Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эффективной системы генетической трансформации льна-долгунца (Linum usitatissimum L. ) и дикорастущих видов рода Linum

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каляева, Марина Александровна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическая трансформация растений

1.2. Краткая характеристика природных векторных систем

1.2.1. «Генетическая колонизация»

1.2.2. Структурно-функциональная организация Тьплазмид

1.2.3. Ш-плазмиды А^оЪааепит rhizogenes

1.2.4. Векторы на основе вирусов растений

1.2.5. Применение природных векторных систем в генетической инженерии растений

1.3. Методы трансформации растений Тл (Ш)-плазмидами

1.3.1. Методы инокуляции

1.3.2. Методы кокультивирования

1.4. Методы прямого переноса ДНК в растения 21 —1.4.1. Химические стимуляторы

1.4.2. Электропорирование

1.4.3. Микроинъекции ДНК

1.4.4. Инъекции ДНК в молодые цветоносные побеги

1.4.5. Инкубация пыльцы в растворах ДНК

1.4.6. Введение ДНК в прорастающие пыльцевые трубки

1.4.7. Перенос ДНК посредством липосом

1.4.8. Электрофорез

1.4.9. Баллистический метод

1.4.10. Поглощение ДНК семенами

1.5. Анализ методов генетической трансформации растений

1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях

1.7. Проблемы и задачи генетической трансформации сельскохозяйственных растений

1.8. Регенерация и агробактериальная трансформация льна культурного

Linum usitatissimum L.)

1.8.1. Биология объекта

1.8.2. Культура in vitro льна обыкновенного (Linum usitatissimum L.). Регенерация растений из соматических тканей

1.8.3. Агробактериальная трансформация льна культурного

1.8.4. Регенерация и агробактериальная трансформация растений льна-долгунца

1.9. Дикорастущие виды рода Linum в кульуре in vitro • 44 1.9.1. Регенерация и агробактериальная трансформация льна крупноцветкового

Linum grandiflorum Desf.) и льна многолетнего {Linum perenne L.) 45 JTJIABA 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

МАТЕРИАЛЫ

2.1. Оборудование

2.2. Реактивы и ферменты

2.3. Объекты исследования

2.4. Среды

2.4.1. Микробиологические среды

2.4.2. Среды для культивирования растений

2.5. Другие растворы

2.6. Бактериальные штаммы и плазмиды

МЕТОДЫ

2.7. Регенерация побегов льна-долгунца из сегментов гипокотилей

2.8. Регенерация побегов льна крупноцветкового и многолетнего из эксплантов различного типа

2.9. Адаптация растений льна-долгунца, многолетнего и крупноцветкового к условиям in vivo

2.10. Колонизация растений льна-долгунца, многлетнего и крупноцветкового метилобактериями Methylovorus mays

2.10.1 Колонизация семян

2.10.2. Колонизация эксплантов

2.11. Индуцирование процессинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами растений

2.11.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений

2.11.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli

2.11.4. Быстрое выделение небольшого количества плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.12. Выделение суммарной растительной ДНК

2.13. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.14. Агробактериальная трансформация льна-долгунца

2.15. Получение фосфинотрицинустойчивых растений льна-долгунца

2.16. Агробактериальная трансформация льна крупноцветкового и льна многолетнего

2.17. Определение активности NPTII

2.18. Выявление GUS-активности в трансгенных клетках

2.18.1. Флюориметрическое определение активности GUS

2.18.2. Гистохимическое выявление GUS-активности в гипокотилях льна

2.19. Статистическая обработка результатов исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности регенерации льна-долгунца (.Linum usitatissimum L.)

3.1.1. Возраст экспланта

3.1.2. Величина экспланта

3.1.3. Фитогормоны в питательной среде

3.1.4. Место инициации •

3.1.5. Генотип

3.2. Регенерация льна многолетнего (Linum perenne L.) и льна крупно цветкового

Linum grandiflorum Desf.)

3.2.1. Возраст сегментов гипокотилей

3.2.2. Состав питательной среды

3.3. Сравнительная характеристика регенерации различных видов рода Linum

3.4. Стимуляция роста и морфогенеза растений льна in vitro ассоциативными метилобактериями Methylovorus mays

3.4.1. Колонизация семян

3.4.2. Влияние метилобактерий на эффективность регенерации эксплантов

3.5. Индукция процессинга Т-ДНК экссудатами растений льна

3.6. Трансформация растений льна-долгунца

3.7. Получение трансгенных растений льна-долгунца, устойчивых к гербициду фосфинотрицину

3.8. Агробактериальная трансформация льна крупноцветкового и льна многолетнего

3.8.1. Изучение действия антибиотиков на регенерацию растений при подборе селективной среды

3.8.2. Анализ способов трансформации эксплантов • 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121 ВЫВОДЫ 123 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка эффективной системы генетической трансформации льна-долгунца (Linum usitatissimum L. ) и дикорастущих видов рода Linum"

Перспективными современными методами являются генетическая и клеточная инженерия, позволяющие вводить в геном растений гетерологичные гены, выделенные из из представителей других таксонов животного и растительных царств или синтезированные химическим путем. Эти методы, в частности, делают возможным создание растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам, насекомым и болезням, вызывающим существенную потерю урожая и снижающим качество семян и волокна.

