Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.)

Котлярова, Екатерина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.)
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.)"

На правах рукописи

—uör37B I,

КОТЛЯРОВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА

АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ЯРОВОГО РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)

06.01.05 - Селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Рамонь - 2007

003057378

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологи-ческий институт рапса»

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук

Подвигина Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук Ошевнев Валерий Павлович

Ведущая организация — ФГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. B.C. Пустовойта» РАСХН

Защита состоится <@> мая 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, ВНИИСС; факс (47340) 2-19-93

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»

Автореферат разослан « апреля 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к. с.-х. н.

Путилина Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Рапс яровой (Brassica napus L.) - ценная масличная и кормовая культура, хорошо приспособленная к умеренному климату. В России рапс является одной из перспективных масличных культур, увеличение объемов производства семян которой позволит полнее обеспечить население растительным маслом, животноводство - кормовым белком, а промышленность - сырьем (Карпачев, 2006).

Создание новых сортов рапса, соответствующих требованиям современного производства, во многом зависит от разнообразия исходного материала, который можно создавать с помощью методов биотехнологии. Одним из них является метод получения гаплоидов из репродуктивных клеток в условиях in vitro, ускоряющий процесс формирования гомозиготных линий по сравнению с традиционными методами селекции в 5-10 раз. У ярового рапса достаточно подробно разработан метод культуры изолированных пыльников. Однако, в ге-терозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности необходимо сохранение материнской цитоплазмы, что возможно только с помощью культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков. Кроме того, растения, полученные данным методом, свободны от некоторых вирусов и нежелательных генов, передающихся по мужской линии. Сведений о получении гаплоидных растений в культуре неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в доступной нам литературе не выявлено.

Метод культуры незрелых зародышей дает возможность получать отдаленные гибриды, что играет немаловажную роль в селекции рапса, так как перенос ценных генов из других видов и родов Brassicaceae расширяет его генетический потенциал, который отличается крайней узостью.

В связи с этим в селекции рапса применение биотехнологических методов, в том числе эмбриокультуры и гаплоидии, позволяющих расширить генетический потенциал и ускорить создание новых сортов и гибридов, является актуальным.

Цель исследований - обосновать приемы культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков и незрелых зародышей в процессе создания нового исходного материала ярового рапса. Задачи исследований:

1. Изучить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регеиерантов из неоплодотворённых семязачатков и формирование реституционных линий ярового рапса.

2. Разработать способ получения нового исходного материала ярового рапса, в том числе восстановителей фертильности, с использованием метода культуры неоплодотворённых семязачатков.

3. Изучить влияние направления скрещиваний (генотипа материнской и отцовской формы) и условий культивирования на развитие зародышей отдаленных гибридов в условиях in vitro.

4. Выявить ценные и хозяйственно-полезные признаки полученных реституционных линий и гибридных растений.

Научная новизна. Впервые установлено, что при культивировании не-оплодотворенных семязачатков ярового рапса тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Данные наблюдения имеют теоретическое значение, так как расширяют научные представления о регуляции ростовых процессов у растений рапса при воздействии стрессовых условий культуры in vitro.

Впервые разработан метод получения гомозиготных линий рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro, позволяющий установить влияние эндо- и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии, определить оптимальные стадии развития эксплантов, выявить состав и последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации и микроразмножения гаплоидных и реституционных линий ярового рапса. Установленные параметры культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса in vitro дали возможность впервые разработать способ, позволяющий ускоренно (в 5-10 раз) получать исходный материал для гетерозисной селекции, на который подана заявка на патент «Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса».

Впервые модифицирован состав питательной среды для получения гибридов от межвидовых и межродовых скрещиваний путем прямой регенерации из незрелых зародышей в условиях in vitro. Установлен оптимальный срок введения зародышей изучаемых отдалённых гибридов семейства Brassica-сеае в культуру. Использование метода эмбриокультуры позволило получить межродовые гибриды между рапсом яровым и горчицей белой при использовании последней в качестве опылителя, что представляет определенный теоретический интерес для отдаленной гибридизации рапса.

Практическая значимость результатов исследований. С помощью культуры неоплодотворенных семязачатков получено 5 реституционных линий ярового рапса, которые были переданы в лабораторию селекции рапса ВНИПТИР и включены в её научно-исследовательскую работу.

Данные линии представляют ценность для использования в гетерозисной селекции в качестве восстановителей фертильности и как перспективный исходный материал для селекции ярового рапса на скороспелость, качество семян и масла, устойчивость к полеганию и другие признаки.

Полученный в ходе применения эмбриокультуры гибридный материал может использоваться в практической селекции и дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях. Среди полученных гибридов выявлены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в учебных программах по биологии и селекции в высших и средних учебных заведениях и в различных областях биотехнологии.

Апробация работы. Основные положения исследовательской работы доложены и обсуждены на школах-семинарах молодых учёных Липецкой области: «Актуальные проблемы современной науки» (Липецк, 2004), «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2005,2006); III и IV Международных конференциях молодых учёных и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007), школе молодых учёных «Экологическая генетика культурных растений» (Краснодар, 2005), Международной научно-практической конференции «Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели» (Липецк, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии в высших педагогических учебных заведениях» (Орехово-Зуево, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Международной научной конференции «Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2006), IX Международной научно-практической экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006), на межвузовских научных конференциях преподавателей, аспирантов и студентов (Липецк, 2003 - 2006 гг.) и заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИПТИР (Липецк, 2004 - 2007 гг.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментальное обоснование влияния эндогенных и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков в условиях in vitro, позволяющее ускоренно получать новый исходный материал ярового рапса.

2. Способ создания реституционных линий рапса, основанный на индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, стабилизации, микроразмножении и диплоидизации полученных регенерантов.

3. Параметры эмбриокультуры, заключающиеся в определении влияния направления скрещиваний и оптимизации условий культивирования зародышей отдаленных гибридов.

4. Ценные признаки полученных гибридных растений и реституционных линий.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и рекомендаций для практического использования. Работа иллюстрирована 53 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 19 таблиц. Библиография включает 222 литературных источника, из которых 135 на иностранных языках.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, кроме того, 3 работы находятся в печати.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории биотехнологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал, методика и условия проведения опытов

Исходный материал. Настоящая работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и проектно-технологическом институте рапса (г. Липецк) в 2003 - 2006 гг. в рамках тематических планов 04.03.04.01.03 «Создать исходный материал для гетерозисной селекции на основе ЦМС с применением метода культуры неоплодотворенных семязачатков рапса» и 04.03.04.01.04 «Создать новый исходный материал от межвидовых и межродовых скрещиваний растений семейства Brassicaceae методом эмбриокуль-туры». Цитоэмбриологические исследования проводились в лабораторных условиях отдела биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института сахарной свёклы и сахара им. A.JI. Мазлумова (п. Рамонь, Воронежской области).

В качестве исходного материала для индуцирования гаплоидии использовались сорта ярового рапса (Ратник, Липецкий, Hanna, Galaxy), полученные на их основе самоопылённые линии на стерильной цитоплазме и гибриды с генами восстановления фертильности.

С целью получения отдаленных гибридов в полевых и тепличных условиях проводили реципрокные межвидовые скрещивания рапса (Brassica napus L., 2n=38, Fs (Харьковская 6 x Hanna)) с горчицей сарептской (В. juncea (L.) Czern., 2n=36, сорт ВНИИМК 13) и межродовые скрещивания рапса (F3 (6В х (СНк198 х LI 59) х (ВНИИМК 162 х ВНИИМК 109)) с горчицей белой (Sinapis alba L., 2п=24, сорт R 166), а также сурепицы яровой (В. campestñs L. var. oleífera, 2п=20, сорт Восточная) и декоративной капустой (В. oleráceo var. capitata, 2n=18).

Условия и методика проведения опытов.

Индуцирование гаплоидии. Растения ярового рапса выращивались в теплице и на полях ВНИПТИР, расположенных в 10 км к северу от г. Липецка. Семязачатки изолировали из 1-30 бутонов от первого цветка, длиной от 2 до 6 мм, с центральной кисти и побегов первого и второго порядков. Введение в культуру проводилось в летний период с растений, выращенных в поле, в зимне-весенний - с доноров, выращенных в теплице. Закладка опытов, фенологические наблюдения, уход за посевами, гибридизация проводились согласно общепринятым методикам (Пустовойт, 1967).

Для стерилизации бутонов ярового рапса применяли растворы веществ: хлорамин Б и Domestos в различных концентрациях, анолит (рН=6) и смесь анолита с католитом (рН=7 и рН=9). Экспозиция бутонов в исследуемых растворах составляла 10 мин.

Извлечение семязачатков из завязи и введение их в культуру проводили в стерильных условиях пылезащитного бокса под бинокулярным микроскопом МБС-9 (кратность увеличения 12,8). Всего культивировалось более 10 тыс. неоплодотворенных семязачатков.

В исследованиях использовалась общепринятая техника приготовления и стерилизации питательных сред (Бутенко, 1964, 1999). Для культивирова-

ния эксплантов применялись среды Мурасиге-Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) и Гамборга (В5) (Gamborg, Eveling, 1968). В питательную среду добавляли витамины по Уайту (White, 1963), 100 мг/л мезоинозита, 20-40 г/л сахарозы. Индукция гаплоидных растений достигалась добавлением гормонов: 6-бензиламинопурина (6-БАП), гиббереллина (ГК), кинетина, а-нафтилуксус-ной кислоты (НУК), индолилуксусной кислоты (ИУК) в различных концентрациях (0,01 - 3 мг/л) и сочетаниях. pH среды поддерживался на уровне 5,86,0. В качестве контроля применяли безгормональную питательную среду.

Обработку материала пониженной температурой (+4-6 °С) при экспозиции 1-3 суток проводили в бытовом холодильнике.

Культивирование неоплодотворённых семязачатков проводили в термальной комнате на свету при 16-часовом фотопериоде и в темноте, при температуре 23 - 26 °С, освещённости 5 тыс. люкс и влажности воздуха 70 %.

Перевод гаплоидных регенерантов на диплоидный уровень в условиях in vitro проводили на основе безгормональной питательной среды с добавлением 0,005 - 0,01 % водного раствора колхицина в течение 2-х суток в условиях темноты. Затем растения пересаживали на питательную среду, содержащую 0,25 мг/л кинетина и культивировали 1 месяц на свету. Определение уровня плоидности производили методом подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в точках роста. Хорошо развитые пробирочные растения пересаживали в теплицу в смесь песка и почвы в соотношении 1:3 и накрывали стеклянными стаканчиками для прохождения акклиматизации.

Жирнокислотный состав масла определялся в биохимической лаборатории отдела селекции ВНИПТИР н.с. Германенко Г.В. по методике Демьян-чук Г.Т. (1988) методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ 30089-93, содержание глюкозинолатов в семенах - экспересс-методом (ГОСТ 9824-87, п. 3.5).

Эмбриокультура. Незрелые зародыши межвидовых и межродовых гибридов вводили в культуру in vitro на разных стадиях развития (5, 7, 10, 13 и 17 дни после опыления). Культивирование зародышей проводили на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, БАП, ГК по 0,2 мг/л, 0,1 мг/л НУК и 300 мг/л гидролизата казеина.

Морфологическое описание гибридов осуществляли по методике ВИР (Корнейчук, 1983). Для цитологического изучения на всех этапах работы использовались общеизвестные методики (Паушева, 1988). Цитологические препараты просматривали на микроскопах МБИ-6, МБИ-15, Ienaval. Фотографирование препаратов и объектов исследования осуществляли с помощью фотоаппарата Olympus 400 Digital на микроскопах МБИ-15 и Ienaval (окуляр 8-10х, объектив - 12,5-40х).

Повторность опытов двух-трехкратная. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1985), программы Excel и Statistica v. 6.0.

ИНДУЦИРОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ИЗ НЕОПЛОДОТВОРЁННЫХ СЕМЯЗАЧАТКОВ ЯРОВОГО РАПСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии Влияние генотипа. Определяющим из комплекса лимитирующих факторов в культуре неоплодотворенных семязачатков являлся генотип растения-донора. Проведенные исследования показали, что реализация морфогенеза происходила по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

При введении в культуру семязачатки имели светло-зеленый цвет, затем становились матово-белыми, а в дальнейшем бурыми, и 37 % образовывали каллусы небольшого размера молочного или желтого цвета. При этом обнаруживалось образование двух типов каллусной ткани. Каллус первого типа (неморфогенный) формировался на 10 - 14-й день культивирования и представлял собой водянистую массу клеток рыхлой консистенции и жёлтого или мутно-серого цвета. На таких каллусах наблюдался некроз тканей или ризо-генез, и они не были способны к регенерации.

Каллус второго типа (морфогенный) становился визуально заметным на 18 - 20-й день культивирования и имел белую или бледно-жёлтую окраску, плотную консистенцию и зернистую или глобулярную структуру. Массовое формирование и развитие каллуса наблюдали за период с 30-го по 45-й день после изоляции, что согласуется с данными других исследователей (Славова, Рафаилова, 1991). В процессе культивирования в нем образовывались проэмбриогенные массы или меристематические зоны. В дальнейшем из этих меристематических очагов путем последующей дифференциации формировались сначала ростовые почки, а затем растения.

Следует отметить, что в 98 % случаев наблюдался процесс развития вегетативной почки (вегетативный геммогенез). Формирующиеся регенераты имели слабо развитый гипокотиль с двумя-тремя узкими листовыми пластинками бледно-зеленого цвета. Отмечались единичные случаи генеративного геммогенеза, когда растение высотой не более 2,5 см образовывало бутоны.

Из 16 изученных генотипов ярового рапса 15 были способны к каллу-сообразованию, 10 обладали способностью к индукции ростовых почек и только у пяти генотипов почки развивались в растения.

Частота индукции каллусных структур колебалась от 0 до 7,10 % в зависимости от генотипа донорского растения. У сортов и самоопыленных линий со стерильной цитоплазмой выявили самую низкую частоту каллусообразования, которая составила 1,15 % и 2,43 %, и регенерации (1,67 % и 3,85 % соответственно). Сорта и линии более чем в 2 раза уступали материалу гибридного происхождения по количеству ростовых почек (12,46 %). Гибриды обладали наибольшей склонностью к индукции каллуса и регенерации проростков, составивших в среднем 3,55 % и 4,72 %. Кроме того, у материала гибридного происхождения были обнаружены максимальные значения частоты образования

каллуса (7,1 %) у генотипа № 3, ростовых почек (29,41 %) у № 7 и регенеран-тов (17,65 %) у № 8 (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние генотипа донорского материала на регенерационную способность неоплодотворённых семязачатков ярового рапса _ (2003 - 2005 гг.) __

№ материала Характеристика материала Введено семязачатков, шт. Получено каллусов Сформировано из каллусов

ростовых почек проростков

шт. % шт. % шт. %

1. Гибриды 1055 43 4,08 0 0 0 0

2. 1048 28 2,67 2 7,14 0 0

3. 507 36 7,10 4 11,11 3 8,33

4. 936 28 2,99 3 10,71 0 0

5. 585 8 1,37 1 12,5 0 0

6. 1119 19 1,70 1 5,26 0 0

7. 811 17 2,34 5 29,41 2 11,76

8. 551 34 6,17 8 23,53 6 17,65

9. Сорта 656 15 2,29 2 13,33 1 6,67

10. 541 6 1,11 0 0 0 0

11. 762 9 1,18 1 11,11 0 0

12. 298 0 0 0 0 0 0

13. Линии 443 13 2,94 3 23,08 2 15,38

14. 234 2 0,85 0 0 0 0

15. 222 9 4,05 0 0 0 0

16. 375 7 1,87 0 0 0 0

НСР0,о5 = 0,03 НСР0,о5= 0,25 НСРао5= 0,23

Максимальную частоту регенерации среди линий наблюдали у № 13

полученной на основе сорта Hanna самоопыленной линии со стерильной цитоплазмой (15,38 %). Сорт Hanna (№ 10) также проявил способность к индукции морфогенного каллуса и образованию ростовых почек (11,11 %). Наибольшей склонностью к индукции гаплоидии среди сортов ярового рапса обладал № 9 (Липецкий) - 6,67 %.

Часть генотипов (№ 1, 10, 14, 15, 16) формировала нерегенерационный каллус. Многие генотипы, например, № 4, 5, 11, обнаруживали относительно высокий выход ростовых почек (10,71 %, 12,5 % и 11,11 % соответственно), однако, при пересадке их на среду для регенерации дальнейшего развития отмечено не было. Таким образом, у ярового рапса способность к каллусооб-разованию и регенерации растений в культуре неоплодотворённых семязачатков зависела от генотипа донорского растения.

Маркерные признаки растений-доноров. Результаты исследований показали, что гетеростилия третьего и четвертого типов и недоразвитость пыльников встречаются у генотипов №№ 3,7,8,13, обладающих лучшей ре-генерационной способностью в культуре неоплодотворенных семязачатков iti vitro. Частота встречаемости аномальных форм цветка колебалась в зависимости от происхождения материала и достигала 73% у линии № 13, в то время как в норме она составляла не более 35,3 %. Кроме того, у гибрида № 8 отмечались случаи срастания соседних цветоножек и уменьшение их длины с 2,1 см до 1,2 см, т.е. почти в 2 раза.

Цитологические наблюдения показали, что данный селекционный материал отличался наличием изменений при формировании мужских гамет. Аномалии проявлялись в формировании микроспор, где были отмечены триады и тетрады с аномальным развитием. Также было отмечено наличие пыльцевых зерен измененной формы и увеличенного размера до 49,5 мкм, что превышало размеры нормальных зерен примерно в 1,5-2 раза.

Проведенные исследования позволили выявить зависимость регенера-ционной способности селекционного материала от количества аномальных пыльцевых зерен. Так, у гибрида № 3 при наличии 3,5 % аномальных пыльцевых зерен регенерационная способность достигала 8,33 %, а у гибрида № 8 данные показатели составили соответственно 32,9 % и 17,65 % (рис. 1).

материал

Рис. 1. Зависимость регенерационной способности от количества нарушений при формировании мужских гамет у растений-доноров Следовательно, морфологические изменения формы цветка и генеративных органов, а также качественные признаки пыльцевых зерен и микроспор можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов для индуцирования гаплоидов.

Зависимость регенерационной способности семязачатков от длины бутонов и расположения ветвей на побеге. Другим существенным фактором, влияющим на регенерационную способность неоплодотворенных семязачатков является стадия развития зародышевого мешка при введении эксплантатов. Анализ полученных результатов показал, что морфогенетическо-му развитию в большей степени подвержены семязачатки, изолированные из бутонов длиной 2,0 - 4,0 мм, частота образования каллуса у которых составляла 3,3 %, а выход регенерантов колебался от 0,3 до 0,7 %.

Результаты исследований показали, что семязачатки из бутонов с центральной кисти обладали максимальной способностью к каллусообразова-нию (5,7 %) и регенерации (1,3 %). Эксплангы из бутонов с ветвей первого порядка, образовывали в два раза меньше каллусных структур (2,6 %) и регенератов (0,7 %), а бутоны с побегов второго порядка практически не были способны к регенерации. Возможно, полученные результаты связаны с повышенной активностью всех физиологических процессов, происходящих в основных побегах ярового рапса.

Таким образом, наибольшей способностью к индукции новообразований обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2-4 мм. Данные наблюдения следует использовать при введении в культуру эксплантов с большей регенераци-онной способностью.

Влияние экзогенных факторов на индукцию гаплоидии

Подбор оптимального стерилизующего агента. Результаты сравнения действия различных стерилизующих агентов показали, что использование 10 %-х растворов хлорамина и Оогг^оз обеспечивало 100 % стерильность материала. Однако, при этом отмечено угнетение развития регенеран-тов. Наибольшее число регенерантов (8,0 %) и их нормальное развитие наблюдали при стерилизации 7 %-ным раствором ОотеБ!*« (табл. 2).

Таблица 2 - Эффективность стерилизации бутонов различными дезинфицирующими веществами при введении неоплодотворённых семяза-_чатков ярового рапса в культуру in vitro (2004-2005 гт.) _

Дезинфици- Концент- Введено в культуру Инфицировано семязачатков, % Получено регенерантов, % Развитие регене-

рующий раствор рация раствора, % семязачатков, шт. грибной инфекцией бактерии- альной инфекцией рантов (по 5-бальной шкале)

Хлорамин 7 123 9,8 21,1 0,8 3

10 119 0 0 2,5 3

5 120 0 12,5 4,2 3

Domestos 7 125 0 0 8,0 5

10 198 0 0 5,1 4

Анолит рН=6 118 0 0 12,7 5

Анолит+ рН=7 200 0 0 21,0 5

католит рН=9 124 0 0 14,5 5

Итого: 1278 0,9 6,9 8,1

Выявлено, что количество семязачатков, поражённых бактериальной инфекцией, составило 6,9 % против 0,9 % эксплантов, подверженных воздействию грибной инфекцией.

Обработка бутонов ярового рапса раствором анолита и смесью анолита с католитом не только уничтожила инфекцию, но и стимулировала развитие семязачатков. При стерилизации бутонов смесью анолита с католитом (рН=7) у каллусов получили максимальное количество регенерантов - 21,0 %. При

этом образование каллуса и ростовых почек наблюдалось на 7 - 10 дней раньше, чем при использовании других дезинфицирующих веществ, что согласуется с отмеченным другими исследователями благоприятным влиянием на растения активированной воды (Васильченко, 2005).

Таким образом, при культивировании неоплодотворённых семязачатков in vitro наряду с 7 %-ным раствором Domestos эффективными дезинфицирующими агентами являются экологически чистые электроактивированные водные растворы анолит и смесь анолита с католитом (рН=7), ускоряющие развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro.

Влияние сроков введения в культуру и предобработки бутонов на индукцию гаплоидии. При изучении регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков ярового рапса, выращенного в условиях теплицы и поля, выявлено, что количество каллусных структур в 2004 - 2005 гг. колебалось от 5, б % до 0,58 % при введении эксплантов с донорских растений, вегетировавших в поле. Условия теплицы были более стабильными, в связи с чем и частота каллусообразования колебалась незначительно и составляла в среднем 2,34 %.

Наибольшее количество проростков (0,26 %) было получено в 2004 г. при эксплантации семязачатков с растений, При зимне-весенней эксплантации частота образования проростков была меньше и составляла 0,03 %, в 2005 г. - 0,19 %.

Экспериментальные данные по обработке неоплодотворённых семязачатков холодом в течение 24 часов показали максимальную склонность эксплантов к образованию каллусов - до 61,1 % и наибольшее количество реге-нерантов (3,1 %). Частота регенерации находилась в прямой зависимости от экспозиции обработки и понижалась с 3,1 % (1 день) до 0,8 % (3 день воздействия). Следовательно, обработка холодом в течение суток повышала морфо-генную способность семязачатков.

Зависимость регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков от условий культивирования. Еще одним экзогенным фактором, от которого зависит эффективность получения гаплоидных растений в культуре in vitro, является состав питательной среды.

Максимальная частота каллусообразования (5,7 %) была получена при добавлении в питательную среду 20 % сахарозы. Увеличение концентрации сахарозы до 30 г/л снижало частоту каллусообразования до 1,2 %, а наличие в питательной среде 40 г/л сахарозы оказывало ингибирующий эффект, что согласуется с данными других исследователей (Zhou, Yang, 1981).

При изучении влияния минерального состава среды на регуляцию роста и развития культивируемых семязачатков ярового рапса не было выявлено достоверных различий по частоте каллусообразования на средах с минеральной основой В5 и MS при 5 %-ном уровне значимости по результатам дисперсионного анализа двухфаеторного опыта (рис. 3).

Рис. 3. Действие гормональных добавок на частоту каллусообразования в зависимости от минерального состава среды В результате исследований было выявлено, что наибольшая частота образования каллуса (5,81 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 5 питательной среды МБ с добавлением 0,3 мг/л 6-БАП, 0,01 мг/л ИУК и 0,3 мг/л ГК. На остальных вариантах сред частота каллусообразования существенно не превышала стандарт и находилась на одном с ним уровне. В связи с этим в дальнейших исследованиях применялась среда с минеральной основой МБ.

Изучение гормонального состава питательной среды показало, что наибольшая способность к каллусообразованию (15 %) и достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались в варианте № 21 питательной среды (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние ростовых веществ в питательной среде на каллусогенез

ярового рапса в культуре неоплодотворённых семязачатков (2004 -2005 гг.)_

Вариант сред Соотношение БАП:кин:ИУК:ГК:гидр.каз.:2,4-Д Введено семязачатков, шт. Образование каллуса

шт. %

1.(51) Без гормонов 561 2 0,36

13 1:0,1 :0:0,5 : 0:0 300 1 0,33

14 2:0,1 :0:0,5:0:0 300 0 0

15 3 : ОД : 0 :0,5 : 0 :0 300 0 0

16 1 : 0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0 300 16 5,33

17 2:0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0 300 9 3,00

18 3:0,1 : 0,01 : 0,5 : 0 : 0 300 4 1,33

19 0,5 : ОД : ОД : 0 : 100 : 0 200 2 1,00

20 0,5 : ОД : ОД : 0:300 : 0 240 2 0,83

21 0:1: 0,1: 1 :10 : 0 200 30 15,00

22 0 : 1 : 0,1 : 1 : 0 : 0 140 10 7,14

23 0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : 0,5 215 3 1,40

24 1 : 0,5 : 1 : 1 : 0 : 1 244 2 0,82

25 0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 : 0 : ОД 680 28 4,12

26 0 :1 : ОД : 0,5 : 0 : 0,5 275 5 1,82

НСР0,о5=4,03

Только морфогенные каллусы, образовавшиеся на средах № 16 и 23 -26 обладали способностью к формированию ростовых почек. Максимальное количество ростовых почек (71,4 %) формировалось на питательной среде (вариант № 25) с превышением концентраций цитокининов по отношению к ауксинам более, чем в 2 раза (1,5 : 0,6).

Оптимальной для индукции проростков оказалась среда № 25, частота регенерации на которой составила 58,8 % (табл. 4).

Таблица 4 - Формирование регенерантов из каллусных структур в зависимо-

сти от состава питательной среды (2004 - 2006 гг.)

Вариант среды, № Число каллусных образований, шт. Получено Характеристика состояния

ростовых почек регенерантов из ростовых почек

шт. % шт. %

l.(st) 2 0 0 0 0 -

16 16 5 31,3 0 0 Бесцветные почки, нет развития

23 3 2 66,7 1 50,0 Проростки с листьями

24 2 1 50,0 1 100,0 Нитрифицированные проростки с широкими листьями и утолщенным стеблем

25 28 20 71,4 11 58,8 Нормально развивающиеся проростки с листьями

26 5 2 40,0 1 50,0

Итого: 54 30 64,5 14 25,0 -

Ббльшее количество кинегина и меньшая концентрация 6-БАП (превосходящего кинетин по активности) в составе данной среды способствовало росту регенерантов и их нормальному развитию из ростовых почек.

При пересадке на среду для регенерации не все ростовые почки, полученные в культуре неоплодотворенных семязачатков, развивались в растения. Частота регенерации широко варьировала в зависимости от генотипа и составляла от 0 до 100 %.

Регенеранты с признаками обводнения погибали в течение 2-х недель от появления проростка. Больше 50 % растений с изменённым морфотипом обладало способностью к образованию вторичных регенерантов на разросшихся тканях гипокотиля. Ростовые почки формировались в количестве от 1 до 7 на первичный регенерант. При пересадке вторичных регенерантов на безгормональную среду В5 они развивались в нормальные растения.

При изучении светового режима культивирования эксплантов выявлено, что в темновых условиях активнее, чем на свету проходило формирование каллусов - 59,5 % и 44,3 % соответственно. Однако при этом наблюдалось угнетение развивающихся эксплантов, а количество регенерантов сокращалось в 2,2 раза, что составляло 1,0 %.

Таким образом, процесс воспроизведения гаплоидных растений в условиях in vitro определяется прежде всего на генетическом уровне, но реализу-

ется в зависимости от конкретных физиологических условий и различных по действию индуцирующих факторов.

ГАПЛОИДИЯ КАК УСКОРЕННЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ ЯРОВОГО РАПСА

Формирование гаплоидных линий. Исследования показали, что на начальных стадиях роста гаплоидные регенераты отличались слабым развитием и жизнеспособностью вследствие одинарного набора хромосом. Гибель реге-нерантов на этой стадии составляла в зависимости от генотипа растений-доноров до 62 %.

Культивирование гаплоидных проростков с признаками витрификации на средах с гормонами не приводило к формированию нормальных растений, а чаще всего влекло за собой их гибель. Для формирования гаплоидных линий многими исследователями было предложено проведение этапа стабилизации, (Таратонов, 1999). Согласно нашим исследованиям, использование чередования гормональной и безгормональной сред позволяло регенерантам приобрести способность образовывать пазушные побеги, благодаря чему количество регенератов гибрида № 3 увеличилось от 3 до 32 растений к 4 пассажу.

Установлено, что для нормально развитых гаплоидных растений этап стабилизации заключался в чередовании следующих сред: гормональная -безгормональная - гормональная. Для слабо развитых или витрифицирован-ных адвентивных побегов необходимо сначала культивирование на безгормональной среде, а затем на гормональной.

Доказательством стабилизации и выравненности гомозиготных линий является анализ плоидности. У каждого из полученных регенерантов в 100 клетках была определена длина замыкающих клеток устьиц и подсчитано число хлоропластов в них. Установлено различие в размерах замыкающих устьичных клеток у растений с разным уровнем плоидности. Отношение длины замыкающих клеток устьиц листа гаплоидов к клеткам ди- и трипло-идной форм составило 1 :1,58 и 1 : 2,21 соответственно.

В результате подсчёта числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц выявлено, что у гаплоидных растений встречалось от 8 до 11 хлоропластов на две замыкающие клетки устьица, у диплоидных — от 12 до 14. У триплоид-ных форм отмечалось более 14 хлоропластов (табл. 5).

Таблица 5 -Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листа и длина клеток у растений ярового рапса при различных уровнях плоидности

Уровень плоидности Количество хлоропластов, шт. Длина замыкающих устьичных клеток, мкм

Среднее значение Мини-максимальные средние

Гаплоидный (п) 9,8 ± 1,45 8,3-11,2 14,6 ± 1,12

Диплоидный (2п) 13,0 ± 1,05 11,9-14,0 23,1 ±1,87

Триплоидмый (Зп) 15,2 ± 1,10 14,1 -16,2 32,2 ± 1,65

Кроме того, у гаплоидных растений наблюдалось возникновение деформированных устьичных клеток и отсутствие в них хлоропластов.

Данные признаки можно использовать в качестве морфологических маркеров для отбора гаплоидных регенерантов на самых ранних этапах развития, когда анализ хромосомного набора крайне затруднителен.

Димоидюация гаплоидов и формирование реституционных линий.

Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения необходимо перевести на более высокий уровень плоидности. В связи с этим изучалась возможность колхицинирова-ния в культуре in vitro.

Исследования показали, что выживаемость регенерантов, подвергнутых воздействию колхицином в зависимости от генотипа составляла от 50 % до 100 %. Для предотворащения возврата регенерантов на гаплоидный уровень их культивировали на среде с кинетином. Наиболее развитые диплоидные растения размножали на среде с БАП, кинетином и гиббереллином до необходимого количества и укореняли на среде с 1 мг/л НУК. Процесс корнеобразова-ния длился 2-4 недели, при этом частота формирования корней зависела от генотипа и колебалась в пределах 35,6 - 97,4 %. Затем растения переносили в грунт теплицы или в полевые условия.

В результате проведенных нами исследований был разработан метод получения гомозиготных линий ярового рапса на основе индуцирования гап-лоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков, заключающийся во введении неоплодотворенных семязачатков в культуру, формировании каллуса и регенерации на нем ростовых почек, стабилизации и микроразмножении гаплоидов, их колхицинировании in vitro (диплоидизации); стабилизации, микроразмножении полигаплоидов и корнеобразовании; пересадке в грунт теплицы, акклиматизации и высадке в полевые условия.

Способ получения восстановителей фертилъносгпи ярового рапса.

В результате применения метода культуры неоплодотворенных семязачатков было получено 5 реституционных линий, в том числе линии PJI7 и PJI8, донорские растения которых имели стерильную цитоплазму типа Polima и гены восстановления фертилыгости. В условиях теплицы и поля полученные растения цвели, и после опыления пыльцой линии PJI 8 формы, обладающей цито-плазматической мужской стерильностью, завязались семена. Эффективность гибридизации при этом достигала 65,3 %.

Семена реституционных линий были высеяны в теплице, и у растений в период цветения проведен анализ фертильности. Установлено, что фертиль-ность донорского растения № 8 повысилась в результате индуцирования гап-лоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro с 78,7 % до 94,5 %, что свидетельствует о том, что линия РЛ 8 может быть использована в качестве восстановителя фертильности в гетерозисной селекции ярового рапса.

Полученные данные позволили разработать способ получения восстановителей фертильности рапса, состоящий из следующих этапов:

1. Получение гомозиготных линий ярового рапса от исходных форм, обладающих свойством восстановления фертильности, с помощью индуцирования гаплоидии посредством культуры неоплодотворенных семязачатков in vitro. 2. Посев семян полученных реституционных линий в поле и обычный уход

за растениями. 3. Опыление форм с цитоплазматической мужской стерильностью пыльцой реституционных линий. 4. Посев полученных семян в поле и анализ фертильности пыльцевых зерен.

Характеристика полученных реституционных линий

Каждую линию по средним значениям показателей в зависимости от того, насколько они превышают значения донорских растений, оценивали по пятибалльной системе. В результате выявили, что по всем исследованным элементам структуры урожая выделилась линия РЛ 8 с максимальным количеством баллов (44). Минимальную оценку получила РЛ 7 (29 баллов), значения которой резко колебались по разным показателям.

Сравнение реституционных линий, полученных в культуре неоплодо-творенных семязачатков, с донорами по элементам структуры урожая показало уменьшение высоты полученных растений примерно в 1,5 раза, повышающее устойчивость растений к полеганию с 3 до 5 баллов.

Кроме того, у полученных линий ярового рапса интерес представляло изучение качества масла и семян. Основным требованием, предъявляемым к современным сортам, принимаемым в производство пищевого рапсового масла, является содержание менее 0,6 % глюкозинолатов в семенах и снижение практически до нуля эруковой кислоты в масле.

Биохимический анализ семян полученных линий выявил, что у трех из пяти линий (РЛ 3, РЛ 8, РЛ 9) содержание глюкозинолатов не превышает 0,6 %. При этом две из них (РЛ 3, РЛ 8) являются и низкоглюкозинолатными, и без-эруковыми, т.е. принадлежат к «00» типу и имеют увеличенное содержание ли-нолевой кислоты (23,7 и 20, 0 % соответственно) по сравнению со стандартом (18,5 %) и пониженное содержание линоленовой кислоты по сравнению с сортом-стандартом Ратник (9,4 %) - 8,4 и 8,1% соответственно. Помимо этого, у данных линий суммарное содержание олеиновой и линолевой кислот составляет более 80,0 %, что представляет большой интерес для селекции на качество пищевого масла. Кроме того, линия РЛ 8 отличалась повышением содержания олеиновой кислоты по сравнению с гибридом-донором с 63,1 % до 66,0 %.

Линия ГЛ 9 с содержанием эруковой кислоты 39,9 % может быть рекомендована в качестве исходного материала для селекции высокоэруковых сортов рапса для производства биотоплива, где высокое содержание эруковой кислоты важно для устойчивости топливной смеси к окислению (Дубов-ская и др., 2005).

Таким образом, полученные линии являются перспективным исходным материалом для создания высокопродуктивных линейных сортов типа «00», а также для использования в гетерозисной селекции.

ЭМБРИОКУЛЬТУРА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro

Основной задачей межвидовых и межродовых скрещиваний являлся перенос рапсу признаков крупности семян и желтой окраски семенной оболочки, а также устойчивости к альтернариозу.

Получение истинных межродовых гибридов горчицы белой с рапсом в полевых условиях затруднено. Проведенные исследования показали, что эффективность гибридизации находилась на низком уровне и достигала 1,2 % в прямом и 0,2 % в обратном скрещивании. Предполагается, что низкая завя-зываемость семян обусловлена несовместимостью пыльцы и рылец (Ripley, Arnison, 1990). Применяя культуру незрелых зародышей, удалось получить гибридные проростки (1,9 %) при использовании рапса в качестве материнской формы, в обратных скрещиваниях регенерация гибридных зародышей не отмечалась. Морфогенез осуществлялся через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов.

Скрещивания рапса ярового с горчицей сарептской в полевых условиях проходили более успешно, но эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне — 5,6 % и 1,7 % в обратных скрещиваниях.

Увеличить жизнеспособность зародышей в 1,8 раза в прямом и в 2,9 раза в обратном скрещивании удалось с применением эмбриокультуры. При использовании рапса в качестве отцовского компонента скрещивания средняя частота образования проростков (16,4 %) была в 5,3 раза больше, чем в прямых скрещиваниях (3,1 %). Кроме того, в обратных скрещиваниях было получено 33,3 % растений с гибридным морфотипом, что составило 4 растения из 12.

Таким образом, в скрещиваниях рапса с горчицей белой наиболее эффективным оказалось культивирование гибридных зародышей от прямых скрещиваний, а с горчицей сарептской - от обратных скрещиваний.

Влияние возраста зародышей и условий культивирования на процесс

регенерации

Результаты проведенных исследований показали, что на развитие незрелых зародышей в культуре in vitro оказывает влияние целый комплекс лимитирующих факторов, одним из которых является возраст эксплантов. Недифференцированные гибридные 5-дневные зародыши (ранняя глобулярная стадия) не прорастали на питательной среде ни в одной из комбинаций скрещивания. Наиболее эффективным было введение в культуру недоразвитых зародышей на 10 -17 дни после опыления.

Для скрещиваний В. napus х В. juncea наибольшее количество регенератов было получено при эксплантировании зародышей через 13 дней после опыления (25 %). В остальных комбинациях скрещивания у зародышей, изолированных на 17 день после опыления, наблюдалась наибольшая частота

регенерации как в скрещиваниях рапса ярового с горчицей белой (3,5 %), так и с горчицей сарептской (54,5 %} (рис. 4).

Комбинация скрещивания:

0 - В парт х В. juncea ^ - В. juncea * Ä napus

^ - * В. парш

® - В. парт * Sinapis alba

т - В. campeslris 4 о&госед

Количество дней после опыления

Рис. 4. Влияние возраста зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro (2005-2006 гг.)

Максимальная частота регенерации (60 %) была получена у зародышей того же возраста от скрещивания сурегтицы яровой и капусты. Данные скрещивания, как и предыдущие, также применялись для получения желтосемян-ных форм рапса посредством его рссинтеза и увеличения генетического разнообразия внутри рода Brassica. Применение эмбриокультуры в данном случае увеличило жизнеспособность гибридных зародышей, так как эффективность гибридизации была небольшой и составляла всего 3,5 %. Следовательно, на развитие оплодотворенных семязачатков в культуре in vitro большое влияние оказывал возраст экспланта.

При изучении состава питательной среды было установлено, что большое количество цнтокининов в варианте среды № 2 (6-БАП - 0,3 мг/л, кине-тин -0,1 мг/л) снижало частоту регенерации до 1,1 % и количество нормально развитых проростков - до 0,7 %.

Добавление НУК и ГК стимулировало регенерацию 4,5 % зародышей. Уменьшение концентрации 6-БАП с 0,3 до 0,2 мг/л и увеличение концентрации ГК до 0,2 мг/л позволило получить максимальное количество нормально развитых проростков (12,0 %). Оптимальным являлось содержание в составе среды 0,2 мг/л б-БАП, 0J мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

Определение светового режима показало, что незрелые зародыши в условиях культуры тканей развивались как в темноте, так и на свету. При относительно равном количестве общего числа полученных проростков (4,0 % и 4,2 % соответственно) образование нормально развитых регенерантов повышалось с 1,3 % в условиях темноты до 3,7 % на световом режиме. Проростки затем проходили этап микроразмножения, укоренения и пересадки в грунт.

Характеристика полученных гибридов

Гибриды рапса ярового и горчицы сарептской. В результате исследований было получено 16 растений, большинство из которых (69 %) имели морфологические признаки материнской формы. Как в условиях т \itro в фазе 2-3 листьев, так и взрослые растения не отличались от горчицы сарептской по окраске, волнистости и зубчатости края листа, его положению на стебле, наличию опушенности и другим признакам.

Гибриды сурепииы яровой и капусты. Растения, полученные в результате ресинтеза, принадлежали либо к материнскому, либо к промежуточному морфотипу. У гибридов доминировали такие признаки отцовской формы, как гофрированность, толщина и темно-зеленая окраска листовой пластинки. Было получено два растения, которые образовали семена, 78 % которых были невыполненными, а остальные нормальные семена имели коричневую окраску.

Гибриды рапса ярового и горчииы белой. Гибридные растения на стадии 2-3 листьев по некоторым морфологическим признакам были аналогичны горчице (отцовской форме): имели сильное опушение, среднюю степень антоциановой окраски семядолей. Данные результаты подтверждают истинность полученных гибридов.

Проведенное в полевых условиях морфологическое описание гибридов р1 горчицы белой и рапса ярового показало промежуточное наследование некоторых признаков (число долей, волнистость и зубчатость края листа изгиб верхушки листа, опушенность края первого листа). Полученные гибриды отличались большим числом ветвей первого порядка (до 12 шт.) и обильным цветением. При их скрещивании с яровым рапсом наблюдалось завязывание семян и образование стручков с промежуточной между родительскими формами длиной створки (табл. 6).

Таблица 6 - Промежуточное наследование некоторых признаков гибридов Б]

горчицы белой и рапса ярового

Признаки Brassica napus Brassica napus * Sinapis alba Sinapis alba НСРо,05

1. Семядоли: - длина, мм - ширина, мм 6,9 ± 0,27 13,8 ±0,41 7,2 ±0,13 15,9 ±0,74 7,6 ±0,71 18,1 ±0,33 0,69 0,81

2. Морфология листа: - число долей - опушенность края первого 4,5 ± 0,65 4,9 ± 0,73 5,8 ±0,17 0,34

редкая средняя густая -

листа - характер изгиба верхушки средний слабый отсутствует -

3. Опушенность стебля отсутствует слабая сильная -

4. Высота ветвления, см 47,3 ± 1,93 40,0 ± 1,13 35,4± 1,65 1,89

5. Длина створки стручка, мм 54,1 ± 0,29 17,6 ±0,67 14,7 ±0,65 1,31

Среди полученных гибридов рапса ярового и горчицы белой выявлены образцы (28 %), устойчивые к тле, на которых отмечалась наименьшая плот-

ность заселения растений (1 балл, менее 25 % поверхности листьев) наряду с растениями горчицы белой. На остальных экземплярах в зависимости от генотипа данный показатель колебался от 26—50 % (2 балла) до более 50 % (3 балла) заселенности всей поверхности листьев тлей. Предполагается, что устойчивость к тле связана с опушением гибридов, которое они унаследовали от отцовской формы (горчицы белой).

У 82,3 % гибридных семян отмечалась желтая семенная оболочка, причем среди желтоокрашенных семян были чисто желтые, с темным рубчиком и крапинками. Расщепление по окраске гибридов Fi объясняется тем, что желтую окраску семян определяет гомозиготное рецессивное состояние аллелей трех локусов, а исходные растения желтосемянного рапса, участвующего в скрещиваниях, имели сложную гибридную природу с участием ре-синтезированных форм. Необходим отбор в последующих поколениях чистых желтоокрашенных семян, дающих полностью светлосемянное потомство. Таким образом, полученный в результате проведенных исследований гибридный материал требует дальнейшего изучения и использования в селекционном процессе.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что генотип растения-донора определяет способность неоп-лодотворенных семязачатков ярового рапса к дальнейшему развитию. Более отзывчивы к индуцированию гаплоидов материалы гибридного и линейного происхождения (в среднем 4,72 и 3,85 %) по сравнению с сортами (1,67 %).

Морфологические изменения формы цветка и наличие аномальных структур при формировании мужского гаметофита можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов. Установлена прямая зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных структур. Наибольшей способностью к регенерации (1,3 %) обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2-4 мм.

2. Показано, что смесь анолита с католитом (рН=7) ускоряет развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro на 7 - 10 дней. Предобработка бутонов холодом в течение суток повышает морфоген-ную способность семязачатков до 3,1 %.

3. Гормональный состав питательных сред определяет пути морфогенеза женского гаметофита и образование морфологических структур при культивировании неоплодотворенных семязачатков ярового рапса. Установлено, что тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

Максимальный выход морфогенного каллуса достигается путём культивирования неоплодотворенных семязачатков ярового рапса на среде, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 1 мг/л ГК я 10 мг/л гидролизата казеина. Наличие в среде 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, ИУК, ГК и 1 мг/л кинетина способствует образованию максимального количества ростовых почек

(71,4 %) и регенерантов (58,8 %). Культивирование неоплодотворённых семязачатков на свету более чем в 2 раза по сравнению с условиями темноты стимулирует появление проростков.

4. Определены параметры стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Стабилизацию гаплоидов проводят одновременно с микроразмножением в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональной - ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной - ростовой -безгормональной для слабо развитых регенерантов.

Диплоидизация гаплоидного материала осуществляется путём добавления в питательную среду 0,005 % колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинетина в течение месяца.

5. Разработан метод ускоренного получения гомозиготных линий ярового рапса путем индукции гаплоидии из неоплодотворенных семязачатков, включающий следующие этапы: введение в культуру донорского материала с ценными признаками; индукция гаплоидии; стабилизация и микроразмножение гаплоидов; диплоидизация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразмножение; корнеобразование in vitro и пересадка в грунт.

6. На основе данного метода создан способ получения восстановителей фертильности ярового рапса, при котором проводят гибридизацию реституционных линий с растениями-донорами для преодоления стерильности, получение семян второго поколения гомозиготных линий, опыление форм с ЦМС пыльцой полученных реституционных линий, получение семян, их посев и анализ фертильности пыльцевых зерен.

7. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Установлены основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими максимальный уровень регенерации, являются подбор донорских растений с ценными признаками, выбор оптимального направления скрещивания, 13-17-дневный возраст зародыша, культивирование на среде, содержащей 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

8. Среди полученного в ходе применения эмбриокультуры гибридного материала выделены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой, которые могут использоваться в селекции ярового рапса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Разработанный метод получения реституционных линий ярового рапса рекомендуется широко использовать в селекции для создания нового исходного гомозиготного материала. В течение 1-1,5 лет он может обеспечить получение необходимого объема исходных форм ярового рапса с материнской цитоплазмой. Полученные в результате исследований линии рекомендуются для включения в селекционный процесс.

2. Разработанный способ ускоренного получения восстановителей фер-тильности ярового рапса рекомендовать для использования в гетерозисной селекции ярового рапса.

3. Установленные параметры культивирования незрелых зародышей, позволяющие расширить генетическую изменчивость и создать новый исходный материал с желтой семенной оболочкой, следует использовать в отдаленной гибридизации ярового рапса.

4. При разработке новых селекционных программ по ускоренному созданию нового исходного материала и высокопродуктивных гибридов рекомендуется применение разработанных для ярового рапса методов биотехнологии: эмбриокультуры и получения гомозиготных линий путем культивирования неоплодотворенных семязачатков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Котлярова Е.Б. Каплусогенез в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса / Е.Б. Котлярова, O.A. Подвигина // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. - Липецк, 2004. -Вып. 12.-С. 31-34.

2. Котлярова Е.Б. Использование метода эмбриокультуры в отдаленной гибридизации растений семейства Brassicaceae / Е.Б. Котлярова // Сборник научных трудов аспирантов и соискателей. - Липецк: ЛГПУ, 2005.-Ч. 1.-С. 134-136.

3. Котлярова Е.Б. Культура неоплодотворённых семяпочек ярового рапса in vitro / Е.Б. Котлярова // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Материалы III Международной конференции молодых ученых и специалистов (28-30 марта 2005 года). - Краснодар, ВНИИМК, 2005. - С. 151-157.

4. Котлярова Е.Б. Влияние генотипа на каллусогенез и регенерацию растений в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса / Е.Б. Котлярова // Экологическая генетика культурных растений: Материалы школы молодых учёных,- Краснодар: РАСХН, ВНИИ риса, 2005.-С. 241-242.

5. Котлярова Е.Б. Зависимость каллусогеиеза и регенерации растений ярового рапса от состава питательной среды в культуре неоплодотворённых семяпочек in vitro / Е.Б. Котлярова, O.A. Подвигина, В.А, Ни-коноренков // Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели: Материалы Международной научно-практической конференции (15-16 июля 2005 года). - Липецк, ВНИПТИР, 2005. - С. 128-134.

6. Котлярова Е.Б. Сравнение действия стерилизующих агентов в культуре неоплодотворённых семяпочек ярового рапса in vitro / Е.Б. Котлярова, O.A. Подвигина // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. - Липецк, 2005. - Вып. 13. - С. 44-46.

7. Котлярова Е.Б. Влияние направления скрещивания и сроков введения в культуру на развитие зародышей отдалённых гибридов семейства Brassi-

caceae / Е.Б. Котлярова // Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологи в высших педагогических учебных заведениях: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (26-27 января 2006 года). - Орехово-Зуево, 2006. - С. 129-133.

8. Котлярова Е.Б. Возможность создания гомозиготного материала ярового рапса в культуре неоплодотворённых семяпочек / Е.Б Котлярова // Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность: Материалы Международной научной конференции (22-24 мая 2006 года). - С.-Пб., 2006. - С. 70-72.

9. Котлярова Е.Б. Условия культивирования неоплодотворенных семяпочек ярового рапса (Brassica napus L.) для получения гаплоидных растений / Е.Б. Котлярова, O.A. Подвигина // Материалы IX Международной конференции молодых ботаников (21-26 мая 2006 года). - С.-Пб., 2006. -С. 368.

Ю.Котлярова Е.Б. Получение отдаленных гибридов семейства Brassica-сеае с помощью эмбриокультуры / Е.Б. Котлярова, E.H. Жидкова // Современные проблемы популяционной экологии: Материалы IX Международной научно-практической экологической конференции (2-5 октября 2006 года). - Белгород, 2006. - С. 67-68.

11.Котлярова Е.Б. Воздействие экзогенных факторов на индукцию гаплоидных растений ярового рапса в условиях in vitro / Е.Б. Котлярова // Вопросы естествознания: Межвузовский сборник научных работ. -Липецк, 2007. - Вып. 14. - С. 78-83.

12.Котлярова Е.Б. Метод создания гомозиготных линий ярового рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков / Е.Б. Котлярова // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Материалы III Международной конференции молодых ученых и специалистов (27-29 марта 2007 года). -Краснодар, ВНИИМК, 2007. - С. - 138-141.

13.Котлярова Е.Б. Формирование линий с помощью культуры неоплодотворенных семязачатков ярового рапса и их биохимическое изучение / Е.Б. Котлярова, В.В. Карпачев // Кормопроизводство. — 2007. - № 4. -С. 17-19.

Е.Б. Котлярова

АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ЯРОВОГО РАПСА {BRASSICA NAPUS L.)

Подписано в печать 20.03.2007 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. - 1. Тираж 100 экз. Заказ № 350.

Отпечатано в РИЦ ЛГПУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котлярова, Екатерина Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биотехнологические методы в селекции ярового рапса.

1.2. Значение гаплоидии и её использование в селекции рапса.

1.3. Применение методов in vitro в получении отдаленных гибридов у растений семейства Brassicaceae.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. ИНДУЦИРОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ИЗ НЕОПЛОДОТВОРЁННЫХ СЕМЯЗАЧАТКОВ ЯРОВОГО РАПСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

3.1. Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии.

3.1.1. Влияние генотипа на индукцию гаплоидов.

3.1.2. Маркерные признаки растений-доноров.

3.1.3 Зависимость регенерационной способности семязачатков от расположения ветвей на побеге и длины бутона.

3.2. Влияние экзогенных факторов на индукцию гаплоидии.

3.2.1. Подбор оптимального стерилизующего агента.

3.2.2. Влияние предобработки бутонов и сроков введения в культуру на индукцию гаплоидии.

3.2.3. Зависимость регенерационной способности неоплодотворённых семязачатков от условий культивирования.

3.3. Гаплоидия как ускоренный метод создания гомозиготных линий ярового рапса.

3.3.1. Формирование гаплоидных линий.

3.3.2. Процесс диплоидизации гаплоидов.

3.3.3. Метод создания гомозиготных линий ярового рапса на основе индуцирования гаплоидии.

3.3.4. Характеристика полученных реституционных линий.

4. ЭМБРИОКУЛЬТУРА В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

4.1. Влияние направления скрещивания на выживаемость гибридных зародышей в условиях in vitro.

4.2. Влияние возраста зародышей и условий культивирования на процесс регенерации.

4.3. Характеристика полученных гибридов.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ. 103 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.)"

Актуальность темы. Рапс яровой (Brassica napus L.) - ценная масличная и кормовая культура, для которой характерна высокая пластичность и приспособленность к умеренному климату. В России рапс является одной из перспективных масличных культур, увеличение объемов производства семян которой позволит полнее обеспечить население растительным маслом, животноводство - кормовым белком, а промышленность - сырьем (Карпачев, 2006).

Создание новых сортов, соответствующих требованиям современного производства, во многом зависит от разнообразия исходного материала. Достижение этого возможно не только с помощью традиционных методов селекции, но и современными методами биотехнологии, которые позволяют ускорить процесс формирования новых сортов ярового рапса в 5-10 раз.

Широкое применение в сельскохозяйственной биотехнологии нашел метод индуцирования гаплоидии в культуре репродуктивных органов. У ярового рапса достаточно подробно разработан метод культуры изолированных пыльников (Муравлёв, Кривошеева, 1999; Keller, Armstrong, 1977). Однако, для гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности необходимо сохранение материнской цитоплазмы, что возможно только с помощью культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков. Причем, растения, полученные данным методом, свободны от некоторых вирусов и нежелательных генов, передающихся по мужской линии (Бутенко, 1999).

Сведений о получении гаплоидных растений в культуре неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в доступной нам литературе не выявлено.

Кроме того, немаловажную роль в селекции рапса играет отдаленная гибридизация, так как перенос ценных генов из других видов и родов

Brassicaceae расширяет его генетический потенциал, который отличается крайней узостью.

В связи с этим актуальным в селекции рапса является применение биотехнологических методов, в том числе эмбриокультуры и гаплоидии, позволяющих расширить генетический потенциал и ускорить создание новых сортов и гибридов.

Цель работы: обосновать приемы культивирования in vitro неоплодотворённых семязачатков и незрелых зародышей в процессе создания нового исходного материала ярового рапса.

Задачи исследований:

1. Изучить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов из неоплодотворённых семязачатков и формирование реституционных линий ярового рапса.

4. Выявить ценные и хозяйственно-полезные признаки полученных реституционных линий и гибридных растений.

Научная новизна. Впервые установлено, что при культивировании неоплодотворённых семязачатков ярового рапса тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Данные наблюдения имеют теоретическое значение, так как расширяют научные представления о регуляции ростовых процессов у растений рапса при воздействии стрессовых условий культуры in vitro.

Впервые разработан метод получения гомозиготных линий рапса путем индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворённых семязачатков in vitro, позволяющий установить влияние эндо- и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии, определить оптимальные стадии развития эксплантов, выявить состав и последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации и микроразмножения гаплоидных и реституционных линий ярового рапса. Установленные параметры культивирования неоплодотворённых семязачатков ярового рапса in vitro дали возможность впервые разработать способ, позволяющий ускоренно (в 5-10 раз) получать исходный материал для гетерозисной селекции, на который подана заявка на патент «Способ получения восстановителей фертильности ярового рапса».

Впервые модифицирован состав питательной среды для получения гибридов от межвидовых и межродовых скрещиваний путем прямой регенерации из незрелых зародышей в условиях in vitro. Установлен оптимальный срок введения зародышей изучаемых отдалённых гибридов семейства Brassicaceae в культуру. Использование метода эмбриокультуры позволило получить межродовые гибриды между рапсом яровым и горчицей белой при использовании последней в качестве опылителя, что представляет определенный теоретический интерес для отдаленной гибридизации рапса.

Практическая значимость результатов исследований. С помощью культуры неоплодотворённых семязачатков получено 5 реституционных линий ярового рапса, которые были переданы в лабораторию селекции рапса ВНИПТИР и включены в её научно-исследовательскую работу.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в ВУЗах.

Апробация работы. Основные положения исследовательской работы доложены и обсуждены на школах-семинарах молодых учёных Липецкой области: «Актуальные проблемы современной науки» (Липецк, 2004), «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2005, 2006); III и IV Международных конференциях молодых учёных и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (Краснодар, 2005, 2007), школе молодых учёных «Экологическая генетика культурных растений» (Краснодар, 2005), Международной научно-практической конференции «Рапс - культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели» (Липецк, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии в высших педагогических учебных заведениях» (Орехово-Зуево, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Международной научной конференции «Проблемы биологии, экологии и образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2006), IX Международной научно-практической экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2006), на межвузовских научных конференциях преподавателей, аспирантов и студентов (Липецк, 2003 - 2006 гг.) и заседаниях Учёного совета ГНУ ВНИПТИР (Липецк, 2004 - 2007 гг.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментальное обоснование влияния эндогенных и экзогенных факторов на индукцию гаплоидии в культуре неоплодотворённых семязачатков в условиях in vitro, позволяющее ускоренно получать новый исходный материал ярового рапса.

2. Способ создания реституционных линий рапса, основанный на индукции гаплоидии из неоплодотворённых семязачатков, стабилизации, микроразмножении и диплоидизации полученных регенерантов.

4 Ценные признаки полученных гибридных растений и реституционных линий.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, 4 глав, выводов и рекомендаций для практического использования. Работа иллюстрирована 52 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 19 таблиц. Библиография включает 222 литературных источника, из которых 135 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Котлярова, Екатерина Борисовна

выводы

1. Выявлено, что генотип растения-донора определяет способность неоплодотворённых семязачатков ярового рапса к дальнейшему развитию. Более отзывчивы к индуцированию гаплоидов материалы гибридного и линейного происхождения (в среднем 4,72 и 3,85 %) по сравнению с сортами (1,67 %).

Морфологические изменения формы цветка, а также качественные признаки пыльцевых зерен можно использовать как маркерные признаки при отборе донорских генотипов для индуцирования гаплоидов рапса. Установлена прямая зависимость регенерационной способности селекционного материала от количества аномальных пыльцевых зерен. Наибольшей способностью к регенерации (1,3 %) обладают семязачатки, эксплантированные с бутонов центральной кисти основного побега ярового рапса длиной 2-4 мм.

2. Показано, что смесь анолита с католитом (рН=7) ускоряет развитие неоплодотворённых семязачатков ярового рапса в культуре in vitro на 7 - 10 дней. Предобработка бутонов холодом в течение суток повышает морфогенную способность семязачатков до 3,1 %.

3. Гормональный состав питательных сред определяет пути морфогенеза женского гаметофита и образование морфологических структур при культивировании неоплодотворённых семязачатков ярового рапса. Установлено, что тотипотентность клеток каллуса различается, и реализация морфогенеза происходит по пути гистогенеза и органогенеза, приводящего к формированию ростовых почек и корней.

Максимальный выход морфогенного каллуса достигается путём культивирования неоплодотворённых семязачатков ярового рапса на среде, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 1 мг/л ГК и 10 мг/л гидролизата казеина. Наличие в среде 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, ИУК, ГК и 1 мг/л кинетина способствует образованию максимального количества ростовых почек (71,4 %) и регенерантов (58,8 %). Культивирование неоплодотворённых семязачатков на свету более чем в 2 раза по сравнению с условиями темноты стимулирует появление проростков.

4. Определены параметры стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Стабилизацию гаплоидов проводят одновременно с микроразмножением в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) -безгормональной - ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной - ростовой - безгормональной для слабо развитых регенерантов.

5. Разработан метод получения гомозиготных линий ярового рапса путем индукции гаплоидии из неоплодотворённых семязачатков, включающий следующие этапы: введение в культуру донорского материала с ценными признаками; индукция гаплоидии; стабилизация и микроразмножение гаплоидов; диплоидизация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразмножение; корнеобразование in vitro и пересадка в грунт. На основе данного метода разработан способ получения восстановителей фертильности ярового рапса, при котором проводят гибридизацию реституционных линий с растениями-донорами для преодоления стерильности, получение семян второго поколения гомозиготных линий, опыление форм с ЦМС пыльцой полученных реституционных линий, получение семян, посев их в почву и анализ фертильности пыльцевых зерен.

6. В культуре незрелых зародышей морфогенез осуществляется через прямую регенерацию, ведущую к формированию ростовых побегов. Установлены основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими максимальный уровень регенерации, являются подбор донорских растений с ценными признаками, выбор оптимального направления скрещивания, 13-17-дневный возраст зародыша, культивирование на среде, содержащей 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

7. Среди полученного в ходе применения эмбриокультуры гибридного материала выделены образцы, устойчивые к тле и с желтой семенной оболочкой, которые могут использоваться в селекции ярового рапса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

2. Разработанный способ ускоренного получения восстановителей фертильности ярового рапса рекомендовать для использования в гетерозисной селекции ярового рапса.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Котлярова, Екатерина Борисовна, Липецк

1. Артемов И.В. Рапс масличная и кормовая культура / И.В. Артемов, В.В. Карпачев. - Липецк: Ориус, 2006. - 143 с.

2. Атабекова А.И. Цитология растений / А.И. Атабекова, Е. И. Устинова. М.: «Агропромиздат», 1987. - 246 с.

3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве / А. Атанасов. -Новосибирск, 1993.-241 с.

4. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно: Атлас / Т.Б. Батыгина. Л.: Наука, 1987. -103 с.

5. Белик Н.Л. Биологические основы технологии возделывания рапса ярового и редьки масличной в Центральном Черноземье: Автореф. дис. доктора с.-х. наук / Н.Л. Белик. Москва, 2003. - 41 с.

6. Биология развития растений / Под ред. М.Х. Чайлахяна. М.: Наука, 1975.-230 с.

7. Ю.Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В.И. Негрука / Под ред. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989. - 280 с.

8. Бочкарева Э.Б. Генетические ресурсы озимого и ярового рапса во ВНИИМК / Э.Б. Бочкарева, С.Л. Горлов, В.В. Сердюк // Рапс -культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. Липецк, 2005. - С. 23-27.

9. Бугара A.M. Культура неоплодотворённых завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений / A.M. Бугара, Л.В. Русина // Физиология и биохимия культурных растений. 1988. - Т. 20, № 5. -С. 419-430.

10. Бугара A.M. Гаплоидный каллусогенез в культуре неоплодотворённых семяпочек шалфея мускатного / A.M. Бугара, Л.В. Русина // Физиология и биохимия культурных растений. 1989. - Т. 20, № 6. -С. 554-560.

11. Бутенко Р.Г. Культура изолированных клеток и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272 с.

12. Бутенко Р.Г. Культура изолированных органов, тканей и клеток растений / Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1970. - 342 с.

13. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. -М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

14. Гончаров С.В. О перспективах рапса на рынке масличных культур / С.В. Гончаров, Н.В. Королькова // Рапс культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. - Липецк: ВНИПТИР, 2005. - С. 18-22.

15. Горлов С.Л. Состояние, перспективы и научное обеспечение производства рапса в РФ / С.Л. Горлов, Э.Б. Бочкарева // Рапс: масло, белок, биодизель: материалы междунар. научно-практ. конф., 25-27 сент. 2006., г. Жодино. Минск, 2006. - С. 21 - 28.

16. Горшков В.И. Результаты испытания сортов ярового рапса в условиях лесостепи ЦЧР / В.И. Горшков, В.В. Карпачев // Рапс культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. - Липецк: ВНИПТИР, 2005. - С. 66-74.

17. Гусаковская М.А. Гиногенез в культуре неоплодотворённых завязей и семяпочек пшеницы / М.А. Гусаковская, М.А. Наджар // Ботанический журнал. 1994. - Т. 79, № 1. - С. 70-79.

18. Давоян Э.И. Получение гаплоидов у риса методом культивирования неоплодотворённых завязей в условиях in vitro / Э.И. Давоян // Доклады ВАСХНИЛ. 1985. -Вып. 3. - С. 15-16.

19. Демьянчук Г.Т. Оценка селекционного материала рапса и сурепицы на содержание эруковой кислоты и глюкозинолатов. Методические указания. / Г.Т. Демьянчук, Мельник М.В., Лысюк В.И., Микитин Н.С. М.: РАСХН, 1988.- 16 с.

20. Домблидес А.С. Разработка лабораторной технологии получения гиногенных растений моркови in vitro: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / А.С. Домблидес. Москва, 2001. - 23 с.

21. ЗЬДубовская А.Г. Исходный материал для селекции сортов и гибридов яровых рапса и сурепицы масличного направления: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / А.Г. Дубовская. Санкт-Петербург, 1993. - 18 с.

22. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 208 с.

23. Жидкова Е.Н. Использование культуры in vitro для получения ресинтезированных форм рапса / Е.Н. Жидкова, А.А. Муравлев // Науч. техн. бюл. ВНИИР им. Н. И. Вавилова. - 1993. - Т. 230. - С. 30.

24. Жидкова Е.Н. Получение ресинтезированных форм ярового рапса с целью селекции на желтосемянность и жирнокислотность масла / Е.Н. Жидкова, В.В. Карпачев // Сельскохозяйственная биология. 1996. -№ 5:-С. 123-125.

25. Жидкова Е. Н. Теоретические и практические аспекты отдалённой гибридизации рапса / Е.Н. Жидкова // Генетика. 1997. - Т. 33, № 1. -С. 5 -11.

26. Жидкова Е.Н. Новый источник ЦМС для селекции рапса / Е.Н. Жидкова, В.В. Карпачев, В.А. Никоноренков // Селекция и семеноводство. 1997. - № 2. - С. 52.

27. Жидкова Е.Н. Использование межвидовой гибридизации и мутагенеза в получении желтосемянного ярового рапса / Е.Н. Жидкова, В.В. Карпачев // Вопросы естествознания. Липецк, 1999. - Вып.7. - С 86-88.

28. Жидкова Е.Н. Получение желтосемянного ярового рапса во ВНИПТИР / Е.Н. Жидкова, А.А. Муравлев // Рапс культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. - Липецк: ВНИПТИР, 2005. - С. 92-93.

29. Жидкова Е.Н. Морфологическое изучение гибридов рапса ярового и горчицы белой / Е.Н. Жидкова, С.А. Шапошникова // Рапс культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. - Липецк: ВНИПТИР, 2005. - С. 94-100.

30. Знаменская В.В. Принципы и методы создания и поддержания исходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. доктора с.-х. наук / В.В. Знаменская. Воронеж, 1999. - 40 с.

31. Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты / Под ред. М.С. Бунина. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. - 44 с.

32. Кавецкая А.А. Цитоэмбриологические исследования рапса: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / А.А. Кавецкая. Киев, 1960. - 16 с.

33. Калинин А.В. Каллусогенез в культуре неоплодотворённых семяпочек картофеля / А.В. Калинин // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тезисы докл. междунар. конф., 2-6 авг. 1988 г., Новосибирск. Новосибирск, 1988. - Т. 2. - С. 206-207.

34. Карпачев В.В. Рапс в России (состояние и перспективы) / В.В. Карпачев // Рапс: масло, белок, биодизель: материалы междунар. науч-практ. конф., 25-27 сент. 2006., г. Жодино. Минск, 2006. - С. 11 - 21.

35. Карпеченко Г.Д. Полиплоидные гибриды Raphanus sativus L. х Brassica napus L. / Г.Д. Карпеченко // Труды по прикладной ботанике. 1927. -№ 17.-С. 305-310.

36. Кефели В.И. Рост растений / В.И. Кефели; Под ред. М.Х. Чайлахяна. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1984. - 175 с.

37. Корнейчук В.А. Классификатор вида Brassica napus L. (рапс) / В.А. Корнейчук. Л.: ВИР, 1983. - 20 с.

38. Муравлёв А.А. Методические рекомендации по получению андроклинных растений ярового рапса / А.А. Муравлёв, О.Г. Кривошеева. М.: РАСХН, 1999. - 23 с.

39. Никитина Н.И. Эмбриоидогенез в культуре пыльников рапса и получение гаплоидных растений / Н.И. Никитина, Т.С. Федоренко, А.Н. Боровков // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. - № 9. - С. 13-16.

40. Павлова М.К. Культура неоплодотворённых завязей и семяпочек: возможности и перспективы / М.К. Павлова // Сельскохозяйственная биология. 1987. - № 1. - С. 27-33.

41. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. М.: Агропромиздат, 1988.-271 с.

42. Першина JI.A. Проблемы использования методов in vitro при отдалённой гибридизации злаков / JI.A. Першина, В.К. Шумный // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991.-С. 102-114.

43. Подвигина О.А. Индуцирование гаплоидии у сахарной свеклы: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / О.А. Подвигина. Рамонь, 1994. - 18 с.

44. Подвигина О.А. Теоретическое обоснование и приёмы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. доктора с.-х. наук / О.А. Подвигина. Воронеж, 2003. - 44 с.

45. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография / А.В. Поляков. Тверь, 2000. - 180 с.

46. Поляков И .Я. Фитосанитарная диагностика в интегрированной защите растений / И.Я. Поляков, М.М. Левитин, В.И. Танский. М.: Колос, 1995.-208 с.

47. Потапов Д.А. Инбридинг как метод генотипической дифференциации исходного материала при создании «000»-форм ярового рапса / Д.А. Потапов // Сельскохозяйственная биология. 2004, № 3. - С. 76-79.

48. Пустовойт B.C. Руководство по селекции и семеноводству масличных культур / B.C. Пустовойт. М.: Колос, 1967. - 351с.

49. Рапс озимый и яровой (практическое руководство по освоению интенсивной технологии возделывания) / Под ред. Ю.П. Бурякова М.: Гос. агропромышл. комитет СССР, 1988. - 43 с.

50. Рафаилова Е. Влияние генотипа на развитие изолированных in vitro неоплодотворённых семяпочек сахарной свеклы / Е. Рафаилова, Ц. Кикиндонов, Р. Петрова // Раст. науки. 1997. - Т. 34, № 7-8. - С. 13-15.

51. Рахимбаев И.Р. Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков (обзор) / И.Р. Рахимбаев, Ш. Тивари, Б.Р. Кударов // Сельскохозяйственная биология. 1990. - № 3. - С. 44-55.

52. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин и др.; Под ред. B.C. Шевелухи 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ВШ, 2003. - 469 с.

53. Славова И.В. Получение гаплоидных растений из неоплодотворённых семяпочек сахарной свёклы В. vulgaris в условиях in vitro / И.В. Славова, Е.Г. Рафаилова // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Мир, 1991 -С. 157-162.

54. Таратонов Н.А. Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенерантов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / Н.А. Таратонов. Рамонь, 1999. -28с.

55. Титова И.В. Включение методов культуры in vitro в процесс создания исходного материала при межвидовой гибридизации лука / И.В.Титова // Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новосибирск, 1988.-Т. 2.-С. 233.

56. Тодераш Л.Г. Использование культуры in vitro зародышей томата в селекции растений / Л.Г. Тодераш // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тезисы докл. междунар. конф., 2-6 авг. 1988 г., Новосибирск. Новосибирск, 1988. - Т. 2. - С. 238-239.

57. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: Научное и прикладное значение / B.C. Тырнов. -М.: Наука, 1998. 53 с.

58. Тюкавин Г.Б. Культура неопылённых семяпочек моркови / Г.Б. Тюкавин, Н.А. Шмыкова // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Труды междунар. научно-практ. конф., 24-27 июля 2000 г., Москва,- М., 2000. Т. 2. - С. 275-277.

59. Akbar М.А. Resynthesis of Brassica napus for earliness and daylength iinsensitivity / M.A. Akbar // Dissertation. Uppsala. - 1987. - 75 p.

60. Agnihotri A. Production of Eruca Brassica hybrids by embryo rescue / A. Agnihotri, V. Gupta, M.S. Laksiimikumaran, K.R. Shivanna, S. Prakash, V. Jagannathan // Plant. Breed. - 1990. - Vol. 104, № 4. - P. 281 - 289.

61. Ao G. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated ovaries of corn (Zea mays L.) / G. Ao, S. Zhao, G. Li // Acta Genet. Sinica. 1982. -№9.-P. 281-283.

62. Arnison P.G. Genotype-specific response of cultured broccoloi (Brassica oleracea var. italica) anthers to cytokinins / P.G. Arnison, P. Donaldson, A. Jackson, C. Semple, W.A. Keller // Plant. Cell Tiss. Org. Cult. 1990. -Vol. 20.-P. 217-222.

63. Ayotte R. The transfer of triazine resistance from B. napus to B. oleracea L. I. Production of hybrids through embryo culture / R. Ayotte, P.M. Harney, V. Souza Machado // Euphytica. 1987. - Vol. 36. - P. 615 - 624.

64. Banga S.S. Spontaneous haploidy in Brassica napus / S.S. Banga, K.S. Labana // Cruciferae Newsl. 1986. - № 11. - P. 54-55.

65. Baillie A.M.K. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris / A.M.K. Baillie, D.J. Epp, D. Hutcheson, W.A. Keller / Plant Cell Rep. 1992. - Vol. 11. - P. 234-237.

66. Bajaj Y.P.S. Interspecific hybridization of Brassica napus and B. juncea through ovary, ovule and embryo culture / Y.P.S Bajaj, S.K. Mahajan, K.S. Labana // Euphytica. 1986. - Vol. 35. - P. 103-109.

67. Batra V. Intergeneric hybridization between Diplotaxis siifolia, a wild species and crop brassicas / V. Batra, S. Prakash, K.R. Shivanna // Theor. Appl. Gen. 1990. - Vol. 80, № 4. - P. 537 - 541.

68. Brown J. Intergeneric hybridization between Sinapis alba and Brassica napus / J. Brown, A. P. Brown, J. B. Davis, D. Erickson // Euphytica. -1997. Vol. 93, № 2. - P. 163 - 168.

69. Bundgaard P.G. Selection in protoplast culture of Brassica napus resistant to toxins from Alternaria brassicae / P.G. Bundgaard, L. Buchwaldt // GCIRC Bull.-1989.-№4.-P. 20.

70. Burnett L. Embryogenesis and plant regeneration from isolated microspores of Brassica rapa L. ssp. oleifera / L. Burnett, S. Yarrow, B. Huang // Plant Cell Rep. 1992. - Vol. 11. - P. 215-218.

71. Campion B. Induction of haploid plants in onion (Allium сера L.) by in vitro / B. Campion, C. Alloni // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1990. -Vol. 20, № l.-P. 1-6

72. Chekurov V.M. Effect of inbreeding and grouth regulators on the in vitro androgenesis of wheatgrass, Agropyron glaucum / V.M. Chekurov, E.P. Razmakhnin // Plant Breed. 1999. - Vol. 118, № 6. - C. 571-573.

73. Chuong P.V. Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus / P.V. Chuong, C. Deslauriers, L.S. Ott, W.D. Beversdorf// Can. J. Bot. 1988. - Vol. 66. - P. 1653-1657.

74. Darrorez G. La selection du colza / G. Darrorez // Cultivar. 1981. -№ 151.-P. 16-17.

75. Delounne R. Intergeneric hybridization of Diplotaxis erucoides with B. napus. I. Cytogenetic analysis of Fj and BCj progeny / R. Delounne, F. Eber, A.M. Chevre // Euphytica. 1989. - Vol. 41, № 1-2. - P. 123 - 128.

76. Diederichsen E. The use of ovule culture in reciprocal hybridization between B. campestris L. and B. oleracea L. / E. Diederichsen, M.D. Sacristan // Plant Breeding. 1994. - Vol. 113. - P. 79 - 82.

77. Dietert M.F. Effects of genotype on in vitro culture in genus Brassica / M.F. Dietert, S.A. Barron, O.C. Joder // Plant Sci. Letters. 1982. - Vol. 26.-P. 233-240.

78. Duijs J.G. Microspore culture is successful in most crop types of Brassica oleracea L. / J.G. Duijs, R.E. Voorrips, D.L. Visser, J.B.M. Custers // Euphytica. 1992. - Vol. 60. - P. 45-55.

79. Dunwell J.M. Induction and growth of microspore-derived embryos of Brassica napus ssp. oleifera / J.M. Dunwell, M. Cornish, A.G.L. Decourcel, J.E. Middlefell-Williams // J. Exp. Botany. 1983. - Vol. 34, № 149. - P. 1768-1778.

80. Dunwell J.M. Anther and о vary culture / J.M. Dunwell // Cereal Tissue and Cell Culture / S.W.J. Bright, M.G.K. Jones (ed.). 1985. - Ch. 1. -P. 1-44.

81. Dunwell J.M. Influence of preculture variables on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera cv. Duplo / J.M. Dunwell, M. Cornish // Annals of Botany. 1985. - № 56. - P. 281-289.

82. Dunwell J.M. Role of sucrose in microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera / J.M. Dunwell, N. Thurling // J. Exptl. Bot. -1985.-Vol. 36.- P. 1478-1491.

83. Frandsen K.J. The experimental formation of Brassica napus L. var. oleifera DC. and Brassica carinata Braun / K.J. Frandsen // Dansk Bot. Arkiv. 1947. - Vol. 12. - P. 1 -16.

84. Gamborg O.L. Nutrient reguirentes of suspension cultures of soybean root cells / O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima // Exp. Cell Res. 1968. -Vol. 50.-P. 151-158.

85. Gemesne J.A. In vitro ginogenesis induction in Hungarian lines of onion (Allium сера L.) / J.A. Gemesne, L. Martinovich // Zoldsegtermesztesi kut. intez. bull. 1995. - Vol. 27. - C. 37-43.

86. Gerdemann-Knoerck M., Utilization of asymmetric somatic hybridization for the transfer of disease resistance from Brassica nigra to Brassica napus / M. Gerdemann-Knoerck, M.D. Sacristan, C. Braatz, O. Scheider//Plant Breed.-1994.-Vol. 113.-P. 106-113.

87. Gland A. Gehalt und Muster der Glucosinolate in Samen von resynthetisierten Rapsformen / A. Gland // Z. Pflanzenzucht. 1982. - Vol. 88.-P. 242 -254.

88. Gland A. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore culture of Brassica napus L. / A. Gland, R. Lichter, H.-G. Schweiger//Plant Physiol.- 1988.-Vol. 132.-P. 613-617.

89. Gowers S. Intercrossing Brassica napus and B. oleracea to introgress characters from kale to rape / S. Gowers, M.C. Christey // 10th Int. Rapeseed Congress. Canberra, 1999. - P. 1147-1149.

90. Goyal R.K. Development of fertile Brassica juncea x B. tournefortii hybrids through embryo rescue / R.K. Goyal, J.B. Chowdhury, R.K. Jain // Cruciferae Newslett. Eucarpia. 1997. - Vol. 19. - P. 19 - 20.

91. Gyulai G. Biotechnology of rapeseed (Brassica napus L.) / G. Gyulai, E. Kiss, L.E. Heszky // Acta Agronomica Hungarica. 1992. - Vol. 41, № 3-4.-P. 277-287.

92. Hansen N.J.P. In vitro chromosome doubling with colchicines during microspore culture in wheat (Triticum aestivum L.) / N.J.P. Hansen, S.B. Andersen // Euphitica. 1998. - Vol. 102, № 1. - P. 101 - 108.

93. Hosemans D. Induction of haploid plant from in vitro culture of unpollinated beet ovules (Beta vulgaris L.) / D. Hosemans, D. Bossoutrot // Z. Pflanzenzucht. 1983. - Vol. 91, № 1. - S. 74-77.

94. Hossain M.M. Intergeneric and interspecific hybrids through in vitro ovule culture in the Cruciferae / M.M. Hossain, H. Inden, T. Asahira // Plant Sci. 1988. -Vol. 58, № l.-P. 121-128.

95. Hossain M.M. In vitro ovule culture of intergeneric hybrids between Brassica oleracea and Raphanus sativus / M.M. Hossain, H. Inden, T. Asahira// Sci. hort. (Neth.). 1990. - Vol. 41, № 3. p. 181 - 188.

96. Huang Q.T. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young flowers in Hordeum vulgare L. / Q.T. Huang, H.Y. Yang, C. Zhou // Acta Bot. Sinica. 1982. - Vol. 24, № 3. - P. 295-300.

97. Inomata N. In vitro culture of ovaries of Brassica hybrids between 2x and 4x. I. Culture medium / N. Inomata // Jpn. J. Breed. 1968. - Vol. 18. -P. 139-148.

98. Inomata N. Interspecific hybrids between Brassica campestris and B. cretica by ovary culture in vitro / N. Inomata // Cruciferae Newslett. Eucarpia.- 1985.-Vol. 10.-P. 92-93.

99. Inomata N. Interspecific hybrids between Brassica campestris and B. bourgeaui by ovary culture in vitro/ N. Inomata // Cruciferae Newslett. Eucarpia. 1986. - Vol. 11.-P. 14-15.

100. Inomata N. Interspecific hybrids between Brassica campestris and B. montana by ovary culture in vitro/ N. Inomata // Cruciferae Newslett. Eucarpia. 1987. - Vol. 12. -P. 8 - 9.

101. Jain R.K. Genotypic and media effects on plant regeneration from cotyledon explant cultures of some Brassica species / R.K. Jain, J.B. Ghowdhury, D.R. Sharma, W. Friedt // Plant Cell Tissue Organ Cult. -1988.-Vol. 14.-P. 197-206.

102. Kameya T. Induction of haploid plants from pollen grains of Brassica / T. Kameya, K. Hinata // Jpn. J. Breed. 1970. - Vol. 20, № 2. - P. 82-87.

103. Keller J. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flower buds in some species of the genus Allium and haploid induction via ginogenesis inonion {Allium сера L.) / J. Keller // Euphytica. 1990. - Vol. 47, № 3. - P. 241-247.

104. Keller W.A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campestris / W.A. Keller, T. Rajhathu, J. Lacapra // Can. J. Genet. Cytol. -1975.-Vol. 17.-P. 655-666.

105. Keller W.A. Embryogenesis and plant regeneration in B. napus anther culture / W.A. Keller, K.C. Armstrong // Can. J. Bot. 1977. - Vol. 55, № 10.-P. 1383-1388.

106. Keller W.A. High frequency production of microspore derived plant from Brassica napus anther cultures / W.A. Keller, K.C. Armstrong // Z. Pflanzenzuchtg. 1978. - Vol. 80. - P. 100-108.

107. Keller W. A. Stimulation of embryogenesis and haploid production in Brassica campestris anther cultures by elevated temperature treatments / W.A. Keller, K.C. Armstrong // Theor. Appl. Genet. 1979. - Vol. 55. - P. 65 - 67.

108. Klimaszewska K. The production of haploids from Brassica hirta Moench (Sinapis alba L.) anther cultures / K. Klimaszewska, W.A. Keller I I Z. Pflanzenphysiol. 1983. - Vol. 109, № 3. - P. 235-241.

109. Komatsu Y. Investigations on the progeny of haploid plants and embryo sac formation by diploid and haploid plants of Brassica napus / Y. Komatsu // Proc. Crop. Sci. Soc. Japan. 1936. - Vol. 8. - P. 364-372.

110. Kudou R. Raising of Brassica interspecific hybrids by embryo culture / R. Kudou, Y. Fujime, N. Fukada // Acta Hort. 1995. - Vol. 392, № 87 - P. 96.

111. Kuo C.S. The preliminary studies on culture of unfertilized ovary of rice in vitro / C.S. Kuo // Acta Bot. Sinica. 1982. - Vol. 24, № 1. - P. 33-38.

112. Kuriyama H. Studies on the haploid plant of Brassica carinata / H. Kuriyama, Y. Watanabe // Jpn. J. Breed. 1955. - Vol. 5. - P. 1-5.

113. Leelavathi S. Somatic cell genetic studies in Brassica species. II. Production of androgenetic haploid plants in Brassica nigra (L.) Koch. / S. Leelavathi, V.S. Reddy, S.K. Sen // Euphytica. -1987. Vol. 36. - P. 215-219.

114. Lichter R. Anther culture of Brassica napus in a liquid culture medium / R. Lichter // Z. Pflanzenphysiol. 1981. - Vol. 103. - P. 229 - 237

115. Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus / R. Lichter // Z. Pflanzenphysiol. 1982. - Vol. 105. - P. 427-434.

116. Lillo C. Anther culture of cabbage. Influence of growth temperature of donor plants and medie composition on embryo yield and regeneration / C. Lillo, M. Hansen//Norw. J. Agr. Sci. 1987.-Vol. l.-P. 105-109.

117. Loh C.S. Cytokinins and the regeneration of plantlets from secondary embryoids of winter oilseed rape, Brassica napus ssp. oleifera / C.S. Loh, Ingram D.S. // New Phytol. 1983. - Vol. 95. - P. 349-358.

118. Loh C.S. The response of haploid secondary embryoids and secondary embryogenic tissues of winter oilseed rape to treatment with colchicine / C.S. Loh, Ingram D.S. // New Phytol. 1983. - Vol. 95. - P. 359-366.

119. MacDonald M.V. Mutagenesis and haploid culture for disease resistance in Brassica napus / M.V. MacDonald, I. Ahmad, D.S. Ingram // Xll Eucarpia Congr. Gottingen. 1989. - P. 22-27.

120. Mamar A. Production de plantes haploids de Gerbera jamesanii par culture in vitro d'ovules / A. Mamar // Can. J. Bot. 1986. - Vol. 64, № 10. - P. 2355-2357.

121. Mathias R. Improved embryo rescue technique for intergeneric hybridization between Sinapis species and Brassica napus / R. Mathias // Cruciferae Newslett. Eucarpia, 1991. - Vol. 14/15. - P. 90 - 91.

122. Meynet J. Possibilities of obtainment and utilization of doubled haploids in Gerbera / J. Meynet // «Gen. Manipulat. Plant Breed.», Proc. Int. Symp., Berlin (West), Sept. 8-13,1985.-Berlin, New York, 1986.-P. 319-321.

123. Mohapatra D. Hybridization in Brassica juncea X B. campestris through ovary culture / D. Mohapatra, Y.P.S. Bajaj // Euphytica. 1988. -Vol. 37,№1.-P. 83 -88.

124. Momotaz A. Production of intergeneric hybrids between Brassica and Sinapis species by means of embryo rescue techniques / A. Momotaz, M. Kato, F. Kakihara // Euphytica. 1998. - Vol. 103. - P. 123 - 130.

125. Morinaga T. Karyological studies on a spontaneous haploid mutant of Brassica napella / T. Morinaga, E. Fukushima // Cytologia. 1933. - Vol. 4. -P. 457-460.

126. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Plant Physiol. 1962. -Vol. 15.-P. 473-497.

127. Naleczynska A., Cegielska T. Dihaploid production in Brassica napus L. by in vitro androgenesis / A. Naleczynska, T. Cegielska // Genet. Pollen.- 1985. Vol. 25, № 3. - P. 271 - 276.

128. Nishi S. Studies on the embryo culture in vegetable crops. III. On the condition affect to embryoculture of interspecefic hybrids between cabbage and Chinese cabbage / S. Nishi, M. Toda, T. Toyoda // Bull. Hort. Res. Sta.- 1970. -A, №9. -p. 75- 100.

129. Ockendon D. J. Anther culture in Brussels sprouts {Brassica oleracea var. gemmifera). II. Effect of donor genotype on embryo yields / D. J. Ockendon // Ann. Appl. Biol. 1985. - Vol. 107. - P. 101 -104.

130. Ockendon D. J. The ploidy of plants obtained from anther culture of cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) / D. J. Ockendon // Ann. Appl. Biol. 1988. - Vol. 113, № 2. - P. 319 - 325.

131. Olsson G. Undersokning av sjalvfertiliteten hos artificiell raps (Investigation of self compatibility of artificial rapeseed) / G. Olsson // Kungl. Lantbr. Akad. Tidskr. 1953. - Vol. 92. - P. 394 - 402.

132. Olsson G. Investigation on a haploid rape / G. Olsson, A. Hagberg // Hereditas. 1955. - Vol. 41. - P. 227-237.

133. Olsson G. Species crosses within the genus Brassica. I. Artificial Brassica juncea Coss. / G. Olsson // Hereditas. 1960. - Vol. 46. - P. 171 - 222.

134. Osolink B. Stimulation of androgenesis in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) anthers by low temperature and anther dissection / B. Osolink, B. Bohancec, S. Jelaska // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1993. - Vol. 32.-P. 241-246.

135. Ozminkowski R.H. Comparing the resynthesis of Brassica napus L. by interspecific somatic and sexual hybridization 1. Producing and identifying hybrids / R.H. Ozminkowski, P. Jourdan // J. Am. Soc. Hortic. Sc. 1994. -Vol. 119,№4.-P. 808-815.

136. Palmer C.E. Experimental haploidy in Brassica species / C.E. Palmer, W.A. Keller, P.G. Arnison // In vitro haploid production in higher plants. -1996.-Vol. 2.-P. 143-172.

137. Paulmann W. Effective transfer of cytoplasmic male sterility from radish (Raphanus sativus L.) to rape (Brassica napus L.) / W. Paulmann, G. Robbelen // Plant Breed. 1988. - Vol. 100, № 4. - P. 299 - 309.

138. Phippen C. Genotype, plant, bud size and media factors affecting anther culture of cauliflowers (Brassica oleacea var. botrytis) I C. Phippen, D.J. Ockendon // Theor. Appl. Genet. 1990. - Vol. 79, № 1. - P. 33-38.

139. Prakash S. Haploidy in Brassica nigra Koch. / S. Prakash // Euphytica. 1973. - Vol. 22. - P. 613-614.

140. Prakash S. Haploid meiosis and origin of Brassica tournefortii Gouan. / S. Prakash // Euphytica. 1974. - Vol. 23. - P. 591-595.

141. Primard C. Interspecific somatic hybridization between Brassica napus L. and Brassica hirta {Sinapis alba L.) / C. Primard, F. Vedel, C. Mathieu // Theor. Appl. Gen. 1988. - Vol. 75, № 4. - P. 546 - 552.

142. Quazi M.H. Interspecific hybrids between Brassica napus L. and B. oleracea L. by embryo culture / M.H. Quazi // Theor. Appl. Gen. 1988. -Vol. 75, №2.-P. 309-318.

143. Ramanujam S. A haploid plant in Toria {Brassica campestris) / S. Ramanujam // Proc. Indian Acad. Sci. B. 1941.-Vol. 14.-P. 25-34.

144. Rangan T.S. Ovary, ovule, and nucellus culture / T.S. Rangan // Experimental embryology of vascular plants. 1982. - P. 105 - 129.

145. Ripley Van L. Hybridization of Sinapis alba L. and. Brassica napus L. via embiyo rescue / Van L. Ripley, P.G. Arnison // Plant Breed. 1990. - Vol. 104,№ l.-P. 26-33.

146. Robers M. B. Cytogenetics of Eruca sativa / Brassica rapa hybrids produced by embryo rescue / M. B. Robers, P. H. Williams, Т. C. Osborn // Cruciferae Newslett. Eucarpia. 1999. - Vol. 21. - P. 41 - 42.

147. Robbelen G. Breeding for low content of glucosinolates in rapeseed / G. Robbelen // Prod, and utilisat. of protein in oilseed crops. -1981. Vol. 5. -P. 91-106.

148. Rongbai L. Development of a technique for in vitro unpollinated ovary culture in rice, Oryza sativa L. / L. Rongbai, M.P. Pandey, G.K. Garg, S.K. Pandey, Dwivedi D.K. // Euphytica. 1998. - Vol. 104, № 3. - P. 159-166.

149. Roulund N. Effect of genotype, environment an carbohydrate on anther culture response in head cabbage {Brassica oleracea L. convar. capitata Alef.) / N. Roulund, L. Hansted, S.B. Anderson, B. Farestveit // Euphytica. 1990. - Vol. 49. - P. 237-242.

150. Roulund N. Optimal concentration of sucrose for head cabbage {Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef.) anther culture / N.

151. Roulund, S.B. Andersen, B. Farestveit // Euphytica. 1991. - Vol. 52, № 2. -P. 125-129.

152. Rudorf W. Uber die erzeugung und die eigenschaften synthetischer Rapsformen / W. Rudorf// Zschr. Pf. Zucht. 1950. - Vol. 29. - P. 35 - 54.

153. Sacristan M.D. Different behavior of Brassica juncea and Brassica carinata as sources of Phoma lingam resistance in experiments of interspecific transfer to B. napus / M.D. Sacristan, M. Gerdemann // Plant Breed. 1986. -Vol. 97,№4.-P. 304-314.

154. San Noeum L.H. Haploids d'Hordeum vulgare L. par culture in vitro d'ovaries non fecondes / L.H. San Noeum // Annual Amelior. Plantes. -1976. Vol. 26, № 4. - P. 751-754.

155. Sarashima M. Intergeneric hybridization between Brassica oleracea and Raphanus sativu by embryo culture / M. Sarashima, Y. Matsuzawa, T. Kimura // Cruciferae Newslett. Eucarpia, 1980. - Vol. 5. - P. 25.

156. Sarmah B.K. Diplotaxis tenuisiliqua x Brassica campestris hybrids obtained by embryo rescue / B.K. Sarmah, N. Sarla // Indian J. Genet. PI. Breed. 1998. - Vol. 58. - P. 35 - 39.

157. Scoog F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / F. Scoog, C.O. Miller // Sym. Exper. Biol. 1957. -Vol. 11.-P. 118.

158. Seguin-Swartz G. Anther culture in Brassica campestris / G. Seguin-Swartz, D.S. Hutheson, R.K. Downey // Proc. 6th Intl. Rapeseed Congr., Paris.- 1983.-P. 246-251.

159. Sharma K.K. Microspore embryogenesis in anther cultures of two indian cultivars of Brassica juncea (L.) Czern. / K.K. Sharma, S.S. Bhojwani // Plant. Cell Tissue Organ Cult. 1985. - Vol. 4. - P. 235-239.

160. Sharma K.K. In vitro regeneration of shoot buds and plantlets from seedling root segments of Brassica napus L. / K.K. Sharma, T.A. Thorpe // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1989.-Vol. 18.-P. 129-141.

161. Sjodin С. Brassica naponigra, a somatic hybrid resistant to Phoma lingam / C. Sjodin, K. Glimelius // Theor. Appl. Gen. 1989. - Vol. 77, № 5.-P. 651 -656.

162. Starzycki M. Production of B. carinata x B. campestris hybrids from crosses made in field and greenhouse conditions using in vitro embryo culture / M. Starzycki, J. Krzymanski // 7th Int. Rapeseed Congress. -Poznan, 1987. -Vol. 2. P. 421 - 422.

163. Svirshchevskaya A.M. Production and performance of gynogenetic sugar beet lines / A.M. Svirshchevskaya, J. Dolezel // J. Sugar Beet Res. -2000.-Vol. 37, №4.-P. 117-133.

164. Takahata Y. Intergeneric (intersubtribe) hybridization between Moricandia arvensis and Brassica A and В genome species by ovary culture / Y. Takahata, T. Takeda // Theor. Appl. Gen. 1990. - Vol. 80. - P. 38 - 42.

165. Takeshita M. Application of ovule culture to the production of intergeneric or interspecific hybrids in Brassica and Raphanus / M. Takeshita, M. Kato, S. Tokumasu // Jap. J. Genet. 1980. - Vol. 55, № 5. -P. 373 -387.

166. Tang K. A comparison of ovary, ovule and embryo culture in producing hybrids from wide crosses among rapid cycling Brassica species and Raphanus / K. Tang, P.H. Williams // Cruciferae Newslett.- Eucarpia, 1988.-Vol. 13.-P. 82- 83.

167. Thomas E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus / E. Thomas, G. Wenzel // Z. Pflanzenzuchtg. 1975. - Vol. 74. - P. 79-81.

168. Thompson K.F. Production of haploid plants of marrow-stem kale / K.F. Thompson//Nature (London). 1956. - Vol. 178. - P. 748.

169. Thompson K.F. Frequencies of haploid in spring oilseed rape {Brassica napus) / K.F. Thompson // Nature (London). 1969. - Vol. 178. -P. 748.

170. Thurling N. The influence of donor genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anthers of Brassicanapus ssp. oleifera / N. Thurling, P.M. Chay // Ann. Botany. 1984. - Vol. 54, №5. p. 681-693.

171. Toriyama K. Ability of callus growth and shoot regeneration in the wild species of Brassicaceae / K. Toriyama, T. Kameya, K. Hinata // Plant Tissue Cult. Lett. 1987. - Vol. 4, № 2. - P. 75-78.

172. U N. Genomic analysis of Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization / N. U // Japanese Journal of Botany. 1935. - № 7. - P. 389 - 452.

173. Vivadilova M. Anther cultures of Brassica napus L. / M. Vivadilova, C.S. Zelenkova, D. Tomaskova // Scienta Agriculturae Bohemoslovaca. -1987.-Vol. 19, №4.-P. 267-273.

174. Wang C.C. Induction of haploid plants from the female gametophyte of Hordeum vulgare / C.C. Wang, B.Q. Kuang // Acta Botanica Sinica. -1981. Vol. 23, № 4.-P. 329-330.

175. Wenzel G. Anther culture of Solanum tuberosum / G. Wenzel, B. Foroughi-Wehr // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. 1984. -Vol. l.-P. 293.

176. Wijowska M. Autonomous endosperm induction by in vitro culture of unfertilized ovules of Viola odorata L. / M. Wijowska, E. Kuta, L. Przywara // Sexual Plant Reproduction. 1999. - Vol. 12, № 3. - P. 164-170.

177. Yadav R.C. Interspecific hybridization in Brassica juncea X Brassica tournefortii using ovary culture / R.C. Yadav, P.K. Sareen, J.B. Chowdhury // Cruciferae Newslett. Eucarpia. 1991. - Vol. 14/15. - P. 84.

178. Yang D.G. Maintenance of male sterile germplasm in Brassica rapa by in vitro propagation / D.G. Yang, N. Tarla, T. Unto, P. Seppo // Agricultural and food Science in Finland. 2000. - Vol. 9. - P. 231-238.

179. Zenkteler M. In vitro culture of ovules of Triticum aestivum at early stages of embryogenesis / M. Zenkteler, W. Nitzsche // Plant Cell Rep. -1985.-Vol. 4, № 3.-P. 168-171.

180. Zenkteler M. In vitro fertilization of ovules of some species of Brassicaceae / M. Zenkteler // Plant Breed. 1990. - Vol. 105, № 3. - P. 221 -228.

181. Zhang G.Q. Plant regeneration from the hybridization of Brassica juncea and B. napus through embryo culture / G.Q. Zhang, W. J. Zhou, H.H. Gu, W.J. Song, E.J.J. Momoh // Journal of Agronomy and Crop Science. -2003.-Vol. 189, №5.-p. 347-350.

182. Zhang G.Q. Resynthesizing Brassica napus from interspecific hybridization between Brassica rapa and B. oleracea through ovary culture / G.Q. Zhang, G.X. Tang, W.J. Song, W. J. Zhou // Euphytica. 2004. - Vol. 140, №3.-P. 181-187.

183. Zhou C. Studies on the in vitro induction of callus from embryo sacs of rice / C. Zhou, H.Y. Yang // Hereditas. 1981. - Vol. 3, № 5. - P. 10-12.

184. Zur I. Efektywnose androgenezy w kulturach mikrospor rzepaku {B. napus L. var. oleifera) /1. Zur // Nowoczesne metody i techniki w hodowi i fizjologii roslin. Warszawa, 2002. - Cz. 2. - S. 675-680.

Информация о работе

Котлярова, Екатерина Борисовна
кандидата биологических наук
Липецк, 2007
ВАК 06.01.05

Диссертация

Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.) - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы