Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние R-фактора pGK101 на спектр белков и функциональную организацию мембран клеток Salmonella derby

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние R-фактора pGK101 на спектр белков и функциональную организацию мембран клеток Salmonella derby"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕЕМ Г.Х. БУНЯТЯНА

'j t' на правах рукописи

СЕДРЖЯН АНАЙТ МИКАЕЛОВНА

ВЛИЯНИЕ R-ФАКТОРА pGKioi НА СПЕКТР БЕЯКОВ й ШЖЦИОШЛЬНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ МЕМБРАН КЛЕТОК Salnoneii* derby

Ч.оо.оз - гоштика и молекулярная биология

О3.00./Г

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ереван - гэ-эб

¿U3UUSUU» ¿ШЧМИППВЗиЬ wsnne3nnu£pr> иаФ13П\, U4MC1JM1 ¿.ft.PnnU»UB3UU> ишь MCUJURMJN13n hujsnsnns

AGneqpfi {1ршфиЬрт{

UD^UMm llUl/hS UhftUSCLh

pGKioi R-qnpinl^h ШЦГ^Ь у П L ja-j П L tip Salmonella derby pg^tlbph

freiriiatipTtfipfi шф$э1]П1.у!Лр}1 Ь. $mtil)yfintiuii ^шф/вфрМЛ ijpui

Ч.оо.оз - qblibtp|il|m k iiri^ti^nL|_mj(iTi L)bttuuipuitinLjnlti

ЦЬtiuuipuitiuiL|utti qfujinLjajfiLtititipti i»bl|traiimf>

qfiratjmli шдфйщЭД hmjyLTIUTJ ииг^СТифпиги. pjtaTi У И It H f1 P

tpUMi - 1996

l

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии HAH РА

"Научные руководители: академик HAH РА К.Г.Карагезян

K.Ö.H., в.н.с. К.А.Кцоян Официальные ошюнвнты: д.б.н., профессор П.А.Казарян

к.б.н. D.Г.Попов Ведущая организация: Ереванская государственный медицинскии университет имени М.Гераци

Защита состоится "—"-l^ser. в -часов на

заседании специализированного совета 042 при Институте биохимии HAH РА по адресу: 375044, Ереван, ул. П. Севака s/i

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии HAH РА.

Автореферат разослан "—"-1ээвг.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук, профессор (//jzaJLaß-Jt■ Симонян

U2N¥rti£E! и)1шрршичи|Ь1_ £ ¿i 4UU llni.Mini.i.tujiiti IjbtmmpumnLpyuiti IrtiuflifnifnLiJ /

Qfiipaljiitti цЭДшфврйЬр4 Ii WU ш^щЬОДпи Ч ЛЛш}Щ},)п\уиЙ1

ty.q.p., lun'.q.m. d.U.Münjuiti 4iu24>ntJiuliuiti ctitytfitfuijiinutitip" Ij.q.ri., u)pn$Dunp "I.U.Iumuipjuiti

3ni .Ч.Чшцп^

UuuiguujWip liuiqiMjbpttjnipjnitf Ср1Мф U.^bpmym mtrijmti ujGipu^mti pdjlpa^niti hua/iq uuipuitt

4m24«i)BiünL|»jnLbc ljUijiutmiLni. t; <-> -lsaej». d. -

II ЧШ1 4btiu!u(i|ul}mjh hüuijifxpni. itfiti l}fiy 042 ilmuliüiq|npu^uiti fiinphpr^p Тфшрт!, hmuybtf 375044, tpluufc, 4.üUailjh - s/i

Uipiiliiii}»nunLf»jmüc IwbLt» С ба&при&иц. i.L 4UU Mtitiuujfpifpmjf) [itiu^ipnupfi qpu^uipuiTinnT

UtirilJiaqlfpn ШППффпД С <-> -1996p

l/umtmqfiipffl^uiti |»nphpnt> ^(»фшЦиШ циц-нрт-гцдр, Lftitiumpiuttiul)uili qf>s«Li»jnuIitibpfi грт1)фпр, щрпфЬипр

U.U.UfHJntymti

Актуальность проблемы. Исследования фундаментальных проблем молекулярной биологии и генетики, а также прикладных аспектов генной инженерии, клинической медианы и эпидемиологии выдвигают новые задачи в изучении структуры и функции плазмид.

Плазмидоноеительство - существенный фактор изменчивости и эволюции бактерий, так как генетическая информация плазмид может расширить адаптивные возможности бактерий, что приобрело особо важное значение для их выживаемости в условиях повышенной агрессивности окружающей среды вследствие загрязнения ее химическими реагентами, а также целенаправленного создания и массового применения антибактериальных агентов.

Плазмидные гены могут принимать участие в формировании разнообразных признаков клетки-хозяина, вносить вклад в спон -тайную и индуцируемую мутабильность ( Mortelmans et al., 1976; Brower et al., 1981), репликацию и рекомбинацию хромосомной ДНК бактериальных клеток, их устойчивость к действию различных повреждающих агентов ( Boulnois et al., 1979; Tsunagushi et al., 1980; Pottjpr et al., 1983; Villetts et al., 1984; Чернин Л.С., 1985). г

Изучение плазмидиых детерминантов устойчивости к антибактериальным-дгентаы имеет важное значение для понимания механизмов взаимодействия плазмидного и хромосомного геномов. Исследования ,в области генетики и циркуляции плазмид резистентности, их роли в патологических процессах в совокупности с исследованиями молекулярных механизмов действия антибиотиков и механизмов антибиотикорезистентности способствуют целенаправленному поиску химиотерапевтических средств.

Сложность функциональных связей плазмидного и хромосомного геномов обусловлена как гетерогенностью плазмид в плане генетической организации, так и видовым многообразна! клеток-хозяев, осуществляющих генетический контроль и создающих специфический фон для активности плазмид ( Чернин Л.С., 1978).

Участие плазмид в генетических процессах бактериальных клеток может быть как конститутивным, так и индуцируемым. Эффекты плазмид могут носить и регуляторньгй характер, взаимодей-чтвуя с регуляторной функцией хромосомных генов.

Исследование R-фактора pGKIOI нлеток Salmonella йегЪу представляет интерес в связи с множественностью эффектов плаз-

миды, которая, наряду с формированием лекарственной устойчивости бактерий ( Саркисян H.H. и др., 1986), оказывает влияние на их формообразование и ультраструктуру мембран ( Кцоян Ж.А., 1991), метаболизм мембранных фосфолипидов ( Pepoyan et al., 1990), ¿^-чувствительность и фагочувствительность ( Антонян Р.Г., Кцоян Ж.А., 1988).

Многие структурно-функциональные свойства клеток s. derby, ассоциированные с R-фактором, обусловлены организацией их клеточных оболочек, что предопределило интерес к исследованию влияния плазмиды на структурные компоненты мембран и их функцио -нальную активность.

Изучение механизмов эффектов крупных плазмид представляет собой сложную задачу как в связи с неоднозначностью состояния плазмидных молекул в клетке ( возможность диссоциации на более мелкие плазмиды), так и в связи со спецификой клеток-хозяев . Возможным подходом к изучению проблемы плазмидно-хромосомных взаимодействий в этих случаях является исследование: эффектов плазмид в штаммах дикого типа; мутантов, природа дефектов которых более или менее идентифицирована генетически и биохимически; трансформантов, полученных передачей плазмидной ДНК при трансформации.

Цель и задачи исследования. С целью исследования влияния R-фактора pGKEOI на белковый спектр и функциональную организацию мембран клеток S. derby , для выявления механизмов взаимодействия плазмидного и хромосомного геномов в системе pGKTOI- s. derby , необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследование качественного и количественного составов белков мембран и цитоплазм штамма S- derby дикого типа и его плазмидных и бесплазмидных производных.

2. Выявление белковых компонентов мембран клеток S. derby,

.обусловленныхR -плазмидой, их роли в функциональной организации мембранных структур бактерий.

3. Исследование механизмов устойчивости s. derby к антибиотикам.

4. Исследование трансформантных штаммов S. derby для выявления влияния плазмидной ДЦК на качественный и количественный составы мембранных белков и фосфолипидов.

Научная новизна. Впервые исследованы белковые спектры мш-

б ран и цитоплазм плазмидных и бесплазмидных клеток 5. derby, что позволило выявить существенное влияние R-фактора pGKIOI на качественный и количественный составы белков этих клеток.

Результаты, полученные при исследовании трансформантных -штаммов, подтвердили детерминирующую рольR-плазмиды в организации белков и фосфолипидов мембран плазмидных штаммов S. derby, что было доказано воспроизведением структурных и функциональных характеристик плазмидного штамма после введения в бесплаз-мидные клеткиR -фактора pGKIOI в полном объеме.

Полученные данные о преобладающих белковых компонентах мембран плазмидного и бесплязмидного штаммов S. derby позволяют анализировать барьерные функции внешней и внутренней мембран этих клеток по отношению к антибиотикам и детергентам.

Полученные данные о влиянии R -фактора pGKIOI на поверхносту ные структуры s. derby позволяют высказать предположение о влиянии плазмиды лекарственной устойчивости на вирулентность клеток s. derby, что представляет интерес для дальнейших исследований.

Практическая ценность. Результаты работы способствуют пониманию молекулярных основ формирования мембранных структур и их функциональных свойств, которые являются результатом взаимодействия плазиидяого и хромосомного геномов в системе и-фактор pGKIOI- s. derby.

Исследование,ыембран s. derby и их модификаций, обусловленных R-фактором, имеет важное значение для клинической медицины в связи с ключевой ролью поверхностных структур в виру -лентности, лиганд-рецепторных взаимодействиях, адгезии и развитии заболевания в целом, а также фагочувствительности сальмонелл.

Полученные данные представляют практический интерес для решения проблем антибиотикотерапии, так как способствуют целенаправленному поиску и применению антибиотиков.

Апробация работы. Результаты работы доложены на семинарах группы репарационных систем клетки и ученых советах Института экспериментальной биологии АН АрмССР.

Работа апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной биологии НАН РА от 21 декабря 1996 года.

Публикации. Основные результаты исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в четырех статьях и тезисе.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, ре -зультатов собственных исследований и их обсуждения ( 3 главы ), заключения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

йгаммы микроорганизмов и их культивирование. Условно-патогенный штамм S. derby К9Э, изолированный из клинического материала ( Вартанян М.К. и др., 1970), содержащий конъюгативный Е-фактор pGKIOI, длиной около 100 т.п.н. и гетерогенные по размерам ( 20 т.п.н. и меньше) плазмидные молекулы ( Саркисян H.H. и др., 1985).

Штамм s. derby KI34 - содержащий pGKIOI, радиочувствительный мутант S. derby К89.

Бесплазмидные штаммы: s. derby К82, полученный обработкой двойного ауксотрофного мутанта s. derby ЮЗ 2 #-ым этилметан-сульфонатом ( Кцоян I.A. и др., 1977); s. derby Кб, полученный обработкой S. К89 в количестве Ю^кл/мл бромидом этидия

в концентрации 100 мкг/мл ( Кцоян I.A. и др., 1988).

Трансформантные штаммы S. derby К82ц_с^, полученные при трансформации бесплазмидного штамма S. derby К82 суммарной плаэ-мидной ДНК из штамма S. derby К98.

В качестве питательных сред использовали: мясопептонный бульон ( МПБ), 2 л5-ый мясопептонный агар ( МПА), минимальную среду М-9 ( Willeta et al., 1970).

Антибиотики использовали в концентрациях. ( мкг/мл): стрептомицина сульфат ( Sm) - 200 и 8000, пенициллина натриевая соль ( En) - 20, тетрациклина гидрохлорид ( Cm) - 20, хлорамфенинол ( Сш) _ 20.

Бактерии выращивали при температуре 37°С до стационарной фазы ( 20 - 24 час.).

Выделение мембран и цитоплазм. Собранные 3-4 г влажных клеток дважды центрифугировали в 10 мМ трис-буфере р^ 7,4 при 5000 об/мин в течение 30 минут.

Выделение мембран клеток проводили по методу Инойе

( Inouye., 1976). Клетки, суспензированные в 10 мл трис-буфера pH 7,4, разрушали ультразвуком ( 22 кГц) в течение 4 минут ггри непрерывном охлаждении. Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием при 15 ООО об/мин в "течение 30 минут. Мембраны отделяли от цитоплазм центрифугированием при 100 000g в течение 30 минут (ïï-бф.

Электрофоретическое разделение белков. Содержание белка в образцах определяли по методу Зарбурга и Кристианеа ( Warburg О., Christian У 1939).

SDS-электрофорез белков проводили по методу Лэммли ( Laem-mli ü. ,1970) Е двухступенчатом 3 % и 10 £-ом полиакриламидном геле. Гель загружали белковыми препаратами в количестве 0,1 мг белка на трек. Для сшивки геля к стеклу использовали silane-AI74 ( Sigma ).

После электрофореза положение белков в геле фиксировали в растворе, содержащем 40 $ изопропанола и 10 % уксусной кислоты, Окрашивали гель 0,2 # кумасси (й -250), содержащем 40 # изо-пропилового спирта и 10 £ уксусной кислоты. Обесцвечивание проводили в 7 # уксусной кислоте, после чего гель высушивали на воздухе, предварительно выдержав 5 минут в растворе, содержащем 3 % глицерина и 70 $ изопропанола. Электрофореграммы сканировали на приборе Ultrascan XI ( ШЗ) при 633 нм.

Концентрацию полипептида в образце характеризовали по площади соответствующего ему пика на кривой сканирования электрофореграммы.

Молекулярные веса полипептидов определяли, используя кривую калибровки геля, построенную по данным об относительной миграции в геле SDS -маркеров ( sigma).

Определение аминокислотного состава. Аминокислотный состав мембранных белков бактериальных клеток определяли на аминокислотном анализаторе AAA 339 фирмы "Microtehna " ( ЧСЛР) после гидролиза препаратов б и HCl в течение 24 час. при Ю5°С.

Определение состава фосфолипидов. Фосфолипидный состав определяли экстракцией ФД из ацетоновых порошков меибрая s. derby с помощьэ хлорофори-метаноловой снеси ( 2:1) по Фолчу ( Polch J. et al., 1957) в модификации Карагеэяна ( Карагезян К.Г., 1972).

M разделяли на фракции в системе растворителей хлороформ-метанол-концентрированный аммиак ( 65:35:5). Количество липид-

ного фосфора определяли спектрофотометрически ( 05-26) при длине волны 830 ны ( Карагезян К.Г., 1969; Зубер В.Л., 1982).

о

РЕЗУШАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУВДЕНИЕ

I. Спектры белков плазмидных клеток s. derby

В спектрах белков мембран и цитоплазм клеток s. derby К89 различимы 39-40 и 36 полос полипептидов соответственно ( рис. 1-3 ).

Некоторые из преобладающих по содержанию ("главных") белковых компонентов мембран ( рис. 2; пики №№23, 25, 28, 39 ) и цитоплазм ( рис. 3; пики №№13, 17-21, 25-35 ), проявляясь конститутивно, образуют характерную для клеток S. derby К89 картину на электрофоретических треках. В числе таких белков примечателен белок мембран №28 ( около 49 кД ), содержание которого составляет до 10 $ от общего количества мембранных белков.

В спектрах мембран s. derby К89 в области полипептидов с мо лекулярными массами от 39 до 42 кД наблюдается группа "главных" белков, состав и концентрации которых преимущественно постоянны, но в некоторых случаях могут проявлять вариабельность ( рис. 2, 3 ).

Обнаружена вариабельность и некоторых других мембранных белков Б. derby К89 ( рис. 3; пики №№8, 17, 19, 36 ).

Потеря или изменение концентрации белковых компонентов мембран могут быть следствием адаптационных реакций, а также малоочевидных изменений в физиологии микроорганизмов, что обусловлено функциональным многообразием и кооперативностыо организации белкового компонента мембран ( Hammond Б.К. et al., 1984 ).

Исследования белков мембран s. derby К89 выявили взаимосвязанность экспрессии группы "главных" белков №№31-34 ( рис. 1-3 ). В спектрах мембран бактерий, выращенных на полноценной питательной среде при 37°С, преимущественно наблюдаются белки №31 и №34 в высоких концентрациях, при этом белки №32 и №33 содержатся в низких концентрациях или не проявляются. Суммарное содержание белков области 39-42 кД мембран s. derby К89 сохраняется примерно равным, независимо от их состава и концентрации ( около 17 $ от общего количества мембранных белков ).

0,5 0,6_

116 кд 97,4 кД

66 кД

45 кД

29 кД

123456789 10

Рис. I. Относительная миграция ( Rf ) мембранных белков

s. derby ( SDS-элвктрофорез в 10 % ПААГ с последующим окрашиванием в кумасси ):

I - S. derby KI34; 2 - S. derby К89; 3 - S. derby Кб; 4 -S. derby K82; 5 - S. derby K824; 6 - S. derby H823 ; 7- S. derby

K822; 8 - S. derby K82j; 9 - S. derby K825; 10 - SDS-маркеры.

Рис. 2. Кривые сканирования электрофо-реграмм мембранных белков S. dexby. I - S. de-rby KI34; 2 - g. derby K89; 3 - S. derby Кб; 4 - derby К82; 5 - S. detby K824; 6- S. derby K823; 7 - S. derby K822; 8 - derby K82j-; 9 - S. de-tby K825.

РАССТОЯНИЕ ОТ СТАРТА ( мм )

0,5 0,6-

o,s

0,9

1,0

Рис. 3. Спектры белков П6 кД s. derby. К89; а) относительная ' ^ миграция ( Bf ) при &DS-электрофорезе в 10 % ПААГ с последующим окрашиванием в кумасси; С) кривые сканирования электрофоре грамм; 1,2- мембраны; 3 - цитоплазма.

66 кД

45 кД

29 кД

"1«=--Т-*-1-г-

60 70 80 90 100 НО

РАССТОЯНИЕ ОТ СТАРТА ( им )

Совокупность полученных данных по характеру профилей и экспрессии белков №№31-34 мембран S. derby дает основание предположить, что перечисленные белки являются Отр белками мембран клеток в. derby: OmpC ( 42 кД ), OmpF ( 41 кД ), OmpD (40 кД) и ОтрА ( 39 кД ).

В мембранах мутантного радиочувствительного штамма 8. derby derby KI34 белок с молекулярной массой 40 кД не выявлен ( рис. I, 2 ). Белки мембран S. derfeyKI34 с молекулярными массами 3942 кД проявляются конститутивно, при этом их суммарное содержание почти в два раза превышает их содержание в мембранах штамма дикого типа ( около 30 $ от общего количества мембранных белков ). Наряду с этим, помимо перечисленных белков, содержание мембранных белков s. derby KI34 снижено по сравнению с белками клеток дикого типа примерно в 1,9 раз.

Различия в белковых спектрах мембран клеток дикого типа и мутантного штамма находят отражение в различиях аминокислотного состава смеси их мембранных белков, анализ которых выявил преобладание в белках области 39-42 кД s. derby нейтральных аминокислотных остатков и пониженное содержание основных аминокислотных остатков ( табл. I ).

Посев клеток S. derby на полноценную питательную среду , содержащую 3 $ SDS, направленный на выявление omp?~ompc~ фенотипа ( Lugtenberg В. et al., 1976 ), не отразился на росте клеток дикого типа S. derby К89, тогда как мутантный штамм S. derby KI34 сформировал лишь отдельные колонии.

Чувствительность клеток мутантного штамма к SDS, по-видимому, нельзя "объяснить отсутствием OmpF и OmpC белков, что противоречило бы как данным электрофоретического анализа белковых спектров, так и отсутствию недостаточности клеток по транспорту метаболитов. Природа чувствительности мутантного штамма к содержанию в среде SDS, по-видимому, заключена в нестабильности связей между внешней мембраной и пептидогликаном, что может быть следствием дефектности по биосинтезу липопротеидных компонентов мембран ( Soantag I. et al., 1978; Tem D.W. et al., 1978 ). Нестабильность связей внешней мембраны с пептидогликаном в s. derby KI34, возможно, в какой-то мере компенсируется повышенным содержанием белков Отр группы, которые стабилизируют структурную организацию внешней мембраны.

Вызывают интерес механизмы, приводящие к интенсификации

Таблица I

Аминокислотный состав смеси мембранных белков S. derby

% от общего количества аминокислот

Аминокислоты штаммы S. derby

К89 KI34 К82 .. трансформанты К82

I 2 3 4 5

Основные:

лизин 4,75 0,44 2,52 5,63 1,98 2,94 1,91 ' 5,9

гистядин 5,71 1,66 0,72 2,5 2,93 3,36 5,34 1,3

аргинин 10,84 3,11 27,1 6,26 4,83 5,11 7,64 2,93

всего: 21,3 5,21 30,35 14,39 9,74 11,41 14,89 10,13

Кислотные:

аспарагин 13,6 9,9 4,37 4,85 8,39... 10,7 15,42 21,13

глутамин 7,36 4,5 3,87 3,29 2,06 5,65 11,54 0,96

всего: 20,96 14,5 8,24 8,14 10,45 17,35 26,96 22,09

Нейтральные: треонин 3,94 7,07 2,36 5,79 9,98 9,12 9,38 16,74

серин 6,88 5,86 2,1 13,62 4,51 10,42 11,96 7,99

проЛИН 5,56 26,24 18,46 27,86 23,75 14,36 9,27 -

глицин 9,4 7,77 17,6 7,51 8,47 6,42 1,22 7,91

аланик 10,3 8,83 12,59 5,63 4,43 10,5 15,27 16,32

всего: 36,08 66,87 53,11 60,41 51,14 56,82 47, Г 48,96

Гидрофобные: метионин 1,14 1,64 0,59 1,88 2,22 1,62 1,67

валин 1,83 2,73 2,38 6,26 3,56 4,18 1,34 0,5

изолейцин 1,77 2,0 1,41 1,88 г,и 1,53 1,09 8,66

лейцин 7,06 2,77 1,02 2,03 11,01 6,24 4,05 0,8

тирозин 5,83 3,7 1,61 2,66 5,38 3,21 1,45 4,18

фенклаланин 3,97 1,56 1,27 2,35 5,38 3,25 3,13 3,01

всего: 21,63 14,4 8,28 15,26 28,66 20,03 II, 06 18,82 _______ -

и конститутивности синтеза Ошр белков в штамме 8. derby KI34. Нарушение осмочувствительности регуляции синтеза пориновых белков возможно как вследствие дефектности клеток по EavZ белку ( фосфатаза и киназа OmpR - активатора транскрипции генов ompF и отрС ), так и в случае мутаций в промоторном участке генов ошрР и отрС.

Исследование состава и функциональной активности Отр белков s. derbynpeflcraBflfleT интерес и в связи с механизмами их множественной устойчивости-к ряду антибиотиков ( 8ш, Рп, От ), детерминируемой R-фактором pGKIOI ( Саркисян H.H. и др. 1986 ). Особый интерес вызывает устойчивость клеток S. derby К89 к высокой концентрации Sm ( 8000 мкг/мл ). Ранее проведенные исследования клеток S. derby исключили механизмы резистентности к Sm, связанные с модификацией молекул антибиотиков или рибосом и привели к предположении о повышенной устойчивости к Sm за счет детерминируемого R—пяазмидой изменения проницаемости клеточной оболочки к его молекулам ( Кцоян Ж.А. и др., 1988 ).

-Полученные данные по составу преобладающих белковых компонентов мембран и функциональному состоянию Отр -порообразущих белков плазмидных клеток 8. derby позволяют сделать вывод о том, что наружняя мембрана плазмидных клеток S. derby не препятствует проникновению молекул антибиотиков в лериплаэматическое пространство. Барьерную функцию, снижающую проникновение ßm в клетку, выполняет, по-видимому, цитоплазматическая мембрана.

Преодоление цитоплазматической мембраны молекулами Sm -процесс энёргозависимый, который может быть нарушен в результате блокировки биосинтеза гема, снижения содержания липофильных хинонов в цитоплазматической мембране, недостаточностью штаммов по компонентам дыхательной цепи ( Таисова A.C., 1986 ).

2. Спектры мембранных белков бесплазмидных клеток S. derby

Сравнительное изучение спектров белков S. derby К89 дикого типа и бесплазмидных штаммов S. derby К82 и 8. derby Кб выявило модифицирован™сть белковых профилей, ассоциированную с отсутствием н-фактора pGKIOI ( рис. I..-3 ).

Число различимых полос полипегггидов в треках мембранных белков равно 26 для штамма s. derby К82 и 39 для штаммов S. derby К89 и S. derby Кб.

- 15 -

Качественный состав белкового спектра мембран плазмидного штамма В. derby К89 на 80 % ( 30 полипептидов ) сохранен в мембранах бесплазмидного штамма S. derby Кб и на 50 $ ( 19 полипептидов ) в мембранах бесплазмидного штамма 8. derby К82.

В мембранах бесплазмиднах- штаммов не наблюдаются некоторые полипептиды мембран плазмидного штамма_Б. derby К89, при этом №№3, б, 10, 26, 39 ( рис. I, 2 ) плазмидного штамма отсутствуют в мембранах обоих бесплазмидных йтаммов.

Вместе с тем, в бесплазмидных штаммах наблюдаются полипептиды, не выявленные в клетках дикого типа, при этом обнаружены различия по составу полипептидов и между белковыми профилями мембран двух бесплазмидных штаммов.

В числе мембранных белков Б. derby Кб, не наблюдаемых в мембранах плазмидного штамма ( 9 белков ), следует отметить Ш7, 17, 29, которые по значениям концентраций ( 0,228, 0,25 и 0,44 соответственно ) можно отнести к "главным" белковым компонентам мембраны.

В бесплазмидном штамме в. derby К82 из 8 мембранных полипептидов, не наблюдаемых в плазмидном штамме, четыре ( №№8, 12, 21, 22 ) содержатся в высоких концентрациях ( 1,12, 0,64, 1,01, 0,99 соответственно ).

Среди белков, появившихся в мембранах клеток S. derby после потери Е-фактора, следует отметить белки с молекулярными весами 180 кД, 52,5 кД, 27,5 кД, которые наблюдаются в обоих бесплазмидных штаммах ( соответственно Ш7 , 25 , 39 штамма S. derby Кб и №»2, 12, 26 штамма S. derby К82 ).

Выявлены различия и в концентрациях мембранных полипептидов сравниваемых штаммов.

В единице сухого веса мембран плазмидного и бесплазмидных штаммов суммарное содержание белков примерно равно, в отличие от содержания фосфолипидов, которое, как было показано ранее ( Pepoyan A. z. et al.,I990 \ в бесплазмидном штамме s. derby К82 снижено значительно ( более чем в 10 раз }.

Полученные данные свидетельствуют о специфике белок-фосфо-липидных соотношений для каждого из исследованных штаммов.

Выявленные различия в белковых спектрах бесплазмидных штаммов и их модифицированность по сравнению с плазмидным штаммом, коррелируют с функциональными особенностями сравниваемых штаммов.

- 16 -

Общими признаками бесплазмидных штаммов, отличающими их от плазмидного штамма, являются округлая форма клеток ( возможно, вследствие дефектности РВР2 ), ауксотрофность, чувствительность к Sm, Pn, Cm и устойчивость к фагу dp8 ( Кцоян Ж. А. и др., 1988 ). Бесплазмидный штамм S. derby К82 устойчив к Тс и отличается повышенной толщиной клеточной оболочки ( Кцоян Ж.А. и др., 1991 ).

Оба бесплазмидных штамма характеризуются пониженной скоростью роста на полноценной среде при неограничивающей температуре и достигают стационарной фазы, а затем и ингибирования клеточного деления при низком по сравнении с плазмидным штаммом титре бактерий в среде ( почти в 2 раза для клеток 8. darby К82 ( Пепоян А.З. и др., 1990 ) и в 20 раз для S. derby Кб ).

Устойчивость S. derby К82 к Тс хромосомной природы и связана, по-видимому, с мобильными генетическими элементами.

Внешняя мембрана бесплазмидных штаммов S. derby проницаема для молекул антибиотиков, что подтвердили полученные данные о составе преобладающих белковых компонентов в их мембранах.

Транспорт Тс через цитоплазматическую мембрану энергозависим и может быть нарушен при недостаточности штаммов по компонентам дыхательной цепи. Возможна и диффузия некоторого количества молекул Тс через фосфолипидные участки цитоплазмати-ческой мембраны.

Пониженное содержание фосфолипидов в мембранах S. derby К82, возможно, препятствует проникновению Тс через цитоплазматическую мембрану, что согласуется с литературными данными об увеличении времени генерации клеток при хромосомной устойчивости к Тс, обусловленной ослабленным поглощением Тс ( Сазыкин И.О., Навашин П.С., 1991 ).

Низкцр максимальные скорости роста бесплазмидных штаммов S. derby в оптимальных условиях культивирования свидетельствуют о появлении "узких мест" метаболизма после удаления В-факто-ра pGKIOI. По предварительным данным, одним из таких " узких мест" в бесплазмидных штаммах S. derby является их дыхательная цепь.

Важнейшее для жизнедеятельности микроорганизмов, свойство саморегуляции включает в себя целенаправленное формирование структур для выполнения ключевой термодинамической функции -обеспечения циклов веществ и энергии в условиях их дефицита ,

вызванного как внешними факторами, так и существованием "узких меет^ метаболизма. В процессах саморегуляции микроорганизмов участвуют механизмы различной степени сложности.

Взаимосвязанные изменения процессов метаболизма белков, фосфолипидов и пептидогликана, а также ограничение роста микроорганизмов, наблюдаемое в клетках з. derby при отсутствии R-фактора pCKIOI, наводят на предположение о влиянии продуктов, кодируемых гогазмидой, на звенья взаимосвязанных механизмов регуляции жизненно важных процессов, возможно, на компоненты системы строгого ответа ( stringent-контроль ).

Ограничение роста микроорганизмов представляет собой существенную составную часть физиологического состояния популяции при культивировании. Подавление клеточного деления в бес-плазмидных клетках S. derby может быть обусловлено продуктом sulA гена SOS-системы репарации, тесно сцепленного с ошрА геном. Существует и другой, sulA-независкмый механизм ингибирова-ния клеточного деления у сальмонелл ( Gilbert I., 1989 ).

Таким образом, Н-фактору pGKIOI S. derby принадлежит важная роль в жизнедеятельности этих клеток. Плазмпда наделяет клетки s. derby рядом селективных преимуществ, способствует формированию гетерогенной структуры микробной популяции, расширяя возможности микроэволюции, реализации различных типов стратегий развития популяции.

3. Влияние пяазмидной ДНК на спектры белков и фосфолипид-ный состав мембран трансформантных клеток s. derby

Исследование трансформантных штаммов S. derby по-

казало, что введение плазмидной ДНК в бесплазмирные клетки S. derby К82 обусловило изменения спектров мембранных белков (рис. I, 2 ) и фосфолипидов ( табл. 2 ).

В мембранах штамма s. derby K82j, содержащего фрагмент It-фактора, наблюдается наибольшее расхождение со всеми сравниваемыми штаммами a. derby по составу белков. Число различимых полипептидов в мембранах s. derby K82j сокращено до 21, а их качественный состав лишь на 40 % воспроизводит спектры бесплаз-мидного и плазмидного штаммов.

В белковых профилях мембран трансформантных штаммов S. derby К82(2_4)» содержащих фрагменты Н-фактора, наблюдается

Таблица 2

Состав фосфолипидов мембран S. derby

Фракция штаммы S. derby

ФЛ К82 трансформанты К82 K8Q KI34

Т 2 3 5

Лизофос- фатидал- а 8,34 холины (ШХ) б 6.65 27,4 54,89 26,21 29,48 3.57 6,03 8.7 2.09 21,65 23,4 1.52 1.57

СфйНГО- - р tyу миелины а (ОВМ) б 2,77 34,3 50,32 33,85 39,73 4,46 5,52 11,25 2,82 28,97 23,0 2,03 2,14

Фосфатя- я 47 дилсерины ' ( ФС ) б 3,96 71,34 41,17 42,59 60,64 9,28 4,5 14,15 4:31 64,94 34,5 4,55 2,31

Фосфати- дилино- а 4,38 зиды ( ФИ ) б 3,66 37,04 70,09 21,85 42,68 4,8 7,8 7,26 3,1 32,4 17,32 2,42 1,16

Фосфати— дилхо- а 14,86 ЛИНЫ ( ФХ ) б 12,43 120,7 211,76 51,95 567,0 15,7 23,27 17,25 40,3 692,64 710,0 48,48 47,5

Фосфати- дилзта- а 11,57 ноламины _ л „ (ФЭА) б 9,68 219,52 320,32 62,24 147,0 28,57 35,2 20,68 10,45 179,65 112,6 12,58 7,53

Фосфати- дилгли- а 12,03 церины ( ФГ ) б 10,04 38,42 54,99 52,42 154,5 4,9 6,08 17,41 10,1 168,81 274,5 11,82 18,4

Общее содержа- 83,645 ние ФЛ 768,44 910,0 301,0 1407,0 1428,6 1493,8

Сумма вышеопределенных 58,72 индивидуальных ФЛ 548,72 804,34 264,9 1041,53 1191,3 1204,3

а - количество фосфора ( мкг ) на I мг сухого веса,

б - процентное содержание индивидуальных ФЛ к общему количеству ФЛ.

увеличение общего числа различимых полипептидов до 30-39. Сшк-

тры мембранных белков этих штаммов, несмотря на некоторые различия по отдельным белкам, на 65 <£ повторяют белковый спектр мембран бесплазмидного штамма. В мембранах трансформантных штаммов выявлены полипептиды, не наблюдаемые в белковых профилях мембран бесплазмидных клеток, которым соответствуют идентичные по электрофоретическим позициям в полиакриламидном геле полипептиды мембран плазмидного штамма S. derby К89, вследствие чего в трансформантных штаммах наблюдается около 70-75 % спектра мембранных белков плазмидного штамма S. derby К89.

Следует отметить, что в мембранах каждого из трансформант-ных штаммов выявлены полипептидн, не наблюдаемые в спектрах мембранных белков бесплазмидного или плазмидного штаммов.

Таким образом, несмотря на некоторые различия между собой, по качественному составу белков мембраны трансформантных штаммов 8. derby проявляют большее сходство с плазмидным штаммом 8. derby К89.

Суммарное содержание ФЛ в мембранах трансформантных штаммов s. derby К82ц_з)различно ( табл; 2 ),■ его значения занимают промежуточное положение между данными для бесплазмидного и плазмидного штаммов. Для трансформантных штаммов, содержащих фрагменты R-фактора, характерно преобладание содержания ФЭА над ФХ, чего не наблюдается ни в плазмидном, ни в бесплазмид-ном штаммах. Все три трансформантных штамма сохраняют высокое содержание Л£Х. Количество ФХ в мембранах трансформаданых штаммов несколько повышено, но остается близким к его уровню в мембранах бесплазмидного штамма.

Таким образом, исследование спектров мембранных белков и ВД в трансформантных штаммах s. derby K82q_^, содержащих фрагменты R-фактора pGKIOI, выявило отличия от бесплазмидных клеток по рассмотренным параметрам, что коррелирует с такими признаками трансформантных клеток, как морфологическая гетерогенность, потеря устойчивости к Тс, увеличение скорости роста по сравнению с бесплазмидными клетками. Шесте с тем, следует отметить, что трансформантные штаммы S. derby сохрани-

ли ауксотрофность, присущую бесшгазмидным клеткам.

В мембранах трансформантного штамма S. derby K82g, содержащего pGKIOI в полном объеме, не обнаружены характерные для бесплазмидных клеток полипептиды, отличающие их от плазмидного

о

штамма S. derby K89; качественный состав белков бесплазмидного штамма S: derby К62 сохранен на 70 %. Наряду с этим, в мембранах трансформантного штамма наблюдается больше полипептидов спектра плазмидного штамма s. derby К89 ( 31 ), чем в мембранах S. derby К82 ( 19 ). Качественный состав мембранных белков трансформантного штамма S. derby K82g на 90 # воспроизводит спектр мембранных белков плазмидного штамма.

По концентрациям мембранных белков'штамм s. derby K82g

отличается от S. derby К89 пониженным содержанием ( более чем в два раза ) около 70 % белков ( 21 ), от S. derby К82 - пониженным содержанием около 30 # белков ( 10 ).

Аминокислотный состав смеси мембранных белков трансформантного штамма S. derby K82g претерпел существенные изменения по сравнению с бесплазмидным штаммом ( табл. I ). Содержание нейтральных аминокислотных остатков в белках S. derby К82§ остается повышенным, как в бесплазмидных клетках S. derby К82, но характерного для них пониженного содержания кислотных остатков и повышенного содержания основных аминокислотных остатков не наблюдается. Аминокислотный состав мембранных белков трансформантного штамма S. derby K82g ближе к составу аминокислот мембранных белков плазмидных клеток, что находит выражение и в отношении суммарного содержания гидрофобных аминокислотных остатков к гидрофильным, которое для трансформантных, плазмидных и бесплазмидных клеток составляет 1/1,8, 1/2 и 1/5 соответственно.

В мембранах трансформантного штамма S. derby K82g наблюдается повышение общего содержания ФЛ до уровня их содержания в плазмидном штамме ( табл. 2 ). Несмотря на повышение 'количеств ЖХ, С&М и ФИ по сравнению с мембранами плазмидных клеток ( на 30, 40, и 30 % соответственно ), качественный состав и количественное содержание индивидуальных разновидностей ФЛ в мембранах трансформантного штамма s. derby K82g, в целом, повторяют картину ФЛ-ФЛ соотношений мембран плазмидного штамма, с характерным для них преобладанием ФХ.

Приближение состава аминокислот, белков и ФЛ мембран S. derby К825 к характеристикам мембран плазмидного штамма В. derby К89 коррелирует с приобретением трансформантными клетками таких его морфофункциональных признаков, как палочковидная форма клеток, прототрофность, множественная устойчивость к ан—

- 21 -

тибиотикам ( Вш, Pn, Cm ), чувствительность к фагу dp8.

Таким образом, введение в бесплазмидные клетки s. derby К82 фрагментов В-фактора в результате трансформации обусловило изменение спектров мембранных"белков и ФЛ, что привело к возникновению специфических для каждого из исследованных транафор-мантных штаммов белок-ФЛ соотноиений, существенно отличающихся от данных для бесплазмидного и плазмидного штаммов. Введение в бесплазмидные клетки й-фактора pGKIOI в полном объеме и восстановление вследствие этого суммарного генетического фонда плазмидных клеток S. derby К89, оказав существенное влияние на процессы метаболизма аминокислот, белков и ФЛ, привело к почти полному воспроизведению в клетках s. derby K82g состава и мор-фо-функциональных параметров мембран штамма s. derby К89.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании трансформантных штаммов, подтвердили детерминирующую роль В-фактора pGKIOI в поддержании определенных белок-ФЛ соотношений в мембранах плазмидных клеток s. darby.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены конститутивные преобладание компоненты белковых спектров мембран и цитоплазм клеток S. derby К89, содержащих Н-фактор pGKIOI, которые создают характерную для штамма картину при SDS-электрофорезе в 10 % ПААГ.

2. Преобладающие белковые компоненты мембран бактерий S. derby К89 с молекулярными весами в области 39-42 кД являются, по-видимому, Ошр белками: ОтрС ( 42 кД ), ОшрР ( 41 кД ), OmpD ( 40 кД ) и ОтрА ( 39 кД ).

3. Повышенное содержание преобладающих белковых компонентов в мембранах мутантного радиочувствительного штамма S. derby KI34 ( почти в два раза ) стабилизирует клеточную оболочку бактерий.

4. Внешняя мембрана не препятствует проникновению молекул Sm в клетки s. derby К89. Устойчивость клеток к высоким концентрациям Sm ( 8000 мкг/мл ), детерминируемая Н-фактором pGKIOI, обусловлена снижением проницаемости цитоплазматической мембраны к молекулам Sm.

5. Остутствие В-фактора pGKIOI обусловило разную степень модифицированное™ белковых спектров мембран бесплазмидных

- 22 -

штаммов s. derby Кб и S. derby K82.

6. R-фактору pGKIOI принадлежит детерминирующая роль в поддержании определенных белок-фосфолипидных соотношений, в мембранах клеток S. derby.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Седракян A.M., Мнацаканян Г.А., Калачян А.С., Кцоян Ж.А., Арутгонян А.А., Карагезян К.Г. Влияние R-плазмиды на белковый спектр клеток Salmonella derby// ДАН РА.- 1993.- Т. 94, №1,-

С. 49-53.

2. Седракян A.M., Пепоян А.З., Кцоян Ж.А., -Карагезян К.Г. Влияние белков и фосфолипидов мембран клеток Salmonella derby на характер межклеточных взаимодействий// ДАН РА, 1994 ( в печати ).

3. Седракян A.M., Кцоян Ж.А., Саркисян Н.Н., Аракелова К.А., Карагезян К.Г. Роль мембран в повышенной устойчивости плазмид-ного штамма Salmonella derby к Sm// ДАН РА, 1996 ( в печати ).

о

4. Sedrakyan A.M., Kerageusyan K.G., Ktsoyan G.A., ^ Sarkisyan N.N., Khanbekyan L.M. The Nature of High So Resistance

—of Salmonella derby// Russian-British International Workshop "Membrane bioenergetics* Moskow, 15-2о December, 1995, P. 5? .

5. Седракян A.M., Кцоян I.A., Саркисян H.H., Карагезян К.Г. Спектры мембранных белков плазмидных и бесплаэмидных штаммов 8almonella derby // ДАН РА, 1996 в печати .

ис^имзиъ liUUhS ипяизыг»

pGKl01 R-qnpàntlfl imir^ynipjllltic Salmonella derby p2h2^p[l

piarjoiîijsTiUph ucj)it*üi)nLyTitipp uujblj^pfi к ^m'ü'qyfrn'tmiL IWiiiml^piMi 1}рщ

иишпшичпп '

pGKlOl R-qnpôntlf>y s. derby pg^tlbpfl lífl

iínp$ui$>nitil}yjintimi hmf4nLj»jnLtititip(»s PJhZ^Ph pœriuiTipmjfiti

фпи^гц fíc;íir|t!Gpf> IpïuiTf», шц q ш j m tin l » j mU fjjnitip

hbçui£pppni.|»jm.ti шйш^шурПу" nLunurtimutiptiL uijr\ i»fflriuiíi|«ijfiti

umfitpa^mytitipli и^Ц^с Ь- R-qnpànîifi umritiynipjnLtip tipa i|pui:

ÇtiOjf» s. derby KS9 > tipBl «ЦШЦ^Ц ЩЩршЬшЦпГ! к

щшщ^шцги-р!} ui¿müyjnn.übp[i hualbiíaiipiuljuiTi ni.uni.inmifipni_i»jnLti(i pmyuihmjqiiy pgkioi R-qnp4n^ 44mLh uuin&ynLpjnitic p«iriuiti|»mj|iíi

ЧЬрвЩгапп jmm&twajhTi hüpn|ni|WL(»jnLtiíitipp

od ißtir^uil^ n L il btf щшрцшршШ^т hu^optinipt)l}tibp[i Tájuiipifiiiiíp S- derby p2h2^bpfi piiirimtifiTitipft fumJiuiIiytiLf»nujajni.ti[]:

SpuiTiu^npiJuiytmjfi iljignynii pGKioi R-qnp&ntip s.derby К82 Щ[шщ1[и>шцпир^р2|52^р tlbpUnL Üti^ TL y hblJSft Щ^ШЩ/^ииЬ^ S- derby K89 2?auffi pii¡quitií»tibptí liiai^lff» ll iínp$u4mtil)yfintmi|_ hiru^nipjnLMttipfi qpbpti IPfnJ ^Ьриффшт^рпи/р ijtipmhmuçmipîiy R-qnpántif» npn2f>¿ rçtïpc uiqfitpml^nLy — fiqfir). hffipiaplipiai|ynL[»jmtj ujuihqmtiifmti ijpui: