Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15

Дорохов, Борис Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15"

На правах рукописи

ии3057Б9б

Дорохов Борис Дмитриевич

Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003057696

Работа выполнена в Лаборатории систем клонирования Центра «Биоинженерия» РосЫ наук.

молекулярного йской академии

Научный руководитель: доктор биологический наук

Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Прозоров Александр Александрович

доктор биологических наук, профессор Аграновский Алексей Аи атольевич

Ведущая организация: Институт микробиологии

им. С. Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится «-г/г .» марта 2007 Г- в г у часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском

государственном университете им. М. В. Ломоносова по Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ Физико-химическс А. Н. Белозерского, Лабораторный корпус «А».

адресу: 119992, й биологии им.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « /б » февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Н. О. Кал:

инина

Введение

Актуальность проблемы

Механизмы стабильного наследования линейных бактериальных репликонов в настоящее время не изучены. Мы

исследуем явление стабильного наследования на примере бактериофага N15, особенностью которого является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому Escherichia coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами. Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F, но имеется ряд особенностей в устройстве Sop системы N15 в сравнении с плазмидой F и другими кольцевыми репликонами. Центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, а представлен

четырьмя повторами, распределенными в геноме, причем каждый из

Ravin and Lane, ряд данных,

этих сайтов функционирует в качестве центромеры 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001). Имеется свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии гег ов фага. В то же время sop опероны кольцевых плазмид являются изолированными генетическими модулями. Изучений молекулярных механизмов, обеспечивающих правильное распределение линейных низкокопийных плазмид в бактериальных клетках, вклад в понимание механизмов наследования генетиче у прокариот.

Цели и задачи работы

Целью работы является изучение особенностей струю урной и функциональной организации локусов, обеспечивающие сегрегационную стабильность линейных бактериальных примере профага N15, и установление возможных взаим

внесет важный ского материала

репликонов, на зсвязей между

установить

процессами сегрегационной стабильности, репликации ДНК, образованием теломер и контролем экспрессии генов на разных стадиях жизненного цикла фага N15. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать промоторы sop оперона фага N15 и механизмы регуляции их активности.

2. Установить факторы, регулирующие экспрессию sop ойерона N15 в лизогенном состоянии и на различных стадиях литичесю зго развития

3. Исследовать возможную роль sop генов N15 в регуляции репликации и числа копий профага.

4. Методом флуоресцентной микроскопии in vivo исследс внутриклеточную локализацию профага N15 и влияние н белков.

5. Установить значимость и функциональную роль налич центромерных сайтов, расположенных в различных райо: для стабильного наследования линейной плазмиды.

вать

i нее Sop гШ 4-х

iax генома N15

Научная новизна

Изучены механизмы стабильного наследования линейных репликонов, на примере бактериофага N15. Установлено, что экспрессия sop оперона бактериофага N15 обеспечивается двумя промоторами, один из которых репрессируется Sop белками, а другой - протеломеразой фага N15 (ферментом, образующим ковалентно замкнутые теломеры). Установлено, что протеломераза может также связываться с промотором кодирующего ее гена и репрессировать его. Показано, что Sop белки обеспечивают правильную внутриклеточную локализацию плазмиды N15 в положениях Ул и % длины клетки, при этом эффективное функционирование механизма стабильного наследования линейной плазмиды требует, в отличие от кольцевых плазмид, наличия множественных центромерных сайтов, расположенных в различных районах генома. Повышенный уровень экспрессии sop оперона приводит к увеличению числа копий профага N15.

Практическая значимость

Помимо своего значения для исследования фундаментальных проблем наследования генетического материала, N15 является уникальной моделью для изучения имеющих большое медицинское значение возбудителей боррелиоза, спирохет Borrelia. Изучение механизмов наследования плазмиды N15 может привести к разработке методов борьбы с вызываемыми Borrelia инфекциями, основанных на высокоспецифичных ингибиторах репликации и сегрегационной стабильности.

Вторая область практического применения результатов связана с конструированием экспрессионных векторов для высокоэффективной экспрессии целевых белков в клетках Е. coli. Включение sop генов и центромер N15 в состав таких векторов может обеспечить их стабильное наследование в отсутствии селекции, обычно достигаемой путем добавления в среду для культивирования антибиотиков или других селективных агентов. Введение антибиотика в среду, с одной стороны, не всегда обеспечивает стабильность плазмидного вектора вследствие возможной инактивации антибиотика при росте бактериальной культуры, сопровождаемой снижением селективного давления,

а с другой стороны, присутствие антибиотика в продует е может быть недопустимо с точки зрения биобезопасности. Использ звание sop системы N15 для стабилизации плазмид позволит ренпть обе эти проблемы.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на M

еждународном

конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва

2003); на 8-й международной школе-конференции мол эдых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2004); на конференции «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва

2004); на международной конференции «Plasmid Biology» (Корфу, Греция 2004) и на ю-й международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2006). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литератуЬы, глав «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 88 страниц, включая 4 таблицы и 22 рисунка. Список цитированной литературы состоит из 101 наименования.

Результаты и обсуждение

Регуляция экспрессии sop оперона N15

Sop локус N15 расположен в районе правого конца линейной плазмиды (Рис. 1). Оперон включает два гена, sopA и sopB, гомологичных соответствующим генам плазмиды F. Для плазмиды F было показано, что SopA репрессирует промотор sop оперона, Psop, причем величина репрессии многократно увеличивается в присутствии SopB. Последовательность длиной 448 нт от правого конца линейного профага N15 до начала гена sopA содержит уже известный промотор Pisop (Ravin and Lane, 1999). Транскрипция, инициируемая с этого промотора, регулируется белком SopA. Последовательность длиной 380 нт перед этим районом не имеет гомологии с последовательностью F, причем компьютерным анализом было предсказано возможное наличие пяти потенциальных промоторов (Ravin et al., 2000; Grigoriev and Lobocka, 2002), однако существование ни одного из них не было доказано экспериментальным образом. Помимо потенциальных промоторов, этот регион содержит три повтора tosRi, tosR2 и tosRe, с которыми может взаимодействовать фермент протеломераза, ответственный за образование теломер линейного профага (Rybchin and Svarchevsky, 1999), а значит протеломераза может принимать участие в регуляции экспрессии sop оперона.

Чтобы установить, существуют ли еще промоторы, помимо Pi, в районе между sop генами и правой теломерой N15, был проведен Northern blot анализ РНК. Для получения транскриптов использовали плазмиды pNSPoi и pNSPo4, содержащие гены lacZYA под контролем промоторов sop оперона N15, - первая из них несет весь изучаемый район sopP, а вторая лишь фрагмент sopPi (См. рис. 1).

В результате было обнаружено несколько специфичных фрагментов (Рис. 2). Транскрипт TRi соответствовал ранее известному промотору sopPi, длина трех других фрагментов (TR 2, 3, 4) соответствует области расположения предполагаемых промоторов. Таким образом, полученные данные показывают, что район, предшествующий промотору sopPi, является транскрипционно активным.

