Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)"

На правах рукописи

Гхасеми Безди Камал

Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)

Специальность: 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии и в Центре молекулярной биотехнологии Российского Государственного Аграрного Университета - МСХА имени К.А.Тимирязева.

Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН, Шевелуха Виктор Степанович, Кандидат биологических наук Карлов Генадий Ильич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук A.B. Поляков

кандидат биологических наук A.M. Камионская

Ведущая организации: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Зашита диссертации состоится "// " июня 2006 в " 1Р " часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском Государственном Аграрном Университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127550, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, д. 49, Ученый совет РГАУ-МСХА имени К .А.Тимирязева, тел/факс 9762984, 9778428.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке Российского Государственного Аграрного Университета-МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан июня 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Е. А. Калашникова

Q-.OQQ fv

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В сельском хозяйстве остро стоит проблема потерь урожая вследствие поражения культурных растений грибными патогенами. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению роли белков

в этом процессе [Сердобинский, 2002]. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название антимикробных. Использование генов из других растений, детерминирующих образование антимикробных белков, особенно обладающих более высокой физиологической активностью пептидов, является перспективным направлением.

Создание векторной конструкции на основе антимикробных белков для проведения агробактериальной трансформации, может обеспечить создание методами генной инженерии трансгенных растений рапса, устойчивых к различным заболеваниям. В связи с этим, актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена.

Рапс (Brassica napus L.) является одной из ценных кормовых и масличных сельскохозяйственных культур, получивших большое распространение в Канаде, Китае, Европейских странах, Индии и в других странах мира. Один из главных факторов, ограничивающих возделывание этой культуры - его восприимчивость к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum). Применение фунгицидов не очень эффективно для устранения симптомов вызванных этой болезнью. Так же применение фунгицидов увеличивает стоимость производства и может оказывать неблагоприятное влияние на окружающую среду. Поэтому идентификация генов для создания устойчивых форм гибридов и сортов рапса методами генной инженерии обеспечивает эффективную и экологическую безопасность для решения указанной задачи.

В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу гена MiAMPl, кодирующего антимикробного белка австралийского ореха и созданию векторной конструкции с этим геном для проведения агробактериальной трансформации сортов рапса иранской селекции.

Иель и задачи исследования. Целью настоящей работы является оптимизация условий регенерации рапса (Brassica napus L.) и конструирование растительного вектора с геном антимикробного белка MiAMPl для генетической трансформации растений.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1) создание генетической конструкции, содержащей ген Mi AMPI на основе стандартного бинарного вектора рСАМВ1А1305.1 под контролем регуляторных элементов, а также - маркерный ген гигромицинфосфо-трансферазы (hpt);

2) определение наличия гена MiAMPl в созданной конструкции с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования нузслеотидной последовательности гена;

3) трансформация конструкции pCAMBIA1305.1-MiAMPl в штамм AGL0 Agrobacterium tumefaciens для агробактериальной трансформации растений;

4) оптимизация условий регенерации in vitro различных сортов рапса иранской селекци;

5) проведение агробактериальной трансформации рапса.

Научная новизна работы. На основе стандартного бинарного вектора pCAMBIAl 305.1 впервые создана генетическая конструкция pCAMBIAl305.1 -MiAMPl, содержащая ген MiAMPl под контролем CaMV 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты. Конструкция трансформирована в штамм AGLO A tumefaciens для агробактериальной трансформации растений. Оптимизированы условия регенерации разных сортов рапса иранской селекци и впервые проведена генетическая трансформация созданной конструкцией pCAMBIA1305.1-MiAMPl в растений рапса

Практическая значимость работы. Созданная генетическая конструкция pCAMBIА1305.1-MiAMPI, содержащая ген антимикробного белка может быть использована для создания сельскохозяйственных растений, устойчивых к склеротинии.

Апробация результатов работы. Результаты работы апробированы на 2005 In Vitro Biology Meeting (Baltimore, Maryland, USA, June 5-7, 2005), 13th Multi-disciplinary Iranian Researchers Conference in Europe (University of Leeds, Leeds, UK, July 2, 2005), 8th Iranian Congress of Biochemistry and First International Congress of Biochemistry & Molecular Biology (Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran, September 11-15, 2005), и международной научной конференции молодых учёных и специалистов "Молодые ученые - аграрной науке", посвященной 140-летию Российского государственного аграрного университета-МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия, 1-2 июня 2005 г).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, выводов, заключения и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на /4У страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунка. Библиография включает/^источников, из них/33 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использован штамм E.coli DH10B [ABRC, США], векторы pGEMT [Promega] и рСАМВ1А1305.1 [pCAMBIA vectors]. Для агробактериальной трансформации пременяли штамм AGLO Agrobacterium tumefaciens [Lazo et al., 1991], содержащий конструкцию pCAMBIA 1305.1 -MiAMP 1.

Конструирование растительного вектора. После определения ориентации гена MiAMPl, полученого из университета Queensland Австралии на плазмиде pGEMT и сайтов рестрикции, ген клонировали в бинарный вектор рСАМВ1А1305.1. Ген MiAMPl лигировали с промотором CaMV 35S и репортёрным геном GUSPlus.

Трансформацию агробактериального штамма AGL0 плазмидной ДНК pCAMBIA1305.1-MiAMPl проводили методом прямой трансформации. Трансформированные клетки высевали на агаризованную среду УЕВ с добавлением 25 мг/л рифампицина и с соответствующим селективным антибиотиком канамицином 50 мг/л при темпратуре 28°С. Наличие vir-генов в трансформируемом штамме агробактерии определяли с помощью ПЦР-анализа ДНК с праймерами VirBl nVirB2.

Регенерация растений в культуре in vitro. В работе были использованы сорта ярового рапса (В. napus L.): Sari Gol, Quantum и Option 500 иранской селекции (Иранской научно-исследовательский институт растениеводства). Все исследования с растительными тканями in vitro проводили на агаризованных средах, содержащих макро- и микросоли по прописи MS [Murashige и Skoog, 1962], витамины по В3 [Gamborg et al., 1968], а также сахарозу, агар и регуляторы роста в различных концентрациях и соотношениях (таб. 1).

В качестве первичного экспланта использовали семядоли, гипокотили и корни, изолированные с 5-дневных проростков. Экспланты культивировали в климатической камере при 20-22°С, освещенности 2.5 клк. и 16-часовом фотопериоде.

Сформировавшиеся растения-регенеранты высаживали в почву в условия максимально приближенные к полевым. Растения были фертильны,

нормально проходили фазу цветения и образовывали семена.

Таблица 1

_Состав питательны! сред для адвентивного морфогенеза рапса

Компоненты (мг/л) Среды

№ 1 № 2 | № 3 | № 4 | № 5 | № 6 | № 7 | № 8 | № 9 №10

Макросоли Vi MS По прописи MS '/2MS

Микросоли

MgS04.7H20

СаС12.2Н20

Хелат железа

Витамины - По прописи B5

БАП - - 4 4 4 8 4 0.5 6 -

НУК - 2 - 1 2 1 2 - 0.6 -

Кинетин - 4

2,4-D - 0.1

AgN03 - - - - - - 10 10 -

ИМК - - - - - - - - 0.5

Сахароза (г/л) 5 30 10 10 10 10 10 10 10 20

pH 5.7-5.8

Агар (г/л) 7|б|б|б|б|б|7|7|б| 7

Статистическая обработка данных. Каждый эксперимент проводили в двухкратной повторности, в среднем по двадцать эксплантов. Частоту регенерации рассчитывали как процентное отношение числа эксплантов, способных к органогенезу к общему числу эксплантов.

Трансформация и селекция трансформантов. В работе для генетической трансформации были использованы семена масличного рапса сортов Quantum и Option 500. Генетическую трансформацию рапса проводили методом совместного культивирования растительных эксплантов с агробактерией [Stewart et al, 1996] модифицированным Cardoza et al [2003]. Для трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens, штамм AGL0 с бинарном векторе pCAMBIA1305.1- MiAMPl.

Анализ растений-трансформантов. Анализ экспрессии гена ß-глюкуро-нидазы проводили гистохимическим способам по стандартам методикам Clark [1997]. Выделение ДНК из свежих листьев рапса, прошедших селекцию на гигромицине проводили по методу, описанному Saghai-Maroof et al. [1984] с незначительными модификациями. Включение чужеродного гена MiAMPl в геном растений рапса поколения Т0 определяли с помощью ПЦР-анализа ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Клонирование ДНК, кодирующей ген Mi AMPI

1.1. Создание векторной конструкции с геном MiAMPl. Нуклеотидная последовательность гена MiAMPl была клонирована по сайтам рестрикции SacII и Spei Т-вектора pGEMT [Promega].

Данную конструкцию pGEMT-MiAMPl трансформировали в штамм E.coli DH10B и проверяли наличие гена с помощью ПЦР с праймерами М13 (рис. 1А), рестриктаз Ncol и BamHI (рис. 1Б) и секвенированием. По сиквенсу определяли ориентацию гена на плазмиде и сайты рестрикции в начале и в конце гена.

Рис. 1. Проверка наличия гена MiAMPl в конструкции pGEMT- MiAMPl с помощью: А) ПЦР с праймерами М13.1,2- конструкция pGEMT-MiAMPl; 3-маркер 100 bp ladder, и Б) рестрикция с Ncol и BamHI. 1: маркер 100 bp ladder; 2, 3: рестрицированные колонии pGEMT-MiAMP 1; 4 нерестрицированная колония pGEMT-MiAMPl; 5: маркер 1 kb ladder

Для генетической трансформации растений, последовательность была субклонирована по сайтам рестрикции Ncol и В gill в бинарный вектор pCAMBIА 1305.1. Для этого была использована следующая схема: после определения ориентации гена MiAMPl на плазмиде pGEMT и сайтов рестрикции в начале и в конце гена, включение гена MiAMPl в векторе pGEMT определяли с помощью ГГЦР-анализа ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров состава: Mial (5 - agatctgccatggcttccaccaagtt-gttc -3") и Mia2 (5'- gcagatctacgcattggatgaagatactcttc -3'), совпадающие с геном MiAMPl, а также для создания сайтов рестрикции Ncol и Bglll в начале и в конце гена MiAMPl, совпадающие с сайтами рестрикции вектора pCAMBI А1305.1 (рис. 2).

Для того, чтобы совпали рамки считивания нуклеотидной последовательности гена MiAMPl с рамками считивания аминокислотной последовательности, добавляли 2 нуклеотида GT в конце гена перед сайтом рестрикции Bglll (рис. 3). Так же был удалён стоп-кодон "tag" на конце гена

MiAMPl, чтобы экспресировался репортёрный ген GUSPlus вместе с геном MiAMPl.

Рис. 2. Продукт ПЦР конструкции pGEMT-MiAMPl; 1: маркер 100 bp ladder 2-4• амплифицируемые колонии pGEMT-MiAMPl

Start cndon

AGA TCT GCC ATG GCT ТСС ACC AAG TTG TTC TTC TCT GTC ATT ACT GTG ATG ATG CTC ATA GCA ATG GCA AGT GAG ATG GTG AAT GGG AGT GCA TTT АСА GTA TGG AGT GGT CCA GGT TGT AAC AAC CGT GCT GAG CGA TAT AGC AAG TGT GGA TGC TCA GCT ATA CAT CAG AAG GGA GGC TAT GAC TTC AGC TAC ACT GGA CAA ACT GCT GCT CTC TAC AAC CAG GCT GGA TGC AGT GGT GTT GCA CAC ACC AGG TTT GGG TCC AGT GCC AGG GCA TGC AAC CCT TTT GGT TGG AAG AGT АТС TTC АТС CAA TGC GTA GAT CTG С

□ ТТЦР ]

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность продукта ицР конструкции pGEMT-MiAMPl с помощью специальных праймеров Mial и Mia2. (Bglll-Ncol - ген MiAMPl - Bglll)

Этот фрагмент MiAMPl после обработки эндонуклеазами Ncol и Bglll и выделения из агарозного геля был лигирован в плазмиде рСАМВ1А1305.1 (12680 н.п.) с помощью Т4 ДНК лигазы, с целью создания векторной конструкции pCAMBIA1305.1-MiAMPl (рис. 4 и 5).

pCAMBIAUOS.l

| Mi

|1 ( I .1

Ncol Gest MIAMI»!

Nhti mos НУ*

5] I! i Г I

Рис. 4. Схема создания конструкции рСАМВ1А1305.1- MiAMPl

C«MY35S Heel Gens >gШ Cautac Shel NOS

fromxa i MiAMPl » min» OUSPlm ftrf/ polyA T-borielfll)

r^l i j H "уц,

C«MV35S

LacZ Poly double entancei CeMV35S TbontaO.)

alpJii linker promoter hygromycinO aolyA 4

Рис. 5. Схема векторной конструкции плазмиды pCAMBIA1305.1, несущей ген антимикробного белка Macadamia integrifolia MiAMPl, использованной для трансформации растений

Наличие в устойчивых к канамицину колоний, плазмид, которые включают в себя вектор рСАМВ1А1305.1 размером 12677 т.н.п. и MiAMPl-фрагмент размером 314 н.п. подтвердили путем проведения рестрикционного анализа, используя рестриктазы BstEII и BamHI (рис. 6А), рестриктазы Spei и BamHI (рис. 6Б), а также ПЦР с праймерами Mial и Mia2 (рис. 7). Данная конструкция содержит в своем составе кодирующую последовательность гена MiAMPl между CAMV 35S промотором и терминатором вируса мозаики цветной капусты, обеспечивающими конститутивную экспрессию гена в растениях и другие регуляторные последовательности и элементы вектора pCAMBIAl 305.1.

Т

щ^^т

^^^^^^ ^^^^^^

v*. * s

ш

зта

2iaipw

1

А)

т

j г :л-

Б)

MiAMPl в

конструкции

Рис. 6. Проверка наличия гена pCAMBIA1305.1-MiAMPl с помощью рестриктаз A) BstEII и BamHI; 7

рестрицированная ДНК pCAMBJA1305.1-MiAMPl; 2-4: рестрицированные ДНК pCAMBIA13051; 5• маркер 1 kb ladder; и Б) Spei и BamHI; 1 рестрицированная ДНК pCAMBIA1305.1-MiAMPl, 2. рестрицированная ДНК pCAMBIA1305 1; 3: маркер 1 kb ladder

Рис. 7. Проверка наличия гена М1АМР1 в конструкции рСАМВ1А1305.1-М1АМР1 с помощью ПДР со специальными праймерами 1УНа1 и М1а2; 16- колонии рСАМВ1А1305.1-М1АМР1 В колонии МгЛг 1, 2, 4, 5 и 6 существует ген М1АМР1; 7* рСАМЫА 1305,1;8: маркер ЮОЬр 1ас1с1ег; 9'колония рОЕШ-МхАМР!

Таким образом, на основе полученных результатов нами создана векторная конструкция, содержащая ген М1АМР1, пригодная для трансформации растений. По завершении клонирования последовательность нуклеотидов гена М1АМР1 была проанализирована при помощи секвенирования.

1.2. Трансформация генетической конструкции в агробактерию.

Созданная конструкция рСАМВ1А1305.1-М1АМР1 была введена в штамм АИ-О А. Ште/аает. В данной конструкции содержится система переноса рВЮ22оп.

После выделения плазмидной ДНК отобранных агробактериальных колоний, несущих конструкцию рСАМВ1А1305.1-М1АМР1 проверяли наличие гена М1АМР1 в данной конструкции с помощью рестрикционного анализа (рис. 8).

А) Б)

Рис. 8. Отбор агробактериальных колоний, несущих конструкцию pCAMBIA1305.1- MiAMPl и проверка наличия гена MiAMPl в данной конструкции с помощью рестрикционного анализа: A) Ncol н Bglll; 1-9: рест-рицированные плазмидные ДНК агробактериальных колоний, трансформируемых с конструкцией рСАМВ1А1305 1-MiAMPl. В колонии № 1-3 и 8 выявлены ген MiAMPl; 10: маркер 100 bp ladder; 11-13• плазмидная ДНК нерестрицированных колоний н Б) Spei и BamHl; 1-7: рестрицированные плазмидные ДНК агробактериальных колоний, несущих конструкцию pCAMBIA1305 1-MiAMPl. В колонии № 1 и 3 существует ген MiAMPl; 8. плазмидная ДНК нерестрицированной колонии pCAMBIA1305 1-MiAMPl; 9■ маркер 100 bp ladder; 10, 11 ■ рестрицированные ДНК рСАМВ1А1305 1

После проверки наличия гена Mi AMPI в штамме AGL0 агробактерии для подтверждения нуклеотидной последовательности использовали специальные праймеры РСАМ1 (5'- cttcgcaagacccttcctctat -3'), комплементарные участку CaMV 35S промотора, и РСАМ2 (5'-gtcctaaccaagaaaatgaaggaga-З'), комплементарный участку Catalase intron, совпадающие с двумя сторонами гена Mi AMPI в растительном векторе рСАМВ1А1305.1, которые использовали для секвеиирования. Амплификацию целевого гена MiAMPl проводили с использованием праймеров Mial иМа2 (рис. 9).

314 bp

л ifeL 'du." т.».»-';'« Ж^ШШ^шш 1 2 3 4 5

А) Б)

Рис. 9. Проверка наличия гена MiAMPl в штамме AGL0 агробактерии с конструкцией pCAMBIA1305.1-MiAMPl с помощью ПЦР со специальными праймерами: А) РСАМ1 и РСАМ2; 1-4: штамм AGL0, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 5: Marker 100 bp ladder; 6, 7: штамм E.coli DH10B, содержащий конструкция pCAMBIA¡305 1-MiAMPl, 8: pCAMBIAl305.1; 9- вода и Б) Mial и Mm2; 1-3: штамм AGLO, содержащий конструкция pCAMBIA1305 1-MiAMPl; 4: штамм E.coli DH10B, содержащий конструкция pCAMBIA 1305.1-MiAMPl; 5: Marker 100 bp ladder

Последовательность амплифицируемого участка была секвинирована. Анализ данной нуклеотидной последовательности показал, что она полностью совпадает с нуклеотидной последовательностью кДНК, кодирующей антимикробный белок MiAMPl и не имеет никаких мутации или делении.

Также для проверки наличия v/r-генов в трансформируемом штамме AGL0 агробактерии, мы использовали праймеры VirBl (5'-ggctacatcgaagatcgta-tgaatg-З') и VirB2 (5'-gactatagcgatggttacgatgttgac-3'), комплементарные участкам vir-области агробактерии (рис. 10).

д Рис. 10. Проверка наличия vir-генов в штамме AGL0 бюьр 3 агробактерии с конструкцией рСАМВ1А1305.1-

тт MiAMPl с помощью ПЦР со специальными праймерами VirBl и VirB2; 1: штамм AGL0 тт агробактерии; 2• штамм Ecoli, содержащий mm конструкцию pCAMBIA 1305.1-MiAMPl; 3, 4: штамм 123 4 5 6 AGLO, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 5: ДНК контроля VIR+ ; 6: Marker 100 bp ladder

Таким образом, нами был проведен анализ полученной ДНК антимикробного белка Mi AMPI, определён его размер и нуклеотидная последовательность. Создана векторная конструкция pCAMBIA1305.1 -MiAMPI, содержащая ген антимикробного белка Mi AMPI для агробактериальной трансформации растений.

2. Оптимизация условий регенерации рапса

2.1. Оценка растительного материала на интенсивность морфогенеза в культуре in vitro. Регенерацию осуществляли на средах № 3-6 (таб. 1), разработаных Г.Н. Ралдугиной и др. [1995] для органогенеза у семядольных эксплантов рапса. Модификацией исходной прописи питательной среды является замена оригинальных витаминов на витамины среды В5.

Работу проводили с прекультивированием эксплантов, изолированных с 5-дневных проростков рапса на каллусообразующей среде № 2 не более 2 сут. Оценку общего морфогенетического потенциала проводили путём подсчёта на 21-е сутки количества эксплантов, способных к регенерации побегов (таб. 2).

Таблица 2

Зависимость частоты регенерации побегов от генотипа

Генотип Тип экспланта В среднем, по генотипу (SE*<g= 1,6)

Семядоль Гипокотиль Корень

Sari Gol 51,6 23,4 6,3 27,1

Quantum 68,8 31,3 7,8 35,9

Option 500 62,5 26,6 3,1 30,7

В среднем, по типу экспланта (SE« =1,6) 60,9 27,1 5,7 -

Примечание: S V.-ce для частных различий = 2,9, прекультивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 2 с последующим их переносом на середу для регенерации. В таблице приведены средние значения по всем составам питательных сред.

Из таб. 2 следует, что средняя частота морфогенеза колебалась от 27,1% до 35,9% в зависимости от генотипа. Причем наибольшей морфогенетической активностью обладали экспланты сорта Quantum. Вероятно, это связано с большим содержанием эндогенных гормонов в тканях, либо большей чувствительностью к действию экзогенных цитокининов на данный генотип. Вместе с тем следует отметить, что семядольные экспланты обладали большим морфогенетическим потенциалом по сравнению с гипокотилями и корнями. Так как сорта Quantum и Option 500 отличались наиболее высоким уровнем

адвентивного морфогенеза, они были нами отобраны для дальнейших исследований.