Известны единичные работы по разработке регенерации льна-долгунца четырех отечественных сортов с подбором питательных сред для эффективной регенерации побегов из эксплантов различного типа (Поляков с соавт., 1991). Получены трансгенные каллусы и побеги льна-долгунца, содержащие маркерный ген nptll (Чикризова, 199?) и растения-трансформанты, устойчивые к гербицидам группы хлорсульфурона (Чикризова и Поляков, 1996). Однако существующие методы дают низкую частоту трансформации (не более 5%).

Для увеличения частоты трансформации льна-долгунца необходимо определить оптимальные условия регенерации побегов: возраст, место инициации и величину экспланта, генотип, гормональный состав питательной среды, способ инокуляции эксплантов и агробактериальный штамм, используемый для трансформации.

В связи с народно-хозяйственной ценностью льна-долгунца актуальна разработка эффективного способа регенерации растений in vitro и на его основе системы трансформации, посредством Ti-плазмид агробактерий, с целью создания ценного материала для селекции.

Коллекция дикорастущих видов льна, которая потенциально может служить источником генов устойчивости к болезням, в т.ч. ржавчине льна Melampsora Uni (Ehrenb.) Lev., вредителям, засухе, заморозкам, засолению и защелачиванию почв, а также неизученным резервуаром генов ценных масел, в настоящее время в селекции практически не задействована из-за сложности межвидовой гибридизации (Wicks а. Hammond, 1978). Методы клеточной и генетической инженерии могут позволить преодолеть эти сложности, а также разнообразить и обогатить ассортимент дикорастущих видов рода Linum, выращиваемых в качестве декоративных растений в цветоводстве многих стран. Сведения о культивировании дикорастущих видов льна в культуре in vitro единичны (Zhan et al., 1989). Работы по агробактериальной трансформации дикорастущих видов льна, в том числе декоративных, отсутствуют.

Разработка эффективных систем регенерации и агробактериальной трансформации льна крупноцветкового {Linum grandiflorum Desf.) и льна многолетнего {Linum perenne L.) служит основой для изучения особенности культивирования in vitro дикорастущих видов рода Linum - источников ценных генов для селекции культурного льна и, возможно, улучшить их декоративные характеристики.

Цель настоящей работы состояла в разработке эффективной системы агробактериальной трансформации льна-долгунца {Linum usitatissimum L.), дикорастущих видов рода Linum - льна крупноцветкового и льна многолетнего, а также получение растений льна-долгунца отечественных сортов, устойчивых к гербициду фосфинотрицину (BASTA).

В задачи исследования входило:

1. Подбор оптимальных условий (возраст, величина и место инициации экспланта, гормональный состав питательной среды), обеспечивающих частоты регенерации льна-долгунца, с анализом регенерационного потенциала ценных сортов отечественной Ьелекции.

2. Разработка методики культивирования in vitro и регенерации растений льна крупно цветкового и льна многолетнего из различных соматических тканей.

3. ' Анализ возможности использования ассоциативных метилотрофных бактерий Methylovorus mays в оптимизации условий регенерации растений.

4. Анализ различных видов рода Linum на присутствие у них сигнальных соединений, индуцирующих процессинг Т-ДНК. Определение сортов и эксплантов льна-долгунца, обладающих наибольшей индуцирующей активностью.

5. Получение трансгенных растений льна-долгунца, льна крупноцветкового и льна многолетнего, содержащие маркерные гены nptll и gus.

6. Получение трансгенных растений льна-долгунца, содержащих целевой ген bar и устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Анализ возможности использования метилотрофных бактерий для увеличения частоты агробактериальной трансформации льна-долгунца.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Каляева, Марина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Выявлены различия в морфогенезе льна-долгунца и льна масличного. Установлены физиологические условия оптимальной регенерации льна-долгунца. Отобраны сорта льна-долгунца отечественной селекции с высокой частотой регенерации.

2. Разработана эффективная методика регенерации двух дикорастущих видов рода Linum - льна крупноцветкового и льна многолетнего.

3. Колонизация эксплантов льна in vitro ассоциативными облигатными метилобактериями Methylovorus mays увеличивает эффективность и частоту регенерации, значительно сокращает сроки пролиферации побегов. Колонизированные метилобактериями растения отличались хорошей укореняемостью и легкой адаптацией к условиям in vivo по сравнению с неколонизированными растениями.

4. Установлена зависимость между присутствием у растений сигнальных соединений, индуцирующих процессинг агробактериальной Т-ДНК и их таксономическим положением. Проанализированы 5 видов рода Linum на присутствие у них этих сигнальных соединений.

5. Разработана эффективная система агробактериальной генетической трансформации льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) и Linum perenne L. и Linum grandiflorum

124

Desf. Новая система регенерации и колонизации эксплантов метилобактериями сокращает сроки получения трансгенных растений и увеличивает частоту трансформации до 20%.

6. Получены каллусы и побеги льна-долгунца и дикорастущих видов льна, содержащие маркерные гены прШ и gus. Получены трансгенные растений льна-долгунца (сорт А-29), содержащие ген bar и устойчивые к гербициду фосфинотрицину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов нами была разработана эффективная система регенерации и агробактериальной трансформации льна-долгунца и дикорастущих видов рода Linum - льна крупноцветкового и многолетнего.

Проведенные эксперименты показали, что органогенез льна-долгунца в значительной мере зависел от генотипа, величины, возраста и места инициации экспланта, концентрации НУК в питательной среды, а также видовых особенностей этого растения. Установлена пониженная морфогенетическая активность льна-долгунца по сравнению с льном масличным.

Экспланты сорта А-29 обладали наиболее высокой эффективностью регенерации (96,7%) по сравнению с другими сортами льна-долгунца.

Проанализирована морфогенетическая способность гипокотильных, семядольных и корневых сегментов льна крупноцветкового и многолетнего. Установлено, что сегменты гипокотиля являются оптимальными эксплантами не только для культурных видов рода Linum, но и дикорастущих. Частота регенерации дикорастущих видов льна зависела прежде всего от возраста и состава питательной среды.

Разработанная нами методика колонизации растений льна ассоциативными метилобактериями Methylovorus mays увеличивает всхожесть семян, эффективность и частоту регенерации, а также значительно сокращает сроки пролиферации побегов льна. Колонизированные растения отличались хорошей укореняемостью и легкой адаптацией к условиям in vivo по сравнению с неколонизированными растениями.

Синтез метилобактериями фитогормонов и, предположительно витаминов, позволяет выращивать растения на обедненных средах с достаточно высокой эффективностью.

Проанализированы 5 видов рода Linum на присутствие у них сигнальных соединений, индуцирующих процессинг агробактериальной Т-ДНК. Отобраны виды, экспланты и сорта, характеризующиеся высокой индуцирующей активностью. Установлена зависимость между индуцирующей активностью растений и их таксономическим положением в филогенетической системе отдела Покрытосеменные. Представители подклассов Rosidae и Asteridae обладают наибольшей способностью индуцировать процессинг Т-ДНК.

Получены каллусы и побеги льна-долгунца и дикорастущих видов льна, содержащие маркерные гены nptll и gus. Перенос гена nptll был доказан ростом трансгенных каллусов и растений на канамицине, наличием фермента NPTII и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), а перенос гена gus - наличием активности фермента (3-глюкуронидазы. Получены трансгенные растения льна-долгунца (сорт А-29), несущие ген bar и обладающие устойчивостью к гербициду фосфинотрицину. Вставка гена bar была доказана ростом побегов в селективных условиях на среде, содержащей 20 мг/л гербицида, и ПЦР-анализом.

Новая система регенерации и колонизации эксплантов метилобактериями сокращает сроки получения трансгенных растений и увеличивает частоту трансформации до 20%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каляева, Марина Александровна, Пущино

1. Балохина Н.В., Каляева М. А., Бурьянов Я.И. Разработка эффективных систем регенерации (Fragaria vesca L.) для проведения агробактериальной трансформации // Биотехнология. 2000. N1. С.46-51.

2. Бурьянов Я.И. Проблемы и перспективы использования векторов на основе Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens для генетической инженерии растений // Биотехнология. 1985. N2. С. 67-74.

3. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 930-944.

4. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. С. 171-188.

5. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток и растений. М.: Наука, 1975. 51 с.

6. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

7. Бутенко Р.Г., Строгонова Б.П., Бабаева Ж. А. Соматический эмбриогенез в культуре ткани моркови в условиях высоких концентраций солей в среде // ДАН. 1967. Т. 175. N5. С. 1179-1181.

8. Внучкова В.А., Аш O.A. Использование ацетона в составе питательных сред с целью увеличения выхода регенерантов // Докл. Акад. с/х наук. 1992. N9-10. С. 10 -12.

9. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий: Автореф. дис. на соискание ученой степени докт. биол. наук. Пущино: Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН, 1999, 33 с.

10. Доронина Н.В., Кудинова JIB., Троценко Ю.А. Methylovorum mays новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Микробиология. 2000. Т. 69. N5. С. 712-716.

11. Егорова Т.В. Семейство льновые (Linaceae) / Жизнь растений / Под ред. Тахтаджяна А.Л. М.: Просвещение, 1981. Т.5(2). 512 с.

12. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами однодольных растений // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 266-275.

13. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Техника генетической трансформации разных сортов сахарной свеклы // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 79-85.

14. ИвановаЕ.Г., ДоронинаН.В., Шепеляковская АО., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины//Микробиология, 2000. Т. 69. N6. С. 764-769.

15. Картель H.A., Забенькова К.И., Манешина Т.В., Аблов С.Е. Растения ячменя с введенным геном канамицинустойчивости // Докл. АН БССР. 1990. Т. 34. N3. С. 261263.

16. Киелен Ф., Калинина Е., Мазин В. Эхинацея in vitro // Цветоводство. 1996. N4. С. 9-10.

17. Колесниченко В.М. Генетическая инженерия древесных растений // Лесоведение. 1989. N6. С. 73-83.

18. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Ацетон как нетрадиционная добавка к среде культивирования клеток пшеницы // ДАН. 1995. Т. 342. N1. С. 115-118.

19. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. 243 с.

20. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

21. Левенко Б. А. Биотехнология растений: сегодня и завтра // Физиология и биохимия культурных растений. 1999. Т. 31. N3. С. 163-172.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

23. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987. 383 с.

24. Носов А.М. Лекарственные растения. М.: Эксмо-Пресс, 1999. 350 с.

25. Носов А.М. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент// Физиология растений. 1999. Т. 46. N6. С. 837-844.

26. Поляков A.B., Кельнер Е.В., Лемешко И.И., Слюсаренко А.Г., Суворова В.В. Органогенез и регенерация у льна-долгунца в культуре in vitro. -Технические культуры: селекция, технология, переработка. -М.: Агропромиздат, 1991. С. 192-199.

27. Приступа A.A. Основные сырьевые растения и их использование. Л.: Наука, 1973. 412 с.

28. Приходько С.Н., Яременко Л.М., Черевченко Т.М. и др. Декоративные растения открытого и закрытого грунта. Справочник под редакцией акад. Гродзинского А.М. К.: Наукова Думка, 1985. 664 с.

29. Сатарова Т.Н. Генетическая трансформация у растений кукурузы. Выбор объектов для переноса чужуродных генов. Ососбенности трансгенеза и наследования // Сельскохозяйственная биология. 1999.N5. Р. 103-109.

30. Сидорович Е. А. и Кутас E.H. Клональное микроразмножение новых плодовых ягодных растений. Минск: Наука и техника, 1996. 246 с.

31. Симоненко Ю.В., Глеба Ю.Ю., Кучук Н.В. Двойная трансформация фосфинотрицинустойчивых растений коммерческих линий гороха // Физиология растений. 1999. Т. 46. N6. Р. 915-918.

32. Тахтаджян A.JI. Классификация и филогения цветковых растений. // Жизнь растений. / Под ред. Тахтаджяна A.JI., М. : Просвещение, 1980. Т.5(1). С. 107-112.

33. Юсуфов А.Г. Культура изолированных листьев. М.: Наука, 1988, 250 с.

34. Юсуфов А.Г. Механизмы регенерации растений. Ростовский Университет, 1982, 172 с.

35. Чикризова О.Ф., Поляков А.В. Оптимизация условий получения трансгенных растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона // Сельскохозяйственная биология. 1996. N3. С. 117-119.

36. Чикризова О.Ф. Создание форм льна-долгунца на основе генетической трансформации Agrobacterium tumefaciens: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. с/х. наук. Москва: Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева, 1997, 16 с.

37. Шепеляковская А.О., Доронина Н.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. новые данные о способности метилотрофных бактерий синтезировать цитокинины // Докл. РАН. 1999. Т. 368. N4. С. 555-557.

38. Шредер Д., Дегрев Г., Гернальстинс Д.П. и др. Перенос генов в клетки высших растений посредством Ti-плазмиды // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987. С. 287-300.

39. Ahuja M.R. Protoplast research in woody plants // Silvae genet. 1984. V, 33. N1. P. 32-37.

40. Akella V., Lurguin P.F. Expression in cowpea seedlings of chimeric transgenic after electroporation into seed-derived embryos // PI. Cell Rep. 1993. V. 12.'N2. P. 110-117.

41. Aldemita R.R., Hodges T.K. Agrobacerium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties // Planta. 1996. V.199. P. 612-617.

42. Anderson N., Kirihara J. Selection of stable transformants from Black Mexican sweet maize suspension cultures // The Maize Handbook / Eds. M. Freeling, V. Walbot. New York: Springer, 1994. - P. 690-694.

43. Ankenbauer R.G., Nester E.W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 6442-6446.

44. Asano Yoshito, and Masashi Ugaki Transgenic plants of Agrostis alba obtained by electroporation-mediated direct gene transfer into protoplasts // PI. Cell Rep. 1994. N5. V. 13. P. 243-246.

45. Baracat M.N., Cocking E.C. Plant regeneration from protoplasts-derived tissues ofLinum usitatissimum L. (flax) // PI. Cell Rep. 1983. V. 2. P. 314-317.

46. Barakat M.N. and Cocking E.C. An assessment of the cultural capabilities of protoplasts of some wild species of linum // PI. Cell. Rep. 1985. V. 4. P. 164-167.

47. Barton K., Binns A., Matzke A., Chilton M. D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA to R1 Progeny // Cell. 1983. V. 32. P. 1033-1043.

48. Basiran N., Armitage P., Scott R.J., Draper J. Genetic transformation of flax (Linum usitatissium L.) by Agrobacterium tumefaciens: regeneration of transformed shoots via a callus phase // PI. Cell Rep. 1987. V. 6. P.396-399.

49. Beard B.H., Comstock V.E. In: Hybridization of crop plants. American Society of Agronomy-Crop Science Society of America. 1990. P. 357-366.

50. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue // Plant J. 1994. V. 5. N2. P. 299-307.

51. Bretagne B., Marrie-Christine Chupeau, Yves Clupeau, and Guy Fouilloux Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as cytokinin source // PI. Cell Rep. 1994. V.14. P. 120-124.

52. Bevan M.W., Flavell R, Chiton M.-D. A chimeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for higher plant transformation // Nature. 1983. V. 304. P. 184-187.

53. Bidney D., Scelonge C., Martich et al. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens // Plant Mol. Biol. 1992. V. 18. N2. P. 301-313.

54. Bolton G.W., Nester E.W., Gordon M.P. Plant phenolic compounds induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence // Science. 1986. V. 232. P. 983985.

55. Booy G., Krens F., Huizing H. Attempted pollen mediated transformation of maize // J. Plant Physiol. 1989. V. 135. N3. P. 319-324.

56. Bradford M.M. A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

57. Caboche M., Deshayes A. Utilization de liposomes pour la transformation de protoplastes de mesophylle de E.coli leur conférant la resistance a la kanamycine // C. R. Acad. Sci. 1984. Ser. III. P. 663-666.

58. Castillo A.M., Vasil V., Vasil I.K. Rapid production of fertile transgenic plants of rye (Secale cereale L.) // Ibid. 1994. V. 12. N12. P. 1366-1371.

59. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 971-980.

60. Crossway A., Hauptli H., Houck C. et al. Micromanipulation techniques in plant biotechnology//Biotechnology. 1986. V. 4. P. 320-334.

61. Crossway A., Oakes J., Irvine J. et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts //Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. Î79-185.

62. Datta, S. K., Datta K., Soltanifar, N., Donn, G. and Potrykus, I. Herbicide resistant Indica rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts // Plant Molec. Biol. 1992. V. 20. N4. P. 619-629.

63. De Cleene M., De Ley J. The host range of crown gall // Bot. Rev. 1976. V. 42. P. 389466.

64. De Cleene, and J. De Ley. The host range of infectious hairy-root // Bot. Rev. 1981. V. 47. P. 147-194.

65. De Cleene M. The susceptibility of monocotyledons to Agrobacterium tumefaciens // Phytopathol. Z. 1985. V. 113. P. 81-89.

66. De Greve H., Dhaese P., Seurinck J., Lemmers M., Van Montagy M., Schell. Nucleotide sequence and trasncript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid-encoded octopin synthase gene // J. Mol. Appl. Genet. 1983. V. 1. P. 499-513.

67. Dennebey B.K., Petersen W.L., Ford-Santino C. et al. Comparison of selective agents for use with the selectable marker gene bar in maize transformation // Plant Cell, Tis. And Org. Cult. 1994. V. 36.N1.P. 1-7.

68. Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. Nopaline synthase transcript mapping and DNA sequence // J. Mol. Appl. Genet. 1989. V. 1. P. 561-575.

69. D'Halluin K., Bonne E., Bossut M. et al. Transgenic maize plants by tissue electroporation // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 1495-1505.

70. Dekeyser R., Claes B., De Rycke R. et al. Transient gene expression in intact and organized rice tissues // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 591-602.

71. De Wet J.M., Bergquest R., Harlan J. Exogenous gene transfer in maize using DNA-treated pollen // Exp. Manipulation of ovule tissues /Ed. P. Charman.: New York, 1985. P. 197-209.

72. Dillen W., Engler G., Van Montagu M. et al. Electroporation-mediated DNA delivery to seedling tissues of Phaseolus vulgaris L. (common bean) // PI. Cell Pep. 1995. V. 15. N1/2. P. 119-124.

73. Dong Jin-Zhio, McHughen Alan. Patterns of transformation intensity on flax hypocotyls inoculated with Agobacterium tumefaciens II PI. Cell Rep. 1991. V. 10'. P. 555-560.

74. Draper J., Davey M. A., Freeman J.P. et al. Ti plasmid homologous sequences present in tissue from Agrobacterium plasmid transformed petunia protoplasts // Plant Cell Physiol. 1982. V. 23. P. 451-458.

75. Draper J., Scott R., Armitage Ph., Walden R. Plant Genetic Transformation and gene expression // A Laboratory Manual / Eds Draper J., Scott R., Armitage Ph. L.: Blackwell Sci. Publ., 1988. 408 p.

76. Edwards K., Johnstone C., Thompson S. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

77. Fall R. Cycling of methanol between plants, methylotrophs and the atmospere. // In microbiol growth on CI compounds /Eds. M.E. Lidstram, F.R. Tabita. Dordrecht: Klumer. 1996. P. 343-350.

78. Finner J .J., Vain P., Jones M. W. et al. Development pf perticle inflow gun for DNA delivery to plant cells // PL Cell Rep. 1993. V. 13. P. 323-328.

79. Firmin J.L., Wilson K.E., Rossen L., Jolnston A.W.B. Flavonoid activation of nodulation genes in Rhizobium reversed by other compounds present in plants // Nature. 1986. V. 324. N6092. P. 90-92.

80. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R. et al. Expression of bacterial genes in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4803-4807.

81. Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5828.

82. Gamborg O.L., Shyluk J.P. Tissue culture, protoplasts and morphogenesis in flax // Bot. Gaz. 1976. V. 137. N4. P. 301-306.

83. Godwin I., Gordon Todd, Brian Ford-Lloyd, and H. John Newbury The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterhim-mediated transformation vary according to plant species //PI. Cell Rep. 1991. V. 9. P. 671-675.

84. Gould J., Devey M., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., Smith R.H. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex // Plant Physiol. 1991. V. 95. P.426-434.

85. Greisbach R.J. Protoplast microinjection // Plant. Mol. Biol. Report. 1983. V. 1. P. 32-37.

86. Hauptmann R.M., Oxias-Akins P., Vasil V. et al. Transient expression of electroporated DNA in monocotyledonous and dicotyledonous species // PI. Cell Rep. 1987. V. 6. N4. P. 265-270.

87. He D.G., A. Mouradov, Y.M. Yang, E. Mouradova, and K.J. Scott. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) through electroporation of protoplasts // PI. Cell Rep. 1994. V. 14. P. 192-196.

88. Hererra-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Schell J. Expression of chimeric genes transferred into plant cell using a Ti-plasmid -derived vector//Nature. 1983. V. 303. P. 209-213.

89. Hererra-Estrella L., de Block M., Messens E. et al. Chimaeric genes as dominant selectable marcers in plant cells // EMBO J. 1983. V. 2. P. 987-995. .

90. Hernalsteens J.-P., Thia-Toong L., Schell J., Van Montagy M. An Agrobacterium transformed cell culture from the monocotyledon Asparagus officinalis //EMBO J. 1984. V. 3. P. 3039-3041.

91. Hess D. Pollen-based techniques in genetic manipulation // Int. Rev. Cytology. 1987. V. 107. P. 367-395.

92. Hoekema A., Hirsch P.B., Hookaas P.J.J., Schilperoort RA. A binary plant vector, strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid //Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.

93. Holland Mark. Methylobacterium and plants // Recent Res. Devel. In Plant Physiol. 1997. V. l.P. 207-213.

94. Holland Mark A. Occam's razor applied to hormonology. Are cytokinins produced by plants? // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 865-868.

95. Holsters M., Villarroel R, Giclen J., Seurinck J., De Greve H., Van Montagu M., Schell J. An analysis of the boundaries of the octopine T-DNA in tumors induced by Agrobacterium tumefaciens //Mol. Gen. Genet. 1983. V. 190. P. 35-41.

96. Horch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L. et al. A simple and general methods for transferring genes into plants // Science. 1985. V. 227. P. 1229-1231.

97. Horn M.E., R.D. Shillito, B.V. Conger, and C.T. Harms Transgenic plants of Orchardgrass (Dactylis glomerata L.) from protoplasts // PI. Cell. Rep. 1988. V. 7. P. 469472.

98. Huang M.-L.W., Cangelosi G.A., Halperin W., Nester E.W. A chromosomal Agrobacterium tumefaciens gene required for effective plant signal transduction // J. Bacterid. 1990. V. 172. P. 1814-1822.

99. Hull R., Davies J.W. Genetic engineering with plant viruses and their potential as vectors // Adv. Virus Res. 1983. V. 28. P. 1-33.

100. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan M.W. GUS fusions: ^-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. V. 6. P. 33013307.

101. Jenes B., Bittencurt P., Csanyi A. et al. The gene booster a new microparticle bombardment device - for genetic transformation of plants // Plant tissue culture and biotechnology. 1996. V. 2. N1. P. 42-52.

102. Jordan M.C., McHughen A. Glyphosate tolerant flax plants from Agrobacterium mediated gene transfer // PI. Cell Rep. 1988. V. 7. P. 281-284.

103. Jordan M.C., McHughen A. Selection for chlorsulfuron resistens in flax (Linum usitatissimum L.) // J. Plant Physiol. 1987. V. 131 P. 333-338.

104. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanferd J.C. High-velocity microinjectiles for deliveringnucleic acids into living cells//Nature. 1987. V. 327. P. 70-73.

105. Kloti A., Iglesias V.A., Wunn J. et al. Gene transfer by electroporation into intact scutellum cells of wheat embryos // PI. Cell Rep. 1993. V. 12. N12. P. 671-675.

106. Koukolikova-Nicola Z., Shillito R.D., Hohn B., Wang K., Van Montagu M., Zambryski P. Involvement of circular intermadiates in the transfer of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens to plant cells // Nature. 1985. V. 313. P. 191-197.

107. KozielM., Beland G., Bowman C. et al. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillis thuringiensis//Biotechnol. 1993. V. 11. P. 194-200.

108. Lawrence W. A., Davies D.R. A method for microinjection and culture of protoplasts at very low densities // PI. Cell Rep. 1985. V. 4. P. 33-35.

109. Lechtenstein С., Draper J. Genetic engineering of plants // DNA cloning / Ed. Glover D.M. Oxford; Washington; IRL Press, 1984. V. 2. P. 67-119.

110. Ledoux L., L. Diels, Huart R. Et al. Transfer of bacterial and human genes to germinating Arabidopsis thaliana // Arabidopsis inform. Service. 1985. V. 22. P. 1-12.

111. Lee Y.-N., Jin S., Sim W.-S., Nester E.W. The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the vir A protein//Gene. 1996. V. 179. P. 83-88.

112. Leroux В., Yanofsky M.F., Winans S.C., Ward J.E., Ziegler S.F., Neater E.W. Characterization of the vir A locus of Agrobacterium tumefaciens; a transcriptional regulator and host range determinant // EMBO J. 1987. V. 6. P. 849-856.

113. Levenko B. A., Rubtsova M. A., Taranenko L.K. et al. Transfer of gene conferring herbicide bialophos resistance into buckwheat plants // Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. N5. С. 416-448.

114. Li L., Qu R., De Kochko A. et al. An improved rice transformation system using the biolistic method//PI. Cell Rep. 1993. V. 12. N5. P. 250-255.

115. Link G.K.K, and Eggers V. Mode, site and time of initiation of hypocotyledonary bud primordia inLinum usitatissimum L. //Botanical Gazette. 1946. V. 107. P. 441-454.

116. Linsmaier E.M., Skoog F. Organic growth factor requirement of tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1965. V. 18. N1. P. 100-127.

117. Long R., Morris R., Polacco J. Cytokinin production by plant-associated methylotrophic bacteria // Am. Soc. Plant Physiol. 1997. Abstr. N1168.

118. Lowe K., Bowen В., Hoerster G. et al. Germline transformation of maize following manipulation of chimeric shoot meristems // Biotechnol. 1995. V. 13. N7. P. 677-682.

119. Luo Z., Wu R. A simple method for the transformation of rice via the pollen tube pathway //Plant Mol. Biol. Rep. 1988. V. 6. N3. P. 165-174.

120. Mathias R.J., Boyd L.A. Cefataxime stimulates callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L. Em. Thell.) // Plant Sci. 1986. V. 46. P. 217-223.

121. Mathias R.J. and C. Mukasa. The effect of cefotaxime on the growth and regeneration of callus from four varieties of barley (Hordeum vulgare L.) // PI. Cell Rep. 1987. V. 6. P. 454457.

122. McCabe D.E., Swain W.F., Martinell B.J. et al. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration // Ibid. 1988. V. 6. N9. P. 923-926.

123. McHughen A. Agrobacterium-medhted transfer of chlorsuliuron resistance to commercial flax cultivars // PI. Cell Rep. 1989. V. 8. P. 445-449.

124. McHughen A., Swartz M. A tissue-culture derived salt-tolerant line of flax (.Linum usitatissimum L.) // J. Plant Physiol. 1984. V. 117. P. 109-117.

125. McHughen Alan, Jorden Mark, and Gine Feist A preculture period prior to Agrobacterium inoculation increases production of transgenic plants // J. Plant Physiol. 1989. V. 135. P. 245-248.

126. Mlynarova L., Bauer M., Nap J-P., Pretova A. High efficiency Agrobacterium-medidLtzd gene transfer to flax // PI. Cell Rep. 1994. V. 13. P. 282-285.

127. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures//Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

128. Murray B.E., Handyside R.J., Keller W. A. In vitro regeneration of shoots on stem explants of shoots on stem explants of haploid and diploid flax (Linum usitatissimum L.) // Can. J. Genet. Cytol. 1977. V. 19. P. 177-186.

129. Nagy F., Kay S.A., Chua V.-H. Analusis of gene expression in transgenic plants // Plant molecular biology manual. / Ed. Gelvin S.B., Schiperoort R. A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. V. 4. P. 1-29.

130. NehraN.S., Chibbar R.N., Kartha K.K., Datla R.S., Crosby W.L., StushnofFC. Genetic transformation of strawberry by A. tumefaciens using a leaf disc regeneration system //. PI. Cell Rep. 1990. V. 9. P. 293-298.

131. Ohta Y. High efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. N3. P. 715-719.

132. Ootsdam Andre, Jos N.M. Mol, and Linus H.W. van der Plas. Establishment of hairy root cultures of Linum flavum producung the lignan 5-methoxypodophyllotoxin // PI. Cell. Rep. 1993. V. 12. P. 474-477.

133. Ow D.W., Wood K.V., Deluca M., De Wet J.R., Helinki D.R., Howell S.H. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants // Science. 1986. V. 234. P. 856-859.

134. Owens L.D. Kanamycin promoters morhogenesis of plant tissues // Plant Sci. Lett. 1979. V.16. P. 225-230.

135. Pena A., Lozz H., Shell J. Transgenic rye plants obtained by injection DNA into young floral tillers//Nature. 1987. V. 325. P. 274-276.

136. Perani L., Radke S., Wilke-Douglas M., Bossert M. Gene transfer methods for crop improvement: Introduction of foreign DNA into plants // Physiol. Plantarum. 1986. V. 68. P. 566-570.

137. Peters N.K., Frost J. W., Long S.R. A plant flavone, luteolin, induces expression of Rhizobium meliloti nodulation genes // Science. 1986. V. 223. N4767. P. 977-980.

138. Petit A., Tempe J., Kerr A., Holstes M., van Montagu M., Shell J. Substate induction of conjugative activity ofAgrobacteium tumefaciensTi plasmid //Nature. 1978. V. 271. P. 570572.

139. Pretova A., Willams E.G. Direct somatic embriogenesis from immature zygotic embrios of flax (Linum usitatissimum L.) II J. Plant Physiol. 1986. V. 126. P. 155-161.

140. Puonti-Kaerlas J., Priska Stabel, and Tage Eriksson. Transformation of pea (Pisum sativum L.) by Agrobacterium tumefaciens //PI. Cell. Rep. 1989. V. 8. P. 321-324.

141. Purnhauser L., Medquesy P., Czako R.M. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifolia Viv. tissue cultures using the ethylene inhibitor AgNo3 //PI. Cell Rep. 1987. V. 6. N1. P. 1-4.

142. Pythoud F., Sinkar V.P., Nester E.W., Gordan M.P. Increased virulence of Agrobacterium rhizogenes conferred by the vir-region of pTiBo542: Application to genetic engineering of poplar // Biotechnology. 1987. V. 5. P. 1323-1327.

143. Reiss B., Sprengel R., Will H., Schaller H. A new sensitive method for quantitative and qualitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts // Gene. 1984. V.30. P. 211-218.

144. Rybczynski J.J. Callus formation and organogenesis of mature cotyledons of Linum usitatissimum L. var Szokijskij in vitro cultures // Gene. Pol. 1975. V. 16. P. 161-172.

145. Sahi S.V., Chilton M.D., Chilton W.S. Corn metabolotes affect growth and virulence of Agrobacterium tumefaciens // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. N10. P. 3879-3883.

146. Sato S., Newell C. et al. Stable trasformation via perticle bombardment in two different soybean regeneration systems // PI. Cell Rep. 1993. V. 12. N7. P. 408-413.

147. Saunders J. A., Matthews B.F., van Wert S.L. Pollen electrotransformation for gene transfer in plants // Guide to Electroporation and Electrofusion. SanDiego; NY: Acad. Press, 1992. P. 227-247.

148. Schroth M.N., Hancock J.G. Disease-Suppressive soil and root-colonizing bacteria // Science. 1982. V. 216. P. 1376-1381.

149. Shenk R.U. and Hildebrandt A.C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can. Journal of Botany. 1972. V. 50. P. 199-204.

150. Shimamoto Ko, Rie Ferada et al. Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts //Nature. 1989. V. 338. N6212. P. 274-276.

151. Songstad David D., David R. Duncan, and Jack M. Widholm Effect of 1-aminocyclopropane-lcarboxylic acid, silver nitrate, and norbornadine on plant regeneration from maize callus culrures // Plant Cell Reports. 1988. V. 7. P. 262-265.

152. Songstad D., Halaka F., DeBoer D. et al. Transient expression of GUS and anthocyanin constructs in intact maize immature embryos following electroporation // Plant Cell. 1993. V. 33. P. 195-201.

153. Songstad D., Armstrong C., Petersen W. et al. Production of transgenic maize plants and progeny by bombardment of Hi-II immature embryos // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 1996. V. 32. P. 179-183.

154. Spencer P. A., Towers G.H.N. Specificity of signal compounds detected by Agrobacterium tumefaciens//Phytochemistry. 1988. V. 27. P. 2781-2785.

155. Stachel S.E., Messens E., Van Montagu M., Zambryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens //Nature. 1985. V. 318. P. 624-629.

156. Steinbiss H., Stabel P. Protoplast derived tobacco cells can survive.capillart microinjection of fluorescent dye Lucifer Yellow // Protoplasma. 1983. V. 16. P. 223-227.

157. Thomas T.H. Biotechnological advances in sugar beet research // Genet. Engen. Biotechnol. 1991. V. 11. P. 14-17.

158. Thompson C.T., Mowa N., Tizard R., Cramer R, Davies J., Lauwereys M., Botterman J. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus II EMBO J. 1987. V.6. P. 2519-2523.

159. Topfer R, Gronenborn B., Schell J., Steinbiss H. Uptake and transient expression of chimeric genes in seed-derived embryos//Plant Cell. 1989. V.l. N1. P. 133-139.

160. Usami S., Morikawa S., Takedo J., Machida Y. Absence in monocotyledonous plants of the diffusible plant factors inducing T-DNA circularization and vir gene expression in Agrobacterium //Mol. Gen. Genet. 1987. V. 209. P. 221-226.

161. Vain P., Keen N., Nurillo J. et al. Development of the particle inflow gun // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1993. V. 33. N3. P. 237-246.

162. Watad A. A., Yun D.-J., Matsumoto T. et al. Microprojectile bombardment-mediated transformation ofLilium longiflorum //PI. Cell Rep. 1998. V. 17. P. 262-267.

163. Watts J.W., King J.M., Stacey N.J. Inoculation of protoplast with viruses by electroporation // Virology. 1987. V. 157. N1. P. 40-46.

164. White F.F., Nester E.W. Hairy root: encodes virulence traits in Agrobacterium rhizogenes in transferred to and expressed in axenic hairy root tissue // Mol Gen. Genet. 1982. V. 186. P. 16-22.

165. Whichers Harry J., Marien P. Harkes and Randy R.J. Arroo. Occurrence of 5-methoxypodophyllotoxin in plants, cell cultures and regenerated plants of Linum flavum II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. V. 23. P. 93-100.

166. Wicks Z.W., III and J.J. Hammond Screening of flax species for new sources of genes resistant toMelampsora lini (Ehrenb.) Lev.) // Crop Science. 1978. V. 18. P. 7-10.

167. Willmitzer L., Sanchez Serrano J., Bushfeld E., Shell J. DNA from Agrobacterium rhizogenes in transferred to and expressed in axenic hairy root tissue // Mol. Gen. Genet. 1982. V. 186. P. 16-22.

168. Zaenen I., Van Laebeke N., Teuchy H., Van Montagu M., Shell J. Supercoiled circula DNA in crown gall-inducing Agobacteium strains I I J. Mol. Biol. 1974. V. 86. P. 109-127.

169. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Shell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. 1983. V. 2. P. 2143-2150.

170. Zhan X.-c., D.A. Jonec and A. Kerr In vitro plantlet formation in Linum marginale from cotyledons, hypocotyls, leaves, roots and protoplasts // Aust. J. Plant. Physiol. 1989. V. 16. P. 315-320.

171. Zhan Xiang-can, David A. Jones and Allen Kerr Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes II PI. Mol. Biol. 1988. V. IIP. 551-559.

172. Zhan X.-c., David A. Jonec and A. Kerr Regeneration of shoots on root explants of flax // Annals of Botany. 1989. V. 63. P. 297-299.

173. Zhou H., Stiff C.M., Konzak C.F. Stably transformed callus of wheat by electroporation-induced direct gene transfer//PI. Cell Rep. 1993. V. 12. N11. P. 612-616.145