А Р2 R3_JR2R1

sopO

зО г—

^Г Г

s орА

sopB Т1

teIR

Ptel

Г* teIN

1er

sopP1 sopP2 sopP

pNSP03

AAAAGCCCCACATAC6TI5GGGCTFTT

fe/R

fe/L

anf

rep

cB Km

lac

rTR3-

- <"35)

1-10)

(-35) ^

teIR GCGTATA ATGGGCAATT 3TGT0CTGAT ATGTTCCGTA ATTGAOATAT GATATAGTGC ATATGTTCC

pPZ(-î5) tosR2

P2 (-10)

TR2

tosR1

TOCATTCCTA TGTTGTGTTC TGTTATGGTG TTCTTAGATA GTGGGGGATG TCACATGGAT TGATGTTCTT TGA7TGTGTJ1 TCAATATAGA GACGGAAGAG

sopP2

ATAGAGATGC CTCAAAGTGT ATAAACAGCG TGAAAATCAG CATGTTCGCT TAACTTTTGA TAGCAATTGG TATGATTTA' PR 43

ТТАОвТТТТА AATATACIAA CGTAAGTAAT ACCQTTGCOC TTAQATGAAB CT &AATAGCT TCTGTAGCGC АТСААААААГ

PI (-35) '

_ PR46 PI (-10)

CGTTTTCTAA GTCACTTTGC TTTTTTTATG TTGCTTTGCT TTAAAAACGT AAAGTATGAT GAAAAACACA AAGATAAGGC^ CATGTTTGAG AGGAAACAGG

sopP1

: l'/V-TTTGCT G-WGArïîT ATCAATCGCG ¡:ГГЛ

-0

sopP

(-10) P2 (-3S) AATTATTGAT ACATTAATGT

PR48

TATCATTTAA ААГСАТТААв

TGATTTGAAC CTTAACTTTG

Рисунок 1. Sop район бактериофага N15 и репортерные плазмиды.

A. Участок генома в районе правого конца линейного профага (развернут, чтобы показать направление транскрипции слева направо), показана ковалентно замкнутая теломера (teIR). Прямоугольниками отмечен sop оперон и ген 26. Tl обозначен терминатор транскрипции. Pi и Р2 обозначены регулируемые промоторы, изучаемые в настоящей работе. sopO ограничивает район операторов, представленный четырьмя CITTG мотивами (показаны стрелками). Ri, R2, R3 соответствуют сайтам связывания протеломеразы tosRi, tosR2 и tosR. sopPi, sopP2 и SopP - участки генома Nij, клонированные в репортерном векторе PRS552.

B. Линейная репортерная плазмида PNSP03. Ant - onepoï: антирепрессора (гены 30, antA, 32 слева на право); rep - район репликации (гены 33, 34, 35, 36, герА) сВ - основной репрессор фага; Km - ген устойчивости к канамицину; lac - лактозный оперон (гены lacAYZ ориентированы слева направо).

C. Последовательность нуклеотидов sop района соответствует нуклеотидам с 24802 по 24269 генома фага N15, включает в себя известный район sopPi и находящуюся перед ним область sopP2 (отмечено рамками). Сайты инициации транскрипции, обнаруженные в этой работе (TR 3, 4), отмечены стрелками. Области -35 и -ю соответствующих промоторов показаны пунктиром. Последовательность Shine-Dalgamo и 5' конец sopA отмечены рамкой (SD) и выделены серым, соответственно. Длинная стр елка показывает

последовательность прайм ера для ПЦР (PR46 и PR23N) и primer extension анализа (PR48), Короткие стрелки отображают CTTTG сайты связывания SOpA,

g а т с 1 2

- 421 ^ . ^TR-i

- 399 — . тяз

- 365—_ ^ tr2

Рисунок 2. Анализ транскрипции sop локуса.

(A) Northern blot. РНК выделена из MCio6i/pNSPoiT ("дорожки 1 и s), MC1061/PNSP04T (3) и MC1061 (4), разделена с помощью электрофореза в $% полиакриламидном геле и гибридизована радиоактивно-меченной пробой sopPi. Мембрана экспонировалась с рентгеновской пленкой в течении двух (дорожка i), 12 (2) или 24 часов (3-4). Положение маркеров молекулярной массы показано стрелками. Отмечено положение транскриптов TRl, TR2, TR3, TR4.

(B) Аналогично рисунку А, пробы специфичны sopP2

(C) Primer extension анализ. Меченный праймер PR48 отжигали с РНК, выделенной из MC1061/PNSP02 (дорожка i) или из бесплазм иди ого штамма (2),и проводили реакцию о бра ной траснкрипщш. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 6% полиакриламидном геле, одновременно с образцами из реакции сиквенирования, полученными с использованием аналогичного праймера и ДНК плазм иды pNSP02 в качестве матрицы. Положения 5' концов мРНК указаны относительно +1 положения «А» в стартовом кодоне sopA.

Для точной идентификации предполагаемых промоторов в пределах sopP2 района были определены положения 5' концов РНК с помощью реакции primer extension. Препараты РНК выделяли из культуры, содержащей плазмиду pNSP02, включающую весь sopP район и использовали в реакции с меченым праймером PR48 (См. рис. 2). После разделения в геле полученных фрагментов была локализована интенсивная полоса в положении -36g относительно нуклеотида «А» в стартовом кодоне sopA, что соответствует транскрипту TR2 и согласуется

с расположением Р2 промотора, идентифицировании анализом. Полосы меньшей интенсивности в положена вероятно, соответствующие транскриптам ТКз и Т1*4. были обнаружены последовательности с умеренно каноническими -ю и -35 промоторными мотивами в о положениях относительно стартовых точек (Рис. 1). Таблица 1. Активность 0-галакгозидазы содержащих репортерные конструкции зорРгЛас го Northern blot [ях - 399 и -426, В обоих случаях й схожестью с войственных им в штаммах, Z

Регуляторный фаьсторы Активность ß-галактозщ (Относительный уровень активности азы sop промотора)

sopPi S0p?2 sopР PNSP03

- i (1513 MU) 1 (4598 MU) i (10845 Ml J) 1 (io48MU'2))

Sop А 0.79 н/у 1.01 0.37

SopA+SopB 0.016 0.99 1.06 0.022

TelN 0.95 0.0017 0.50 I.05

SopA+SopB+TelN н/у 0.0019 0.05 н/у

СВ 0.67 0.96 0.57 н/п

RepA 0.94 н/у 0.89 н/п

AntA н/у 0.91 0.75 н/п

MU - единицы Миллера. (1) присутствие в клетке не содержащего вставки экспрес не изменяет уровень активности ß-галактозидазы более че (2) В пересчете на одну копию плазмиды. Исходное зна было пересчитано с учетом на число копий pNSl бесплазмидных клеток. н/у - не установлено н/п - не применимо вследствие того, что плазмида pNSF гены этих регуляторных факторов и не совместима с проф Для исследования механизмов регуляции экспрес был использован метод репортерного гена. С этой це ДНК N15, содержащие промотор sop оперона N15 (so sopP), были клонированы в транскрипционном репор PRS551 (Simons et ah, 1987) на 5' конце гена ß-галактозщ чего конструкция sopP::lacZYA была перенесена в хром эксперименте исследовали влияние следующих rei -8- ¡ионного вектора м на 10%. гение, 5030 MU, 03 и фракцию эз уже содержит Е1Г0М N15. сии sopP нами /:ью фрагменты pPi, sopPs или терном векторе (азы, lacZ, после крсому Е. coli. В I3B N15: sopA

(отдельно и совместно с sopB), telN (протеломераза), сВ (репрессор, аналог cl фага лямбда), antA (антирецрессор) и герА (репликаза).

Было установлено, что в отсутствии репрессии промотор Pi значительно слабее Рг, что согласуется с результатами Northern blot анализа (См. Таблицу i). Подобно промотору Psop плазмиды F он незначительно репрессируется белком SopA, но эта репрессия существенно увеличивается в присутствии SopB. В тоже время, промотор Р2 оказался нечувствительным к Sop белкам. Подобный результат был ожидаем вследствие того, что sopP2 район не содержит характерных сайтам связывания белка SopA мотивов. Для проверки возможности связывания Sop белков N15 с промотором был также использован метод задержки в геле. Полученные результаты свидетельствуют о специфическом связывании N15 SopA и/или N15 SopB с фрагментом ДНК N15, содержащем Pisop.

Было установлено, что Р2 сильно репрессируется (более чем в 500 раз) протеломеразой N15 TelN, а другие регуляторные факторы не оказывают влияния. Репортерная конструкция, содержащая весь фрагмент sopP, позволила выявить более сложную модель регуляции sop оперона. Линейная плазмида PNSP03 несет ген протеломеразы telN, а между геном sopA и концом профага содержит в точности такой же район, что и в N15, но гены sopAB были заменены на lac оперон. Таким образом, полученная плазмида PNSP03 несет ген telN, но не содержит sop генов. Было установлено, что штамм MC1061/PNSP03 производит немногим меньше р-галактозидазы, нежели эквивалентный sopPi штамм. Промотор в значительной степени репрессирован протеломеразой, но дальнейшей репрессии дополнительным количеством TelN не происходит. Наиболее очевидным объяснением полученных результатов является то, что Р2 промотор в pNSP03 уже полностью репрессирован при естественном базовом уровнем протеломеразы, в то время как Pi остается активным. Простой тест по определению уровня репрессии Рг белком TelN не представляется возможным вследствие необходимости этого белка для поддержания линейной плазмиды в клетке. Полученные данные показывают, что активность и механизм регуляции промотора Pi сходны для линейных и кольцевых плазмид и согласуются с существенной репрессией протеломеразой TelN промотора Рг в обоих типах молекул.

-9-

На основании результатов этого эксперимента можно предположить, что регуляция sop оперона не связана с топологическими особенностями ДНК, такими как суперскрученность. Вероятно, в лизогенном состоянии Р2 промотор постоянно репре ссирован TelN, а большая доля экспрессии sopAB происходит с неполностью репрессированного Pi промотора.

Далее мы исследовали, какой вклад, вносят оба промотора sop оперона в его транскрипцию в лизогенном состоянии и на различных этапах литического развития фага N15. Для этого выделяли тотальную РНК из штаммов, содержащих профаг N15 или плазмиду PG591 (мини-плазмида на основе N15, не содержит последовательности sopAB генов, но содержит ген telN) ее с помощью ОТ-ПЦР. Были использованы две пары п] (PRi и 28L) выявляла фрагмент длиной 752 нт (FRi), специфичный для РНК инициируемой с sopP2, в то время как вторая (28R и 28L) -фрагмент (FR2), являющийся продуктом реакции с РНК, инициируемой

большую часть и анализировали »аймеров: первая

с обоих фрагментов $орР1 и ворРэ. Полученные фрагменты разделяли с помощью электрофореза. (Рис. 3) Полученные результаты показывают, что

амплификацией

инициируемый с промотора Pi, составляет более 80% всей РНК,

транскрипт,

аг N15 (Рис. зВ). рипции lacZ под

производимой sop опероном в клетке, содержащей профг Этот результат соответствует данным об уровнях транскр контролем репрессированного промотора (См. Таблицу l). В клетках, содержащих плазмиду PG591, транскрипты, инициируемые с Pi, составляют еще большую долю в общем количестве РНК sop оперона, а именно около 95% (Рис. з А). Полученные данные предположение о том, что промотор Р2 практически полностью репрессирован базовым уровнем TelN, в то время как Pi остается активным в отсутствии Sop белков (рG591) или репрессируется (профаг N15).

частично ими

1 2 3 4 5 Рисунок 3. ОТ-ПЦР анализ гранскриптов.

(A) Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных с праймером РКд и 281. (РЕ.1) или 28Я н 28Ь №112), В реакции использовалась РНК, выделенная из штамма 1)НхоВ/?0591- Количество матрицы для реакции 1-5, 4 пкг, 1,33 пкг, 0,44 пкг, 0,15 пкг и 0,05 пкг исходной РНК соответственно (3-х кратное разведение).

(B) Аналогично А, РНК выделена из штамма ОНзоВ/]\(15. Количество матрицы для реакции: 133 пкг, 44 пкг, 15 пкг, 4,9 пкг и 1,6 пкг общей РНК соответственно (з-х кратные разведения).

(C) Электрофорез продуктов ПЦР полученных на матрице ДНК фага N15, дорожки 1-5 соответствуют пятикратному разведению ДНК матрицы.

Целью следующего этапа работы было установить, как происходит регуляция Бор промотора при литическом развитии. В эксперименте использовали лизогенный по N15 штамм, содержащий вектор рВАВ24_31, несущий ген 31 (а нти реп ре ссор) иод контролем индуцируемого арабинозой промотора агаРмс. Индукция промотора арабинозой приводила к активации литического развитая профага. Через определенные промежутки времени с момента начала индукции отбирали образцы культуры, выделяли суммарную РНК и использовали в ОТ-ПЦР анализе. Продукты ОТ-ПЦР получали описанным выше способом и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле (Рис. 4). Фрагмент ИЙ! является специфичным для РНК, инициируемой

с БорРг, в то время как РК2 являлся продуктом реакции ОТ-ПЦР с РНК, инициируемой со всей промотороной области ворР.

Полученные результаты (Рис.4) позволяют сделать предположение, что в процессе литического развития происходит активация .адрРз, ранее репрессированного протеломеразой.

12345678

А В С D

10'

50'

60'

Рисунок 4. ОТ-ПЦР анализ транскриптов при литическом развитии.

Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных с праймером PRi и 28L (FRi) или 28R и 281, (FR2). В реакции использовалась РНК, выделенная из DHioB(Ni5)/pBAD24_3i штамма. На дорожках 1-8 показаны продукты, полученные последовательным пятикратным разведением исходной матрицы РНК (изначально в реакцию брали матрицу разведенную в 27 раз - дорожка 1). А, В, С, D соответствует пробам отобранным в лизогенном состоянии и после ю, 50 и 6о минут после индукции логического развития арабинозой. На панели D - исходная матрица РНК была разведена в 67 раз - дорожка 1,

Об этом свидетельствуют данные об активностях промоторных областей sopP'2 и sopP после индукции логического развития. Если в лизогенном состоянии вклад промотора sopP2 невелик (Рис. 4А) по сравнению с общим уровнем экспрессии, то через один час с момента начала литического развития количество синтезируемой РНК, соответствующей обоим фрагментам, становится равным (Рис. 4D), Подобный результат может говорить о снятии вызванной TelN репрессии с промотора sopPs,. Такой механизм регуляции sop оперю на протеломеразой можно объяснить тем, что на поздних стациях литического развития активность пр отел о мер азы каким-то образом

блокируется, поскольку в противном случае этот фермент разрезал бы линейные фаговые молекулы, готовые к упаковке в вирионы.

Регуляция экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15

В предыдущем эксперименте было установлено, что протеломераза N15 может репрессировать Р2 промотор sop оперона и, как следствие, может участвовать в регуляции процесса сегрегационной стабильности линейной молекулы профага N15. На следующем этапе был изучен механизм регуляция экспрессии гена протеломеразы. Для экспериментального подтверждения активности предсказанного промотора Ptel и исследования механизма регуляции его экспрессии, нами был использован метод репортерного гена. Полученная нами плазмида pZS-Ptel содержит фрагмент ДНК N15 с последовательностью промотора Ptel на 5' конце гена бета-галактозидазы, lacZ. За уровень активности промотора принимали количество синтезируемой с его помощью (3-галактозидазы, активность которой определяли с помощью метода Миллера (Miller, 1972). Полученные результаты (Табл. 2) подтверждают наличие промоторной активности в исследуемом фрагменте. Поскольку фрагмент содержит только один набор -35 и -ю консенсусных последовательностей, мы предполагаем, что ген протеломеразы транскрибируется с единичного промотора.

В результате было установлено, что N15 Ptel может быть репрессирован протеломеразой в 20-50 раз (см. Таблицу 2). Следует отметить, что наблюдаемая активность (3-галактозидазы несколько снижалась и в присутствии контрольных плазмид (примерно в 2 раза, см. Таблицу 2), что может объясняться снижением числа копий репортерной плазмиды pZS-Ptel (данные не представлены).

Таблица 2. Регуляция промотора протеломеразы

Штамм Регуляторный фактор Активность Р-галактозидазы1 (единицы Миллера ) Степень активности Ptel промотора

DHioB/pZS-Ptel - 9-3 1

DHl0B/pMSll9EH - 3-7 0.40

DHloB/pJDioi TelN 0-5 0.05

DH10B/PZC176 - 5-1 0-55

DHloB/pNPoi TelN 0.2 0.02

DHioB(Ni5)/pZS-Ptel профаг N15 1.1 0.12

(i) Среднее из 6 независимых экспериментов, погрешно превышает ю%.

:ть измерения не

Для определения уровня репрессии №е1 в реальны был сконструирован лизогенный штамм БН1 Измерение активности р-галактозидазы показало, чтс промотора в этих условиях составляет 12%, т.е профага действительно репрессирован в лизогенной ку.

х условиях нами <j)B(Ni5)/pZS-Ptel. активность Ptel промотор N15 ■Льтуре.

Ptel

Определение внутриклеточной локализации линейных плазмид на основе репликона N15. Влияние Sop белков на положение плазмид в клетке

Целью следующего этапа работы было изучение вопроса о том, как число центромер в линейной плазмиде влияет на ее внутриклеточную локализацию в присутствии Sop белков N15. Для этого мы использовали систему на основе гибридных флуоресцентных белков желтого и синего цветов, способных специфически связываться с наборами операторов, помещенных вблизи центромер. О влиянии белков ЛорА и SopB на внутриклеточную локализацию линейной плазмиды судили по положению флуоресцентных фокусов в клетке. Линейная плазмида-мишень содержит температурно-чувствительную мутацию в репликационном гене герА, что позволило изучить внутриклеточную локализацию как для многокопийного состояния, так и и случае, когда в клетке оставалась лишь одна копия линейной плазмидь;. В норме число копий изучаемой плазмиды при выращивании куль|гуры при зо°С

составляло от 4 до 6 копий на хромосому. При повышении температуры до 37°С за счет блокирования репликации уже через 4,5 часа в клетке оставалась одна копия. В эксперименте использовали три плазмиды-мишени рБА07И (2 Ж), рОАС720 (1 Ш) и рБА0721 (без 1К) отличающихся друг от друга лишь разным числом центромерных сайтов, помимо этого, каждый штамм содержал плазмиды, экспрессирующие флуоресцентные белки и вор белки N15. Были получены и проанализированы цифровые изображения, для оценки положения фокуса бактериальную клетку условно разбили на три области: полюс, Уа - и центр. В многокопийном состоянии фокусы желтого и синего цвета, образованные на одной линейной молекуле, всегда локализовывались в одном положении (перекрытие составляло от 70% до юо% площади) и далее принимались за один флуоресцентный фокус. В отсутствии экспрессии Бор белков в клетке фокусы располагаются случайным образом, примерно в равной степени распределяясь по всей длине клетке. Присутствие одного ЭорВ приводило к появлению одного или двух крупных фокусов у полюсов клетки, что можно объяснить образованием сегрегационных комплексов за счет связывания БорВ с центромерами и взаимодействием образованных комплексов между собой. При одновременной экспрессии белков БорА и БорВ наблюдали увеличение числа фокусов в клетке, что можно объяснить нормальной работой аппарата стабильного наследования, который разделяет сегрегационные комплексы, тем самым, позволяя каждой дочерней клетке получить свою копию линейной плазмиды. В клетках с двумя фокусами, их локализация происходила преимущественно в положениях Ул и % длины клетки, что соответствует центрам будущих дочерних клеток, а значит распределенные подобным образом линейные молекулы окажутся расположенными в центрах будущих дочерних клеток, готовые к последующей репликации (Рис. 5). Подобное расположение наблюдалось и для состояния, когда в клетке наблюдали четыре фокуса, за исключением того, что образовавшаяся клетка получит уже две копии линейной плазмиды.

III

\\\ч. \ \\ч A pDAG711 {SopA* SopB+>

f *\ • 4

\ 4

0 \ * 3

Wf. н \V-. ? v\\ В PPA6711 (SopA* SopP+> V.

N \ \ \ \

\ \ \ \ 4 \ 4 v

Ota»

Рисунок 5, Диаграмма распределения флуоресцентных фокусом в клетках содержащих плазм иду pDAG7ii.

I. Определение относительной доли фокусов локализованных в центре, V4 длины клетки или у полюса. А) Экспрессия обоих Sop белков приводит к распределению фокусов преимущественно в положения Уа или % длины клетки. В) В присутствии только SopB фокусы образуются у полюсов. С) В отсутствии Sop белков сегрегационный не функционирует и плазм иды распределяются в клетке случайным образом.

II. Доля клеток содержащих фокусы в различных положениях. III. Схема расположения фокусов в клетке.

Представленные выше результаты соответствуют данным, полученным для PDAG711 с двумя центромерами; плазмида PDAG720 с одной центромерой локализуется в положении У4 и 3А с меньшей

роде?и

(SopA* SopB"*)

PDAG711 (SopA- SopB+)

рОА<3711 (SopA" SopB'}

эффективностью, а на плазмиду PDAG721 без центромерных сайтов Sop белки не оказывают видимого влияния, и она всегда распределяется в бактериальной клетке случайным образом. Таким образом, только наличие обоих Sop белков и центромерного сайта обеспечивает правильное распределение и стабильное наследование линейных плазмид.

Б однокопийиом состоянии в отсутствии Sop белков в клетке желтый и синий фокус располагались в одном положении, а плазмида распределялась случайным образом. Экспрессия SopB приводила к смещению плазмиды к полюсу клетки, при этом положения фокусов обоих цветов совпадало. Наиболее существенные изменения появлялись при одновременной экспрессии SopA и SopB при условии, что плазмиды находятся в однокопийном состоянии. Оказалось, что плазмиды, содержащие центромерные сайты, располагалась преимущественно в центре или в положении Уь длины бактериальной клетки, а в 8о% случаев наблюдали несовпадение синего и желтого фокуса для плазмиды PDAG711 с двумя центромерами и лишь в Ю% случаев, - для PDAG720 с одной центромерой (Рис. 6).

расстояние от полюса клетки (цМ)

части клетка

pDAG71l одна копия (SopA+ SopB+)

центр

Рисунок 6. Локализация линейной плазмиды с двумя центромерными сайтами (однокопийное состояние).

A) Диаграмма, показывающая расположение жетого и синего фокуса в клетке (плазмида рОАСуп 8орАВ+)-

B) Сравнение распределения флуресцентных фокусов в клетке в зависимости от числа копий. Показаны относительные доли фокусов в той или иной части клетки.

Для плазмиды PDAG721, не содержащей центромерных сайтов, не наблюдалось разницы в положении cfp и yfp фокусов, и ее внутриклеточная локализация не была выраженнэй. Полученный результат позволяет сделать предположение, что одной из функций SopA является разделение сегрегационных комплексов, образованных SopB на центромерах, с дальнейшим распределением р еплицированных молекул в положения хк и % длины бактериальной к тетки. Роль SopA N15, таким образом, оказывается аналогичной рол з РагА согласно теории работы сегрегационного аппарата, предложенной для кольцевых плазмид (Barilla et al., 2005), а именно обеспечение активного транспорта реплицированных молекул в направления. Поскольку N15 обладает четырьмя возникает вопрос, как осуществляется разделение комплексов и почему все центромерные сайты о двигаются в одном направлении? Мы предполагаем, чт}| состоянии, когда число копий профага составляет хромосому, внутримолекулярные сегрегационные комплексы оказываются прочнее межмолекулярных, и SopA предпочтительнее разделяет последние. Описанное выше явлен внутримолекулярного комплекса в однокопийном состоянии лишь подтверждает предположение о функции SopA, но такого разделения в норме обычно не происходит, потому что однокопийт ое состояние не является естественным для профага N15 и может нарушать процесс сегрегации.

Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне N15

На основании полученых данных о внутриклеточн линейных плазмид было установлено, что центромеры правильного позиционирования реплицированных молекул в клетке, что необходимо для их стабильного н, следующем этапе работы предстояло выяснить, как] то роль играет множественность центромер N15 для эффективности работы механизма сегрегационной стабильности, и имеет ли значение их распределенное

противоположные центромерами, сегрегационных дной плазмиды о в естественном от з до 5 на

ои локализации «обходимы для плазмидных ^следования. На

расположение в линейной молекуле. Для изучения влияния числа и положения центромерных сайтов на стабильность линейных репликонов определяли скорость их потери при выращивании в среде без антибиотика. Для этого эксперимента был создан набор линейных плазмид на основе минимального репликона N15, который содержал ген репликации герА и ген репрессора сВ, контролирующего его транскрипцию. В пределах последовательности герА располагается сайт инициации репликации и центромерный сайт (IRi). Кольцевая плазмида pNCio, использованая в этом эксперименте для сравнения с линейными производными, не содержит sop генов и в отсутствии отбора на канамицине, теряется при делении клеток. Ранее было установлено, что экспрессия Sop белков в клетке приводит к полной стабилизации pNCio (<0.01% потери на генерацию), в то время как эквивалентная ей линейная плазмида (с геном telN и ковалентно замкнутыми концами) стабилизируется не полностью (Ravin et al., 2003). В эксперименте использовали мини-плазмиду PG591 на основе репликона N15, имеющую один центромерный сайт в пределах гена герА, но не содержащую большую часть последовательности sopAB генов.

Чтобы оценить значение числа центромер и их расположения для процесса сегрегационной стабильности была определена скорость потери различных производных плазмиды PG591, различающихся количеством и расположением центромер, а также общей длиной плазмиды, в присутствии и отсутствии в клетке Sop белков. В эксперименте использовали плазмиду pDAG2l6 для экспрессии Sop белков на уровне не превышающим естественный. В таблице з показаны схемы плазмид и приведены результаты эксперимента. Было установлено, что единичный центромерный сайт, расположенный как в своем естественом положении в пределах гена герА (PG591), так и в другой части молекулы (PG598, PG750) может обеспечить лишь частичную стабилизацию плазмиды. Вставка второй центромеры на растоянии 4 тпн от первой (PG593) или на растоянии 8,7 тнп (PG751) приводит к существенному увеличению стабильности этих плазмид, однако когда вторая центромера расположена на незначительном удалении от первой -1,7 тнп (PG599) подобного эффекта стабилизации не наблюдалось.

Таблица 3. Влияние количества и положения стабильное наследование линейных плазмид на

центромер на основе N15.

Название (размер, тпн)

Схема плазмиды

Скорость потери плазмиды

pNCio (6,5)

PG591 (132)

гуч rapA w

PG593 (13-4)

PG591L (35-2)

PG593L (35-5)

PG595 (13-2)

zrepA&z

PG598 (135)

-Jk>

PG599 (155)

J-Kl

PG598L (35-5)

<0.007

O.15

0.06

О.83

О.З

1.9

0.11

0.13

PG599L (37-5)

pG750 (13-1)

PG751 (13-4)

pG752 (15-4)

1 РИП^МЦ ifc»

J ,IQ

PG750L (35-1)

PG751L (35-4)

PG752L (37-4)

(Размер

плазмиды, тпн)

0.83

О.ЗЗ

O.l

0.02

0.01

0.1

0.02

J-o

0.01

Скорость потери плазмиды при экспрессии SopA и SopB, в % на генерацию. Скорость потери измеряли в штамме DH10B, содержащем линейную плазмиду на основе репликона N15 (Кт+) и используемый для экспрессии Sop белков вектор pDAG2i6 (Cm+) или штамм DH10B без pDAG2i6 для определения скорости потери в отстугсвии Sop белков. Делали серию разведений ночной культуры в жидкой среде без канамицина с таким

расчетом, чтобы клетки прошли ю, 20, 40, 6о, 80 или Выращенные таким способом культуры рассевали по чашкам ( а полученные колонии с помощью метода реплик переносили на чашки с канамицином и определяли количество клеток без линеных плазмид.

юо генерации, без канамицина,

¡убда

Скорость потери была определена и для произво, длины, полученных вставкой фрагмента ДНК фага ля; тпн, что привело к увеличению размера линейной плазмй, три раза. Было установлено, что единичный центр обеспечивает меньшую стабильность такой плазмиды коротким аналогом (рС591Ь и рС598Ь), однако в случае р потери была меньше по сравнению с коротким предшественником

дных большей длиной 22 [ды примерно в омерный сайт о сравнению с 3750L скорость

Можно предположить, что эффективность единичного центромерного сайта зависит и от его расположения в молекуле. В остальных случаях для длинных плазмид наблюдался сходный эффект стабилизации в зависимости от расположения второй центромеры (PG593L и PG751L), а степень стабилизации PG599L по сравнению с ее коротким аналогом был незначительным. Вставка третьей центромеры на растоянии 1,7 тпн от второй не увеличивает существенно стабильность по сравнению с плазмидой, уже содержащей два центромерных сайта (PG752 и PG752L), однако стоит отметить, что плазмида PG752L по уровню стабилизации приближается к кольцевой pNCio. Таким образом, число и расположение центромер в линейной молекуле является определяющим фактором стабильного наследования.

Влияние Sop белков на число копий плазмиды N15

Поскольку некоторые из центромер N15 располагаются в областях ответственных за репликацию и контроль лизогении, мы предоложили, что они могут принимать участие в регуляции этих процессов. Так, одна из центромер N15 (IRi) находится в пределах гена герА, кодирующего репликационный белок, что позволяет выдвинуть гипотезу о том, что Sop белки могут принимать участие в регуляции репликации, взаимодействуя с этим центромерным сайтом. Для проверки высказаного предположения был проведен эксперимент, в котором мы исследовали влияние Sop белков на число копий линейной миниплазмиды PG591, содержащей герА. В качестве контроля была использована эквивалентная миниплазмида, содержащая мутацию в сайте IRi. Оказалось, что повышенная экспрессия обоих Sop белков приводит к увеличению числа копий для плазмиды, содержащей центромеру в гене герА. Если центромера инактивирована, подбного явления не наблюдали (Рис. 7, дорожки 3 и 4). Так же было показано, что именно SopB белок, способный связываться с инвертированным повтором (IRi) внутри гена, способствует активации репликации, a SopA сам по себе не оказывает видимого влияния (Рис. 7, дорожки 5, 6 и 7, 8 соответственно). Таким образом, эффект активации репликации Sop белками и возможная регуляторная роль продуктов sop оперона обусловлена взаимодействием SopB с центромерой, расположеной в герА.

1234 Б 6 78

I' i Л шЯк

LP-

RP-

IR+ IRK

IR+ IR-SopAB

IR+ IR-SopB

IR+ IR-SopA

Рисунок 7. Влияние вор белков на репликацию линейных репликонов N15

ЬР обозначает линейные плазмиды на основе реплике центромерой (1Н+) в герА и ее аналог рС595 с инактивированным центромерным сайтом (III-).

ИР обозначает референсную плазмиду конститутивно регуляторный фактор. К - контрольная плазмида ргЭгг, ЗорАВ - рБАС242; ЭорВ - рБАС713; йорА - рБАС4о8.

она N15 PG591 с

экспрессирующую

звания линеинои г для регуляции

Мы показали, что расположение центромер в геноме N15 не только играет важную роль в обеспечении стабильного наслед молекулы профага, но также может иметь значени других его жизненно важных функций. Показанный в настоящей работе эффект увеличения числа копий при повышенной экспрессии Sop белков позволяет сделать предположение, что подобный механизм регуляции репликации с помощью продуктов сегрегационного модуля реализуется при литическом развитии инфекции, чогда снимается репрессия sop оперона. Как было показано, повышенная экспрессия Sop белков может приводить к существенному увеличению числа копий, наблюдающемуся в ходе литической репликации.

Таким образом, sop оперон N15 представляет изолированную единицу, а является частью единой системы, включающей сегрегационную стабильность, репликацию ДНК, образование теломер и контроль экспрессии генов на жизненного цикла профага N15.

собой не

разных стадиях

Выводы

1. Транскрипция sop оперона бактериофага N15 обеспечивается двумя промоторами. Промотор Pi может быть репрессирован за счет связывания с ним SopA, причем SopB усиливает репрессию. Промотор Р2 не контролируется Sop белками, но может быть репрессирован протеломеразой, - ферментом, образующим ковалентно замкнутые концы линейного профага N15.

2. В лизогенном состоянии транскрипция sop оперона обеспечивается промотором Pi, а промотор Р2 практически полностью репрессирован протеломеразой. При литическом развитии фага N15 на определенной стадии происходит активация промотора Р2 и повышение уровня транскрипции sop генов.

3. Протеломераза может репрессировать промотор своего гена.

4. Sop белки обеспечивают внутриклеточную локализацию плазмиды N15 в положениях, соответствующих центрам будущих дочерних клеток.

5. Эффективное функционирование механизма стабильного наследования линейной плазмиды N15 требует, в отличие от кольцевых плазмид, наличия множественных центромерных сайтов, расположенных в различных районах ее ДНК.

6. Повышение уровня экспрессии sop оперона по сравнению с уровнем, наблюдаемым в лизогенной культуре, приводит к увеличению числа копий профага N15, что обусловлено взаимодействием Sop белков с центромерой IRi, расположенной в репликационном гене герА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Dorokhov, B.D., Lane, D., & Ravin, N.V. (2003) Partition operon expression in the linear plasmid prophage N15 is controllc d by both Sop proteins and protelomerase. Mol. Microbiol, 50,713-721.

2. Равин H.B., Дорохов Б.Д., Lane D. (2004) Структурная организация и контроль экспрессии sop оперона линейного плазмидного профага N15. Молекулярная Биология, 2,297-302.

3. Дорохов Б.Д., Страхова Т.С., Равин Н.В. (2004) Регуляция экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология, №2, с. 28-32.

4. Дорохов Б.Д., Страхова Т.С., Равин Н.В. (2003) Протеломераза фага N15 защищает линейную ДНК с ковалентно замкнуты^ деградации в клетках Escherichia coli. Тезисы Второго Международного конгресса «Биотехнология: состояни]е перспективы развития», с. 20. Москва.

5. Дорохов Б.Д., Равин Н.В. (2004) Исследование механизмов, обеспечивающих сегрегационную стабильность линейной плазмиды N15. Тезисы 8-й международной школы-конференции ] ученых «Биология-наука XXI века», с.8-9. г. Пущино.

6. Дорохов Б.Д., Равин Н.В. (2004) Исследование механизмов стабильного наследования линейных бактериальных ре

ми концами от

ей

молодых

примере бактериофага N15. Тезисы конференции «Ген1 веке: современное состояние и перспективы развития» Москва.

Dorokhov, В., Lane, D., Ravin, N. (2005) Mechanisms of partitioning of linear bacterial plasmids: the phage N15 model. Plasmid, 5J3, p.76-77

8. Дорохов Б.Д., Lane D., Равин H.B. (2006) Определение

внутриклеточной локализации линейной плазмиды N15 в клетках E.coli методами флуоресцентной микроскопии in vivo. международной школы-конференции молодых ученых наука XXI века», с.15. г. Пущино.

:пликонов на ггика в XXI Т.1., с. 336. г.

езисы ю-и «Биология-

Принято к исполнению 14/02/2007 Исполнено 15/02/2007

Заказ № 100 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дорохов, Борис Дмитриевич, Москва

61:07-3/569

Центр «Биоинженерия» Российская Академия Наук

правах рукописи

Дорохов Борис Дмитриевич

Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере

бактериофага N15

(03.00.03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Равин Николай Викторович

Москва - 2007

Содержание

Введение..........................................................................- 4 -

Обзор литературы...........................................................- 5 -

Бактериофаг Pi..................................................................................................- 9 -

ПлазмидаР......................................................................................................-10-

Плазмида Ri....................................................................................................-12 -

Плазмида RK2.................................................................................................-13 -

Внутриклеточная локализация плазмид.....................................................-15 -

Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности.. -17 -Особенности генетической организации и устройства сегрегационной системы бактериофага N15...........................................................................- 20 -

Цели и задачи работы...................................................- 24 -

Задачи работы:................................................................................................- 24 -

Материалы и методы....................................................- 25 -

Среды, реактивы, ферменты и синтетические олигонуклеотиды......- 25 -

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды...........................- 26 -

Плазмиды, используемые для экспрессии генов N15.................................- 26 -

Плазмиды и штаммы, используемые для экспериментов с репортерными

геном при анализе транскрипции sop оперона N15...................................- 27 -

Плазмиды и штаммы, используемые для Northern-blot и primer extension

анализа транскрипции sop оперона N15......................................................- 28 -

Плазмиды, используемые в эксперименте по изучению регуляции

экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15...................................- 28 -

Плазмиды, используемые для определения скорости потери линейных

репликонов N15...............................................................................................- 29 -

Плазмиды, используемые для определения внутриклеточной локализации

линейных репликонов...................................................................................- 30 -

Трансформация Е. coli....................................................................................- 32 -

Выделение плазмиднойДНК.........................................................................- 32 -

Электрофорез ДНК........................................................................................- 32 -

Определение активности sop промотора.................................................- 33 -

Анализ транскриптов с помощью ОТ-ПЦР...............................................- 33 -

Определение активности Ptel промотора................................................- 36 -

Определение эффективности трансформации........................................- 36 -

Флуоресцентная микроскопия.....................................................................- 36 -

Определение скорости потери линейных плазмид...................................- 37 -

Результаты.....................................................................- 39 -

Регуляция экспрессии sop оперона N15.......................................................- 39 -

Структура sop оперона плазмиды N15......................................................- 39 -

Связывание Sop белков N15 с sopPi промотором......................................- 41 -

ОТ-ПЦР анализ транскриптов sop оперона N15......................................- 48 -

Структурная организация промоторной области гена

протеломеразы..............................................................................................- 51 -

Регуляция экспрессии промотора протеломеразы..................................- 52 -

Роль протеломеразы в стабилизации концов линейной ДНК................-54 -

Внутриклеточная локализация. Многокопийное состояние.................- 57 -

Внутриклеточная локализация. Однокопийное состояние...................- 62 -

Определение скорости потери линейных плазмид с разным количеством центромерных сайтов, основанных на репликоне N15...............................- 64 -

Обсуждение....................................................................- 69 -

Регуляция экспрессии sop оперона...............................................................- 70 -

Внутриклеточная локализация плазмид..................................................- 72 -

Роль числа и расположения центромер в эффективной работе механизма сегрегационной стабильности линейной плазмиды N15.........................- 75 -

Список публикаций по теме диссертации...................- 79 -

Цитированная литература............................................- 8о -

Введение

Стабильное наследование бактериальных хромосом и низкокопийных плазмид обеспечивается правильным распределением реплицированных молекул между дочерними клетками перед клеточным делением. Функционально этот процесс аналогичен митозу у эукариот. Как правило, стабильное наследование обеспечивается опероном из двух генов (sopA и sopB) и центромерным сайтом (sopC). Репликация плазмид сопровождается формированием сегрегационных комплексов (Sop белки, связанные с центромерами); реплицированные молекулы образуют пары за счет взаимодействия этих комплексов. После завершения репликации происходит разделение пар и активный транспорт плазмид к противоположным концам клетки. Механизм активной сегрегации бактериальных хромосом принципиально аналогичен. Эта модель является результатом исследования механизмов стабильного наследования кольцевых бактериальных репликонов (хромосом и плазмид), в первую очередь, плазмид F и Pi Escherichia coli. Однако, известны и прокариотические организмы, имеющие линейные плазмиды и хромосомы с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). К их числу относятся возбудитель боррелиоза (болезни Лайма) Borrelia burgdorferi, патоген растений Agrobacterium tumefaciens, линейные плазмиды phiK02, PY54 и N15. Механизмы стабильного наследования линейных бактериальных репликонов в настоящее время малоизучены. Мы исследуем явление стабильного наследования на примере бактериофага N15, особенностью которого является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому Escherichia coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами. Стабильное наследование плазмиды N15 обеспечивается sop локусом, имеющим гомологию с sop локусом плазмиды F, но центромерный сайт N15 не представляет собой несколько кластерированных инвертированных повторов, расположенных непосредственно рядом с sop опероном, как в плазмиде F, а представлен четырьмя повторами, распределенными в геноме, причем каждый из этих сайтов функционирует в качестве центромеры (Ravin and Lane, 1999; Grigoriev and Lobocka, 2001). В то время sop опероны кольцевых плазмид являются функционально изолированными генетическими модулями; имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что sop оперон N15, помимо обеспечения сегрегационной стабильности профага, имеет функции, связанные с контролем репликации ДНК и контроля экспрессии генов фага. Изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих правильное распределение линейных низкокопийных плазмид в бактериальных клетках, внесет важный вклад в понимание механизмов наследования генетического материала у прокариот.

Обзор литературы

Механизм распределения бактериальных плазмид и хромосом между будущими дочерними клетками при делении, наряду с работой аппарата репликации ДНК, является необходимым для стабильного наследования генетического материала. Высококопийные плазмиды не требуют наличия специальных механизмов сегрегационной стабильности для гарантированного распределения их реплицированных копий между дочерними клетками при делении. Случайного пассивного распределения вполне достаточно, чтобы, как минимум, одна копия оказалась в каждой из дочерних клеток. Низкокопийные плазмиды должны обладать специальным механизмом для обеспечения гарантированного наследования. Первые работы по изучению активного процесса сегрегации и связанных с этим явлением генов были проведены для низкокопийных плазмид Escherichia coli Pi и F. (Ogura and Hiraga, 1983; Austin and Abeles, 1983). В дальнейшем, в плазмидах разнообразных бактерий экспериментально, и/или компьютерным анализом последовательностей геномов были найдены аналогичные, обнаруженным у Pi и F сегрегационные модули, ответственные за стабильное наследование.

Обычно сегрегационный модуль состоит из двух генов, кодирующих транс-активные белки, способные образовывать комплекс на цис-активном центромерном сайте ДНК. Первый из двух генов в опероне кодирует белок, как правило, называемый РагА, второй ген кодирует белок, который является ДНК-связывающим фактором (РагВ). Существует значительная неоднородность в размерах и последовательности РагА белков, но одни из них обладают слабой АТФ-азной активностью и содержат Walker-type АТФ-азный мотив (РагА), другие же являются актиноподобными белками (РагМ) (Surtees and Funnell, 2003; Gerdes et al, 2004). В случае плазмиды Ri, кодирующей РагМ актиновый гомолог, АТФ-опосредованная двунаправленная полимеризация этого белка обеспечивает внутриклеточный транспорт прикрепленных плазмид к центрам будущих дочерних клеток (Moller-Jensen et al., 2002; van den Ent et al., 2002; Moller-Jensen et al., 2003; Garner et al., 2004). Известные на настоящий момент данные говорят о том, что и белок РагА также управляет распределением плазмид за счет активного процесса полимеризации (Ebersbach and Gerdes, 2004; Barilla et al., 2005; Lim et al., 2005; Adachi et al., 2006), однако

молекулярные механизмы, вовлеченные в процесс сегрегационной стабильности, все еще не достаточно изучены.

Начальной стадией процесса сегрегации является сборка нуклеопротеинового комплекса на центромере, так называемой сегросомы. Механизм наиболее хорошо изучен на примере бактериофагов Pi и Р7. Эти фаги являются родственными, содержат протяженные участки гомологии (см. Yun and Yanpnek, 1977), а в лизогенном состоянии не интегрируются в хромосому Е. со/г, а представляют собой кольцевые низкокопийные плазмиды. Все компоненеты системы сегрегационной стабильности локализованы в одном локусе, par (Austin and Abeles, 1983a, b; Ludtke et al., 1989). Этот локус включает авторегулируемый оперон, состоящий из двух генов, рагА и рагВ, а также cis-действующий сайт parS, следующий за геном рагВ. ParS включает два типа последовательностей, узнаваемых РагВ (Davis et al, 1990), расположенных по обеим сторонам сайта связывания бактериального белка IHF.

Рисунок 1. Организация сегрегационного модуля. Оперон состоит из двух генов, кодирующих Walker-type или актиноподобную АТФ-азу (показано серым цветом) и белок, способный связываться с центромерой (красный). Происходит сборка комплекса на центромере (белый квадрат), расположеной после или перед опероном. Фактор связывания с центромерой вовлекает АТФ-азу, которая, в свою очередь полимеризуется и направляет плазмиду к центру будущей дочерней клетки (Hayes and Barilla, 2006).

Основная последовательность, обеспечивающая связывание РагВ, - это гептамер (atttcac), называемый Бокс А. Имеются четыре копии Бокса А, два из которых образуют инвертированный повтор в правой половине parS, -минимальную последовательность, необходимую для связывания РагВ (Martin

-С

T/BS

et al, 1991). Второй последовательностью, участвующей в связывании РагВ, является гептамер (tcgcca), называемый Боксом В (Davis et al, 1990). Связывание IHF с parS вызывает изгиб ДНК, центр которого находится в сайте связывания IHF. Этот изгиб способствует специфическому свзыванию РагВ с parS (См. Рис. 2 b.) (Davis and Austin, 1988; Funnell, 1988b, 1991; Funnell and Gagnier, 1993, Radnedge et al, 1996).

N-концевой участок белка РагВ включает последовательность, обеспечивающую взаимодействие с РагА, в то время как С-конец содержит последовательность, существенную как для связывания с центромерой parS, так и для димеризации. РагВ образует семь a-helix районов (helix-turn-helix [НТН] домен), соединенных четырьмя подвижными аминокислотными линкерами с отдельным доменом, который содержит три антипараллельные (3 цепи и С-концевой a-helix (димерный домен). Димеризация РагВ происходит за счет упаковки Р цепей и С-конечного участка (Schumacher and Funnell, 2005).

Хотя сегрегационные модули плазмид, как правило, организованы в соответствии с описанной выше схемой, центромерные сайты могут иметь весьма разнообразную структуру. Обычно, центромера представляет собой набор из прямых повторов, но также может включать инвертированные повторы и/или прямые повторы с внутренней симметрией. Центромера parS бактериофага Pi представляет собой набор прямых повторов, расположенных после генов, отвечающих за сегрегационную стабильность. Однако, число повторов, их длина, расстояние между ними, нуклеотидная последовательность, - всё это может сильно различаться в структурной организации других известных центромер (Рис. 2 a.) (Hayes and Barilla, 2006).

F sopC PI parS RK2 0B3 TP288 par H pTAR parS pTAVlinc2 pRA2 parS

-OX-

lOObp

* i и

-сфсфс^с^

pB171 parCl -

R1 рагС -Ефк^ИСфвфжг^-C^EZyCZ^CZ^e^-

10bp

Рисунок 2. Разнообразие строения центромерных сайтов бактериальных плазмид.

a. Показаны наиболее изученные центромеры различных плазмид. Стрелками показаны повторы, длина и число которых различно у разных центромер. Для Pi parS повторы бокса А и бокса В показаны серым и красным сответственно. Сайт связывания IHF показан синим прямоугольником. Масштаб для центромеры sopC плазмиды F отличается от других центромер.

b. Схематическое изображение молекулярной организации сегросомы Pi, содержащей parS последовательность ДНК, с которой взаимодействует IHF (фиолетовый), образуя изгиб ДНК. РагВ (зеленый) взаимодействует с гептамерными и гексамерными последовательностями на обоих концах parS. РагА (красный) вовлекается в сегросому за счет взаимодействия с РагВ.

К примеру, кодируемый плазмидой F белок SopB, являющийся гомологом РагВ, распознает сайт связывания, представляющий собой двенадцать последовательно расположенных повторов длиной 43 нт (sopC). Для сравнения, белок КогВ плазмиды RK2 связывается с полиндромом длиной 13 нт (ОвЗ)- Последние исследования структуры ДНК-связывающего домена белка КогВ выявили консервативный НТН мотив, а также необычный механизм распознавания белком центромеры. Механизм основан на двустороннем взаимодействии белка с двумя парами нуклеотидов, смежными со средней парой тринадцати нуклеотидного сайта связывания (Khare et al, 2004). Более того, в отличии от РагВ фага Pi, процесс димеризации КогВ за счет взаимодействия С-концевых районов белка приводит к существенному увеличению способности связываться с ДНК. (Delbruck et al., 2004). КогВ-0 НТН мотив связывается с центромерой, изменяя вторичную структуру ДНК в месте контакта. N-концевой район КогВ взаимодействует с родственным аналогом РагА белка (IncC), который, в свою очередь, после связывания перекрывает часть последовательности центромерного сайта. Таким образом, РагВ и КогВ, являясь по сути белками, связывающимися с центромерой и

гомологами, используют различный механизм как для олигомеризации, так и для связывания с ДНК. Каждый из этих двух белков распознает свои центромеры, которые у Pi и RK2 различаются как организацией повторов, так и нуклеотидными последовательностями. В последнее время было идентифицировано множество ДНК-связывающих белков, осуществляющих функции, аналогичные РагВ, но структурно отличающихся от него, а также существенные различия в механизмах формирования ДНК-белкового комплекса. Несмотря на такое разнообразие в организации центромер, РагВ белки выполняют главную функцию - формируют ДНК-белковые комплексы и обеспечивают специфичное связывание родственных РагА белков с образованием сегрегационного комплекса. Стоит отметить, что в большинстве случаев системы сегрегационной стабильности плазмиды самостоятельно обеспечивают правильное распределение репл^цированных молекул перед делением. Скорее всего, этот процесс не связан с компактизацией ДНК, как в случае распределения бактериальных хромосом, и происходит независимо от сегрегации нуклеоидов (см. обзор Прозоров, 2005), так^мутантном штамме mukB плазмида F распределяется правильным образом (Hiraga, 1992).

Бактериофаг Pi

В настоящий момент наиболее хорошо изучена организация сегрегационного модуля бактериофага Pi. Сайт parS представляет собой последовательность - 8о нт, расположенную следом за генами рагАВ. Центромерный сайт parS состоит из двух частей, разделенных сайтом связывания IHF. Каждая из частей содержит несимметрично расположенные гептамерные и гексамерные мотивы, с которыми может связываться РагВ (Hayes and Austin, 1994; Davis and Austin, 1988; Surtess and Funnell 2001). Белок IHF, связываясь с ДНК, вызывает изгиб в области parS, тем самым способствуя взаимодействию РагВ с сайтами связывания обоих частей центромеры (Funnell, 1991). Подобные конформационные изменения необходимы для образования сегросомы и правильного функционирования механизма сегрегационной стабильности Pi. Однако стоит отметить, что участие IHF или других структурных белков, кодируемых клеткой, в формировании нуклеопротеиновых комплексов на центромерах других бактериальных репликонов пока не было описано.

Белок РагА обладает АТФ-зной активностью и выполняет две функции: во-первых, он репрессирует промотор par оперона и, во-вторых, является компонентом собственно механизма сегрегационной стабильности (Davis et al, 1992 Friedman and Austin, 1988, Davis et al, 1996). РагА образуют димеры, связываясь с ATP или ADP, причем связывание с АТР приводит к изменению конфигурации РагА, делая возможным специфичное взаимодействие с SopB и включение в ст�

Информация о работе

Дорохов, Борис Дмитриевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение механизмов сегрегационной стабильности линейных плазмид на примере бактериофага N15 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы