -

3,0 _ 35,9 ±12,0 - -

0,5 0 11,7 ±0,1 4,7 ±0,1 - -

3,0 89,0 ±7,8 92,2 ±0,1 - -

1,0 0 18,3 ±0,1 14,1 ±0,2 - -

3,0 83,6 ± 10,0 37,5 ± 13,0 51,4 ± 17,2 7,1 ±0,3

8,0 1,0 0 10,4 ± 0,1 6,9 ±0,1 - -

3,0 91,1 ±0,1 72,7 ± 12,1 563 ± 17,9 47,9 ± 14,5

5,0 1,0 3,0 - - 70,1 ± 14,7 46,3 ±13,6

«-» - не проверяла

Из данных табл. 1 следует, что на частоту регенерации побегов на семядольных эксплантах изучаемых сортов существенное влияние оказало добавление в питательную среду АБК, увеличив её в 7-8 раз. Для с. \Vestar на семядольных эксплантах частота регенерации составила до 91,1% на среде, содержащей 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, а для с. Подмосковный -92,2% на среде, содержащей 4 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.

Исходя из полученных результатов, в дальнейших экспериментах при изучении регенерации на листовых эксплантах мы использовали среды с обязательным добавлением АБК.

На листовых эксплантах с. \yestar наибольшую частоту побегообразования (70,1%) получали при концентрации 5 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, а для с. Подмосковный (47,9%) - 8 мг/л, 1 мг/л и 3 мг/л, соответственно (табл. 1).

Регенерацию побегов наблюдали по срезанному краю как семядольных, так и листовых эксплантов. Эта особенность может играть положительную роль при проведении трансформации, так как известно, что трансформация и пролиферация трансформированных клеток происходят, как правило, вокруг раневой поверхности.

Экспериментально установлено, что на одних и тех же эксплантах нередко наблюдали оба типа органогенеза - как корне-, так и побегообразование. Однако в зависимости от типа первичного экспланта образование меристематических зон происходило по-разному. На семядольных эксплантах побеги формировались из небольшой каллусной ткани, которая образовывалась

на черешке семядолей, а на листовых эксплантах - во многих местах вдоль срезанного края первичного экспланта, минуя образование каллуса. Несмотря на то, что частота регенерации на листовых эксплантах значительно ниже, чем на семядольных, суммарное число побегов, полученных в этом варианте, было выше. Следует отметить, что растения-регенеранты, формирующиеся на листовых сегментах, как правило, характеризовались слабой дифференцировкой и подвергались витрификации.

Было исследовано и влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на получение растений-регенерантов с неизмененной морфологией на листовых эксплантах с. Westar (табл.2). В результате исследований было установлено, что понижение концентрации сахарозы приводило к некоторому повышению частоты образования побегов и к уменьшению их витрификации.

Таблица 2. Влияние сахарозы на частоту дифференцированных побегов

Концентрация сахарозы, % Частота дифференцированных побегов, %

1,0 7,6 ± 0,3

0,7 8,7 ± 0,3

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что регенерационный потенциал рапса зависит от сорта, типа первичного экспланта, а также от класса и концентрации применяемых регуляторов роста. Разработанный нами протокол регенерации различных сортов рапса позволил получать в достаточном количестве растения-регенеранты для проведения дальнейшей работы по генетической трансформации.

2. Трансформация двух типов эксплантов рапса

Следующим этапом нашей работы было проведение агробактериальной трансформации рапса.

2.1. Освобождение эксплантов от бактериальной инфекции

Одной из основных проблем трансформации растений с помощью Agrobacterium tumefaciens является освобождение эксплантов от бактерий после сокультивирования. В наших исследованиях был использован цефотаксим в качестве антибиотика для элиминации агробактерий. По литературным данным при проведении трансформации Цф входит в состав питательной среды в концентрациях от 100 до 500 мг/л (Данилова, Долгих, 2004; Bade, Damm, 1993; Khan et al., 2003; Khan et al., 2009). В нашей работе с целью полной элиминации агробактерий, Цф добавляли в питательную среду в концентрации 800 мг/л на

этапе индукции образования побегов с последующим его постепенным уменьшением в среде до 300 мг/л - на этапе черенкования и укоренения.

2.2. Влияние сорта и регуляторов роста на частоту регенерации при агробактериалыюй трансформации

Известно, что при проведении трансформации агробактерии сильно ингибируют побегообразование. Этот факт отмечен и в наших исследованиях. Регенерация снизилась на 10-50% в зависимости от исследуемого сорта и первичного экспланта (табл. 3). Установлено, что среда, содержащая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, была оптимальной для проведения трансформации как на семядольных, так и на листовых эксплантах обоих сортов рапса. Наиболее высокой регенерационной способностью обладали семядоли - 79,9% у с. Подмосковный и 70,5% у с. \Vestar. На листовых эксплантах частота побегообразования была ниже и составила 66,1% у с. \Vestar и 30,9% у с. Подмосковный.

Таблица 3. Влияние регуляторов роста на частоту регенерации при трансформации эксплантов различных сортов рапса

Концентрация регуляторов роста, мг/л Частота регенерации при трансформации, %

семядольных эксплантов листовых эксплантов

БАП НУК АБК с. \Vestar с. Подмосковный с. \Vestar с. Подмосковный

4,0 0,5 3,0 62,7 ± 7,5 37,6 ±9,5 - -

1,0 3,0 61,1 ± 13,3 69,4 ± 6,9 20,8 ±9,6 -

8,0 1,0 3,0 70,5 ± 9,3 79,9 ±5,5 66,1 ± 12,7 30,9 ±12,5

5,0 1,0 3,0 - - 15,3 ±0,2 42,1 ± 16,2

«-» - пс проверяли

Полученные результаты показали, что регенерационная способность побегов при проведении агробактериальной трансформации также зависела от сорта, типа эксплантов и компонентов питательной среды.

3. Анализ растений-трапсформантов

Наличие гена в трансформированных растениях было подтверждено с помощью ПЦР-анализа ДНК, выделенной из растений-трансформантов. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК исходного растения, в качестве положительного - плазмидную ДНК вектора рА3011. На рис. 1, можно видеть четкие полосы, специфичные для гена Длина амплифицируемого фрагмента составляла 539 н.п. и соответствовала рассчитанной.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК растевий рапса со специфичными к

гену £//> праймерами: М - маркер 1КЬ; С+ - положительный контроль; С--

отрицательный контроль; \У - дистиллированная вода; 1-8 - ДНК трансгенных растений рапса

Таким образом, в ДНК полученных растений-регенерантов после проведения трансформации было подтверждено наличие гена ф.

3.1. Влияние типа эксплантов на частоту трансформации

При ПЦР-проверке трансформантов на наличие встраиваемого гена было показано, что при использовании семядольных эксплантов число трансгенных побегов составило для с. \Vestar и с. Подмосковный 71,8% и 74,1%, соответственно, тогда как на листовых эксплантах их число было значительно меньше и составило 47,1% и 28,6%, соответственно (табл. 4).

Таблица. 4. Влияние типа экспланта на образование растений, экспрессиующнх ген

Сорт рапса Тип экспланта Число полученных растений, шт. Число ПЦР «+» на геи ¿/р растений с флюоресценцией, шт.

\Vestar семядоли 131 94 (71,8 %)

лист 17 8 (47,1 %)

Подмосковный семядоли 81 60 (74,1%)

лист 7 2 (28,6%)

Таким образом, при использовании семядольных эксплантов эффект агробактериальной трансформации был вдвое выше, чем при использовании листовых эксплантов, то есть, очевидна зависимость эффективности трансформации от типа исследуемых эксплантов.

3.2. Влияние антибиотика канамицина на частоту трансформации

Для оценки действия селективного агента антибиотика Км во втором пассаже семядольные экспланты культивировали на двух вариантах сред: 1) без применения Км, 2) с добавлением 15 мг/л Км. Известно, что действие Км приводит к разрушению хлорофилла у чувствительных побегов. Через 3 недели зеленые побеги, образовавшиеся на среде для морфогенеза, отделяли от эксплантов и переносили на среду для роста побегов без добавления Км. Устойчивость к Км полученных растений была подтверждена экспрессией гена

прШ. Для доказательства трансгенности полученных после отбора на Км зеленых растений проводили ПЦР-анализ на наличие гена (табл. 5).

Таблица 5. Влияние канамицииа на частоту трансформации на семядольных эксплаитах

Сорт рапса Общее число побегов, шт. Число белых побегов, шт. Число зеленых побегов, шт. ПЦР «+» на геи ¡/р, среди канамицин-устойчивых растений, шт. Частота трансформации, %

^Уеяйг 199 126 37 15 40,5

Подмосковный 174 128 20 9 45,0

ПЦР-анализ ДНК растений-трансформантов, устойчивых к Км, показал наличие гена %[р только у 15-ти зеленых растений с. \Vestar и у 9-ти зеленых растений с. Подмосковный. Частоту трансформации рассчитывали как отношение числа ПЦР-положительных на ген ф канамицин-устойчивых растений к общему количеству канамицин-устойчивых растений. Частота трансформации семядольных эксплантов рапса при применении Км в качестве селективного агента, составила 40-45%, то есть результаты показали, что не все растения, устойчивые к Км, являются трансгенными. При сопоставлении с ранее полученными результатами (табл. 4) установлено, что при добавлении Км в среду для морфогенеза частота трансформации значительно уменьшается.

Мы предположили, что получение сравнительно небольшого числа трансформированных растений, несущих ген связано с тем, что не все растения, имеющие ген прШ, имели и ген Для подтверждения этого была проведена оценка наличия белка вРР у белых и зеленых побегов с применением флуоресцентного микроскопа. Результаты показали, что среди неустойчивых к Км побегов были обнаружены побеги, светящиеся зеленым цветом, а у некоторых зеленых побегов флуоресценцию вРР не наблюдали.

3.3. Влияние концентрации сахарозы на частоту трансформации листовых эксплантов

Ранее было исследовано влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на выход растений-регенерантов листовых эксплантов с. \Vestar. При проведении трансформации также изучали влияние концентрации сахарозы на частоту получения растений-трансформантов (табл. 6).

Таблица 6. Влияние сахарозы на частоту трансформации листовых эксплантов с. \Vestar

Концеятрация сахарозы, % Частота трансформации, %

1,0 0

0,7 66,7 ± 19,7

Полученные результаты показывают, что частота трансформации зависела от концентрации сахарозы в питательной среде: при наличии 1% сахарозы трансгенные растения не были обнаружены, в то время как на среде с применением 0,7% сахарозы частота трансформации была достаточно высокой и составляла 66,7%.

4. Микроскопический анализ экспрессии гена

Образовавшиеся в процессе морфогенеза структуры анализировали в люминесцентном микроскопе. По мнению К. Эсау (1969) у большинства видов двудольных растений апикальная меристема состоит из корпуса и туники, которая часто разделена на 3 поверхностных слоя, в некоторых случаях изменяющиеся от 0 до 6 (ЯотЬе^ег, 1963). Отдельные поверхностные слои клеток обозначают 1Л, 1Д ЬЗ и относят к тунике. Из слоя Ы туники у двудольных обычно формируется только эпидермис. Ь2 формирует подэпидермальную ткань, и этот же слой участвует в формировании флоральных органов. Листья обычно формируются из слоя \2. или из слоев Ь2 и 1Д а из слоя ЬЗ формируется внутренняя ткань. Стебель и ткани корня возникают из слоя ЬЗ. Поэтому интересно было по свечению белка ОБР посмотреть образование тканей на первых стадиях органогенеза, чтобы понять какие слои туники участвуют в процессе формирования трансгенных растений

Визуализация белка СРР была проведена на всех стадиях развития трансформированных растений — как на стадии первичного морфогенеза при образовании побегов, так и на всех стадиях развития растений в почве.

4.1. Экспрессия гена в каллусной ткани и образовавшихся из нее побегах

Флюоресценцию белка СРР определяли в клетках морфогенной каллусной ткани, в частности, в меристематических зонах корня и адвентивных почек. Визуально установлено, что свечение вРР наблюдалось в основном в клетках, расположенных в поверхностном слое каллуса (рис. 2,Б), или в клетках апикальной меристемы (рис. 2,Г), меристемы корня (рис. 2,А), а также в клетках проводящей системы. Причем на одной каллусной ткани можно наблюдать одновременное формирование и меристемы корня, и меристемы апекса (рис. 2,Г). При дифференцировке корня свечение белка СРР наблюдали в периферийной зоне (рис.2,В), а при дифференцировке почек обнаружена флюоресценция белка СРР почти во всех клетках (примордии, меристема, проводящая система) (рис. 2,Д).

4.2. Экспрессия гена gfp в полученных трансформированных растениях

При наблюдении трансформированных растений во флуоресцентном микроскопе было видно, что у многих из них отмечалось интенсивное свечение белка GFP. Это свидетельствует об экспрессии гена gfp в клетках растений. Причем в разных частях растений интенсивность свечения была различна. Так, например, у побегов свечение GFP наблюдали в листьях разных ярусов. При этом на одном и том же растении свечение было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых (рис. 2,Е и Ж). По всей вероятности это связано с накоплением белка в зрелых клетках. В некоторых листьях свечение белка GFP наблюдали только в группах клеток, тогда как основная ткань листа не флуоресцировала (рис. 2,3).

На листьях растений-регенерантов свечение GFP лучше проявлялось на жилках, трихомах и устьицах (рис. 2И, К, Л). Белок GFP сильнее всего светился в клетках вокруг трихомы. Менее интенсивное свечение наблюдали на устьицах и жилках.

Исследования также показали, что при наблюдении листьев под флуоресцентной лупой отмечалось сильное свечение всех клеток главной жилки (рис. 2М), а с увеличением порядка жилкования интенсивность свечения уменьшалась, но была сильнее, чем в клетках мезофилла и эпидермиса. Флуоресценция белка GFP была также обнаружена и в стебле (рис. 2,Н).

Обнаруженная флуоресценция белка GFP в различной ткани трансгенных растений не позволила нам сделать однозначный вывод об участии определенных слоев апикальной меристемы в формировании трансгенных растений. Трансформированные ткани могли происходить из всех слоев меристематической туники.

4.3. Экспрессия гена gfp в генеративных органах трансформированных растений

Для проведения последующих исследований трансгенные растения с целью получения семян были высажены в закрытый грунт. Цветки этих растений были проанализированы с помощью флюоресцентного микроскопа. В результате было установлено, что свечение GFP наблюдалось в лепестках трансформированных растений (рис. 2,Р) и не наблюдалось в лепестках исходного образца (рис. 2,П), причем интенсивность свечения была ярче выражена в клетках проводящей системы. Кроме того, свечение белка GFP было обнаружено в пыльниках и пыльце трансгенных растений (рис. 2,Т и Ф). У исходных растений также наблюдали слабое зеленое свечение пыльцы (рис. 2,С и У), по-видимому, связанное с автофлюоресценцией одного из

растительных белков. Однако следует отметить, что люминесценция белка вРР в трансгенных растениях была значительно интенсивнее.

1-> . А У - г> Vj в % 4Л А 1 Г ЭЙ&/ . | % 2->

^gagy Л F. % 5J 1 fC 3 f^lraSr'

И к 1 [ м

н ° п р

с Гщ^ т 20hfm У ф

Рис 2. Экспрессия гена gfp в разных тканях: А, Б - поперечный срез каллуса: 1 -иериетемоидиые образования корней, 2 - каллус; В - срез ризоидного образования; Г -поперечный срез каллуса с формирующейся почкой: 1 - образование почки, 2 -образование корня; Д - срез меристемы; Е - старый лист; Ж - молодой лист; 3 -листовая пластинка; И - устьица; К - трихома листа; JI — жилка листа; М - главная жилка листа при увеличении 80Х; Н - трансгенный побег; О - срез ткани пыльника; П - лепесток исходного растения; Р - лепесток трансгенного растения; С - пыльник исходного растения; Т - пыльник трансгенного растения; У - пыльца исходного растення; Ф - пыльца трансгенного растения

4.4. Локализация белка GFP в клетках трансгенных растений

Представляло интерес изучение мест локализации белка в различных органах и клетках трансгенных растений. Наиболее четкое доказательство о его локализации было получено при анализе пыльников. Обнаружено, что белок накапливается в клеточных стенках и располагается равномерно в виде отдельных телец по всему периметру клетки (рис.2,0). Исходя из данных других авторов (Замятнин, 2002; Горшкова, 2003; Hefferon et al, 1997; Solovyev et al., 2000; Cowan et al., 2002) мы предположили, что одним из мест локализации белка GFP может быть плазматическая мембрана или структуры эндоплазматического ретикулума, сконцентрированные в районах плазмодесм.

Таким образом, подводя итоги исследований по микроскопическому анализу трансгенных растений, можно заключить, что присутствие флюоресцирующего белка GFP в клетках различных органов и тканях растений-трансформантов, является доказательством встраивания гена gfp в геном растений рапса и его трансляция.

Однако из представленных результатов остается неясным вопрос о происхождении трансформантов из клеток имеющих или не имеющих ген gfp. Поэтому было целесообразно провести дальнейшие исследования по изучению наследования полученных растений, так как только по наличию гена в потомстве можно сделать четкий вывод о трансгенности или нетрансгенности полученных растений.

5. Изучение наследования встроенного тепа, gfp

Исходя из полученных данных, мы предположили, что трансформация затронула именно те клетки, из которых в дальнейшем образуются генеративные органы. Поэтому было решено проверить, какое количество трансгенных и нетрансгенных семян находится в одном стручке в зависимости от его расположения на цветоносе, и установить зависимость наследования от числа черенкований.

Для изучения наследования гена gfp использовали по 4-5 стручков с каждой линии, из семян которой были получены стерильные растения in vitro. Было проанализировано 9 линий, полученных из семядольных эксплантов и 3 линии - из листовых эксплантов.

Исследования показали, что ген gfp в трансгенных растениях, полученных на семядольных эксплантах, наследовался в семенном поколении. Однако его наличие в семенах каждого растения не зависело от порядка расположения стручков и происходило случайно по всей кисти. У трансгенных растений, сформировавшихся на листовых эксплантах, ген gfp в растениях первого поколения не был обнаружен. Вероятно, это связано с тем, что гаметы

полученных трансформированных растений образовывались из нетрансформированной ткани.

Исходя из полученных данных, мы предположили, что регенеранты, полученные из семядольных эксплантов, как правило, формируются в основном из слоя L2, затрагивая слои LI и L3, а на листовых эксплантах формирование побегов происходит исключительно из клеток слоя L3. Эти факты также подтверждают образование побегов из группы клеток.

По литературным данным известно (Misra, Gedamu, 1989; Denis et al., 1993), что, как правило, в первом поколении, введенные гены наследуются как единичный локус (соотношение 3:1 при самоопылении и 1:1 при анализирующем скрещивании). Это свидетельствует о встраивании последовательностей чужеродной ДНК в один локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок.

Статистическая оценка результатов расщепления (табл. 7) с помощью критерия проведённая нами, показала, что только у трех растений, полученных при первом черенковании, соблюдались менделевские правила наследования одного признака для самоопыленных растений. Однако уже после второго черенкования эти правила нарушались. Вполне вероятно, что это свидетельствовало о химерности получаемых трансформантов, в тканях, которых имелись как трансгенные, так и нетрансгенные клетки. Ткань генеративных органов растений, полученных на семядольных эксплантах, развивалась одновременно из клеток обоих типов, показывая в результате неменделевское наследование одного признака. Мы предположили, что такую "неправильность" развития флоральной ткани можно преодолеть, высаживая растения-регенеранты в грунт сразу же после получения, не проводя их черенкования.

Таким образом, размножение полученных растений черенкованием оказывало влияние на этап расхимеривания, и было экспериментально установлено, что при дальнейшем черенковании полученных растений соотношение изменялось в сторону уменьшения потомков, наследующих признак трансгенности. По-видимому, в процессе роста растений, трансформированные клетки в химерных растениях замещались нетрансгенными.

Исходя из этих данных, можно сделать предположение, что большинство полученных нами при трансформации растений-регенерантов являются химерами и при формировании цветоносных побегов, они «расхимериваются», т.е. разделяются на составляющие генотипы с преобладанием нетрансформированных клеток, а основным, фактором образования химер является тип ткани экспланта.

Таблица 7. Лиали) расщепления Т| трансгенных растений рапса

по наследованию гена

Линия Черенкование Число растений Т,, шт. Количество трансгенных растений (ПЦР*), шт. Количество нетрансгенных растений (ПЦГ), шт. Фактическое расщепление Н„ ^фмет.

В-1 я 20 4 16 0,8:3,2 3 1 >3,84

Ь 21 0 21 0:4 3 1 -

В-2 а 24 18 6 3:1 3 1 0

Ь 42 6 36 0,6:3,4 3 1 >3,84

В-3 а 18 15 3 3,3:0,7 3 1 0,67

Ь 33 16 17 1,9:2,1 3 1 >3,84

я 20 16 4 3,2:0,8 3 1 0,27

Ь 37 14 23 1,5:2,5 3 1 >3,84

В-5 а _ . - - -

Ь 31 24 7 3,1:0,9 3:1 0,10

В-6 а . - - -

Ь 18 0 18 0:4 3:1 -

П-7 а 47 7 40 0,6:3,4 3:1 >3,84

Ь . - - - - -

П-8 а 37 19 18 2:2 3 1 >3,84

Ь 40 17 23 1,7:23 3 1 >3,84

П-9 а 39 5 34 0,5:3,5 3 1 >3,84

Ь 30 11 21 1,5:2,5 3 1 >3,84

Стандартное значение х^ор.^84! Но-теоретическое расщепление; В-сорт \Уе81аг; П - сорт Подмосковный; а - первое черенкование; Ь - второе черенкование

6. Биохимический анализ семян трансгенных растений

Очень важно работы по генной и клеточной инженерии направлять на создание новых форм растений с сохранением их питательной ценности. Особо показательным для рапса является содержание белка и жирных кислот в семенах. Поэтому был проведен сравнительный анализ семян Т| и исходного с. ШеБ1аг по содержанию белка и жирных кислот.

В результате исследований было установлено, что содержание белка в семенах Т1 было ниже по сравнению с контрольным сортом и составляло в среднем 28,8% и 32,6%, соответственно. При анализе трансгенных линий были обнаружены различия: этот показатель менялся от 28,1% до 30,0%.

Определение содержания жирных кислот показало различия в их составе (табл.8).

Таблица 8. Содержание жирных кислот в семенах трансгенных линий н нсходвого с. \Vestar, %

Жирные кислоты с. \Vestar Линия 1 Линия 2

Лаурииовяя кислота 0 0,02 0,03

Миристиновая кислота 0,06 0,08 0,10

Пептадекановая кислота 0,02 0,05 0,15

Пальмитиновая кислота 6,13 5,54 6,49

7-гексадеценовая кислота 0,03 0,07 0,13

Пальмнтолеииовая кислота 0,15 0,21 j 0,33

7,10-гексаднеаовая кислота 0,03 0,12 0,15

Маргариновая кислота 0,04 0,08 0,08

10-гептадеценовая кислота 0 0,07 0,06

7,10,13-гексатриеноваи кислота 0 0,15 0,22

Стеариновая кислота 1,75 2,42 2,11

Олеиновая кислота 61,00 67,40 64,66

Вакценовая кислота 3,79 3,02 3,54

Линолевая кислота 17,28 13,36 12,88

Липоленовая кислота 7,03 4,93 6,69

Нонадекановая кислота 0 0,09 0,22

10-нонадеценовая кислота 0 0,05 0,09

Арахнновая кислота 0,61 0,72 0,58

Гадоленновая кислота 1,42 1,01 1,07

10,13-эйкозадиеновая кислота 0,04 0,05 0,05

Бегеновая кислота 035 038 030

Эруковая кислота 0,18 0 0

Лигноцернновая кислота 0,03 0,11 0,07

Нервоновая кислота 0,07 0,06 0

Из данных таблицы 8 видно, что эруковая кислота в отличие от исходного сорта не присутствует в семенах трансгенных линий. Кроме этого, в семенах трансгенных растений отмечено появление новых жирных кислот, таких как лауриновой, 10-гептадеценовой, 7,10,13-гексатриеновой, нонадекановой и 10-нонадеценовой. В семенах Т, наблюдалось также и увеличение концентрации большинства проанализированных жирных кислот. Однако содержание некоторых жирных кислот, таких как линолевой, линоленовой и гадолеиновой в семенах трансгенных растений уменьшалось.

Таким образом, полученные результаты говорят, что в трансгенных растениях, вероятно, меняется в некоторой степени метаболизм, результатом которого является изменение количественного и качественного состава питательных веществ в семенах. Это свидетельствует о том, что даже встраивание нецелевых генов может изменять биохимию растений, позволяя

создавать при дальнейшей селекции растения с новыми хозяйственно-ценными

признаками.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован протокол получения растений-регенерантов рапса из семядольных и листовых эксплантов, позволяющий увеличить частоту регенерации до 92%. Оптимальной питательной средой для регенерации растений рапса из семядольных и листовых эксплантов после трансформации является среда, содержащая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.

2. Установлено, что наибольшей морфогенетической активностью обладают семядольные экспланты (92%) по сравнению с листовыми эксплантами (70%). При использовании семядолей развитие побегов происходит из первичного каллуса, формирующегося из черешков семядолей локально, а при использовании листовых сегментов - из края первичного экспланта минуя процесс каллусогенеза.

3. Выявлены существенные различия в частоте трансформации изучаемых сортов в зависимости от типа первичного экспланта: на семядольных эксплантах частота трансформации была более 70%, а на листовых сегментах - 28 - 47%. Присутствие в питательной среде селективного фактора Км приводило к существенному снижению частоты трансформации, а уменьшение концентрации сахарозы с 1% до 0,7% повышало частоту трансформации на листовых эксплантах до 66,7%.

4. Свечение белка GFP наблюдали на всех стадиях развития трансформированных растений. В каллусной ткани наибольшую флуоресценцию GFP наблюдали в зоне меристематических очагов, а также в местах дифференцировки проводящей системы. У сформировавшихся побегов свечение GFP было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых, и лучше всего его можно было видеть на жилках, трихомах и устьицах. На листовой пластинке свечение часто проявлялось в группах клеток. Установлено, что белок GFP локализован по пунктирным тельцам в клеточных стенках.

5. Анализ растений Т, показал, что у трансгенных растений, полученных из листовых эксплантов не наблюдали наследование гена ф в растениях первого поколения, в то время как в трансгенных растениях, полученных из семядольных эксплантов, наличие гена gfp наблюдали. Черенкование трансгенных растений рапса приводит к проявлению неменделевского правила наследования встроенного гена gfp.

6. Установлено, что трансформация ярового рапса приводит к созданию растений с измененным количественным и качественным составом питательных веществ в семенах первого поколения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е. А. Изучение первых стадий регенерации побегов на семядольных эксплантах рапса (Brassica napus L.) при использовании генетических конструкций, содержащих ген GUS с интроном или ген GFP // Известия ТСХА, 2010, № 5, С.96-102.

2. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Регенерация трансгенных растений, экспрессирующих ген gfp, на семядольных и листовых эксплантах растений рапса (Brassica napus I.): влияние абк и генотипа // Физиология растений, 2012, Т.59, №3 (принято к печати).

3. Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи Жанг, Динь Суан Ту. Изучение первых стадий регенерации побегов на различных эксплантах рапса (Brassica napus L.) после трансформации генетической конструкцией, содержащей ген gus с интроном // Тезисы докладов VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток". Звенигород, Москва, 2009, С.42.

4. Raldugina GN, Hoang TG, Belyaev DV. Approach to the Problem of Chimeric Genetically Transformed Rapeseed // Тезисы докладов Международной конференции "Molecular aspects of plant development". Вена, Австрия, 2010, C.75.

5. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Подход к проблеме образования химер у генетически трансформированных растений рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов X молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 2010, С.57.

6. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Проблемы химерности регенератов при получении генетически трансформированных растений рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов III Всероссийского симпозиума "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности". Москва, 2010, С.82.

7. Raldugina, G., Hoang, G. Chimeric formation when obtaining genetically transformed plants of Rapeseed // Тезисы докладов Международной конференции "Plant Transformation Technologies II". Вена, Австрия, 2011, C.48.

8. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е.А. Исследование формирования химер при регенерации растений рапса (Brassica napus L.) // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева: Сборник статей: Изд-во РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва, 20И, С. 48-49.

9. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е. А. Образование трансгенных растений, экспрессирующих ген gfp, из листовых эксплантов рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов XI молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" Москва, 2011, С.49-50.

Ю.Хоанг Т.Ж., Ралдугина Г.Н. Исследование влияния генотипа и вида экспланта на формирование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) // VII съезд Общества физиологов растений России. Международная конференция "Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" Нижний Новгород, Россия, 2011, Часть И, С.728-729.

П.Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи Жанг. Образование химерных растений при получении генетически трансформированных растений рапса // Тезисы докладов VIII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" Звенигород, Россия, 2011, С. 37.

12.Т. Ж. Хоанг, Г.Н. Ралдугина, Е.А. Калашникова. Образование химерных побегов при получении генетически трансформированных растений рапса // Тезисы докладов 2-й Международной школа-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях технологиях" Звенигород, Россия, 2011. С.73.

Подписано к печати 28.12.2011 Формат 60x84/16 Усл.-печ.л. 1,1 Тираж 100эю. Заказ №758

Отпечатано в ООО «СпецПринт»

109469, Москва, ул. Братиславская, д. 34, корп. 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хоанг Тхи Жанг

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Регенерация растений рода Brassica.

1.1.1. Зависимость морфогенеза от источника экспланта.

1.1.2. Зависимость морфогенеза от генотипа растения-донора.

1.1.3. Зависимость морфогенеза от состава среды.

1.2. Методы получения трансформированных растений.

1.2.1. Перенос ДНК с помощью агробактерий.

1.3. Селекция трансформированных тканей растений.

1.4. Экспрессия чужеродных генов в трансформированных растениях.

1.5. Трансформация растений рода Brassica с помощью Agrobacterium tumefaciens.

1.6. Получение трансгенных растений рода Brassica.

1.6.1. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам.

1.6.2. Трансгенные растения, устойчивые к патогенам.

1.6.3. Трансгенные растения с измененным составом жирных кислот.

1.6.4. Трансгенные растения с измененным составом белка.

1.6.5. Трансгенные растения с мужской стерильностью.

1.6.6. Трансгенные растения, устойчивые к стрессовым воздействием.

1.7. Наследование встроенных генов в растениях-трансформантах.

1.8. Химерность.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II.1. Характеритика объекта исследования.

11.2. Среды для культивирования растений и растительных тканей.

11.3. Получение эксплантов.

11.4. Регенерация растений.

11.5. Укоренение растений-регенерантов и высадка в почву.

11.6. Бактериальные штаммы и среды для выращивания бактерий.

11.7. Трансформация растений.

11.8. Анализ трансформированных растений.

11.8.1. Тестирование на устойчивость растений к Км.

11.8.2. Микроскопический анализ экспрессии гена gfp в растительном материале

11.8.3. Методы молекулярной биологии.

11.9. Биохимический анализ семян трансгенных растений.

11.9.1. Определение содержания белка.

11.9.2. Определение содержания жирных кислот.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов изучаемых сортов рапса.

111.2. Трансформация двух типов эксплантов рапса.

111.2.1. Освобождение эксплантов от бактериальной инфекции.

111.2.2. Влияние сорта и регуляторов роста на частоту регенерации при агробактериальной трансформации.

111.3. Анализ растений-трансформантов.

111.3.1. Влияние типа эксплантов на частоту трансформации.

111.3.2. Влияние антибиотика канамицина на частоту трансформации.

111.3.3. Влияние концентрации сахарозы на частоту трансформации листовых эксплантов.

III. 4. Микроскопический анализ экспрессии гена gfp.

III.4.1. Экспрессия гена gfp в каллусной ткани и образовавшихся из нее побегах

111.4.2. Экспрессия гена gfp в полученных трансформированных растениях.

111.4.3. Экспрессия гена gfp в генеративных органах трансформированных растений.

111.4.4. Локализация белка GFP в клетках трансгенных растений.

111.5. Изучение наследования встроенного гена gfp.

111.6. Биохимический анализ семян трансгенных растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации"

При изучении наследования в растениях чужеродных генов для большинства трансгенных растений было показано, что трансгены, как правило, наследуются в потомстве самоопыленных трансгенных растений в отношении 3:1, как единый менделевский признак. Однако в некоторых случаях наблюдается наследование в других отношениях, например, только в 3 из 50 семян трансгенного табака содержался встроенный ген nptll (Schmülling, Schell, 1993). Это затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформантами. Поэтому, для создания генетически однородных растений-трансформантов очень важно знать причины подобного явления, одной из которых может быть образование химер, то есть организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток и чтобы исключить их формирование.

Химерность растений-трансформантов описывалась у некоторых видов, например, табака (Schmülling, Schell, 1993; Faize et al., 2010), сои (Christou, 1990), картофеля (Rakosy-Tican et al., 2007), риса (Christou, Ford, 1995), льна (Dong, McHughen, 1993), капусты (Berthomieu et al., 1994) и земляники (Mathews et al., 1995), а также y древесных плодовых растений, например, у яблони (Flachowsky et al., 2008), или у цитрусовых (Costa et al., 2002). Полученные в некоторых случаях химеры составляли до 90% растений-регенерантов. Авторы по-разному объясняют причины возникновения химерных растений: результатом происхождения растений не из одной клетки, а из группы клеток первичного экспланта (Poethig, 1989; Zhu et al., 2007); последствием защиты ^трансформированных клеток от действия селективного фактора трансформированными клетками (Park et al., 1998; Domínguez et al., 2004) или неэффективностью селективных агентов совместно с эндогенной толерантностью (Rakosy-Tican et al., 2007). Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждают причины этого феномена. Выяснение механизмов образования химерных растений позволило бы исключить условия их возникновения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

2. Изучить образование химерных растений рапса после генетической трансформации.

3. Исследовать экспрессию встроенного гена gfp на этапах каллусообразования и морфогенеза.

4. Провести анализ растений-трансформантов рапса на наличие встроенного гена gfp.

5. Проверить потомство трансгенных растений на наследование встроенного гена gfp.

6. Провести биохимический анализ семян трансгенных и исходных растений рапса.

Научная новизна работы. Оптимизированы условия регенерации и трансформации разных сортов рапса с использованием семядольных и листовых эксплантов. Результаты по протоколу регенерации ярового рапса сорта Подмосковный являются оригинальными и проведены впервые. Получены трансформированные растения из листовых эксплантов сорта \Vestar и Подмосковный. Впервые проведена трансформация растений рапса без применения селективного фактора и определено его влияние на эффективность трансформации. Впервые установлено влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на дифференциацию побегов, полученных на листовых эксплантах рапса, а также на эффективность трансформации. Выявлены существенные различия в свечении белка ОРР в зависимости от первичного экспланта и стадии развития растений-регенерантов. Анализ растений Т] показал, что у трансгенных растений наследование гена зависит от типа исследуемого экспланта. Установлены факторы, оказывающие влияние на проявление неменделевского наследования встроенного гена у трансгенных растений рапса, которые, вероятно, связаны с образованием генотипических химер. Показано, что основным фактором проявления этого является тип первичного экспланта. Выявлено, что расхимеривание не зависит от расположения стручков на цветоносе, но зависит от числа черенкований растений-трансформантов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Хоанг Тхи Жанг

выводы

1. Усовершенствован протокол получения растений-регенерантов рапса на семядольных и листовых эксплантах, позволяющий увеличить частоту регенерации до 92%. Оптимальной питательной средой для регенерации растений рапса на семядольных и листовых эксплантах после трансформации является среда, содержащая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.

3. Выявлены существенные различия в частоте трансформации изучаемых сортов в зависимости от типа первичного экспланта: на семядольных эксплантах частота трансформации была более 70%, а на листовых сегментах - 28 - 47%. Присутствие в питательной среде селективного фактора Км приводило к существенному снижению частоты трансформации, а уменьшение концентрации сахарозы с 1 % до 0,7% повышало частоту трансформации на листовых эксплантах до 66,7%.

5. Анализ растений Т) показал, что у трансгенных растений, полученных из листовых эксплантов не наблюдали наследование гена в растениях первого поколения, в то время как в трансгенных растениях, полученных из семядольных эксплантов, наличие гена наблюдали. Черенкование трансгенных растений рапса приводит к проявлению неменделевского правила наследования встроенного гена ^р.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований были подобраны оптимальные условия регенерации и трансформации разных сортов рапса {Brassica napus L.) с использованием семядольных и листовых эксплантов. Наилучшей тканью, применяемой в качестве первичного экспланта обладали семядоли, изолированные от пятисуточных проростков. Причем использование листовых сегментов имеет ряд недостатков. Во-первых, большинство побегов, сформировавшихся на листовых эксплантах, были витрифицированы или наблюдалась блокировка их дальнейшей дифференцировки. Во-вторых, при использовании в качестве первичного экспланта листовых сегментов частота трансформации была достаточно меньше по сравнению с семядолями. Кроме этого, у трансгенных растений, полученных на листовых эксплантах, ген gfp не наследовался в первом поколении.

Было показано, что повышение частоты трансформации увеличивало число растений, экспрессирующих трансген. Трансгенные растения, полученные на семядольных эксплантах обоих испытанных сортов, где частота трансформации достаточно высока, чаще показывали флуоресценцию белка GFP, тогда как из числа растений, полученных на листовых эксплантах, светились лишь немногие. Были выявлены большие различия в свечении белка GFP в зависимости от начального экспланта и возраста растения-регенеранта. При этом ген экспрессировался только в половине трансгенных растений, которые были расчеренкованы и высажены в почву. При анализе расщепления признака трансгенности в растениях-потомках было обнаружено, что почти во всех растениях наблюдалось значительное отклонение от значения 3:1, свидетельствуя о немеделевском наследовании. Вполне вероятно, что это свидетельствовало о химерности получаемых трансформантов, в тканях которых имелись как трансгенные, так и нетрансгенные клетки. Ткань генеративных органов развивалась одновременно из клеток обоих типов, показывая в результате неменделевское наследование одного признака.

В исследовании по выяснению факторов, от которых зависит проявление неменделевского наследования встроенного чужеродного гена у растений рапса было показано, что формирование химерной ткани побегов зависит от ткани экспланта. На семядольных эксплантах регенеранты формируются в основном из слоя Ь2, затрагивая слои Ь1 и ЬЗ, а на листовых эксплантах формирование побегов происходит исключительно из клеток слоя ЬЗ. Эти факты подтверждают образование побегов из группы клеток. Черенкование полученных трансформантов оказывает отрицательное влияние на расхимеривание встроенного в геном растений гена. Мы предположили, чтобы обойти этап расхимеривания, целесообразно высаживать растения в почву сразу после их получения.

Использование метода генетической трансформации рапса дает возможность получать трансгенные растения с улучшенным составом питательных веществ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хоанг Тхи Жанг, Москва

1. Белоногова М.А. (2006) Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) с использованием семядольных эксплантов: Дисс. на соиск. ученой степени канд. Биолог, наук. М: ИФР, 76 с.

2. Бережная Г.А., Елисеев И.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. (1988) Определение жирнокислотного состава и количественного содержания липидов в плодах облепихи. Прикл. биохимия и микробиология, 24, 568-573

3. Бутенко Р.Г. (1956) Культура изолированных растительных тканей. Физиология растений, 3, 217-286.

4. Бутенко Р.Г. (1964) Культура изолированных растительных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука.

5. Бутенко Р.Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 157 с.

6. Горшкова E.H. (2003) Получение и анализ трансгенных растений, экспрессирующих белки тройного блока генов гордеивирусов: Дисс. на соиск. ученой степени канд. биолог, наук. М: МГУ, 87-101 с.

7. Данилова С.А., Долгих Ю.И. (2004) Стимуляция регенерации растений в культуре тканей кукурузы под действием антибиотика цефотаксима. Физиочогия растений, 51, № 4, 621-625.

8. Данилова С.А., Долгих Ю.И. (2005) Условия, необходимые для эффективной агробактериальной (Agrobacterium tumefaciens) трансформации эмбриогенного каллуса кукурузы. Физиология растений, 52, № 4, 600-607.

9. Данилова С.А., Кузнецов В.В., Долгих Ю.И. (2009) Новый эффективный метод трансформации кукурузы с использованием агробактериального газона. Физиология растений, 56, 285-290.

10. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитедж Ф., Дьюри Г., Джекоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. (1991) Генная инженерия растений. М.: Мир, 408 с.

11. Карначук P.A., Гвоздева Е.С., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. (2006) Биотехнология и генная инженерия растений. Томск: Изд-во ТГУ, 132 с.

12. Косолапое В.М., Драганов И.Ф., Чуйков В.А. (2011) Методы анализа кормов. Москва.

13. Кренке Н.П. (1947) Химеры растений. М: Изд-во Академии Наук СССР,373 с.

14. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Бузовкииа И.С., Левашина Е.А., Тиходеев О.Н., Ходжайова Л.Т., Шарова Н.В., Шишкова С.О. (1994) Влияние генотипа растения на регенерационные процессы. Генетика, 30, №8, 1065-1074.

15. Малышенко С.И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д., Ралдугина Г.Н. (2003) Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfp. Физиология растений, 50, 309-315.

16. Милащенко Н.З., Абрамов В.Ф. (1989) Технология выращивания и использования рапса и сурепицы. М.: Агропромиздат, 223 с.

17. Пирузян Э.С. (1988) Основы генетической инженерии растений. М.: Наука,393 с.

18. Пирузян Э.С. (1990) Проблемы экспрессии чужеродных генов в растениях. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М: ВИНИТИ, 23, 176 с.

19. Ралдугина Г.Н. (1997) Получение и исследование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.): Дисс. на соиск. ученой степени канд. Биолог, наук. М: ИФР, 155 с.

20. Ралдугина Г.Н., Горелова C.B., Кожемякин A.B. (2000) Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса. Физиология растений, 47, 437^145.

21. Ралдугина Г.Н., Соболькова Г.И. (1995) Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса. Физиология растений, 42, 916-922.

22. Романов Г. А. (2000) Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности. Физиология растений, 47, № 3, 343-353.

23. Сахно JI.A., Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук. (2008) Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях рапса. Цитология и генетика, № 1, 21-28.

24. Синская Е.Н. (1939) Род Brassica L. В кн. Флора СССР. М.-Л., 8, 469-466с.

25. Смиряев А.В., Кильчевский А.В. (2007) Генетика популяций и количественных признаков,- М.: КолосС, 215-218 с.

26. Терешонок Д.В. (2009) Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt): Дисс. на соиск. ученой степени канд. биолог, наук. М: ИФР, 77 с.

27. Akasaka-Kennedy Y., Yoshida Н., Takahata Y. (2005) Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed {Brassica napus L.): influence AgN03 and genotype. Plant Cell Reports, 24, 649-654.

28. Ali H., Z. Ali S. Mehmood, Ali W. (2007) In vitro regeneration of Brassica napus L., cultivars (star, cyclone and westar) from hypocotyls and cotyledonary leaves. Pak. J. Bot,, 39, 1251-1256.

29. Altenbach S.B., Kuo C.C., Staraci L.C., Pearson K.W., Wainright C., Georgescu A. (1992) Accumulation of Brazil nut albumin in seeds of transgenic canola results in enhanced levels of seed protein methionine. Plant Mol. Biol., 18, 235-245.

30. Aragao F.J.L., Barros L.M.G., Brasileiro A.C.M., Ribeiro S.G., Smith F.D., Sanford J.C., Faria J.C., Rech E.L. (1996) Inheritance of foreign genes in transgenic bean

31. Phaseolus vulgaris L.) co-transformed via particle bombardment. Theor. Appl. Genet., 93, 142-150.

32. Bade J., Damm B. (1993) Agrobacterium mediated transformation of rapeseed (Brassica napus). MÖGEN. Leiden. The Netherlands.

33. Bajaj Y.P.S., Nietsh P. (1975) In vitro propagation of red cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata). J. Exp. Bot., 26, 883-890.

34. Barfield D.G., Púa E.C. (1991) Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Plant Cell Rep., 10, 308-314.

35. Baroncelli S.M., Buiatti M., Bennici A. (1973) Genetics of growth and differentiation in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. I. Differences between 6 inbred Lines. Z. Pflanzenzucht., 70, 99-107.

36. Ben Ghnaya A., Charles G., Branchard M. (2008) Rapid shoot regeneration from thin cell layer explants excised from petioles and hypocotyls in four cultivars of Brasscica napus L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 92, 25-30.

37. Berthomieu P., Béclin C., Chariot F., Doré C., Jouanin L. (1994) Routine transformation of rapid cycling cabbage (Brassica oleracea). Molecular evidence for regeneration of chimeras. Plant Sei., 96, 223-235.

38. Bieber N.E., Reynolds J.F. (1983) Influence of media, genotype, explant source, and serial subculture on shoot regeneration of in vitro broccoli, Brassica oleracea. In Vitro, 19, 248.

39. Binding H., Witt D., Monzer J., Mordhorst G., and Kollmann R. (1987) Plant cell graft chimeras obtained by co-cultivation of isolated protoplasts. Protoplasma, 141, 6473.

40. Blackshaw R.E., Kanashiro D., Moloney M.M., Crosby W.L. (1994) Growth, yield and quality of canola expressing resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides. Cañad. J. Plant Sei., 74, 745-751.

41. Bornman C.H. (1983) Morphological, and ultrastructural responses to abscisic acid. In: Abscisic acid. Praeger N.Y., pp. 523-647.

42. Botanik online. Dr. Peter von Sengbusch, der Universität Hamburg).http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/dOO/inhalt.htm, http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/el 2/2.htm.

43. Botterman J., D'Halluin K., De-Block M., De-Greef W., Leemans J. (1991) Engineering of glufosinate resistance and evaluation under field conditions. Long-Achton-Int. Symp., 11 Meet., 355-363.

44. Brishbane P.G., Kerr A. (1983) Selective media for three biovars of Agrobacterium. J. Appl. Bacteriol., 54, 425-431.

45. Broglie K., Chet I., Holliday M., Cressman R., Biddle P., Broglie R. (1991) Transgenic plants with enchanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science, 254, 1194-1197.

46. Brown D.C.W., Geng X.M., Singh J., Takahata Y., Watson E.M. (1991) Enhacement of regeneration by ABA in Brassica napus microspore-derived embryos. In Vitro, 27, 70A.

47. Brown D.C.W., Thorpe T.A. (1986) Plant Regeneration by Organogenesis. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Plant Regeneration and Genetic Variability (Ed. Vasil I.) Academic Press. N.Y., 3, pp. 49-65.

48. Budar F., Thia-Toong L., Van Montagu M., Hernalsteens J.P. (1986) Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendelian factor. Genetics, 114, 303-313.

49. Buiatti M., Baroncelli S., Bennici A. (1974) Genetics of growth and differentiation in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. IV. Genotype-hormone interactions. Z. Pflanzenzucht, 73, 298-302.

50. Canli F.A., Skirvin R.M. (2003) Separation of thornless rose chimera into their (Rose sp.) consistent genotypes by in vitro TDZ applications. P. J. Bio. Sic., 6 (19), 16441648.

51. Cannell M.E., Doherty A., Lazzeri P.A., Barcelo P. A. (1999) Population of wheat and tritordeum transformants showing a high degree of marker gene stability and heritability. Theor. Appl. Genet., 99, 772-784.

52. Cao J., Tang J. D., Strizhov N., Shelton A. M., Earle E. D. (1999) Transgenic broccoli with high levels of Bacillus thuringiensis CrylC protein control diamondback moth larvae resistant to crylA or crylC. Mol. Breed., 5, 131-141.

53. Charest P.J., Holbrook L.A., Gabard J., Jyer V.N., Miki B.L. (1988) Agrobacterium-mediated transformation of thin cell layer expiants from Brassica napus. Theor. Appl. Genet., 75, 438-445.

54. Chaudhary S., Parmenter D.L., Moloney M.M. (1998) Transgenic Brassica carinata as a vehicle for the production of recombinant proteins in seeds. Plant Cell Rep., 17, 195-200.

55. Chavadej S., Brisson N., McNeil J.N., Deluca V. (1994) Redirection of tryptophan leads to production of low indole glucosonolate canola. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91 (6), 2166-2170.

56. Cherdshewasart W., Gharti-Chhetri G.B., Saul M.W., Jacobs M., Negrutiu I.1993) Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants. Trans. Res., 2, 307-320.

57. Chi G.L., Barfield D.C., Sim G.E., Pua E.C. (1990) Effect of AgN03 and aminoethoxyvinylglycine on in vitro organegenesis from seedling explants of recalcitrant Brassica genotypes. Plant Cell Rep., 9, 195-198.

58. Chi G.L., Pua E.C. (1989) Ethylene inhibitors en hanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. chinensis (Chinese cabbage) in vitro. Plant Sci., 64, 243-250.

59. Cho H.S., Cao J., Ren J.P., Earle E.D. (2001) Control of Lepidopteran insect pests in transgenic Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) transformed with a synthetic Bacillus thuringiensis crylC gene. Plant Cell Rep., 20, 1-7.

60. Choffnes D.S., Philip R., Vodkin L.O. (2001) A transgenic locus in soybean exhibits a high level of recombination. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 37 (6), 756-762.

61. Chourey P.S., Zurawski D.B. (1981) Callus formation from protoplasts of a maize cell culture. Theor. Appl. Genet., 59, 341-344.

62. Christou P. (1990) Morphological description of transgenic soybean chimeras created by the delivery, integration and expression of foreign DNA using electric discharge particle acceleration. Ann Bot., 66, 379-386.

63. Christou P., Ford T. (1995) Recovery of chimeric rice plants from dry seed using electric discharge particle acceleration. Annals of Botany, 75, 449-454.

64. Chyi Y., Jorgensen R.A., Goldstein D., Tanksley S.D., Loaiza-Figueroa F. (1986) Locations and stability of Agrobacterium-mediated T-DNA insertions in the Lycopersicon genome. Mol. Gen. Genet., 204, 64-69.

65. Costa M.G.C., Otoni W.C., Moore G.A. (2002) An Evaluation of factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of Citrus paradisi

66. Macf.) and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic genes. Plant Cell Rep., 21,365-373.

67. Cowan G.H., Lioliopoulou F., Ziegler A., Torrance L. (2002) Subcellular localization, protein interactions, and RNA binding of Potato mop-top virus triple gene block proteins. Virology, 298, №1, 106-115.

68. Crouch M.L., Sussex J.M. (1981) Developmental and storage-protein synthesis in Brassica napus L. embryos in vivo and in vitro. Planta, 153, 64-74.

69. Davies H.M., Kridl J.C., Thompson G.A., Voelker T.A. (1993) Genetic engineering of altered fatty saturation and chain lengst in rapeseed. Plant Physiol., 102, 1.

70. De Block M., De Brower D., Tenning P. (1989) Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol., 91, 694-701.

71. De Carvalho F., Gheysen G., Kushnir S., Van Montagu M., Inze D., Castresana C. (1992) Suppression of P-l,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. EMBOJ., 11, 2595-2602.

72. Deng X.W., Gruissem W. (1988) Constitutive expression and regulation of gene expression in non-photosynthetic plastids of higher plants. EMBOJ., 7, 3301-3308.

73. Denis M., Delourme R., Gourret J.-P., Mariani C., Renard M. (1993) Expression of engineered nuclear male sterility in Brassica napus. Plant Physiol., 101, 1295-1304.

74. Deroles S.C., Gardner R.C. (1988) Expression and inheritance of kanamycin resistance in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol., 11, 355-364.

75. Dietert M.F., Barron S.A., Yoder O.C. Effects of genotype on in vitro culture in the genus Brassica.// Plant Sci. Lett. 1982. V. 26. P. 233-240.

76. Dong J.Z., McHughen A. (1993) Transgenic flax plants from Agrobacterium mediated transformation: incidence of chimeric régénérants and inheritance of transgenic plants. Plant Sci., 91, 139-148.

77. Dong J.Z., Jia S.R. (1991) High efficiency plant regeneration from cotyledons of watermelon (Citrillus vulgaris Shrad). Plant Cell Rep., 9, 559-562.

78. Dorlhac De Borne F., Vincentz M., Chupeau Y., Vaucheret H. (1994) Co-suppression of nitrate reductase host genes and transgenes in transgenic tobacco plants. Mol. Gen. Genet., 243, 613-621.

79. Dunwell J.M. (1981) In vitro regeneration from excised leaf discs of three Brassica species. J. Exp. Bot., 32, 789-799.

80. Eady C., Davis S., Catanach A., Kenel F., Hunger S. (2005) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of leek (Allium porrum) and garlic {Allium sativum). Plant Cell Reports, 4, 209-215.

81. Eady C., Weld R., Lister C. (2000) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and regeneration of onion {Allium cepa L.). Plant Cell Reports, 19, 376-381.

82. Eapen S. and George L. (1997) Plant regeneration from peduncle segments of oil seed Brassica species: influence of Silver nitrate and Silver thiosulfate. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 51, 229-232.

83. Ellerstrom S. (1977) Interspecific hybrydisation in breeding work. Artkorsuingar i foradlingsorbeter. Sveriges Utsadesforenings Tibskrif, 87, 363-367.

84. Elliott A.R., Campbell J.A., Dugdale B., Brettell R.I.S., Grof C.P.L. (1999) Green-fluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically transformed plant cells. Plant Cell Reports, 18, 707-714.

85. Esau K. (1969). Pflanzenanatomie. Gustav Fischer, Jena.

86. Facciotti M.T., Bertain P.B., Yuan L. (1999) Improved stearate phenotype in transgenic canola expressing a modified acyl-acyl carrier protein thioesterase. Nat. Biotechnol., 17, 593-597.

87. Faize M., Faize L., Burgos L. (2010) Using quantitative real-time PCR to detect chimeras in transgenic tobacco and apricot and to monitor their dissociation. BMC Biotechnology, 10, 53.

88. Feirer R.P., Conkey J.H., Verhagen S.A. (1989) Triglycerides in embryogenic conifer calli: a comperison with zygotic embryos. Plant Cell Rep., 8, 207-209.

89. Finnegan J., McElroy D. (1994) Transgene inactivation-plants fight back. Bio/Technology, 12, 883-888.

90. Flachowsky H., Riedel M., Reim S., Hanke V. (2008) Evaluation of the uniformity and stability of T-DNA integration and gene expression in transgenic apple plants. Electronic Journal of Biotechnology, 11, 1-15.

91. Fry J., Barnason A., Horsch R.B. (1987) Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors. Plant Cell Rep., 6, 321-325.

92. Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. (1995) Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants. Plant Molecular Biology Reporter, 13 (3), 207-209.

93. Gal S., Pisan B., Hohn T., Grimsley N., Hohn B. (1991) Genomic homologous recombination in plants. EMBOJ., 10, 1571-1578.

94. Gambourg O.L., Evelegh D. (1968) Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys. Can. J. Biochem., 46, 417—421.

95. George E.F., Sherrington P.D. (1984) Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Eversley, England, 465.

96. Glimelius K. (1984) High growth rate and regeneration capacity of hypocotyls protoplasts in some Brassicaceae. Physiol. Plant., 61, 38-44.

97. Guerche P., Jouanin L., Tepfer D., Pelletier G. (1987) Genetic transformation of oilseed rape (Brassica napus) by the Ri T-DNA of Agrobacterium rhizogenes and analysis of inheritance of the transformed phenotype. Mol. Gen. Genet., 206, 382-386.

98. Gupta V., Sita G. L., Shaila M. S., Jagannathan V. (1993) Genetic transformation of Brassica nigra by Agrobacterium based vector and direct plasmid uptake. Plant Cell Rep., 12, 418-421.

99. Hachey J.E., Sharma K.K., Moloney M.M. (1991) Efficient shoot regeneration of Brassica campestris using cotyledon explants cultured in vitro. Plant Cell Rep., 9, 549-554.

100. Hackett W.P., Anderson J.M. (1967) Aseptic multiplication and maintenance of differentiated carnation shoot tissue derived from shoot apices. Proc. Amer. Soc. Hort. Set, 90, 365-369.

101. Haddad R., Morris K., Buchanan-Wollaston V. (2002) Regeneration and transformation of oilseed (Brassica napus) using CaMV 35S promoter- 3-glucuronidase gene. J. Agric. Sci. Technol., 4, 151-160

102. Halfhill M.D., Richards H.A., Mabon S.A., Stewart C.N.Jr. (2001) Expression of GFP and Bt transgenes in Brassica napus and hybridization with Brassica rapa. Theor. Appl. Genet., 103, 659-667.

103. Halfhill M.D. (2003) Gene flow from transgenic crops to wild relatives. Dissertation, North Carolina State University, Raleigh, 107-146 p.

104. Hânisch Ten Cate C.H., Loonen A.E.H.M., Ottaviani M.P., Ennik L., Van Eldik G., Stiekema W.J. (1990) Frequent spontaneous deletions of Ri T-DNA in Agrobacterium rhizogenes transformed potato roots and regenerated plants. Plant Mol. Biol., 14, 735-741.

105. Harper B.K., Mabon S.A., Leffel S.M., Halfhill M.D., Richards A.H., Moyer K.A., Stewart C.N. (1999) Green fluorescent protein as a marker for expression of a second gene in transgenic plants. Nature Biotechnology, 17, 1125-1129.

106. Hartnett M.E., Chui C.F., Falco S.C., Knowlton S., Mauvais C.J., Mazur

107. B.J. (1991) Molecular analysis of sulfonilurea herbicide resistant ALS genes. Long-Ashton-Int. Symp., 11 Meet., 343-353.

108. Haseloff J., Amos B. (1995) GFP in plants. Trends in Genetics, 8, 328-329.

109. Hawkins D., KridI L. (1998) Characterization of acyl-ACP thioesterase of mangosteen (Garcinia mangosteena) seed and high levels of state production in transgenic canola. Plant J., 13, 743-752.

110. Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D., Schernthaner J.P., Barta A., Matzke A.J.M., Matzke M.A. (1988) Genetic analysis of T-DNA insertions into the tobacco genome. Plant Cell Rep., 7, 571-574.

111. Hefferon K.L., Doyle S., AbouHaidar M.G. (1997) Immunological detection of the 8K protein of potato virus X (PVX) in cell walls of PVX-infected tobacco and transgenic potato. Arch. Virol., 142, №. 2, 425-433.

112. Hibberd J.M., Linley P.J., Khan M.S., Gray J.C. (1998) Transient expression of green fluorescent protein in various plastid types following microprojectile bombardment. Plant J, 16, 627-632.

113. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journ., 6, 271-282.

114. Hobbs S.L.A., Warkentin T.D., Delong C.M.O. (1993) Transgene copy number canbe positively or negatively associated with transgene expression. Plant Mol. Biol., 21, 17-26.

115. Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J., Schilperpoort R.A. (1993) A binary plant vector strategy based on seperation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature, 303, 179-180.

116. Hofte H., Whitely H.R. (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Micribial Rev., 53, 242-255.

117. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. 1984Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. V. 223. P. 496-498.

118. Hu Q., Anderson S.B. and Hansen L.N. (1999) Plant regeneration capacity of mesophyll protoplasts from Brassica napus and related species. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 59, 189-196.

119. Inomata N. (1983) Hybrid progenies of the cross, Brassica campestris x B.oleracea II. Crossing ability of F1 hybrids and their progenies. Jap. J. of Genet., 58, 433449.

120. Jagannath A., Arumugam N., Gupta V., Pradhan A., Burma P. K., Pental

121. D. (2002) Development of transgenic barstar lines and identification of a male sterile (barnase)IrQstorer (barstar) combination for heterosis breeding in Indian oilseed mustard (Brassica júncea). Curr. Sci., 82, 46-52.

122. Jain R.K., Chowdhury J.B., Sharma D.R., Friedt W. (1988) Genotype and media effects on plant regeneration from cotyledon explant cultures of some Brassica species. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 14, 197-206.

123. Jin R.G., Liu Y.B., Tabashnik B.E., Borthakur D. (2000) Development of transgenic cabbage (Brassica oleracea var. capitata) for insect resistance by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 36, 231-237.

124. Jonoubi P., Mousavi A., Majd A., Daneshian J. (2004). Improved Brassica napus L. regeneration from hypocotyls using thidiazuron and benzyladenine as cytokinin sources. Pak. J. Bot., 36(2), 321-329.

125. Jordan M.C. (2000) Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. Plant Cell Reports, 19, 1069-1075.

126. Jorgensen R. (1991) Silencing of plant genes by homologous transgenes. AgBiotech News Inf., 4, 265-273.

127. Jorgensen R. (1993) The germinal inheritance of epigenetic information in plants. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B., 339, 173-181.

128. Kadota M., Niimi Y. (2003) Effects of cytokinin types and their concentration on shoot proliferation and hyperhydricity in in vitro pear cultivar shoots. Plant Cell, Tiss. and Org. Cult., 72, 261-265.

129. Kaeppler H.F., Menon G.K., Skadsen R.W., Nuutila A.M., Carlson A.R. (2000) Transgenic oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein. Plant Cell Reports, 19, 661-666.

130. Kamal G.B., Illich K.G., Asadollah A. (2007) Effect of genotype, explant type and nutrient medium components on canola (Brassica napus L,) shoot in vitro organogenesis. African J. Biotech., 6, 861-867.

131. Kandasamy M.K., Thorsness M.K., Rundle S.J., Goldberg M.L., Nasrallah J.B., Nasrallah M.L. (1993) Ablation of papillar cell function in Brassica flowers results in the loss of stigma receptivity to pollination. The Plant Cell, 5, 263-275.

132. Kaur N.D., Vyvadilova M., Klima M., Bechyne M. (2006) A Simple Procedure for Mesophyll Protoplast Culture and Plant Regeneration in Brassica oleracea L. and Brassica napus L. Czech J. Genet. Plant Breed., 42, 103-110.

133. Kerlan M.C., Chevre A.M., Eber F. (1993) Interspecific hybryds between a transgenic rapeseed (Brassica napus) and related species-cytogenetical characterization and detection of the transgenic. Genome, 36, 1099-1106.

134. Khan I., Ali W., Takar Z.A., Frooqi A., Sikandar, Akhtar W. (2010) Increased regeneration efficiency of Brassica napus L. cultivars Star, Westar and Cyclone from hypocotyle and cotyledonary explants. Nature Precedings: hdl: 10101/npre. 4781.1.

135. Khan M.M.A., Robin A.B.M.A.H.K., Nazim-Ud-Dowla M.A.N., Talukder S. K., Hassan L. (2009) Agrobacterium-mediated genetic transformation of two varieties of brassica: optimization of protocol. Bangladesh J. Agril. Res., 34, №. 2, 287-301.

136. Khan M.R., Rashid H. and Quraishi A. (2002) High Frequency Shoot Regeneration from Hypocotyl of Canola (Brassica napus L.) cv. Dunkled. Plant Tissue Cult, 12(2), 131-138.

137. Khan M.R., Rashid H., Ansar M., Chaudry Z. (2003) High frequency shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in Canola (Brassica napus). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75, 223-231.

138. Kinney A.J., Hitz N.S., Yadav N.S., Perez-Grau L. (1993) Genes of fatty biosynthesis in developing oilseeds. Plant Physiol., 102, 1.

139. Klee H. (2000) A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science, 5, 446-451.

140. Klee H., Horsch R., Rogers S. (1987) Agrobacterium-mediated plant transformation and its further application to plant biology. Ann.Rev.Plant Physiol., 38, 467486.

141. Klimaszewska K., Keller W.A. (1985) High frequency plant regeneration from thin cell layer expiants of Brassica napus. Plant Cell Tis. Organ Cult., 4, 183-197.

142. Köhler R.H., Zipfel W.R., Webb W.W., Hanson M.R. (1997) The green fluorescent protein as a marker to visualize plant mitochondria in vivo. Plant J., 11, 613621.

143. Kohli A., Gahakwa D., Vain P., Laurie D.A., Christou P. (1999). Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta, 208, 88-97.

144. Kong F., Li J., Tan X., Zhang L., Zhang Z., Qi C., Ma X. (2009) A new time-saving transformation system for Brassica napus. African Journal of Biotechnology, 8, №.11,2497-2502.

145. Kumpatla S.P., Teng W., Buchholz W.G., Hall T.C. (1997). Epigenetic transcriptional silencing and 5-azacytidine-mediated reactivation of a complex transgene in rice. Plant Physiol., 115, 361-373.

146. Kunz C., Schob H., Stam M., Kooter J.M., Meins F.J. (1996) Developmentally regulated silencing and reactivation of tobacco chitinase transgene expression. Plant J., 10(3), 437-450.

147. Lambert B., Referoen M. (1992) Insecticidal promise of the Bacillus thuringiensis. Bioscience, 42, 112-122.

148. Lee W.S., Tzen J.T.C., Kridl J.C., Radke S.E., Huang A.H.C. (1991) Maize oleosin is correctly targeted to seed oil bodies in Brassica napus transformed with the maize oleosin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 6181-6185.

149. Li X.B., Mao H.Z., Bai Y.Y. (1995) Transgenic plants of rutabaga (Brassica napobrassica) tolerant to pest insects. Plant Cell Rep., 15, 97-101.

150. Li X.B., Zheng S.X., Dong W.B., Chen G.R., Mao H.Z., Bai Y.Y. (1999) Insect-resistant transgenic plants of Brassica napus and analysis of resistance in the plants. Acta Genet. Sin., 26, 262-268.

151. Limanton-Grevet A., Jullien M. (2001) Agrobacterium-mediated transformation of Asparagus officinalis L.: molecular and genetic analysis of transgenic plants. Mol. Breed., 7, 141-150.

152. Liu J.W., DeMichele S., Bergana M., Bobik E., Hastilow C., Chuang L.T., Mukerji P., Huang Y. S. (2001) Characterization of oil exhibiting high gamma-linolenic acid from a genetically transformed canola strain. J. Am. Oil Chem. Soc., 78, 489-493.

153. Mahdiyeh Kharrazi, Hossein Nemati, Ali Tehranifar, Abdolreza Bagheri and Ahmad Sharifi. (2011) In vitro culture of carnation (Dianthus caryophyllus L.) focusing on the problem of vitrification. J. Biol. Environ. Sci., 5(13), 1-6.

154. Marcotrigiano M. (1986) Experimentally synthesized plant chimeras 3. Qualitative and quantitative characteristics of the flowers of interspecific Nicotiana chimeras. Annals of Botany, 57, 435—442.

155. Marcotrigiano M., Bernatzky R. (1995) Arrangement of cell layers in the shoot apical meristems of periclinal chimeras influences cell fate. The Plant Journal, 7, 193— 202.

156. Marcotrigiano M., Gouin F.R. (1984) Experimentally synthesized plant chimeras 2. A comparison of in vitro and in vivo techniques for the production of interspecific Nicotiana chimeras. Ann. Bot., 54, 513-521.

157. Marcotrigiano M., Morgan P.A. (1988) Chlorophyll-deficient cell lines which are genetically uncharacterized can be inappropriate for use as phenotypic markers in developmental studies. American Journal of Botany, 75, 985-989.

158. Mathews H., Bharathan N., Litz R.E., Narayanan K.R., Rao P.S.C.R.B.1990) Transgenic plants of mustard Brassica juncea (L.) Czern and Coss. Plant Sci., 72, 245-252.

159. Mathews H., Wagoner W., Kellogg J., Bestwick R.K. (1995) Genetic transformation of strawberry: Stable integration of a gene to control biosynthesis of ethylene. In Vitro Cell Dev Biol -Plant, 31, 36-43.

160. Matzke M.A., Matzke A.J.M. (1995) How and why do plants inactivate homologous (trans)genes? Plant Physiol., 107, 679-685.

161. McCabe M., Mohapatra U.B., Debnath S.C. et al. (1999) Integration, expression and inheritance of two linked T-DNA marker genes in transgenic lettuce. Molecular Breeding, 5, 329-344.

162. McElroy D., Brettel R.I.S. (1994) Foreign gene expression in transgenic cereals. Trends Biotechnol., 12, 62-68.

163. Meira Ziv. (1991) Quality of Micropropagated Plants: Vitrification. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant, 27(2), 64-69.

164. Metz T.D., Dixit R., Earle E.D. (1995a) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var italica) and cabbage (B. oleracea var capitata). Plant Cell Rep., 15, 287-292.

165. Metz T.D., Roush R.T., Tang J.D., Shelton A.M., Earle E.D. (1995b) Transgenic broccoli expressing a Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein -implications for pest resistance management strategies. Mol. Breed., 1, 309-317.

166. Metz T.D., Shelton A.M., Roush R.T., Earle E.D. (1993) Transgenic broccoli expressing Bt toxine are resistant to diamondback moth larvae. Plant Physiol, 102, 174.

167. Misra S. (1990) Transformation of Brassica napus with a "disarmed" oktopine plasmid of Agrobacterium tumefaciens'. molekular analysis and inheritance of the transformed phenotype. J. Exp. Bot., 41, 269-275.

168. Misra S., Gedamu L. (1989) Heavy metal tolerant transgenic Brassica napus L. and Nicotiana tabacum L. plants. Theor. Appl. Genet., 78, 161-168.

169. Moghaieb R.E.A., El-Awady M.A., Mergawy R.G.R., Sawsan S.Y., El-Sharkawy A. (2006) A reproducible protocol for regeneration and transformation in canola (Brassica napus L.). African Biotechnology, 5 (2), 143-148.

170. Moloney M.M., Walker J., Sharma K.K. (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Rep., 8, 238-242.

171. Mouras A., Saul M.W., Essad S., Potrycus I. (1989) Localization by in situ hybridization of a low copy chimeric resistance gene introduced into plants by direct gene transfer. Mol. Gen. Genet., 207, 204-209.

172. Murashige T. (1974) Clonal propogation through tissue cultures. Annu. Rev. Plant Physiol., 25, 133-160.

173. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassys with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15, №. 13, 473-497.

174. Murata M., Orton T.J. (1987) Callus initiation and regeneration capacities in Brassica species. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 11, 111-123.

175. Murphy D.J. (1992) Modifying oilseed crops for non-edible products. Trends-Biotechnol., 10, 84-87.

176. Nagy F., Kay S.A., Chua N.-H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. In: Plant Molecular Biology Manual. Edited by Gelvin S.B. and Schilperoort A.R. Kluwer Academic Publishers Dordrecht, the Netherlands, pp. 1-29.

177. Nap J.P., Conner A.J., Mlynarova L., Stiekema W.J., Jansen R.C. (1997) Dissection of a synthesized quantitative trait to characterize transgene interactions. Genetics, 147,315-320.

178. Narasimhulu S.B., Kirti P.B., Mohapatra T., Prakash S., Chopra V.L.1992) Shoot regeneration in stem explants and its amenability to Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer in Brassica carinata. Plant Cell Rep., 11, 359-362.

179. Narasimhulu S.B., Chopra V.L. (1988) Species specific shoot regeneration response of cotyledonare explants of Brassicas. Plant Cell Rep., 7, 104-106.

180. Nauerby B., Billing K., Wyndaele R. (1997) Influence of the antibiotic timentin on plant regeneration compared to carbernicillin and cefotaxime in concentration suitable for elimination of Agrobacterium tumefaciens. Plant Science, 123, 169-177.

181. Niedz R.P., Smith S.S., Dunbar K.B., Stephens C.T., Murakishi H.H.1989) Factors influencing shoot regeneration from cotyledonary explants of Cucumis melo L. Plant Cell, Tissue and Organ culture, 18, 313-319.

182. Nitsch J. (1974) La culture de pollen isolesur millien synthetique. Acad. Sci., 278, 1031-1034.

183. Ohlsson M., Eriksson T. (1988) Transformation of Brassica campestris protoplasts with Agrobacterium tumefaciens. Hereditas, 108, 173-177.

184. Ono Y., Takahata Y. and Kaizuma N. (1994) Effect of genotype on shoot regeneration from cotyledonary explants of rapeseed (Brassica napus L.). Plant Cell Rep., 14, 13-17.

185. Ono Y., Takahata Y., Kaizuma N. (2000) Genetic analysis of shoot regeneration from cotyledonary explants in Brassica napus. Theoretical and Applied Genetic, 100, 895-898.

186. Opabode Jelili T. (2006) Agrobacterium-mediated transformation of plants: emerging factors that influence efficiency. Biotechnology and Molecular Biology Review, 1 (1), 12-20.

187. Park S.H., Pinson S.R.M., Smith R.H. (1996) T-DNA integration into genomic DNA of rice following Agrobacterium inoculation of isolated shoot apices. Plant Mol. Biol., 32, 1135-1148.

188. Park S.H., Rose S.C., Zapata C., Srivatanakul M., Smith R.H. (1998) Cross-protection and selectable marker genes in plant transformation. Vitro Cell Dev Biol-Plant, 34, 117-121.

189. Patent, Sanofi, (1990) Elf-Aquitaine. New recombinant protein with endochitinase activity. FR-009460. PR-24.07.

190. Paul S., Sikdar S.R. (2005) Regeneration of plants from root explant of two Indian cultivars of Brassica campestris L. through somatic embryogenesis. Current science, 89, №. 8, 1323-1326.

191. Pechan P.M. (1989) Successful cocultivation of Brassica napus microspores and proembrios with Agrobacterium. Plant Cell Rep., 8, 387-390.

192. Petersen S., Stummann B., Olesen P., Henningsen K. (1989) Structure and function of root-inciding (Ri) plasmids and their relation to tumour inducing (Ti) plasmids. 77, 427-435.

193. Pineau C., Freydier A., Ranocha P., et al. (2005) hca\ an Arabidopsis mutant exhibiting unusual cambial activity and altered vascular patterning. The Plant Journal, 44, 271-289.

194. Poethig S. (1989) Genetic mosaics and cell lineage analysis in plants. Trends in Genetics, 5, 273-277.

195. Ponappa T., Brzozowski A.E., Finer J.J. (1999) Transient expression and stable transformation of soybean using the jellyfish green fluorescent protein. Plant Cell Reports, 19, 6-12.

196. Popadin P.V. (2002) Application of Agrobacterium transformation in selection of cabbage for desease resistance: PhD Dissertation. Russian State Agrarian University-MTAA named after K. A. Timiriazev. Moscow. Russia.

197. Potrykus I., Paszkowski J., Saul M.W., Petruska J., Shillito R.D. (1985b) Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer. Mol. Gen. Genet., 199,169-177.

198. Potrykus I., Shillito R., Saul M., Paszkowski J. (1985a) Direct gene transfer, state of the art and future potential. Plant Mol. Biol. Reporter, 3, 117-128.

199. Prasad K.V.S.K., Sharmila P., Kumar P.A., Saradhi P.P. (2000) Transformation of Brassica juncea (L.) Czern with bacterial codA gene enhances its tolerance to salt and cold stress. Mol. Breed., 6, 489-499.

200. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene., Ill, №2, 229-233.

201. Pua E.C., Mehra-Palta A., Nagy F., Chua N.-H. (1987) Transgenic plants of Brassica napus L. Bio/Technology, 5, 815-817.

202. Qin Y., Gao L.H., Pulli S., Guo Y.D. (2006) Shoot differentiation, regeneration of cauliflower and analysis of somaclonal variation by RAPD. Hereditas, 1-8.

203. Qing C. M., Fan L., Lei Y., Bouchez D., Tourneur C., Yan L., Robaglia C. (2000) Transformation of Pakchoi {Brassica rapa L. ssp chinensis) by Agrobacterium infiltration. Mol. Breed., 6, 67-72.

204. Quiroz-Figueroa F., Monforte-Gonzalez M., Galaz-Avalos R.M., Loyola-Vargas V.M. (2006) Direct somatic embryogenesis in Coffea canephora. Methods Mol. Biol., 318, 111-117.

205. Radke S.E., Turner J.C., Facciotti D. (1992) Transformation and regeneration of Brassica rapa using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep., 11, 499505.

206. Radke S.E., Andrews B.M., Moloney M.M., Crouch M.L., Kride J.C.,

207. Knauf V. C. (1988) Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens:developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. Theor Appl. Genet., 75, 685-694.

208. Rakosy-Tican E., Aurori C.M., Dijkstra C., Thieme R., Aurori A., Davey

209. M.R. (2007) The usefulness of the gfp reporter gene for monitoring Agrobacterium-mediated transformation of potato dihaploid and tetraploid genotypes. Plant Cell Rep., 26, 661-671.

210. Romberger J. (1963) Meristems, growth and development in woody plants. USDA Tech Bull., 1293, 214.

211. Schmulling T., Schell J. (1993) Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks can be periclinal chimeras. Plant Mol Biol., 21, 705-708.

212. Schroder M., Dixelius C., Rahlen L. and Glimilus K. (1994) Transformation of Brassica napus by using the AddA. gene as selectable marker and inheritance studies of the marker genes. Physiol. Plant, 92, 37-46.

213. Scott A., Woodfield D., White D.W.R. (1998) Allelic composition and genetic background effects on transgene expression and inheritance in white clover. Mol. Breed., 4, 479-^190.

214. Senaratna T., Kott L., Beversdorf D.W., McKersie D. (1991) Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rape (.Brassica napus L.). Plant Cell Reports, 10, 342-344.

215. Sethi U., Basu A., Guha-Mukherjee S. (1990) Role of inhibitors in the induction of differentiation in callus cultures of Brassica, Datura and Nicotiana. Plant Cell Rep., 8, 598-600.

216. Sharma K.K. and Thorpe T.A. (1989) In vitro regeneration of shoot buds and plantlets from seedling root segments of Brassica napus L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 18, 129-141.

217. Sharma K.K., Bhojwani S.S., Thorpe T.A. (1990) Factors affecting hogh frequency differentiation of shoots and roots from cotyledon explants of Brassica juncea (L.) Czern. Plant Sci., 66, 247-253.

218. Sharma K.K., Bhojwani S.S., Thorpe T.A. (1991) The role of cotyledonary tissue in the differentiation of shoots and roots from cotyledon explants of Brassica juncea (L.) Czern. Plant Cell Tis. Organ Cult., 24, 55-59.

219. Sharma M., Sahni R., Kansal R., Koundal K.R. (2004) Transformation of oilseed mustard Brassica juncea (L.) Czern & Coss cv. Pusajaikisan with snowdrop lectin gene. Indian Journal of Biotechnology, 3, 97-102.

220. Shewmaker C.K., Sheehy J.A., Daley M., Colburn S., Ke D.Y. (1999) Seedspecific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects. Plant J., 20, 401-412.

221. Shields R. (1987) Towards insect-resistant plants. Nature, 238, 12-13.

222. Shimomura O., Johnson F.H., and Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol., 59, 223-239.

223. Shukla A. Sawhney V.K. (1991) Comparative regenerative ability of internodal segments of wild type and a genie male sterile line of rapeseed (Brassica napus) cultured in vitro. Plant Science, 79, 95-98.

224. Skoog F. (1944) Growth and organ formation in tobacco tissue cultures. Am. J. Bot., 31, 19-24.

225. Skoog F., Miller C. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. In: The biological action of growth substances, Porter H.K. (ed.). Academic Press. N.Y., 11, pp. 118-131.

226. Solovyev A.G., Stroganova T.A., Zamyatnin A.A. Jr., Fedorkin O.N., Schiemann J. and Morozov S.Y. (2000) Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins: TGBp3-assisted targeting of TGBp2. Virology, 269(1), 113-127.

227. Southern E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of molecular biology, 98 (3), 503-517.

228. Spangenberg G., Koop H.U., Lichter R., Schweiger H.G. (1986) Microculture of single protoplasts of Brassica napus. Physiol. Plant, 66, 1-8.

229. Spencer T.M., O'brien J.V., Start W.G., Adams T.R., Gordon-Kamm W.J., Lemaux P.G. (1992) Segregation of transgenes in maize. Plant Mol. Biol., 18, 201210.

230. Srivastava V., Vasil V., Vasil I.K. (1996) Molecular characterization of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 92, 1031-1037.

231. Stachel S.E., Messens E., Van Montagu M., Zambryski P. (1985) Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature, 318, 624-629.

232. Stewart C.N., Adang M.J., All J.N., Raymer P.L., Ramachandran S., Parrott W.A. (1996) Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene. Plant Physiol., 112, 115-120.

233. Stewart R.N., Burk L.G. (1970) Independence of tissues derived from apical layers in ontogeny of the tobacco leaf and ovary. Am. J. Bot., 57, 1010-1016.

234. Stewart, R.N., Dermen H. (1970) Somatic genetic analysis of the apical layers of chimeral sports in Chrysanthemum by experimental production of adventitious shoots. Amer. J. Bot., 57 (9), 1061-1071.

235. Szymkowiak E.J., Irish E.E. (1999) Interactions between jointless and wildtype tomato tissues during development of the pedicel abscission zone and the inflorescence meristem. Plant Cell, 11, 159-175.

236. Takahata Y., Wakui K., Kaizuma N. (1992) A dry artificial seed system for Brassica crops. Acta Horticulturae, 1, 317-322.

237. Takasaki T., Hatakeyama K., Ojima K., Watanabe M., Toriyama K., Hinata K. (1997) Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of Brassica rapa L. Breeding Science, 47, 127-134.

238. Tang G.X., Zhou W.J., Li H.Z., Mao B.Z., He Z.H., Yoneyama K. (2003) Medium, Explant and Genotype Factors Influencing Shoot Regeneration in Oilseed Brassica spp. Journal of Agronomy and Crop Science, 189, Iss.5, 351-358.

239. Theis R., Robbelen G. (1990) Anther and microspore development in different male sterile lines of oilseed rape {Brassica napus L.). Angew. Bot., 64, 419-434.

240. Thorpe T.A., Patel K.R. (1984) Clonal propogation: Adventitious buds. In: Cell culture and Somatic Genetics of Plants (Ed.Vasil I.K.), Academic Press, N.Y., 1, pp. 49-60.

241. Tilney-Bassett R.A.E. (1986) Plant Chimeras. Edward Arnold. Baltimore, 2521. P

242. Tooke F., Battey N. (2003) Models of shoot apical meristem function. New Phytol., 159, № 1, 37-52.

243. Toriyama K., Stein J.C., Nasrallah M.E., Nasrallah J.B. (1991) Transformation of Brassica oleracea with an S-locus gene from B.campestris changes the self-incompatibility phenotype. Theor. Appl. Genet., 81, 769-776.

244. Tovar J., Lichtenstein C. (1992) Somatic and meiotic chromosomal recombination between inverted duplications in transgenic tobacco plants. Plant Cell, 4, 319-322.

245. Tsydendambaev V.D., Christie W.W., Brechany E.Y., Vereshchagin A.G.2004) Identification of unusual fatty acids of four alpine plant species from the Pamirs. Phytochemistry, 65, Iss.19, 2697-2705.

246. Turgut R., Bargchi M., Draper J. (1991) Agrobacterium-mediated transformation of Brassica napus. In Vitro, 27, 150A.

247. Ueda K., Sakaguchi S., Kumagai F., Hasezawa S., Quader H., Kristen U. (2003) Development and disintegration of phragmoplasts in living cultured cells of a GFP: TUA6 transgenic Arabidopsis thaliana plant, Protoplasma, 3-4, 111-118.

248. Uliaie E.D., Farsi M., Ghreyazie B. and Imani J. (2008) Effects of genotype and AgN03 on shoot regeneration in winter cultivars of rapeseed {Brassica napus). Pak. J. Bot. Sci., 11(16), 2040-2043.

249. Vain P., Keen N., Murillo J., Rathus C., Nemes C., Finer J.J. (1993) Development of the particle inflow gun. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 33, 237-246.

250. Valvekens D., Van Montagu M., Van Lijsebettens M. (1988) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamiein selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 5536-5540.

251. Vasil V., Vasil I.K. (1981) Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of pear millet (Pennisetum americanum). Ann. Bot., 47, 669-678.

252. Verma R., Singh R.R. (2007) Regeneration and in vitro flowering in Brassica campestris (L.) var. Bhavani. Our Nature, 5, 21-24.

253. Vieitez A.M., Ballester A., San-Jose M.C., Vieitez E. (1985) Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro. Physiologia Plantarum, 65, Iss. 2, 177-184.

254. Wallroth M., Gertats G.M., Rogers S.M., Fraley R.T., Horsh R.B. (1986) Chromosomal localization of foreign gene in Petunia hybrid. Mol. Gen. Genet., 202, 6-12.

255. Walters D.A., Vetsch C.S., Potts D.E., Lundquist R.C. (1992) Transformation and inheritance of a hygromycin phosphotransferase gene in maize plants. Plant Mol. Biol., 18, 189-200.

256. Wang Y.P., Sonntag K., Rudloff E. et al. (2005) Production of fertile transgenic Brassica napus by Agrobacterium-mediated transformation of protoplasts. Plant Breeding, 124, 1-4.

257. Waterer D., Lee S., Scoles G., Keller W. (2000) Field evaluation of herbicideresistant transgenic broccoli. HortScience, 35, 930-932.

258. White Ph. (1939) Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient. Amer. J. Bot., 26, 59-64.

259. Williams E.G., Maheswaran G. (1986) Somatic embryogenesis: Factors influencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group. Ann. Bot., 57, 443462.

260. Williams J., Pink D.A.C., Biddington N.L. (1990) Effect of silver nitrate on long-term culture and regeneration of callus from Brassica oleracea var. gemmifera. Plant Cell Tissue Org. Cult., 21, 61-66.

261. Wu H., Sparks C., Amoah B., Jones H.D. (2003) Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat. Plant Cell Rep., 21, 659-668.

262. Xiang Y., Wong W.-K.R., Ma M.C., Wong R.S.C. (2000) Agrobacterium-mediated transformation of Brassica campestris ssp. Parachinensis with synthetic Bacillus thuringiensis crylAb and cry 1 Ac genes. Plant Cell Reports, 19, 251-256.

263. Xu Z.H., M.R. Davey and E.C. (1982) Cocking. Plant regeneration from root protoplasts of Brassica. Plant Sci. Lett., 24, 117-121.

264. Yang M.Z., S.R. Jia and E.C. Pua. (1991) High frequency of plant regeneration from hypocotyl explants of Brassica carinata A. Br. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 24, 79-82.

265. Ye F., Signer E.R. (1996) RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is transcriptional and alters chromatin configuration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 10881-10886.

266. Yu Ya, Zhao Yong-Qin, Zhao Bing, Ren Shuxin, Guo Yang-Dong. (2011) Influencing factors and structural characterization of hyperhydricity of in vitro regeneration in Brassica oleracea var. italic. Canadian Journal of Plant Science, 91(1), 159-165.

267. Zaccomer B., Cellier F., Boyer J.C., Haenni A.L., Tepfer M. (1993) Transgenic plants that express genes including the 3'untranslated region of the turnip yellow mosaic virus (TYMV) genome are against TYMV infection. Gene, 136, 87-94.

268. Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. (1983) Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBOJ., 2, 2143-2150.

269. Zhang P., Ling D.H. (1995) Enhancement of plant regeneration rate of Brassicaparachinensis cultured in vitro. Acta Botanica Sinica, 37, 902-908.

270. Zhong R., Zhu F., Liu Y. L., Li S.G., Kang L.Y., Luo P. (1997) Oilseed rape transformation and the establishment of a bromoxynil-resistant transgenic oilseed rape. Acta Bot. Sin., 39, 22-27.

271. Zhu X.Y., Zhao M., Ma S., Ge Y.M., Zhang M.F., Chen L.P. (2007) Induction and origin of adventitious shoots from chimeras of Brassica juncea and Brassica oleracea. Plant Cell Rep., 26, 1727-1732.

272. Zhukov A.V., Vereshchagin A.G. (1970) Heptadecanoic acid as an internal standart in the gas chromatographic weight determination of fatty acids. J. Chromatogr, 51, 155-166.

273. Zieg R.G., Outka D.A. (1980) The isolation, culture and callus formation of soybean pod protoplasts. Plant Sciens Lett, 18, 105.

Информация о работе

Хоанг Тхи Жанг
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы