Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ И СОЗДАНИЕ ВЕКТОРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ И СОЗДАНИЕ ВЕКТОРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)"



На правах рукописи

-Ч'

Гасеми Безди Камал

Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)

Специальность: 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии и в Центре молекулярной биотехнологии Российского Государственного Аграрного Университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научные руководители' Доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН, Шевелуха Виктор Степанович, Кандидат биологических наук Карлов Геиааий Ильич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

A.B. Поляков

кандидат биологических наук А.М. Камионская

Ведущая организации Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Зашита диссертации состоится "2У " июня 2006 в 45"1 часов на заседании диссертг4„онного совета Д 220 043 10 при Российском Государственном Аграрном Университете МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, H-sSO, >1 Тимирязевская, д 49, Ученый совет РГАУ-МСХА и мечи К А Тимирязева, тел/факс 4762984, 977S428

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке Российского Государственного Аграрного Университета-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан "_<£_" июня 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Е. А. Калашникова

. . , ( i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В сельском хозяйстве остро стоит проблема потерь урожая вследствие поражения культурных растений грибными патогенами. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению роли белков в этом процессе [Сердобинский, 2002]. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название антимикробных. Использование генов из других растений, детерминирующих образование антимикробных белков, особенно обладающих более высокой физиологической активностью пептидов, является перспективным направлением.

Создание векторной конструкции на основе антимикробных белков для проведения агробактериальной трансформации, может обеспечить создание методами генной инженерии трансгенных растений рапса, устойчивых к различным заболеваниям. В связи с этим, актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена.

Рапс (Brassica napus L.) является одной из ценных кормовых и масличных сельскохозяйственных культур, получивших большое распространение в Канаде, Китае, Европейских странах, Индии и в других странах мира. Один из главных факторов, ограничивающих возделывание этой культуры - его восприимчивость к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum). Применение фунгицидов не очень эффективно для устранения симптомов вызванных этой болезнью. Так же применение фунгицидов увеличивает стоимость производства и может оказывать неблагоприятное влияние на окружающую среду. Поэтому идентификация генов для создания устойчивых форм гибридов и сортов рапса методами генной инженерии обеспечивает эффективную и экологическую безопасность для решения указанной задачи.

В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу гена MiAMPl, кодирующего антимикробного белка австралийского ореха и созданию векторной конструкции с этим геном для проведения агробактериальной трансформации сортов рапса иранской селекции.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является оптимизация условий регенерации рапса* (Brassica napus L.) и конструирование растительного вектора с геном антимикробного белка MiAMPl для генетической трансформации растений.

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева ЦНБ имени Н-И. Железнова

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи

1) создание генетической конструкции, содержащей ген MiAMPl на основе стандартного бинарного вектора pCAV!BIA1305 1 под контролем регуляторчых элементов, а также - маркерный ген гигромицинфосфо-трансферазы (Apt),

2) определение наличия гена MiAMPl в созданной конструкции с помощью рестрикпионного анализа, ПЦР и секвенирования нуклеотддной последовательности гена,

3) трансформация конструкции pCAMBIA1305 1-MiAMPl в штамм AGL0 Agrohacterium tumejucinns для агробактериальной трансформации растений,

■1) оптимизация условий регенерации т vitro различных сортов рапса

гр »некой селекции» S) проведение агробактериальной трансформации рапса

Научая iiobihiu работы. На основе стандартного бинарного вектора рС \MBIA 1305 1 впервые создана генетическая конструкция pCAMBI М305 1-MiAMPl, содержащая ген \liAMPl под контрочем CaMV 35S промотра и терминатора вируса мозаики цветной капусты Конструкция трансформирована в штамм AGLO A tumefauens дзя агробактериальной -р^нсформ .цмн растений Оптимизированы условия регенерации разных сортов рапса иранской селекции и впервые проведена генетическая T4a!ii.q.opvaiaM создтнной конструкцией pCAMBIA1305 1-MiAMPl в расчечий раюа.

Практическая значимость работы. Созданная генетическая конструкция pCAMBIA1305 1-MiAVIPl, содержащая ген антимикробного белка может быть использована для создания сельскохозяйственных растений, четойчлаих к склеротинии

Апробация резлльтатов работы. Результаты работы апробированы на 200* In htro Biology Meeting (Baltimore, Maryland. LSA, June 5-7, 2005), 13th Multi disciplinary Iranian Researchers Conference in Europe (University of Leeds, F eeds, UK, July 2, 2005), 8Л Iranian Congress of Biochemistry and First Interrationa! Congress of Biochemistry & Molecular Biology (Tarbiat Modarres L'niversitv, Tehran, Iran, September 11-15, 2005), и международной научной конференции молодых ученых и специалистов "Молодые ученые - аграрной науке , посвященной 140-тетию Российского государственного аграрного универслтета-МСХА им К А Тимирязева (Москва, Россия, 1-2 июня 2005 г)

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, выводов, заключения и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена страницах

машинописного текста, содержит таблиц и 3/. рисунка. Библиография включает/££ источников, из них /33 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использован штамм E.coli DH10B [ABRC, США], векторы pGEMT [Promega] и рСАМВ1А1305.1 [pCAMBIA vectors]. Для агробактериальной трансформации пременяли штамм AGLO Agrobacterium tumefaciens [Lazo et al., 1991], содержащий конструкцию pCAMBIA1305.1-MiAMP 1.

Конструирование растительного вектора. После определения ориентации гена MiAMP 1, полученого из университета Queensland Австралии на плазмиде pGEMT и сайтов рестрикции, ген клонировали в бинарный вектор рСАМВ1А1305.1. Ген MiAMPl лигировали с промотором CaMV 35S и репортёрным геном GUSPJus.

Трансформацию агробактериального штамма AGL0 плазмидной ДНК pCAMBIA1305.1-MiAMPl проводили методом прямой трансформации. Трансформированные клетки высевали на агаризованную среду УЕВ с добавлением 25 мг/л рифампицина и с соответствующим селективным антибиотиком канамицином 50 мг/л при темпратуре 28°С. Наличие vir-генов в трансформируемом штамме агробактерии определяли с помощью ПЦР-анализа ДНК с праймерами VirBl и VirB2.

Регенерация растений в культуре in vitro. В работе были использованы сорта ярового рапса (В. napus L.): Sari Gol, Quantum и Option 500 иранской селекции (Иранской научно-исследовательский институт растениеводства). Все исследования с растительными тканями in vitro проводили на агаризованных средах, содержащих макро- и микросоли по прописи MS [Murashige и Skoog, 1962], витамины по В5 [Gamborg et al., 1968], а также сахарозу, агар и регуляторы роста в различных концентрациях и соотношениях (таб. 1).

В качестве первичного экспланта использовали семядоли, гипокотили и корни, изолированные с 5-дневных проростков. Экспланты культивировали в климатической камере при 20-22°С, освещенности 2.5 клк. и 16-часовом фотопериоде.

Сформировавшиеся растения-регенеранты высаживали в почву в условия максимально приближенные к полевым Растения были фертильны, нормально проходили фазу цветения и образовывали семена

Таблица 1

Состав питательных сред для адвентивного морфогенеза рапса

Среды

Компоненты

(мг'ч) I №1 №2 I №3 i V-4 №5 j №6 .Vo7 №8 j >9 I X»'iO

Макросоли

Микросоли

MgS047H;0 I M*s

По прописи MS

CaCh 2H;Q

..

MS

Хелат железа

Витамины I По прописи В,

БАП j - - 4 4 4 8 4 05 6 -

НУК 1 - 2 - 1 1 2 - 06

Кинетин 1 4 - - - - -

24 D | - 01 - - - - ' 1 "

AnNOi 1 - 1 - I - - 10 10 - 1

ИМК - - 1 - - - - - - - 05

Сахароза (г'т) 5 30 | 10 10 10 10 10 10 10 20

pH 5 7 - 5 8

Агар (г 1) 7 6 6 6 6 6 7 7 6 7

Статистическая обработка данных. Каждый эксперимент проводили в двухкратной повторности, в среднем по двадцать эксплантов Частоту регенерации рассчитывали как процентное отношение чиста эксплантов, способных к органогенезу к общему числу эксплантов

Трансформация и сетекцня трансформантов. В работе для генетической трансформации были использованы семена масличного рапса сортов Quantum и Option 500 Генетическую трансформацию рапса проводит методом совместного культивирования растительных эксптантов с агробактерией [Stewart et al, 1996] модифицированным Cardoza et al [2003] Для трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens, штамм AGL0 с бинарном векторе рСАМВ1Л1305 1- MiAMPl

Аналнз растеннй-трансформантов. Анализ экспрессии гена ß-глюкуро-нидазы проводили гистохимическим способам по стандартам методикам Clark [1997] Выделение ДНК из свежих листьев рапса, прошедших сечекцию на гигромицине проводили по методу, описанному Saghai-Maroof et al [1984] с незначительными модификациями Включение чужеродного гена MiAMPl в геном растений рапса поколения Т0 опредепяли с помощью ПЦР-анализа ДНК

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 1. Клонирование ДНК, кодирующей ген Mi AMPI

1.1. Создание векторной конструкции с геном MiAMPl. Нуклеотидная последовательность гена MiAMPl была клонирована по сайтам рестрикции SacII и Spei Т-вектора pGEMT [Promega].

Данную конструкцию pGEMT-MiAMPl трансформировали в штамм E.coli DH10B и проверяли наличие гена с помощью ПЦР с праймерами М13 (рис. 1А), рестриктаз Ncol и BamHI (рис. 1Б) и секвенированием. По сиквенсу определяли ориентацию гена на плазмиде и сайты рестрикции в начале и в конце гена.

Б)

Рис. 1. Проверка наличия гена MiAMPl в конструкции pGEMT- MiAMPl с помощью: А) ПЦР с праймерами М13.1,2: конструкция pGEMT-MiAMPl; 3: маркер 100 bp ladder, и Б) рестрикция с Ncol и BamHI. 1: маркер 100 bp ladder; 2, 3: рестрицированные колонии pGEMT-MiAMPl; 4: нерестрицированная колония pGEMT-MiAMPl; 5: маркер 1 kb ladder

Для генетической трансформации растений, последовательность была субклонирована по сайтам рестрикции Ncol и BgUI в бинарный вектор pCAMBIAl 305.1. Для этого была использована следующая схема: после определения ориентации гена MiAMPl на плазмиде pGEMT и сайтов рестрикции в начале и в конце гена, включение гена MiAMPl в векторе pGEMT определяли с помощью ПЦР-анализа ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров состава: Mial (5- agatctgccatggcttccaccaagtt-gttc -3") и Mia2 (5 - gcagatctacgcattggatgaagatactcttc -3'), совпадающие с геном MiAMPl, а также для создания сайтов рестрикции Ncol и BgUI в начале и в конце гена MiAMPl, совпадающие с сайтами рестрикции вектора pCAMBIAl305.1 (рис. 2). .

Для того, чтобы совпали рамки считивания нуклеотидной последовательности гена MiAMPl с рамками считивания аминокислотной последовательности, добавляли 2 нуклеотида GT в конце гена перед сайтом рестрикции BgUI (рис. 3). Так же был удалён стоп-кодон "tag" на конце гена

MiAMPl, чтобы экспресировался репортерный ген GUSPIus вместе с геном Mi AMPI

ioüCnm»-

30CU—,

2

Рис. 2. Продукт ПЦР конструкции pGEMT-MiAMPl; / маркер 100 Ьр ladder 2-4 амплифицируемые колонии pGEWT-MiAMP!

1 I Nco/ I

Start CDdnn

AGA TCT GCC ATG GCT ТСС ACC AAG TTG TTC TTC TCT GTC ATT ACT GTG ATG ATG CTC ATA GCA ATG GCA AGT GAG ATG GTG AA I GGG AGT GCA TTT АСА GTA TGG AGT GG Г CCA GGT TGT AAC AAC CGT GCT GAG CGA ГАТ AGC AAG TGT GGA TGC TCA GCT ATA CAT CAG AAG GGA GGC TAT GAC TTC AGC T VC ACT GGA CAA ACT GCT GCT CTC TAC AAC CAG GCT GGA TGC AGT GGT GTT GCA CAC ACC AGG TTT GGG TCC AGT GCC AGG GCA TGC AAC CCT TTT GGT TGG AAG AGT АТС TTC АГС CAA TGC G Г A GAT CTG С

fag/я

иг

¡ГГГВД

Рис. 3. Нуклеотидная носледоватс тьность продукта 11ЦР конструкции рСЕМТ-М|АМР1 с помощью специальных праймеров \lial и М1а2. (Д?/// -\coI-ген \tiAMPl - В^Ш)

Этот фрагмент М1АМР1 носче обработки эндонуклеазами Лео/ и и выделения из агарозного гепя был тигирован в пчазмиде рСАМВ1А1305 1 (12680 нп) с помощью Т4 ДНК лигазы, с целью создания векторной конструкции рСАМВ1А1305 1-М1АМР1 (рис 4 и 5)

ob—*

Рис. 4. Схема создания конструкции рСАМВ1А1305.1- MiAMPl

CaMV35S NcoJ Gene tgtn Cmlase Nhd KOS

MiAMPl A . intra« GUS Пи* ртЦ potyA T-borderfR) BsiEIt

promoter a MiAMPl a y mtraa ousnn

■Ц-T - Ц т

4

CaMV35S LmZ Poiy double enhance •Jphe linker promoter bygrorayan®

t t

C«MVJ5S (OiyA

Рис. 5. Схема векторной конструкции плазмиды рСАМВ1А1305.1, несущей ген антимикробного белка МасаЛшша Ше&1/оИа М1АМР1, использованной для трансформации растений

Наличие в устойчивых к канамицину колоний, плазмид, которые включают в себя вектор рСАМВ1А1305.1 размером 12677 т.н.п. и MiAMPl-фрагмент размером 314 н.п. подтвердили путем проведения рестрикционного анализа, используя рестриктазы BstEII и BamHI (рис. 6А), рестриктазы Spei и BamHI (рис. 6Б), а также ПЦР с праймерами Mial и Mia2 (рис. 7). Данная конструкция содержит в своем составе кодирующую последовательность гена MiAMPl между CAMV 35S промотором и терминатором вируса мозаики цветной капусты, обеспечивающими конститутивную экспрессию гена в растениях и другие регуляторные последовательности и элементы вектора рСАМВ1А1305.1.

А) Б)

Рис. б. Проверка наличия гена MiAMPl в конструкции pCAMBIA1305.1-MiAMPl с помощью рестриктаз A) BstEII и BamHI-, I:

рестрицированная ДНК pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 2-4: рестрицированные ДНК рСАМВ1А1305.1; 5: маркер 1 kb ladder; и Б) Spei и BamHI; 1: рестрицированная ДНК pCAMBIA1305.1-MUMPl; 2: рестрицированная ДНК рСАМВ1А1305.1; 3: маркер 1 kb ladder

а Рис. 7. Проверка наличия гена MiAMPl в I конструкции pCAMBIA1305.1-MiAMPl с помощью I ПЦР со специальными праймерами Viial и Mia2; 11 б колонии рСШВ1А1305 1 Mi AMPI В колонии №№ 1 / 2 4 5 и 6 существует ген \iiAMPl 7 I pCAMBIA1305 1 8 маркер ЮОЬр ladder 9 коюния pGEWT-MiA UPI

Таким образом, на основе потучснных результатов нами создана векторная конструкция, содержащая ген MiAMPl, пригодная дтя трансформации растений По завершении клонирования постедоватечьность нуклеотидов гена MiAMPl была проанализирована при помощи секвенирования

>■2. Трансформации генетической конструкции в агробактерню.

Созданная конструкция pCAMBIA1305 1-MiAMPl была введена в штамм AGLO A tumefaciens В данной конструкции содержится система переноса pBR322on

Посте выделения птазмидной ДНК отобранных агробактериальных колоний, несущих конструкцию pCAMBIA1305 1-MiAMPl проверяли наличие гена MiAMPl в данной конструкции с помощью рестрикционного анализа (рис. 8)

г; •в Ш w

_ „ 314 bp

M b)

Рис. 8. Отбор агробактериальных колоний, несущих конструкцию pCAMBIAI305.1- MiAMPl и проверка наличия гена MiAMPl в данной конструкции с помощью рестрикционного анализа: A) Ncol и Bglll, 1-9 рест-рицированные пдазмидные ДНК агробактериальных коюний, трансформируемых с конструкцией pCA МВ1А1305 1 MiAMPl В коюнии № 1-3 и 8 выявлены ген \fiAMPl, 10 чаркер 100 bp ladder 11 13 плазмидная ДНК нерестрицированных колоний и Б) Spel и BamHI; 1-7 рестрицированные пдазмидные ДНК агробактериальных коюний несущих конструкцию pC4WBlA13Q5 1-MiAMPl В колонии Х° 1 и 3 существует <.ен MiAMPl 8 плазмидная ДНК нерестрицированной коюнии pCi WBIA1305 1-MiA\fPl 9 иаркер 100 bp ladder 10 11 рестрицированные ДНК pCA MBIA1305 1

После проверки наличия гена М1АМР1 в штамме АйЬО агробактерии для подтверждения нуклеотидной последовательности использовали специальные праймеры РСАМ1 (5- сПс§саа£асссйсс1сШ -3'), комплементарные участку СаМУ 35 Б промотора, и РСАМ2 (5-gtcctaaccaagaaaatgaaggaga-3')) комплементарный участку СаЫаве шггоп, совпадающие с двумя сторонами гена М1АМР1 в растительном векторе рСАМВ1А1305.1, которые использовали для секвенирования. Амплификацию целевого гена М1АМР1 проводили с использованием праймеров М1а1 иМ1а2 (рис. 9).

А) Б)

Рис. 9. Проверка наличия гена MiAMPl в штамме AGL0 агробактерии с конструкцией pCAMBIA1305.1-MiAMPl с помощью ПЦР со специальными праймерамн: А) РСАМ1 н РСАМ2; 1-4: штамм AGL0, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 5: Marker 100 bp ladder; 6, 7: штамм Rcoli DH10B, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 8: pCAMBIA1305.1; 9: вода и Б) Mial и Mia2; 1-3: штамм AGLO, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 4; штамм E.coli DH10B, содержащий конструкция pCAMBIAl305.1-MiAMPl; 5: Marker 100 bp ladder

Последовательность амплифицируемого участка была секвинирована. Анализ данной нуклеотидной последовательности показал, что она полностью совпадает с нуклеотидной последовательностью кДНК, кодирующей антимикробный белок MiAMPl и не имеет никаких мутации или делении.

Также для проверки наличия vir-генов в трансформируемом штамме AGL0 агробактерии, мы использовали праймеры VirBl (5'-ggctacatcgaagatcgta-tgaatg-З') и VirB2 (5'-gactatagcgatggttacgatgttgac-3'), комплементарные участкам vi'r-области агробактерии (рис. 10).

Рнс. 10. Проверка наличия v/г-генов в штамме AGL0 680bp =5 агробакгерии с конструкцией рСАМВ1А1305.1-

тт MiAMPl с помощью ПЦР со специальными """* праймерами VirBl и VirB2; 1: штамм AGL0 шя агробактерии; 2: штамм E.coli, содержащий конструкцию pCAMBIAl305.1-MiAMPl; 3, 4: штамм 123456 AGL0, содержащий конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl; 5: ДНК контроля VIR* ; 6: Marker 100 bp ladder

Таким образом, нами был проведен анализ полученной ДНК антимикробного белка MiAMPl, опредепен его размер и нуклеотидная последовательность Создана векторная конструкция pCAMBIA1305 1-MiAMPI, содержащая ген антимикробного белка MiAMPl для агробактериальной трансформации растений

2. Оптимизация условий регенерации рапса

2.1. Оценка растительного материала на интенсивность морфогенеза в культуре in vitro. Регенерацию осуществляли на средах 3-6 (таб 1), разработаных Г Н Ралдугиной и др [1995] для орюногенеза у семядольных эксплантов рапса Модификацией исходной прописи питательной среды является замена оригинальных витаминов на витамины среды В<

Работу проводили с прекультивированием эксп ынтов, изолированных с 5-дневных проростков рапса на каллусообразующей среде № 2 не более 2 сут. Оценку общего морфогенетического потенциала проводили путем подсчёта на 21 е сутки количества эксп гантов, способных к регенерации побегов (таб 2)

Таблица 2

Зависимость частоты peieiiepaiuiif побеюв от генотипа _ и первичного экспланта (в%)_

Гип экспланта

Генотип Семядо ь | Гигкжоти1ь Корень raiOTimv -16)

San Gol S1 6 I 23 4 63 1 27 1

Quantum 68 8 | 31 я 7S 1 3* 9

Option 500 62 5 i 26 6 3 1 i Ю 7

В среднем, по типу экспланта (Ь =161 60 9 27! 1 V 1

Примечание SJius для чайных различии — 2,9 прекультивирование жп^аиюа в течение 2 сут на середе № 2 с постедуюшим их переносом на середу для регеаерашш В таблице приведены средние значения по всем составам питкгельных сред

Из таб 2 следует, что средняя частота морфогенеза колебалась от 27,1% до 35,9% в зависимости от генотипа Причем наиботьшей морфогенетической активностью обладали зкепланты сорта Quantum Вероятно, это связано с большим содержанием эндогенных юрмонов в тканях, чибо большей чувствительностью к действию экзогенных цитокининов на данный генотип Вместе с тем следует отметить, что семядольные экспланты обладали большим морфогенетическим потенциалом по сравнению с гипокотилями и корнями Так как сорта Quantum и Option 500 отличались наиболее высоким уровнем

адвентивного морфогенеза, они были нами отобраны для дальнейших исследований

2.2. Влияние состава питатечьнон среды на формирование адвентивных почек рапса в условиях in vitro На следующем этапе исследований проводили оценк} влияния питатечьных сред различного состава, на адвентивный органогенез с печью увеличения его эффективности (таб 3)

Таблица 3

Частота регенерации побегов рапса в зависимости от фитогормонального состава питательной среды, типа первичного экспланта н генотипа (в %)

Фитогормоны 1 (мг/i) OKCII 13HT В среднем, по фнтогормона м БАП и НУК и генотипу В среднем, по

Среда Yo БАП НУК С<.рт семядоть гиг котть корень фитогормо нам БАП и НУК (bb^l 9)

San Gol jl 2 63 - 12 5

3 4 0 Quantum | 43 7 188 20 8 174

Option ! 43 7 12 5 18 8

I San Gul | 43 7 25 22 9

4 1 1 Quantum 1 <6 ? 43 7 125 37,5 10 6

| Option ' 62 5 31 2 - 31 2

1 ban Gol ">6 2 43 7 12 5 37 5

5 4 i 2 Quantum 7S 43 S 18 7 45 8 39 6

1 Option 62 * 37 5 6 25 »5 4

1 San Gol 75 187 12 5 3*4

б S 1 I Quantum I 100 187 - 39 6 37 5

1 Option 81 3 25 6 25 37 5

В <.реднеч по типу экспанта | 1 6> 60 9 27,1 <73 -

Примечание S F.ii для частных рапичи'I 5 7 Прекуи-тивирование экспантов в течение 2 с\т на середе .V» 2 перед переносом и\ на чорфогенные питательные середы

Как (,тедует из данных таб 3, наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на среде V» 5, где она составила, в среднем, 39,6%, в то время как наименьшая- зафиксирована на среде >> 3, где ее значение равно 17,-1/о Среды X« 5 и 6 по этому показатечю не имели существенных различий между собой на 5% уровне значимости и были оптимальными (37,5 и 39,6%)

Из сравнения результатов, полученных на средах № 3-6 можно слетать вывод, что содержание НУК в концентрации 1 мг/ I в питательной среде существенно увеличивает эффективность органогенеза Кроме того, результаты, полученные на средах № 5 и 6 свидетельствуют о том, что относите чьно высокая концентрация одновременно БАГ1 и НУК в

питательной среде приводит к увеличению количества регенерирующих эксплантов.

Анализируя полученные нами результаты можно заключить, что органогенез рапса зависит от соотношения и концентраций цитокининов и ауксинов в питательной среде. Это согласуется с литературными данными [Ралдугина и др. 1995; Майсурян и др., 2005; Jonoubi et al., 2005; Reda et al., 2006].

Установлено, что семядоли обладали большей регенерационной способностью, по сравнению с гипокотилями и корнями. Эффективность регенерации семядолей составила, в среднем, 60,9%, тогда как гипокотилей -27,1%, а корней-5,7%, поэтому в дальнейших экспериментах по генетической трансформации в качестве первичного экспланта были использованы семядоли, изолированные с 5-дневных проростков, полученных из семян в условиях стерильной культуры.

Таблица 4

Влияние АБК на частоту регенерации побегов у сортов рапса в зависимости

от фитогормонов БАП и НУК в составе питательной среды __ и разных эксплантов (в %)__

Среда № АБК (мг/л) Эксплант В среднем, по фитогормонам БАП, НУК и АБК (S£«5=2,7) В среднем, по фитогормонам БАП и НУК (S.Eos=l,9)

семядоль гипокотиль корень

3 - 25 8,3 - И,1 17,4

3 54,2 16,7 - 23,6

4 - 41,7 29,2 - 23,6 30,6

3 66,7 37,5 8,3 37,5

5 - 58,3 29,2 12,5 33,3 39,6

3 70,8 54,2 12,5 45,8

6 • 70,8 16,7 - 29,2 37,5

3 100 25 12,5 45,8

В среднем, по типу экспланта (S.Eos=l,6) 60,9 27,1 5,7 - -

Примечание: вЕ^з для частных различий = 4,7. Прекультивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 2 с последующим их переносом на середу для регенерации. В таблице приведены средние значения по 3 сортам.

Помимо изучения влияния различных концентраций ауксинов и цитокининов, а также их соотношения на процесы индукции образования адвентивных почек, нами было изучено влияние фитогормона АБК на побегообразование. Из результатов, представленных в таб. 4 следует, что добавление АБК в среду, индуцирующую морфогенез, как правило, вызывало статистически значимое на 5% уровне влияние на побегообразование и значительно увеличивало частоту регенерации у всех изучаемых

типов эксплантов на всех питательных средах Самую высокую частоту побегообразования (100%) наблюдали у семядолей при их культивировании на среде, содержащей НУК 1 мг'л, БАП 8 мг/л и АБК 3 мг/л

2.3. Сравнение питательных сред № 5 ч JVa 9 па адвентивный морфогенез рапса сорта "Quantum" в условиях /и vitro. На следующем этапе нами проведена сравнительная оценка влияния питательных сред № 5 и 9, на регенерационную способность семядольных эксплантов сорта "Quantum", обладающих существенно большей относительной частотой регенерации побегов, по сравнению с другими сортами рапса (таб 5)

Таблица 5

Сравнение частоты регенерации побегов у сорта рапса Quantum в _питательных средах № 5 и 9 (в %)_

j Среда д.ю Средз для морфогенеза | D среднем, по среде для |

преку-ьтивировании I ^ I №4 прекульгивировании |

>2 1 М 2 46 6 50 4 |

№5 52 i 41,4 47 1

В среднем, по сред« для | морфогенеза (Ь 1 77) 53 5 44 0 , - ,

Примечание ЬЬ^о? для частых различий — 1X5 Прекультивирование зкстантов в течение 2 сут перед переносом на их морфогенные середы

Как следует из таб 5 наибольшую частоту регенерации побегов сорта Оиапшт наблюдали на среде .V" 5, где она составила в среднем 53,5%, в го время как на среде .V» 9 учитываемый показатель имел значение в среднем 44%

2.4 Влияние фнтогормонов на внтрнфнканню растенин-регенерантов рапса. При культивировании растений в условиях т VIпо нередко наблюдается явление витрификации, которое проявляется в сильной оводненностн листьев и стеблей, вследствие чего побеги становятся прозрачными В нашей работе мы также наблюдали формирование верифицированных побегов <"габ 6)

Исходя из полученных данных в таб б следует отметить, что, хотя среды № 3 и > 4 не имеют существенного различия на 5% уровне значимости по относительной частоте регенерации нитрифицированных побегов (6% и 6,9% соответственно), однако наблюдается тенденция к увеличению данного показателя при использовании сред № 5 и № 6 На этих средах отмечены большие различия на 1% уровне значимости по частоте регенерации нитрифицированных побегов (14,8%, и 12,1% соответственно) При сопоставлении этих данных с составом питательных сред можно

заключить, что высокое содержание ауксина ПУК или цитокинина БАП в питательной среде повышает витрификацию.

Таблица 6

Частота возникновения нитрифицированных регенерантов на семядольных эксплантах сорта рапса Quantum в зависимости от __состава питательной среды (в %) _

Среда № АБК (мг/л) Витрификация (%) В среднем, по составу питательной среды (S.E<>5=0,47)

3 - 5,6 6,0

3 6,4

4 - 6,3 6,9

3 7,6

5 . 13,9 14,8

3 16,7

6 - 10,8 12,1

3 13,5

Примечание: S.Eos для частных различий = 0,66. Прехультивирование эксплантов в течение 2 сут на середе № 1 перед переносом их на морфогенные середы.

Тенденция к увеличению данного показателя наблюдается при добавлении АБК. В целом, при полном отсутствии АБК частота витрифицированных побегов была ниже, чем на среде с АБК 3 мг/л.

Таким образом, на способность к адвентивному морфогенезу рапса существенное влияние на 5% уровне значимости оказывали следующие факторы: генотип, тип экспланта, состав питательной среды (соотношение различных концентрации цитокининов, ауксинов и АБК в питательных средах, а так же взаимодействие этих факторов).

Микропобеги, полученные из семядольных эксплантов формировали мощную корневую систему. Отобранные таким образом растения рапса высаживали в почву в условиях максимально приближенных к полевым. Растения выращивали в вегетационных сосудах в теплице. Они были фертильны, нормально проходили фазу цветения и образовывали семена.

3. Трансформация растений рапса с геном антимикробного белка MiAMPl. Следующим этапом нашей работы было проведение агробактериальной трансформации. В работе был использован масличный рапс (В. napus L.) сортов "Quantum" и "Option 500".

3.1. Влияние антибиотиков на экспланты ^трансформированных растений. Изучение влияния антибиотиков гигромицина и цефотаксима на жизнеспособность нетрансформированных семядольных регенерантов рапса сорта Quantum показало, что семядольные экспланты были высоко

чувствительны к действию гигромицина и почти не реагировали на цефотаксим Гигромшшн отрицательно действовал на регенерацию побегов из семядольных эксплантов т vitro Начиная с концентрации гигромицина 2 мг/л, происходило ингибирование роста, что приводило к гибели регенератов При концентрации гигромицина 2 мг/л после 5 недель обработки 37,5% регенерантов погибали При 5 мг/л гигромицина экспланты в местах среза темнели и через 5 недель все регенеранты погибали При увеличении концентрации гигромицина до 10 мг/л гибель регенерантов происходила через 4 недели, а при концентрации 20 мг/л через 3 недели регенеранты теряли жизнеспособность (таб 7)

Таблица 7

Влияние разных концентрации антибиотика гигромицина на жизнеспособность ^трансформированных растений - регенерантов _ _ рапса сорта Quantum_

Концентратам гигромицина (мг i)

Неделя псхпе обработки гигромицина

100

7S0

10

_64 6_ 43 3

87 <

62 S

87 5

62 5

37 5

29 2

0

Примечание

таблице

процент

жизнеспособных

^трансформированных регенерантов поточенных из семялотьных чкеплантов

Из результатов следует, что селективная среда для регенерации побегов-трансформантов должна содержать гигромицин в концентрации 510 мг/т Добавление в среду цефотаксима даже в высоких концентрациях не оказывало влияние на жизнеспособность экептантов, хотя и не снижало частоту побегообразования При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из использованных нами концентрациях (цефотаксим 500 мг/ч), получали такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина

3 2. Определение ?ффектнвностн трансформации рапса при помощи созданной векторной конструкции с геном \TiAMPt. Трансформацию растений рапса проводили при помощи Agrobacterium tumefactens штамма AGL0 с бинарным вектором pCAMBIA1305 1-MiAMPl В качестве селективного гена использовали ген гигромицинфосфотрансферазы (hpt) под контролем CaMV 35S double enhancer промотора Посте трансформации экспланты помещали дтя кокутьтивирования на агаризованные среды MS

№ 2 и № 5 без добавления антибиотика цефотаксима. Кокультивирование проводили в течение двух суток на рассеянном свете как при температуре 26°С, так и при температуре 22°С, до момента начала появления едва заметного бактериального газона вокруг эксплантов. Такая методика была нами применена и для нетрансформированных эксплантов, которые использовали в качестве контроля (таб. 8).

Таблица 8

Влияние кокультнвирования эксплантов на среде для каллусообразования и обработки температурой на частоту регенерации трансформированных эксплантов у сорта рапса Quantum (в %)_

Кокультивирование эксплантов Обработка температурой В среднем, по кокультивированию эксплантов (S.Eos=1,77)

1 2 3

Среда №2 55,2 41,7 54,3 50,4

Среда № 5 49,5 44,2 47,6 47,1

В среднем, по обработке температурой (S£os=2,16) 52,4 42,9 50,9 -

Примечание: SJLos для частых различий = 3,06. кокультивирование эксплантов в течение 2 сут перед переносом их на морфогенную середу № 6. Обработка температурой: 1. нетрансформированные экспланты; 2. трансформированные экспланты, культивируемые при температуре 26°С; 3. трансформированные экспланты, культивируемые при температуре 22°С.

Как следует из таб. 8, частота регенерации трансформированных эксплантов на среде № 2 для каллусооброзавания (50,4%) была выше, чем в контрольном варианте (47,1%). Учитываемые показатели не имели существенных различий между собой на 5% уровне значимости.

При обработке температурой наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на нетрансформированных эксплантах, где она составила в среднем 52,4%, в то время частота регенерации трансформированных эксплантов при культивировании их при температуре 26°С составила в среднем 42,9%, а при культивировании эксплантов при 22°С - 50,9%. Данные обработки имели существенные различия между собой на 5% уровне значимости.

Так же мы изучали влияние времени кокультивации семядольных эксплантов и обработки температурой сорта Option 500 с агробактерией на частоту регенерации побегов трансформированных и нетрансформированных эксплантов (рис. 11).

•о

Al.

«Г —t—•

ПГ

ф

s

I

»

Вариант

Рис. 11. Влияние времени кокультивации эксплантов с агробактерией и обработки температурой на частоту регенерации трансформированных эксплантов сорта рапса Option 500 (в %).

Обработки; 1 нетрансформированные экспланты при температуре 22°С в течение 48 час 2 кок\ 1ьтивация при 26 С в течение 24 час 3 кокхптивацхы при 26°С в течение час 4 кок\ лыпивация при 22'С в течение 24 час 5 кокучътивацш при 22"-С в течение 48 час

Кокультивация эксплантов с агробактерией в течение 2-х суток приводила к уменьшению частоты регенерации трансформированных семядольных эксплантов у сорта рапса Option 500 (53,3 против 23,3 при культивировании их при температуре 26°С и 67 против 28,1 при культивировании при температуре 22°С, соответственно)

3 3. Анализ первичных трансформантов рапса. Высокую чувствитечь-ность эксплантов и тканей рапса к гигромицину преодолевали с помощью трехэтапной схемь сстекции Первичную сечекпию, полученных в результате трансформации растений рапса, проводили на среде, содержащей 2 мг/л гигромицина Затем проводили повторную селекцию полученных регенерантов на среде для морфогенеза с содержанием шгромицина 5 и 10 мг/1 Выявленная селективная концентрация гигромицина 5-10 мг/л позволяет с успехом отбирать трансформанты

Сохранившиеся посте обработки растения рапса, устойчивые к гигромицину, были проанализированы с помощью ПЦР-анализа с использованием праймеров РСАМ1 и РСАМ2 Длина амплифицируемош фрагмента 428 нп (рис 12) Результаты проведенного ПЦР-анализа трансгенных растений рапса поколения Т0 показывают наличие целевого гена Mi AMPI в растениях

3.4. Определение экспрессии гена В-глюкуронидазы (GLS). Наличие в трансформированных эксипантах репортерного гена ß-глюкуронидазы

(GUS), показано при определении его экспрессии гистохимическим методом. При этом экспланты-трансформанты окрашивались в синий цвет.

Рис. 12. Электрофореграмма продуктов ПЦР-анализа растений рапса, трансформированных штаммом AGL0, содержащим векторы рСАМВ1А1305.1-MiAMPl с использованием праимеров РСАМ1 и PC AM 2 в 2%-ном агарозном геле. I, 2: ДНК нетрансгенного рапса; 3-8: ДНК разных растений, трансформированных штаммом AGL0 // pCAMBIAl305.l-MiAMPl; 9: Marker 100 bp ladder; 10: плазмида pCAMBIA1305.1-MiAMPl; И: плазмида рСАШ1А1305.1-MiAMPl+ДНК нетрансгенного растения; 12: плазмида рСАМВ1А1305.1; 13: вода

ВЫВОДЫ

1. На основе стандартного бинарного вектора рСАМВ1А1305.1 создана генетическая конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl, содержащая ген MiAMPl под контролем конститутивного CaMV 35S промотора и терминатора вируса мозаики цветной капусты, а также маркерный ген GUS и ген гигромицинфосфотрансфераза typt), устойчивости к антибиотику гигромицину.

2. Подтверждено наличие гена MiAMPl в созданной конструкции с помощью рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования нуклеотидной последовательности гена.

3. Конструкция pCAMBIA1305.1-MiAMPl трансформирована в штамм AGL0 Agrobacterium tumefaciens для агробактериальной трансформации рапса.

4. Разработана оптимальная технология регенерации растений из разных соматических органов и тканей трёх сортов рапса:

- установлено, что эффективность реализации морфогенетического потенциала рапса зависит от генотипа, типа первичного экспланта, а также от гормонального состава питательной среды. Наивысшей регенерационной способностью среди изученных генотипов обладает сорт рапса "Quantum";

- выявлено, что более высокой регенерационной способностью обладают семядольные экспланты рапса по сравнению с сегментами гипокотилей и корней на всех используемых питательных средах;

- включение в состав среды Мурасиге и Скуга 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, 3 мг/л АБК и витаминов по В$, вызывают наибольшую частоту регенерации побегов, формирующих из семядолей,

- добавление 3 мг/л АБК в питатетьную среду MS, индуцирующую морфогенез, как правито, вызывает значимое влияние на побегообразование, а также увеличивает частоту регенерации у всех типов эксплантов

5 Витрификации регенерантов способствует повышенное содержание в питательной среде ауксина НУК или питокинива БАП, а так же АБК

6 Семядольные экспланты рапса прояв.ыют высокую чувствительность к антибиотику шгромицину Жизнеспособность побегов, сформировавшихся из семядольных эксплантов сорта ' Quantum", сохраняется при концентрации 2 мг/л шгромшшна до 40 дней, а при уветичении его содержания до 10 мг/л, все образующиеся побеги теряют жизнеспособность через 20 дней Установлена оптимальная концентрация гигромицина дтя регенерации побегов-трансформантов на селективной среде 5-10 мг/т

7 Добавление к среде цефотаксима даже в высоких концентрациях не изменяет жизнеспособность -эксплантов и не снижает частоту побегообразования При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из испотьзованных нами концентрациях (цефотаксим 500 мг/л), по тучен такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина.

8 Созданная конструкция pCAMBIA1305 1-MiAMPI трансформирована в семядольные эксптанты рапса методом агробактериалыюй трансформации

Ч Частота регенерации побегов, порученных из трансформированных семядольных зкстднтов растений рапса сорта ' Quantum" при их кокутьтивировании с агробактерией снижается Уветичение продолжительности кокутьтивации трансформированных семядолей до 2-х суток вызывает снижение частоты регенерации На рассеянном свету при снижении температуры с 26°С до 22°С этот показатечь возрастает

10 Получены первичные трансформированные регенеранты рапса сорта Quantum" устойчивые к гигромицину

Список публикаций по теме диссертация

1. Гасеми Бездн К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Ген устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) как новый ген для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). 13-ая Мультидисциплинарная Конференция Иранских Исследователей в Европе. Университет Лидса, Лидс, Великобритании, 2 июля 2005. http://13th.irce.org/va html ai=649. (перевод с английского).

2. Гасеми Бездн К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Использование кДНК как ген устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). Сборник статей 8-ого Иранского Конгресса Биохимии и 1-ого международного Конгресса Биохимии и Молекулярной Биологии, 11-15 сентября 2005 г., Университет Tarbiat Modarres, Тегеран, Иран, С. 364. (перевод с английского).

3. Гасеми Бездн К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Генетическая трансформация рапса (Brassica napus L.) для технической устойчивости, используя ген, кодирующий антимикробный белок. Конференция In Vitro Биологии 2005, Балтимор, Штат Мэриленд, США, 5-7 июня 2005 г., С. 2065. (перевод с английского).

4. Гасеми Бездн К.. Шевелуха В. С., Карлов Г. И., Ралдугина Г. Н. Использование гена устойчивости к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.). Материала международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвященной 140-летию Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К. А. Тимирязева (1-2 июня 2005 г). Изд-во МСХА, М. 2006. с. 357-361.

Зак. 400

Тир. 100 экз.

1,25 печ. л.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44