2.2. Влияние состава питательной среды на формирование адвентивных почек рапса в условиях in vitro. На следующем этапе исследований проводили оценку влияния питательных сред различного состава, на адвентивный органогенез с целью увеличения его эффективности (таб. 3).

Таблица 3

Частота регенерации побегов рапса в зависимости от фитогормонального состава питательной среды, типа первичного экспланта и генотипа (в %)

Фитогормоны (мг/л) Эксплант В среднем, по фитогормона м БАП и НУК и генотипу (S£O5=33) В среднем, по

Среда № БАП НУК Сорт семядоль пшокотиль корень фитогормо нам БАП и НУК (S.Eo5=l,9)

Sari Goi 31,2 6,3 - 12,5

3 4 0 Quantum 43,7 18,8 - 20,8 17,4

Option 43,7 12,5 - 18,8

SariGol 43,7 25 - 22,9

4 4 1 Quantum 56,3 43,7 12,5 37,5 30,6

Option 62,5 31,2 - 31,2

SariGol 56,2 43,7 12,5 37,5

5 4 2 Quantum 75 43,8 18,7 45,8 39,6

Option 62,5 37,5 6,25 35,4

SariGol 75 18,7 12,5 35,4

6 8 1 Quantum 100 18,7 - 39,6 37,5

Option 81,3 25 6,25 37,5

В среднем, по типу экспланта (SE«-1,6) 60,9 27,1 5,73 - -

Примечание: для частных различий = 5,7 Прекультивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 2 перед переносом их на морфогенные питательные середы.

Как следует из данных таб. 3, наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на среде № 5, где она составила, в среднем, 39,6%, в то время как наименьшая- зафиксирована на среде № 3, где её значение равно 17,4%. Среды № 5 и 6 по этому показателю не имели существенных различий между собой на 5% уровне значимости и были оптимальными (37,5 и 39,6%).

Из сравнения результатов, полученных на средах № 3-6 можно сделать вывод, что содержание НУК в концентрации 1 мг/л в питательной среде существенно увеличивает эффективность органогенеза. Кроме того, результаты, полученные на средах № 5 и 6 свидетельствуют о том, что относительно высокая концентрация одновременно БАП и НУК в

питательной среде приводит к увеличению количества регенерирующих эксплантов.

Анализируя полученные нами результаты можно заключить, что органогенез рапса зависит от соотношения и концентраций цитокининов и ауксинов в питательной среде. Это согласуется с литературными данными [Ралдугина и др. 1995; Майсурян и др., 2005; Jonoubi et al., 2005; Reda et al., 2006].

Установлено, что семядоли обладали большей регенерационной способностью, по сравнению с гипокотилями и корнями. Эффективность регенерации семядолей составила, в среднем, 60,9%, тогда как гипокотилей -27,1%, а корней-5,7%, поэтому в дальнейших экспериментах по генетической трансформации в качестве первичного экспланта были использованы семядоли, изолированные с 5-дневных проростков, полученных из семян в условиях стерильной культуры.

Таблица 4

Влияние АБК иа частоту регенерации побегов у сортов рапса в зависимости

от фитогормонов БАП и НУК в составе питательной среды __ и разных эксплантов (в %)__

Среда № АБК (мг/л) Эксплант В среднем, по фитогормонам БАП, НУК и ABK(S.Ros=2,7) В среднем, по фитогормонам БАП и НУК (S£«=l,9)

семядоль гипокотиль корень

3 - 25 8,3 - 11,1 17,4

3 54,2 16,7 - 23,6

4 - 41,7 29,2 - 23,6 30,6

3 66,7 37,5 8,3 37,5

5 - 58,3 29,2 12,5 33,3 39,6

3 70,8 54,2 12,5 45,8

6 - 70,8 16,7 - 29,2 37,5

3 100 25 12,5 45,8

В среднем, по типу экспланта (S£os=l,6) 60,9 27,1 5,7 - -

Примечание: в-Е« для частных различий = 4,7. Прекулмивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 2 с последующим их переносом на середу для регенерации. В таблице приведены средние значения по 3 сортам.

Помимо изучения влияния различных концентраций ауксинов и цитокининов, а также их соотношения на процесы индукции образования адвентивных почек, нами было изучено влияние фитогормона АБК на побегообразование. Из результатов, представленных в таб. 4 следует, что добавление АБК в среду, индуцирующую морфогенез, как правило, вызывало статистически значимое на 5% уровне влияние на побегообразование и значительно увеличивало частоту регенерации у всех изучаемых

типов эксплантов на всех питательных средах. Самую высокую частоту побегообразования (100%) наблюдали у семядолей при их культивировании на среде, содержащей НУК 1 мг/л, БАП 8 мг/л и АБК 3 мг/л.

2.3. Сравнение питательных сред № 5 и № 9 на адвентивный морфогенез рапса сорта "Quantum" в условиях in vitro. На следующем этапе нами проведена сравнительная оценка влияния питательных сред № 5 и 9, на регенерационную способность семядольных эксплантов сорта "Quantum", обладающих существенно большей относительной частотой регенерации побегов, по сравнению с другими сортами рапса (таб. 5).

Таблица 5

Сравнение частоты регенерации побегов у сорта рапса Quantum в _питательных средах № 5 и 9 (в %)_

Среда дом прекультивировании Среда для морфогенеза В среднем, по среде для прекультивировании (Sbo5=l,77)

№5 №9

№2 54,2 46,6 50,4

№5 52,8 41,4 47,1

В среднем, по среде для морфогенеза (SE.05=1,77) 53,5 44,0 -

Примечание: в-Е« для частных различий = 25. Прекультивирование эксплантов в течение 2 сут перед переносом на их морфогенные середы.

Как следует из таб. 5 наибольшую частоту регенерации побегов сорта Quantum наблюдали на среде № 5, где она составила в среднем 53,5%, в то время как на среде № 9 учитываемый показатель имел значение в среднем 44%.

2.4. Влияние фитогормонов на витрификацию растений-регенерантов рапса. При культивировании растений в условиях in vitro, нередко наблюдается явление витрификации, которое проявляется в сильной оводнённости листьев и стеблей, вследствие чего побеги становятся прозрачными. В нашей работе мы также наблюдали формирование витрифицированных побегов (таб. 6).

Исходя из полученных данных в таб. 6 следует отметить, что, хотя среды № 3 и № 4 не имеют существенного различия на 5% уровне значимости по относительной частоте регенерации витрифицированных побегов (6% и 6,9% соответственно), однако наблюдается тенденция к увеличению данного показателя при использовании сред № 5 и № 6. На этих средах отмечены большие различия на 1% уровне значимости по частоте регенерации витрифицированных побегов (14,8%, и 12,1% соответственно). При сопоставлении этих данных с составом питательных сред можно

заключить, что высокое содержание ауксина НУК или цитокинина БАП в питательной среде повышает витрификацию.

Таблица б

Частота возникновения верифицированных регенерантов на семядольных эксплантах сорта рапса Quantum в зависимости от __состава питательной среды (в %)_

Среда № АБК (мг/л) Витрификация (%) В среднем, по составу питательной среды (S.Eos=0,47)

3 - 5,6 6,0

3 6,4

4 - 6,3 6,9

3 7,6

5 - 13,9 14,8

3 16,7

6 - 10,8 12,1

3 13,5

Примечание' S.Eos для частных различий = 0,66. Прекультивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 2 перед переносом их на морфогенные середы.

Тенденция к увеличению данного показателя наблюдается при добавлении АБК. В целом, при полном отсутствии АБК частота витрифицированных побегов была ниже, чем на среде с АБК 3 мг/л.

Таким образом, на способность к адвентивному морфогенезу рапса существенное влияние на 5% уровне значимости оказывали следующие факторы: генотип, тип экспланта, состав питательной среды (соотношение различных концентрации цитокининов, ауксинов и АБК в питательных средах, а так же взаимодействие этих факторов).

Микропобеги, полученные из семядольных эксплантов формировали мощную корневую систему. Отобранные таким образом растения рапса высаживали в почву в условиях максимально приближенных к полевым. Растения выращивали в вегетационных сосудах в теплице. Они были фертильны, нормально проходили фазу цветения и образовывали семена.

3. Трансформация растений рапса с геном антимикробного белка MiAMPl. Следующим этапом нашей работы было проведение агробактериальной трансформации. В работе был использован масличный рапс (В. napus L.) сортов "Quantum" и "Option 500".

3.1. Влияние антибиотиков на экспланты ^трансформированных растений. Изучение влияния антибиотиков гигромицина и цефотаксима на жизнеспособность нетрансформированных семядольных регенерантов рапса сорта Quantum показало, что семадольные экспланты были высоко

чувствительны к действию гигромицина и почти не реагировали на цефотаксим. Гигромицин отрицательно действовал на регенерацию побегов из семядольных эксплантов in vitro. Начиная с концентрации гигромицина 2 мг/л, происходило ингибирование роста, что приводило к гибели регенератов. При концентрации гигромицина 2 мг/л после 5 недель обработки 37,5% регенерантов погибали. При 5 мг/л гигромицина экспланты в местах среза темнели и через 5 недель все регенераты погибали. При увеличении концентрации гигромицина до 10 мг/л гибель регенерантов происходила через 4 недели, а при концентрации 20 мг/л через 3 недели регенераты теряли жизнеспособность (таб. 7).

Таблица 7

Влияние разных концентрации антибиотика гигромицина на жизнеспособность нетрансформированных растений - регенерантов _ рапса сорта Оиапйнп_

Концентрация гигромицина (мг/л) Неделя после обработки гигромицина

2 3 4 5

2 100 87,5 87,5 62,5

5 75,0 62,5 37,5 0

10 64,6 29,2 0 0

20 33,3 0 0 0

Примечание: в таблице указан процент жизнеспособных

нетрансформированных регенерантов, полученных из семядольных эксплантов

Из результатов следует, что селективная среда для регенерации побегов-трансформантов должна содержать гигромицин в концентрации 510 мг/л. Добавление в среду цефотаксима даже в высоких концентрациях не оказывало влияние на жизнеспособность эксплантов, хотя и не снижало частоту побегообразования. При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из использованных нами концентрациях (цефотаксим 500 мг/л), получали такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина.

3.2. Определение эффективности трансформации рапса при помощи созданной векторной конструкции с геном MiAMPl. Трансформацию растений рапса проводили при помощи Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 с бинарным вектором pCAMBIA1305.1-MiAMPl. В качестве селективного гена использовали ген гигромицинфосфотрансферазы (hpt) под контролем CaMV 35S double enhancer промотора. После трансформации экспланты помещали для кокультивирования на агаризованные среды MS

№ 2 и № 5 без добавления антибиотика цефотаксима. Кокультивирование проводили в течение двух суток на рассеянном свете как при температуре 2б°С, так и при температуре 22°С, до момента начала появления едва заметного бактериального газона вокруг эксплантов. Такая методика была нами применена и для нетрансформированных эксплантов, которые использовали в качестве контроля (таб. 8).

Таблица 8

Влияние кокультивирования эксплантов на среде для каллусообразования и обработки температурой на частоту регенерации трансформированных эксплантов у сорта рапса Quantum (в %)

Кокультивирование эксплантов Обработка температурой В среднем, по кокультивированию эксплантов (S.Eos=1,77)

1 2 3

Среда № 2 55,2 41,7 54,3 50,4

Среда № 5 49,5 44,2 47,6 47,1

В среднем, по обработке температурой (S.E«5=2,16) 52,4 42,9 50,9 -

Примечание: дня чайных различий = 3,06. кокультивирование эксплантов в течение 2 сут перед переносом их на морфогенную середу № 6. Обработка температурой: 1. нетрансформированные экспланты; 2. трансформированные экспланты, культивируемые при температуре 26°С; 3 трансформированные экспланты, культивируемые при температуре 22°С

Как следует из таб. 8, частота регенерации трансформированных эксплантов на среде № 2 для каллусооброзавания (50,4%) была выше, чем в контрольном варианте (47,1%). Учитываемые показатели не имели существенных различий между собой на 5% уровне значимости.

При обработке температурой наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на нетрансформированных эксплантах, где она составила в среднем 52,4%, в то время частота регенерации трансформированных эксплантов при культивировании их при температуре 26°С составила в среднем 42,9%, а при культивировании эксплантов при 22°С - 50,9%. Данные обработки имели существенные различия между собой на 5% уровне значимости.

Так же мы изучали влияние времени кокультивации семядольных эксплантов и обработки температурой сорта Option 500 с агробактерией на частоту регенерации побегов трансформированных и нетрансформированных эксплантов (рис. 11).

M г - - -

<1111 Вармнг

Рис. 11. Влияние времени кокультивации эксплантов с агробактерией и обработки температурой на частоту регенерации трансформированных эксплантов сорта рапса Option 500 (в %).

Обработки: 1 ^трансформированные экспланты при температуре 22°С в течение 48 час; 2 кокулътивация при 26°С в течение 24 час; 3. кокулътивация при 26°С в течение 48 час, 4 кокулътивация при 22°С в течение 24 час; 5.кокулътивация при 22°С в течение 48 час

' Кокулътивация эксплантов с агробактерией в течение 2-х суток

приводила к уменьшению частоты регенерации трансформированных семядольных эксплантов у сорта рапса Option 500 (53,3 против 23,3 при культивировании их при температуре 26°С и 67 против 28,1 при

1 культивировании при температуре 22°С, соответственно).

3.3. Анализ первичных трансформантов рапса. Высокую чувствительность эксплантов и тканей рапса к гигромицину преодолевали с помощью трёхэтапной схемы селекции. Первичную селекцию, полученных в результате трансформации растений рапса, проводили на среде, содержащей 2 мг/л гигромицина. Затем проводили повторную селекцию полученных регенерантов на среде для морфогенеза с содержанием гигромицина 5 и 10 мг/л. Выявленная селективная концентрация гигромицина 5-10 мг/л позволяет с успехом отбирать трансформанты.

Сохранившиеся после обработки растения рапса, устойчивые к гигромицину, были проанализированы с помощью ПЦР-анализа с использованием праймеров PC AMI и РСАМ2. Длина амплифицируемош фрагмента 428 н.п. (рис. 12). Результаты проведенного ПЦР-анализа трансгенных растений рапса поколения Т0 показывают наличие целевого гена Mi AMPI в растениях.

3.4. Определение экспрессии гена ß-глюкуронидазы (GUS). Наличие в

1 трансформированных эксплантах репортерного гена ß-глюкуронидазы

S !

(GUS), показано при определении его экспрессии гистохимическим методом. При этом экспланты-трансформанты окрашивались в синий цвет.

Рис. 12. Электрофореграмма продуктов ПЦР-анализа растений рапса, трансформированных штаммом AGL0, содержащим векторы рСАМВ1А1305.1-MiAMPl с использованием праймеров РСАМ1 и РСАМ2 в 2%-ном агарозном геле. 1, 2: ДНК нетрансгенного рапса; 3-8: ДНК разных растений, трансформированных штаммом AGL0 //pCAMBIAl305.1-MiAMPl; 9• Marker 100 bp ladder, 10: плазмида pCAMBlA1305.1-MiAMPl, И. плазмида pCAMBIA1305.1-MiAMPl+ДНК нетрансгенного растения; 12. плазмида pCAMBIA 1305.1; 13 -вода

ВЫВОДЫ

1. На основе стандартного бинарного вектора рСАМВ1А1305.1 создана генетическая конструкция pCAMBIA 1305.1 -MiAMP 1, содержащая ген MiAMPl под контролем конститутивного CaMV 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты, а также маркерный ген GUS и ген гигромицинфосфотрансфераза (hpt), устойчивости к антибиотику гигромицину.

2. Подтверждено наличие гена MiAMPl в созданной конструкции с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования нуклеотидной последовательности гена.

3. Конструкция pCAMBIA 1305.1-MiAMPI трансформирована в штамм AGL0 Agrobacterium tumefaciens для агробактериальной трансформации рапса.

4. Разработана оптимальная технология регенерации растений из разных соматических органов и тканей трёх сортов рапса:

- установлено, что эффективность реализации морфогенетического потенциала рапса зависит от генотипа, типа первичного экспланта, а также от гормонального состава питательной среды. Наивысшей регенерационной способностью среди изученных генотипов обладает сорт рапса "Quantum";

- выявлено, что более высокой регенерационной способностью обладают семядольные экспланты рапса по сравнению с сегментами гипокотилей и корней на всех используемых питательных средах;

- включение в состав среды Мурасиге и Скуга 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, 3 мг/л АБК и витаминов по В5, вызывают наибольшую частоту регенерации побегов, формирующих из семядолей;

- добавление 3 мг/л АБК в питательную среду MS, индуцирующую морфогенез, как правило, вызывает значимое влияние на побегообразование, а также увеличивает частоту регенерации у всех типов эксплантов.

5. Витрификации регенерантов способствует повышенное содержание в питательной среде ауксина НУК или цитокинина БАП, а так же АБК.

6. Семядольные экспланты рапса проявляют высокую чувствительность к антибиотику ппромицину. Жизнеспособность побегов, сформировавшихся из семядольных эксплантов сорта "Quantum", сохраняется при концентрации 2 мг/л гигромицина до 40 дней, а при увеличении его содержания до 10 мг/л, все образующиеся побеги теряют жизнеспособность через 20 дней. Установлена оптимальная концентрация гигромицина для регенерации побегов-трансформантов на селективной среде 5-10 мг/л.

7. Добавление к среде цефотаксима даже в высоких концентрациях не изменяет жизнеспособность эксплантов и не снижает частоту побегообразования. При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из использованных нами концентрациях (цефотаксим 500 мг/л), получен такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина.

8. Созданная конструкция pCAMBIAl305.1 -MiAMPl трансформирована в семядольные экспланты рапса методом агробактериальной трансформации.

9. Частота регенерации побегов, полученных из трансформированных семядольных эксплантов растений рапса сорта "Quantum" при их кокультивировании с агробактерией снижается. Увеличение продолжительности кокультивации трансформированных семядолей до 2-х суток вызывает снижение частоты регенерации. На рассеянном свету при снижении температуры с 26°С до 22°С этот показатель возрастает.

10. Получены первичные трансформированные регенеранты рапса сорта "Quantum" устойчивые к ппромицину.

Список публикаций по теме диссертации

1- Гхасеми Безди К., Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Ген устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) как новый ген для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). 13-ая Мультидисциплинарная Конференция Иранских Исследователей в Европе. Университет Лидса, Лидс, Великобритании, 2 июля 2005. http://13th.irce.org/va html ai=649. (перевод с английского).

2. Гхасеми Безди К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Использование кДНК как ген устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). Сборник статей 8-ого Иранского Конгресса Биохимии и 1-ого международного Конгресса Биохимии и Молекулярной Биологии, 11-15 сентября 2005 г., Университет Tarbiat Modarres, Тегеран, Иран, С. 364. (перевод с английского).

3- Гхасеми Безди К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Генетическая трансформация рапса (Brassica napus L.) для технической устойчивости, используя ген, кодирующий антимикробный белок. Конференция In Vitro Биологии 2005, Балтимор, Штат Мэриленд, США, 5-7 июня 2005 г., С. 2065. (перевод с английского).

4- Гхасеми Безди К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И., Ралдугина Г. Н. Использование гена устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). Материали международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвященной 140-летию Российского государственного аграрного университета - МСХА им, К. А. Тимирязева (1 -2 июня 2005 г). Изд-во МСХА, М. 2006. с. 357-361.

Тир. 100 экз.

Зак. 400

1,25 печ. л.

Центр оперативной полаграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

¿OO&ft

ÎÏIgîl ^1 4 2 62

и

i!

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гхасеми Безди Камал

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Молекулярно-генетические механизмы агробактериальной трансформации.

1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений

1.2. Процесс переноса Т-ДНК из агробактерии в растительную клетку

1.3. Конструирование бактериальных векторов для введения генов в растения.

1.3.1. Создание вектора на основе Ti-плазмиды.

1.3.2. Векторы для трансформации растений на основе Ti-плазмиды.

1.3.3 Маркёры трансформации.

1.3.3.1. Селективные маркеры.

1.3.3.2. Репортёрные гены.

1.3.4. Промоторы.

ГЛАВА 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений.

2.1. Классификация антимикробных белков.

2.2. Растительные дефензины.

2.3. Антимикробные свойства растительных дефензинов.

2.4. Трансгенные растения с генами антимикробных белков, устойчивые к грибным патогенам.

2.5. Очистка и экспрессия антимикробного белка MiAMPl.

ГЛАВА 3. Регенерация из соматических тканей растений

3.1. Регенерации рода Brassica.

3.2. Регенерация рапса.

3.2.1. Выбор экспланта рапса.

3.2.2. Роль фитогормонов в среде для регенерации рапса.

ГЛАВА 4. Генетическая трансформация представителей рода Brassica с помощью Agrobacterium tumefaciens.

4.1. Метод кокультивирования с агробактерией.

4.2. Факторы, влияющие на агробактериальную трансформацию представителей рода Brassica.

РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 5. Объекты, условия и методы проведения исследований.

5.1. Клонирование.

5.1.1. Место исследования.

5.1.2. Бактериальные штаммы, плазмиды и используемые среды для выращивания бактерий.

5.1.3. Выделение и очистка плазмцдной ДНК E.coli.

5.1.4. Конструирование растительного вектора.

5.1.5. Трансформация агробактериального штамма AGL0 плазмидной ДНК pCAMBIA1305.1-MiAMPl.

5.1.6. Наращивание и приготовление агробактериального газона.

5.1.7. Проверка наличия рекомбинантных ДНК в агробактерии.

5.1.8. Проверка наличия v/r-генов в трансформируемом штамме агробактерии.

5.1.9. Анализ клонированного гена.

5.1.10. Культивирование и хранение бактериальных штаммов.

5.2. Культивирование in vitro и оптимизация условий регенерации рапса

5.2.1. Растительный материал.

5.2.2. Условия культивирования.

5.2.3. Подбор и приготовление питательных сред.

5.2.4. Введение в культуру in vitro.

5.2.5. Выбор экспланта рапса.

5.2.6. Укоренение регенератов в среде in vitro.

5.2.7. Математическая обработка.

5.3. Агробактериальная трансформация рапса.

5.3.1. Подготовка эксплантов рапса к трансформации.

5.3.2. Получение ночной культуры агробакгерии.

5.3.3. Инокуляция экспланта агробактерией.

5.3.4. Получение трансформантов рапса.

5.4. Методы анализа растений-трансформантов.

5.4.1. Гистологическая окраска GUS.

5.4.2. Выделение растительной геномной ДНК для ПЦР.

5.4.3. ПЦР-анализ наличия трансгена гигромицин-устойчивых растений.

РАЗДЕЛ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 6. Клонирование ДНК, кодирующей ген антимикробного белка MiAMPl.

6.1. Создание векторной конструкции с геном MiAMPl.

6.2. Трансформация генетической конструкции в агробактерию.

6.3. Проверка наличия v/r-генов в трансформируемом штамме агробактерии.8g

ГЛАВА 7. Оптимизация условий регенерации рапса.

7.1. Оценка растительного материала на интенсивность морфогенеза в культуре in vitro.

7.2. Влияние состава питательной среды на формирование адвентивных почек рапса в условиях in vitro.

7.3. Влияние АБК на побегообразование эксплантов рапса.

7.4. Сравнение питательных сред № 5 и № 9 на адвентивный морфогенез рапса сорта "Quantum" в условиях in vitro.

7.5. Влияние фитогормонов на витрификацию растений-регенерантов рапса.

ГЛАВА 8. Трансформация растений рапса геном антимикробного белка MiAMPl.

8.1. Влияние антибиотиков на экспланты нетрансформированных растений.

8.2. Определение эффективности трансформации рапса при помощи созданной векторной конструкции с геном MiAMPl.

8.3. Анализ первичных трансформантов рапса.

8.4. Определение экспрессии гена Р-глюкуронидазы (GUS).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)"

В последние годы, в связи с задачами наращивания производства сельскохозяйственной продукции, большое внимание уделяется теоретическим разработкам и практической реализации внедрения новейших достижений биотехнологии. Проблема создания новых форм может быть решена по-разному для различных видов растений. Для одних, более лабильных, для этих целей может быть использована сомаклональная изменчивость, для других — это может быть слияние протопластов или мутагенез. К настоящему времени наиболее совершенным методом, позволяющим получать растения, обладающие новыми заранее заданными свойствами, несвойственными исходным формам, является генетическая инженерия.

Генетическая инженерия дает возможность получения растений со свойствами присутствие которых невозможно обеспечить методами традиционной селекции. Методами генетической инженерии можно конструировать функционально активные генетические структуры in vitro из фрагментов генов различных организмов и вводить такие конструкции в клетку, создавая условия для экспрессии введенных, часто совершенно чужеродных генов.

В настоящее время решены фундаментальные вопросы, связанные с передачей генов: разработаны методы трансформации, созданы плазмиды для переноса, подобраны условия эффективного введения чужеродных генов. С помощью генетической трансформации созданы трансгенные растения, представляющие интерес для сельскохозяйственного производства, в том числе, обладающие такими признаками как устойчивость к гербицидам, насекомым, вирусам, фитопатогенам, абиотическим стрессам и др. Трансгенные формы картофеля, томатов, табака, риса, кукурузы, сои, рапса, подсолнечника, льна проходят испытания на экспериментальных полях, а некоторые уже составляют значительную часть в валовом сельскохозяйственном продукте ряда стран, в первую очередь, США.

В сельском хозяйстве остро стоит проблема потерь урожая вследствие заражения культурных растений бактериальными и грибными патогенами. До недавнего времени она была трудно разрешима. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению важной роли белков в этом процессе. Интенсивное изучение структуры и функций антимикробных пептидов, исследование их генетической обусловленности может помочь в создании методами генной инженерии трансгенных культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям.

В последние годы развитие биотехнологии и генной инженерии позволило методом генетической трансформации, применяя векторные конструкции, создавать растения, устойчивые к грибным болезням. Это достигается главным образом путем введения в них чужеродных генов, кодирующих защитные белки, накопление которых в тканях растений губительно для патогенов. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название антимикробных белков.

Агробактериальная трансформация известна как наиболее оптимальный способ введения чужеродных генов в двудольные растения. В связи с этим, достаточно актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена. От патогенов в большей степени страдают вегетативные органы растений. Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особенно-обладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения.

Актуальность нашего исследования определялась тем, что рапс (Brassica napus L.) является одной из ценных кормовых и масличных % $ f л i сельскохозяйственных культур, получивших большое распространение в Канаде, Китае, Европейских странах, Индии, и в других странах мира. В Иране ежегодно увеличивается площадь под посевами рапса. В 2004 году в Иране объем производства рапса на площади 72,000 га был 108,000 т.

Один из главных факторов, ограничивающих возделывание этой культуры - его восприимчивость к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) -причинный агент белой болезни гнили. Применение фунгицидов не очень эффективно для устранения симптомов вызванных этой болезнью. Дополнительно применение фунгицидов увеличивает стоимость производства и может оказывать неблагоприятное влияние на окружающую среду. Поэтому идентификация генов для создания устойчивого рапса методами генной инженерии обеспечивает привлекательную альтернативу для улучшения устойчивости к этой болезни [Kazan et al., 1999].

Ускорить решение данной проблемы можно при помощи методов генной инженерии. McManus и его коллеги выделили из ядра австралийского ореха (Macadamia integrifolia) антимикробный белок MiAMPl в 1999 году в Австралии в университете Квинсленда. Они полагали, что ген, кодирующий этот белок, может быть использован для генетической манипуляции с целью увеличения устойчивости к болезням в трансгенных растениях.

В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева гена MiAMPl, кодирующего антимикробного белка австралийского ореха, созданию векторной конструкции с этим геном для проведения агробактериальной трансформации иранского рапса, который отличается генетической устойчивостью к болезни склеротинии.

Целью данной работы является создание растительного вектора, оптимизация условий регенерации и генетической трансформации рапса с использованием Agrobacterium tumefaciens. Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи:

1. Сконструировать растительный вектор;

2. Оптимизировать условия регенерации и агробактериальной трансформации рапса;

3. Отобрать первичные трансформанты рапса.

В связи с вышеизложенными, важнейший этап в создании трансгенных растений посвящен разработке эффективной методики регенерации и генетической трансформации рапса. Целью данной методики является проведение эксперимента по агробактериальной трансформации, в результате которой в геном рапса будет включен фрагмент чужеродной ДЕК, содержащий ген MiAMPl, продукт которого придаст растениям рапса устойчивость к склеротинии.

В работе по трансформации растений рапса применяли специальный агробактериальный штамм AGL0, содержащий растительный вектор pCAMBIAl305.1 с геном MiAMPl в качестве целевого гена.

Метод создания трансгенных растений рапса в культуре тканей включает в себя целый ряд важных этапов: выбор реципиентной системы, подбор оптимальных условий, культивирования, проведения регенерации и генетической трансформации, отбор устойчивых трансформантов рапса к антибиотику гигромицину и получение первичных трансформантов рапса. и

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гхасеми Безди Камал

ВЫВОДЫ

1. На основе* стандартного бинарного вектора рСАМВ1А1305.1 создана генетическая конструкция pCAMBIA13 05.1-MiAMPl, содержащая ген MiAMPl под контролем конститутивного CaMV 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты, а также маркерный ген GUS и ген гигромицинфосфотрансфераза (hpt), устойчивости к антибиотику гигромицину.

2. Подтверждено наличие гена MIAMP1 в созданной конструкции с помощью рестрикционного анализа, ПНР и секвенирования нуклеотидной последовательности гена.

3. Конструкция: pCAMBIA 1305.1-MiAMPl трансформирована в штамм AGL0 Agrobacterium tumefaciens для агробактериальной трансформации рапса.

4. Разработана оптимальная технология регенерации растений из разных соматических органов и тканей трёх сортов рапса:

- установлено, что эффективность реализации морфогенетического потенциала рапса зависит от генотипа, типа первичного экспланта, а также от гормонального состава питательной среды. Наивысшей регенерационной способностью среди изученных генотипов обладает сорт рапса "Quantum";

- выявлено, что более высокой регенерационной способностью обладают семядольные экспланты рапса по сравненшо с сегментами гипокотилей и корней на всех используемых питательных средах;

- включение в состав среды Мурасиге и Скуга 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, 3 мг/л АБК и витаминов по Bs, вызывают наибольшую частоту регенерации побегов, формирующих из семядолей;

- добавление 3 мг/л АБК в питательную среду MS, индуцирующую морфогенез, как правило, вызывает значимое влияние на побегообразование, а также увеличивает частоту регенерации у всех типов эксплантов.

5. Витрификации регенерантов способствует повышенное содержание в питательной среде ауксина НУК или цитокинина БАП, а так же АБК.

6. Семядольные экспланты рапса проявляют высокую чувствительность к антибиотику гигромицину. Жизнеспособность побегов, сформировавшихся из семядольных эксплантов сорта "Quantum", сохраняется при концентрации 2 мг/л гигромицина до 40 дней, а при увеличении его содержания до Ш мг/л, все образующиеся побеги теряют жизнеспособность через 20 дней. Установлена оптимальная концентрация гигромицина для регенерации побегов-трансформантов на селективной среде 5-10 мг/л.

7. Добавление к среде цефотаксима даже в высоких концентрациях не изменяет жизнеспособность эксплантов и не снижает частоту побегообразования. При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из использованных нами концентрациях (цефотаксим 500 .мг/л), получен такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина.

8. Созданная конструкция pCAMBIAl305.1-MiAMPl трансформирована в семядольные экспланты рапса методом агробактериальной трансформации.

9. Частота регенерации побегов, полученных из трансформированных семядольных эксплантов растений рапса сорта "Quantum" при их кокультивировании с агробактерией снижается. Увеличение продолжительности кокультивации трансформированных семядолей до 2-х суток вызывает снижение частоты регенерации. На рассеянном свету при снижении температуры с 26°С до 22°С этот показатель возрастает.

10. Получены первичные трансформированные регенераты рапса сорта "Quantum", устойчивые к гигромицину.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своими научными руководителями, профессору и заведующему кафедрой сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, академику РАСХН, д.б.н. B.C. Шсвслухе, и заведующему Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени КА.Тимирязева, к.б.н. Г.И. Карлову за огромную помощь при проведении исследований, обсуждении результатов изложенных в диссертационной работе и ее подготовке.

Автор сердечно благодарит зав. лабораторией культуры тканей растений РГАУ-МСХА имени КА.Тимирязева, д.б.н. проф. Е.А. Калашникову за неоценимую помощь оказанную ей при проведении исследований, а также выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку всем преподавателям, сотрудникам, аспирантам и студентам кафедры с/х биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, проф. д.б.н. Л.И. Хрусталевой, проф. д.с/х.п. Н.Б. Прониной, проф. д.б.н. В.М. Ковалеву, ст.н.сотр. Т.Н. Андреевной, доцент Н;П; Карсункиной, ст.н.сотр. И.В. Скоробагатовой, к.б.н. И.А. Фесенко, МЛО. Куклеву, А.Н. Сахаровой, Т.В. Даниловой, и О.Ю. Мироновой.

Глубокую признательность за помощь, ценные советы и участие автор выражает руководителю группы трансгенеза лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР РАН, к.б.н., Г.И. Ралдугиной и научными сотрудниками лаборатории генетической инженерии растений ИОГен РАН, д.б.н. проф. Э.С. Пирузян и д.б.н., И.В. Голденковой:

Автор признателен научным сотрудником кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, к.б.н. А.А. Соловьев, а также директору селекционной станции им. Н.Н.Тимофеева, к.б.н., Г.Ф. Монахосза поддержку при проведении исследований.

Автор благодарен заместителю заведующей лаборатории клеточной инженерии растений ВНИИСБ, глав.н.сотр. д.б.н. А.Н. Майсуряну, и ст.н.сотр. М.Д. Калиженковой за полезные советы и поддержку при проведении исследований.

Автор также благодарит научным представителем Министерства наук, исследований и технологий Ирана в России проф. А. Риази, а также всем добрым друзьям и коллегам Резе Салехи Джузаии, Асадоллаху Ахмадихаху, Резе Маали, Мохаммеду за всемерную помощь, поддержку и дружеское отношение.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам деканата по работе с иностранными учащимися за внимание и помощь.

Автор благодарен руководителю группы генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН, О.А. Шульга за ценные советы.

Искреннюю благодарность автор выражает своим родителям Миргасем Гасеми Безди и Монаввар Ахмади за всемерную поддержку, и жене Неджат Ал и шах и за любовь, доброту, понимание и терпение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что введение в геном растений гетерологичных генов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам может приводить к значительному положительному результату. Среди генов устойчивости представляют практический интерес гены, кодирующие короткие антимикробные цистеин-богатые белки. Структура антимикробного белка MiAMPl хорошо изучена, показана его антимикробная активность к широкому кругу грибных патогенов растений in vitro, в том числе лептосферии (L. maculans) и склеротинии (S. sclerotiorum). В связи с этим проведена работа по анализу и клонированию данного гена. При этом ген MiAMPl был клонирован в бинарный вектор рСАМВ1А1305.1 под контролем 35S промотора и терминатора CaMV.

При помощи созданной конструкции pCAMBIA1305.1-MiAMPl была проведена агробактериальная трансформация растений рапса, в результате исследований были подобраны условия для наиболее полного проявления регенерационной способности разных соматических тканей трёх иранских сортов рапса.

Проведенные эксперименты показывают, что органогенез в значительной степени зависит от генотипа, типа первичного экспланта, а также от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста. Семядольные экспланты всех исследованных генотипов обладают большим морфогенетическим потенциалом, чем гипокотили и корни, что позволяет использовать их для получения растений-регенерантов. Выделено 2 сорта Quantum и Option 500 — отличающиеся высокой способностью к регенерации адвентивных побегов. Частота регенерации у семядольных эксплантов сорта Quantum достигала, в среднем, 68,8%, a Option 500 - 62,5%.

В результате многоплановых экспериментов определён оптимальный состав питательной среды, обеспечивающий максимальную регенерацию растений рапса из разных эксплантов. Для семядольных эксплантов-минеральная основа по Мурасиге и Скугу, витамины В5, сахароза 10 г/л, БАП 8 мг/л, НУК 1 мг/л и АБК 3 мг/л; для гипокотилей и корней минеральная основа по MS, витамины В5, сахароза 10 г/л, БАП 4 мг/л, НУК 2 мг/л и АБК 3 мг/л.

В работе по генетической трансформации были подобраны условия для трансформации семядольных эксплантов рапса. Это стало возможным благодаря отработке ряда приемов: способ инокуляции семядольных эксплантов агробактерией с минимальным снижением регенерационной способности; преодоление высокой чувствительности тканей рапса к гигромицину с помощью трёхэтапной схемы селекции - включение гигромицина в регенерационную среду в концентрации 2 мг/л и повторная селекция полученных регенерантов на морфогенетической среде с содержанием 5 и 10 мг/л гигромицина. Выявлена селективная концентрация гигромицина (5-10 мг/л), позволяющая с успехом отбирать трансформанты.

Таким образом, в результате проведённых экспериментов оптимизированы эффективные методики регенерации и агробактериальной трансформации сортов рапса. Были получены и изучены первичные трансформанты рапса сорта Quantum, экспрессирующие маркерные гены глзокуронидазы (GUS) и гигромицинфосфотрансферазы (hpt), содержащие ген MiAMPl. Наличие и экспрессия репортерного гена были доказаны методом анализа GUS-активности с помощью гистохимическога окрашивания. Первичные трансформированные регенераты были доказаны методом ПЦР, при использовании праймеров РСАМ1 и РСАМ2.

Полученные в ходе исследований трансформанты рапса могут быть использованы для дальнейшего изучения наследования и экспрессии гена MiAMFT.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гхасеми Безди Камал, Москва

1. Бурьянов Я.И., Кадо К.И. Стратегия создания трансгенных растении с устойчивостью к фигопатогенам и вредителям.// Биоорганическая химия. 1999. т. 25. №12. с, 903-910,

2. Геринг X. Преодоление нитрификации и улучшение акклиматизации растений при ююнальном микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений.//М.: Наука. 1991. с. 197-200.

3. Данилова С.А. Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы, дис. канд. биологических наук.// М.:РАН, Институт Физиология Растений им. К. А. Тимирязева, 2001. 120 с.

4. Дёрфлинг К. Гормоны растений. Системный подходУ/ JVL: Мирт 1985. с. 42-46.

5. Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Регд.) Генная инженерия растений.//Москва: Мир. 1991. 408 с.

6. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования.// Фитология растений. 2000. т. 4-7. с. 479-488.

7. Катаева Н. В., Александрова И. Г., Драгавцева Е. В. Значение гормонов в формировании витрифицированных побегов яблони при микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений.// М.: Наука. 1991. е. 1:89-1:92.

8. Левенко Б. Генная инженерия растений.// 2000. М.: Школьник.

9. Лутова JI.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды.// Соросовский Образовательный Журнал. 2000. т. 6. № 10. с. 10-17.

10. И) Майсурян А.Н., Капиженкова М.Д., Мазин В.В., Ляпкова Н.С., Дридзе И.Л., Харченко П.Н. Получение ярового рапса, устойчивого к гербициду «БАСТА» (глюфосинт). Методические рекомендации.// Москва. 2005. ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.

11. Малышенко С. И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д. и Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfp.H физиология растений. 2003. т. 50. № 2. с. 309-315.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.//Москва: Мир. 1985. 480с.

13. Пирузян Э.С., Адрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений.//М.:Наука. 1985. с. 62-73.

14. Попадьин П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: дис. канд. биологических наук.// М.: МСХА, 2002. 162 с.

15. Ралдугина Г.Н, Горелова С.В., Кожемякин А.В. Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса.// физиология растений. 2000. т. 47. № 3. с. 437445.

16. Ралдугина Г.Н., Соболкова Г.И. Генотипические различшг приг действии абсцизовой кислоты на каллусные культуры Brassica napus L.// Физиология растений. 1994. т. 41. № 5. с. 702-706.

17. Ралдугина Г.Н., Соболкова Г.И. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса.// физиология растений. 1995. т. 42. с. 916-922.

18. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии.// СПБ.: СПБГТУ. 1999. с. 372380.

19. Сафразбекян С.А., Катаева П., Миляена Э.Л. Морфогенетические особенноспг побегов каперса и системе клонального микроразмножения.// Физиология растений. 1990. т. 37. № 1. с. 169-176.

20. Сердобинский Л.А., Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно бактериальных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений,// дис. канд. биологических наук. М.:ВНИИ Сельскохозяйственной Биотехнологии. 2002. 98 с.

21. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная Биотехнология. 2-е изд., перераб. и доп.//М.: Высш. шк 2003.469 с.

22. Arroyo R., Revilla M.A. In vitro Plant Regeneration from Cotyledon and Hypocotyl Segments in Two Bell Pepper Cultivars.// Plant Cell Rep. 1991. V. 10. N. 8. P. 414416.

23. Benoit L., Manjusha V., Tzvi Т., Vitaly C. The VirE3 protein of Agrobacterium mimics a host cell function required for plant genetic transformation.// The EMBO Journal. 2005. 24:428-437.

24. Binns A.N., Thomashow M.F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants.// Ann. Rev. Microbiol.- 1988,- V.42.- P.575-606.

25. Bisht N.C., Burma P.K., Pental D. Development of 2,4-D-resistant transgenics in Indian oilseed mustard {Brassica juncea).// Current Science. 2004. V. 87, No. 3. P. 367-370.

26. Blackshow R.E., Kanashiro D., Moloney M.M., Crosby W.L. Growth, Yield and Quality of Canola Expressing Resistance to Acetolactate Synthase Inhibiting Herbicides.// Can. J. Plant. Sci. 1994. V. 74. P. 745-751.

27. Bol J.F., Linthorst H.J.M., Cornellissen B.J.C. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection.// Annu. Rev. Phytopathol.- 1990,- V.28.- P. 113-138.

28. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity.// Annu. Rev. Immunol. 1995.- V.13.-P.61-92.

29. Boulter M.E., Cray E., Simpson P., Shields R., Croy R.R.D. and Shirsat A.H. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhtzogenes- a comparison.// Plant Science. -1990. -V. 70-P. 91-99.

30. Broekaert W.F. et al. Biocidal Chitin-Binding Proteins.// WO. 1994. 94/11511.

31. Broekaert W.F. et al. Biocidal Proteins.// WO. 1992a. 92/21699.

32. Broekaert W.F. et al. Biocidal Proteins.// WO. 1993. 93/05153.

33. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M.F.C., Thevissen K., De Samblanx G.W., and Osborn RW. Antimicrobial peptides from plants.// Critical Rev. Plant Sci. 1997. 16:297-323.

34. Broekaert W.F., Marien W., Terras F.R.G. et al. Antimicrobial Peptides from Amaranthus caudatus Seeds with Sequence Homology to the Cysteine/Glycine-Rich Domain of Chitin-Binding Proteins.// Biochemistry.- 1992b.- V.31.- P.4308-4314.

35. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A., Osborn R. W. Plant Defensins: Novel Antimicrobial Peptides as Components of the Host Defense System.// Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1354-1358.

36. Broglie K., Chet I., Holliday M., Cressman R., Bidille P., Broglie R. Transgenic Plants with Enhanced Resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia solani.ll Science. 1991. V. 254. P. 1194-1197.

37. Bushnell W.R., Somers D.A., Giroux R.W., Szabo L.J. and Zeyen R.J. Genetic engineering of disease resistance in cereals.// Can. J. Plant. Pathol. 1998. 20:137149.

38. CAMBTA vectors p., Version 3.10. Nov. 2001.

39. Cardoza V, Stewart C.N. Agrobacterium-mQdmtQd transformation of canola.// Transgenic Crops of the World Essential Protocols. 2004. Netherlands. P. 379-387.

40. Cardoza V., Stewart C.N. Increased Agrobacterium-mediatGd transformation and rooting efficiencies in canola {Brassica napiis L.) from hypocotyl segment explants.// 2003. Plant Cell Rep. 21:599-604.

41. Chen L.F.O., Huang C.Y., Charng Y.Y., Sun C.W. and Yang S.F. Efficiency on Agrobacterium mediated transformation of antiscense genes in broccoli {Brassica oleracea var. itaUcd)JIIn Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1999, 35. 63A.

42. Chen L.F.O., Huang J.Y., Chen H.H. and Shaw J.F. Transformation of ethylerie-response-sensor (ERS) mutant gene in broccoli {Brassica oleracea var. italica) by Agrobacterium tumefaciens.///« Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2001. 37. 37A.

43. Chen L.F.O., Yang S.F., Huang J.Y. High Efficiency Plant Transformation of Brassica oleracea. 2003. US Patent. #6,667,428 Bl.

44. Chen Y., Rao Y. and Meng J. Reating new variety with Sclerotinia sclerotiorum resistance by transforming two broad-spectrum antifungal genes into Brassica napusL., Molecular Plant Breeding. 2003. 1: 457-463.

45. Cheng Z.D., Wei Z.M. and Xu Z.H. Transformation of Brassica napus Using Agrobacterium tumefaciens and Regeneration of Transgenic Plants.// Journal of Integrative Plant Biology. 2005.

46. Chi G.L., Batfield D.C., Sim G.E., Pua E.C. Effect of AgN03 and Aminoethoxy-vinylglycine on in vitro Organogenesis from Seedling Explants of Recalcitrant Brassica Genotypes.//Plant Cell Rep. 1990. V. 9. N. 4. P. 195-198.

47. Chi G.L., Pua E.C. Ethylene Inhibitors Enhanced Shoot Regeneration from Cotyledons of Brassica campestris ssp. chinensis (chinese cabbage) in vitro.II Plant Sci. 1989. V. 64. N. 2. P. 243-250.

48. Chiang M.M., Hadwiger L. A. The Fusarium solan induced exspressionof a pea gene family encoding high cysteine content proteins.// Mol. Plant Microbe Interact. -1991.-V.4.-P. 324-331.

49. Christey M.C, Sinclair B.K., Braun R.H., Wyke L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas {Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.//Plant Cell Reports. -1997. V. 16 - P. 587-593.

50. Clark M.S. Plant Molecular Biology A Laboratory Manual.// Springer Lab Manual. Scientific Publishing Services (P). 1997. Madras, Germany. 529 c.

51. Curtis O.F., Shetty К. Growth medium effects on vitrification, total phenolics, chlorophyll, and water content of in vitro propagated oregano clones.// Acta Horticulture. 1996. 426: 498-503.

52. De Wet J.R., Wood K.V., Deluca M., Helinski D.R. Firely luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.// Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 725-737.

53. Dong N., Williams N.T., Mcmahan C.M., Rath D., Pearson C., Cornish K. Factors Affect Agrobacterium-Mcdiatcd Sunflower Transformation.// In Vitro Biology Meeting. 2005. 41. P. 30-A.

54. Douglas C.J., Staneloni R.J., Rubin R.A. and Nester E.W. Identification and genetic analysis an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence region.// J. Bacterid. 1985.-V. 161.-P. 850-860.

55. Eduardo R., Alexandre S., Karina P., Suzana N., Maira G., Josias C.F., Elibio L.R. and Francisco J.L.A. Transgene elimination in GM dry bean and soybean lines.// Genetics and Molecular Research. 2005. 4 (2): 177-184.

56. Edwards KJ. Plant Biotechnology. Comparative. Biochemistry and Physiology.// Part A. 134. 2003. S1-S237.

57. Farsi M., Zolala J. Introduction to Plant Biotechnology.// Ferdowsi University of Mashhad: 2004. 495 c.

58. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P. 5824-5825.

59. Fry J., Barnason A., Horsch R.B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors.// PlantCell Reports. 1987. 6: 321-325.

60. Funakoshi Т., Takehiko H., Eiichi I. and Hiroyuki A. Gene expression of lactoferrin-derived antimicrobial peptides in rice.// 4th International Crop Science Congress. 2004. Brisbane, Australia.

61. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrition requirements of suspension cultures of soybean root cells.// Expt. Cell. Res. 1968. 50:151-158.

62. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A. et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide.// Nature Biotechnology. -2000.-V. 18.-P. 1307-1310

63. Golovkin M.V., Abraham M., Morocz S., Bottka S., Feher a., Dudits D. Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts.// Planta Science 1993 - v. 90 - is.l - p. 41-52.

64. Gong H., Pua E.C. Identification and expression of genes associated with shoot regeneration from leaf disc explants of mustard (Brassica juncea) in vitro.// Plant Science. 2004. 167: 1191-1201.

65. Grison R., Grezes-Besset В., Schneider M., Lucante N., Olsen L., Leguay J-J., Toppan A. Field tolerance to fungal pathogens of Brassica napus constitutively expressing a chimeric chitinase gene.//Nature Biotechnology. 1996. 14:643-649.

66. Gruber Margaret Y., Auser P., and Rakow G. Plant transformation in yellow-seeded Brassica napus breeding germplasm.// 10th International Rapeseed Congress. 1999. Canberra, Australia.

67. Hachey J.E., Sharma K.K., Moloney M.M. Efficient Shoot Regeneration of Brassica campestris Using Cotyledon Explants Cultured in vitro,// Plant Cell Rep. 1991. V. 9. P. 549-554.

68. Hain R., Reif H.J., Krause E. et al. Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in novel plant.//Nature. 1993. v. 361 - p. 153 -156.

69. HalinaH., MarzenaP., Grzegorz G. Morphological and Histological Aspects of 2,4-D Effects on Rape Explants (Brassica napus L. cv. Kana) Cultured In vitro.// Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. 2005. 47/1: 219-226.

70. Hauptmann R.M., Ozias Akins P., Vasil V., Tabaeizadeh Z., Rogers S.G., Horsch R.B., Yasil Г.КГ., Fralev R.T. Transient expression of electroporated DNA in monocotyledonous and dicotyledonous species.// Plant Cell Rep. - 1987 - v. 6 - p. 265 - 270.

71. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: B-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in plants.// EMBO J. 1987 - v. 6 - p. 3901-3907.

72. Jonoubi P., Mousavi A., Majd A., Daneshian J. Improved Brassica napus L. regeneration from hypocotyls using thidiazuron and benzyladenine as cytokinin sources.// Рак. J. Bot. 2004. 36 (2): 321-329.

73. Jonoubi P., Mousavi A., Majd A., Jalali Javaran M., Daneshian J., Salmanian A.H. Shoot regeneration induced by thididzuron and Agrobacterium-mQdmiQd transformation of Brassica napus J I J. Sci. of Tarbiat Moallem University. 2005. 3: 167-180.

74. Jonoubi P., Mousavi A., Majd A., Jalali Javaran M., Salmanian A.H., Daneshian J. Efficient Regeneration of Brassica napus L. Hypocotyls and Genetic Transformation by Agrobacterium tumefaciens.il Biol. Plantarum. 2005. 49 (2): 175-180.

75. Jonoubi P., Mousavi A., Majd A., Jalali M. and Salmanian A. Agrobacterium-mediated transformation of Brassica napus. II 2nd National congress of Biotechnology, Karaj, Iran. 2001. P. 57-61.

76. Kazan K., Curtis M.D., Goulter K.C. and Manners J.M. Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Double Haploid Canola {Brassica napus) Lines.//Australian Journal of Plant Physiology. 2005. 24(1) 97-102.

77. Kazan K., Marcus J.P., Goulter K.C. and Manners J.M. Application of genes encoding antimicrobial peptides for the control of fungal pathogens of canola.// Proceeding of the 10th International Rapeseed congress, 1999. Canbera, Australia.

78. Khehra G. S. and Mathias R. J. The interaction of genotype, explant and media on the regeneration of shoots from complex explants of Brassica napus ~L.II J. Exp. Bot. 1992. 43: 1413-1418.

79. Kranthi S., Kranthi K.R., Bharose A. A., Syed S.N. Regeneration of plants from root explant of two Indian cultivars of Brassica campestris L. through somatic embryogenesis.// Current Science. 2005. Vol. 89. No. 8. P. 1323-1326.

80. Kumar A., Rakow G., Downey R.K. Genetic Characterization of Glufosinate-Ammonium Tolerant Summer Rape Lines.// Crop. Sci. 1998. V. 38. P. 1489-1494.

81. Kuvshinov V.V. Development of transgenic crops protected from insect damage andtransgene escape. 2001. 70p.

82. Kuvshinov V.V. et al. Agrobacterium tumefaciens-medmted transformation of greenhouse grown Brassica rapa ssp. Oleifera.ll Plant Cell Reports. 1999. 18:773777.

83. Lazo G.R., Stein P.A., Lidwig R.A. A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.il Biotechnology (NY). 1991. V. 10. P. 963-967.

84. Leshem В., Shaley D.P. and Izhar S. Cytokinin as an inducer of vitrification in Melon.// Annals of Botany. 1988. V. 61. P. 255-260.

85. Lin W., Anuratha C.S., Datta K. et al. Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight.// Ibid. 1995. V. 13. is. 7. P. 686-691.

86. Lingling L., Jianjun L., Song-Ming L., Liyun L., Bihao C. Study on transformation of cowpea trypsin inhibitor gene into cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis).ll African Journal of Biotechnology. 2005. Vol. 4 (1), P. 45-49.

87. Lutful H. and Talukder S.K. Molecular gene transfer for the generation of salt tolerant rapeseed (Brassica campestris, Brassica napus) varieties in Bangladesh.// 4th International Crop Science Congress. 2004. Brisbane, Australia.

88. Malik V.S., Saroha M.K. Marker gene controversy in transgenic plants.// J. Plant Biochem. Biotechnol.- 1999.-V.8.-P. 1-13.

89. Manners J.M., Marcus J.P., Goulter K.C., Green J.L., Harrison S.J.//United States Patent Application. 2002. Application Number PN7802.

90. Marcus J.P., Goulter K.C., Green J.L., Harrison S.J. and Manners J.M. Purification, characterization and cDNA cloning of an antimicrobial peptide from Macadamia integrifolia.il Eur. J. Biochem. 1997. 244:743-749.

91. McCartney H.A., Ни В., Li Y. and Grezes-Besset B. Exploitation of Biotechnology in Developing Strategies for Integrated Control of Sclerotinia Stem Rot in Rapeseed. // 10th International Rapeseed Congress. 1999. Canberra, Australia.

92. Metz T.D., Roush R.T., Tang J.D., Shelton A.M., Earle E.D. Transgenic Broccoli Expressing a Bacillus thuringiensis lnsecticidal Crystal Protein: Implications for Pest Resistance Management Strategies.//Mol. Breeding. 1995. V. 1. P. 309-317.

93. Miller J.H. Experiments in molecular genetics.// Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1972. N.Y.

94. Moloney M.M., Walker J.M., Sharma K.K. High Efficiency Transformation of Brassica napus using Agi'obacterium Vectors.// Plant Cell Rep. 1989. V. 8. N5. P. 238-242.

95. Ning S.u., James A.S., Xing W.D. Modulation of F1 hybrid stature without altering parent plants through trans-activated expression of a mutated rice GAI homologue.// Plant Biotechnology Journal. 2005. V. 3. P. 157-164.

96. Osborn R.W., De Samblanx G.W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins of Asteracea, Fabacea, Hippocastanacea and Saxifragacea.// FEBS Lett. 1995. -V. 368. - P. 257-262.

97. Ovesna J., Ptacek L. and Opatrny Z. Factors influencing the regeneration capacity of oilseed rape and cauliflower in transformation experiments. // Biologi. Plant. 1993. 35,107-112.

98. Penninckx I.A.M., Eggermont K., Terras F.R.G. et al. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway.//Plant Cell. -1996. -V.8. -P. 2309-2323.

99. Petersen C., Smith R. Effect of Abscisic Acid and Callus Size on Regeneration of American and International Rice Varieties.//Plant Cell Rep. 1991. V.10, N.l, P. 3538.

100. Puddephat I. J., Riggs T.J. and Fenning T.M. Transformation of Brassica oleracea L.: A critical review.//Molecular Breeding. 1996. 2: 3: 185-210.

101. Radchuk V.V., Klocke E„ Radchuk R.I., Neumann M., Blume Y.B. Production of transgenic rape plants {Brassica napus L.) using Agrobacterium tumefaciens.I I Genetika. 2000. 36(7):932-41.

102. Raikhel N.V., Lee H.I., Broekaert W.F. Structure and function of chitin-binding proteins.// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1993. -V.44. P. 591-615.

103. Rakoczy-Trojanowska M. Alternative methods of plant transformation a short review.// Cell Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7(3). P. 849-858.

104. RedaE. A. Moghaieb M.A., El-Awady R.G. El-Mergawy S.S.Y. and El-Sharkawy A.M. A reproducible protocol for regeneration and transformation in canola СBrassica napus L.).// African Journal of Biotechnology. 2006. V. 5 (2), P. 143-148.

105. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A. and Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics.// Proc Natl Acad Sci USA. 1984. 81: 8014-8018.

106. Schloupf R.M., Barringer S.A. and Splittstoesser W.E. A review of hyperhydricity (vitrification) in tissue culture.// Plant Growth Regulator Society of America Quaterly. 1995. 23: 149-158.

107. Sen S., Newton R.J., Fong F., Neuman P. Stimulation Abscisic Acid: a Role in Shoot Enhancement from Loblolly Pine (Pinus taeda) Cotyledon Explants.// Plant Cell Rep. 1989. V. 8. N. 3. P. 191-194.

108. Sethi U., Basu A., Guha-Mukherjee S. Role of Inhibitors in the Induction of Differentiation in Callus Cultures of Brassica, Datura and Nicotiana.il Plant Cell Rep. 1990. V. 8. N. 9. P. 598 600.

109. Sharma K.K. and Thorpe T.A. In vitro Regeneration of shoot Buts and Plantlets from seedling root segments of Brassica napus L.// Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1989. V. 18(1), 129-134.

110. Sharma K.K., Bhojwani S.S., Thorpe T.A. The role of cotyledon tissue in the differentiation of shoots and roots from cotyledon explants of Brassica juncea L. Czern.// Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. 24:55-59.

111. Sheng J. and Citovsky V. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel.// The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1699-1710.

112. Sonntag K., Dijscher В., Sellner M. Genotype effects on Agrobacterium-mediatQd genetic transformation of Brassica napus.// IV International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. 2001. Belgium.

113. Sparrow P.A., Townsend T.M., Arthur A.E., Dale P.J., Irwin J.A. Genetic analysis of Agrobacterium tumefaciens susceptibility in Brassica oleracea.// Theor Appl Genet. 2004. Feb;108(4):644-650.

114. Sparrow P.A.C., Townsend Т., Arthur A.E., Morgan C.L., Dale P.J. and Irwin J.A. Genetic analysis of in vitro shoot regeneration from cotyledonary petioles of Brassica oleracea.// Theor. Appl. Genet. 2004. 108: 1249-1255.

115. Stephens C., Kazan K., Goulter K.C., Maclean D.J., Manners J.M. The mode of action of the plant antimicrobial peptide MiAMPl differs from that of its structural homologue, the yeast killer toxin WmKT.// FEMS Microbiol Lett. 2005. 243(1):205-210.

116. Stewart C.N.J., Adang M.J., All J.A., Raymer P.L., Ramachandran S., Parrott W.A. Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAC gene.// Plant Physiol. 1996. 112:115-120.

117. Stewart Jr.C.N., Millwood R.J., Halfhill M.D. et al. Laser-Induced Fluorescence Imaging and Spectroscopy of GFP Transgenic Plants.// Journal of Fluorescence. 2005. V. 15, No. 5.

118. Stringham G.R., Bansal V.K., Thiagarajah M.R., Degenhardt D.F., Tewari J.P. Development of an agronomically superior blackleg resistant canola cultivar in Brassica napus L. using doubled haploidy.// Can. J. Plant Sci. 1995. 75:437-439.

119. Tang G.X., Zhou W.J., Li H.Z., Mao B.Z., He Z.H. and Yoneyama K. Medium, explant and genotype factors influencing shoot regeneration in oilseed Brassica spp.// J. of Agronomy and Crop Science. 2003. 189 (5): 351-358.

120. Tempe J., Goldman A. Occurence and biosynthesis opines.// Mol. Biol. Plant Tumours. -1982 New York: Acad. Press - P. 575-584.

121. Thomzik J.E. Agrobacterium-mediated transformation of stem disks from oilseed rape (Brassica napus L.) Methods in Molecular Biology Vol 44: Agrobacterium protocols Edited by K.M.A. Gartland and M.R. Davey Humana Press Inc. 1995. Totwa, NJ.

122. Van Loon L.C., Gerrittsen Y.A.M., Ritter C.E. Identification, purification and characterization of pathogenesis-related proteins from virus-infected Samsun NN tobacco leaves.//Plant Mol. Biol. 1987. V. 9. P. 593-609.

123. Van Loon L.C., Pierpoint W.S., Boiler Т., Conejero V. Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins.// Plant Mol. Biol. Reporter.- 1994.-V.I2.- P.245-264.

124. Van Loon L.C., Van Strien. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins.// Physiological and Molecular Plant Pathology. 1999. V. 55. P. 85-97.

125. Wang J.X., Zhao F.Y. and Xu P. Use of aroA-Ml as a Selectable Marker for Brassica napus Transformation.// Crop Sci. 2006. 46:706-711.

126. Wang Y., Nowak G., Culley D. et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg {Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola {Brassica napus).// Mol. Plant-Microbe Interact.- 1999.-V. 12,-P.410-418.

127. Wei Z.M., Huang, J.Q., Xu S.P., Xue H.W. High efficiency regeneration and Agrobacterium-mQdiatQd transformation of hypocotyl in Brassica oleracea var. capitata with B.t. gene.//Acta Agricultural Shanghai. 1998. 14:11-18.

128. Xiang Y., Wong W.K.R., Ma M.C., Wong R.S.C. Agrobacterium-MQdmted Transformation of Brassica campestris ssp. Parachinensis with Synthetic Bacillus thuringiensis crylAb and crylAc Genes.// Plant Cell. Rep. 2000. V. 19. P. 251-256.

129. Zaccomer В., Cellier F., Boyer J.C., Haenni A.L., Tepfer M. Transgenic Plants that Express Genes Including the 3' Untranslated Region of the Turnip Yellow Mosaic Virus (TYMV) Genome Are against TYMV Infection.// Gene. 1993. V. 136. P. 8794.

130. Zambryski P., Joos H., Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity.// EMBO J.-1983.-P.2143-2150.

131. Zarhloul M.K., Wilfried W.L., Alexandra S.E., Hausmann L., Friedt W. and Reinhard T. Molecular approaches to the biosynthesis of medium-chain triacylglycerols in Brassica napus.ll 10th International Rapeseed Congress. 1999. Canberra, Australia.

132. Zhang Y. and Prem L.B. Shoot regeneration potential from seedling explants of Australian cultivars of oil seed rape (Brassica napus L.).// 10th International Rapeseed Congress. 1999. Canberra, Australia.

133. Zhang Y., Mohan B.S., Ines S. and Prem L.B. Agrobacterium-mGdiated transformation and generation of male sterile lines of Australian canola.// Australian Journal of Agricultural Research. 2005. 56(4) 353-361.

134. Zhao J., Meng J. Genetic analysis of loci associated with partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in rapeseed (Brassica napus L.).// Theor. Appl. Genet. 2003. 106: 759-764.