Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиорезистентность бактериальных клеток Salmonella derby и Escherichia coli, обуславливаемая природной R-плазмидой из AMMA Salmonella derby K89

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Радиорезистентность бактериальных клеток Salmonella derby и Escherichia coli, обуславливаемая природной R-плазмидой из AMMA Salmonella derby K89"

[ОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ

йНстютт зиохимии имени г.х. вунятяна

д£м isas

Нв правах рукописи

ИСДЯАНОВА КАРИНЕ ГЕННАДЬЕВНА

РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ БАКТВРИЛЛШК KJEXCK Salmonella tíerby й cherichla coli, &ГСЯ№!№ЖРЯ ШРОШт R - ЛЛДЗКЭДОй ЙЭ ' Aíaja 2з1юп«Хха <ЗзгЬу К63

,.CC.Gi - s ¡¿йлвкучягрия;! *2ояогив

АВТОРЕФЕРАТ

leaUSObh <иЪГи"!Ъ5ПМ»Зи^ ЧМПЬМПМД/ЬРЪ иа<Ш8ЬЪ UHiU'lbüMJ

<.iu.nO{-W-UriOm,b аъчиъ <>Ъ1ДШРМТМ10Ь I^OSMÍlbS

ЙЬогадр]» ¡ipun[mlipml

Salmonella derby и Escherichia colí puiipnhptmn pjligiibpli qfiiiIjuijmlimpjniliQ, ujmpriuliuiilnpijtiiü Salmonella derby KS9 jinuiiíji

utyuiU B—ojiuiqiípitntJ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1996

ьоимлъпча чигьх-ъ чъъиаьь

Ч-.00.03 — qhl!htn[)!¡u! !i líniMinqmjfili ^ЫтшршIjntpjmli

''iMiuun'mUailjuib qtiuimpjmtibhnli рЬЦЪш&пф q¡iuiuil(uib шитрЛшТф huíjgifuiU utinbtimtununtpjTuli

иь«ши<и-г

ЬрЬшЪ - 1996

Работа выполнена в Института молекулярной биологии HAH РА

Научные руководители; академик HAH РА К.Г.Карагезян 1

K.Ö.H., а.u.c. Е.Д.Кцояк Официальные оппоненты: Д.б.н., профессор Р.М.Арутюняк • K.Ö.H., ст.н.с. Г.А;Геворйян

Ведущая организация: Ереванский государственный медицински университет имени M .Гвр&щ ' .

Защита состоится Г996г.в ! ]__часов ш

заседании специализированного совете 042 при Институте биохшип HAH РА по адресу: 375044. Ереван, ул. П. Севака 5/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоюшни HAH РА. ^

Автореферат разослан «''>" И О ьР 1ээбг.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук, профетош ^£ ^ Симонш

UjlumwiraUjD цшшрштп^ t <><> <ШО ЦпОДоцшфЬ ЦЫшшрш^рццЪ tiliamfimnui

Ч}ипш1(шЪ цЫрш}шрЬЬр' <А lau mlimrjtiiltiljno *i,4/luipttiqjnqjuiti

Ijqi»- шп^ш. d.U.4bnjuiU

<4m2uin1milimli ЕЪчоИвфпаЬЬр' li9n.»4hn»Wunp WmpniP jnib

W-, lutlAU. ^иЛЬпр* jirti

йпздгштшр Ijraqilœljbpujiniijnib' . DpUoilj|j Г. ibpojqni иЪ|]цЛ чЬиыЦиЛ! prfjljui^iuii <mtTui( ивриЛ

*4mju»qmbnn»jittlic ijuijuibtnim t t_t _1996p. d. ____

SS Ш 4bUiiui£[iif|)Ui)f] |ibauititnniin|ili Iffig 042 ilamlnmjJitnmliuiU (ипрЬрц lilttnnmtl, "hoiugbb' 375044,' bpUmb, *4.Ubniljli фпц. 5/1

lIuitUmlunumpjn|bQ lpupbi|) ôuilmpuilitu[ WO

.Mnimfimrutnl» qpmniupuilmiit

■ Uhiiviuiq[ipi] wnuipi|iiii 1; t_* 1996p

Uui>itiuiq|iwuili«ilt {unphpi})) q|iuitulju]b (шрттцшр, (¡ЫшшршЬш^ш!! qliuinipjml)libp|) jjnlpnnp, и(рп$1шпр U,U.U|iiinlijaili

- з -

Актуальность проблемы. Изучений вкехромосетягк генетических элементов у оактерия и эукаряотпчоскях органигноз является одшш 13 глэвш^х направлений современной молекулярной биологии, имеюозш авжнов прикладное ч яаучтоо" зпгчешт. Взкреркалышо плазиида п гвш, локзлизовалшв я» этих плззиадах, sraposo Используются в практика и методологи» по рекомбинанташ ДНК. и р«эря5ггт:п яознх гкепгесг-методов выявления опасных для человека кдащзрогвлимзг кур.честдах соадинепяй в окруяагаей орело

исследование и»? гетто? п гфазнвков, -яц)9деяят«их злэзуидрки. представляем большой интерес в злг»нэ из\":з:;чл •airtposBawwf т-екоцэв каа дркарйо*гйчесхпх, так и эукаряотических клеток, и роля "экспериментальной" я-га --- 0

ivinaTotm. i r>cainiMV. -i w/v • ПГ~Ь311, /

Ил-срас исследования бактериальных плазмид для фундаментальной науки связан с их участием в осуществлении таких яроцессоз '.штаболизма. хромосомной ДНК бактерий, как еэ репликация, рекомбинация и репарация. Особенности изучения системы ллазмидного контроля в клетка заключается в способности различных плазмид оказывать влияние нз один я тот же процесс внутриклеточного метаболизма через различные механизмы его регуляции.

Зффбхяголни подходе« как для изучения этапов ,рспарадии, ,гд>«итирул»дяг рзпара*швпый потвготиял бзтаоряалымх клеток» тач « для управления ycTof^îiroocïbïo к пеб«згопряятта?1 факторам среди тоя!10'|'ся юкягироЕашс гонов систем репарации и рексибшшлш, Однако, высокая концентрация белковых продуктов, возникающая при использовании, как правило, иногокопийнцх плазмид для клонирования может интерферировать с нормальной репарацией н рекомбинацией ( ï-îatson S.W., 1991).

До сих пор единствеинша примерами локуссв, способных йовышать радиоустойчивость клеток дикого типе яря--зпсаройсии с иногокопийных плазмид били ген recA ( Brozmanova et al., 19911, гены синтеза глутатиона .( Moore S.S., Anderson M.B., 1969), а также клонированные, но еще не картированные аллели из радаоустойчивого мутанта Е. coli Ganf 444 (Бреслер C.B., Вербенко В.Н., 1580), в то se зреад, ряд природных пл8яиидв ягйргкзр,р!ме ( Drabble W,T., Stocker В.A.D., 1968), ее производная pKMOl (Dobson P.F,, Walker G.G., 1980), pR205 i Dowden 5.B., ülasebrooit J.A., i984), pTPHO f Dowden S.B. et al., 1984} и pColl { Howartn S., 1965) обладают способяостьв усиливать устойЧ1тость п

инактивирующоиу дайствкэ УО-свата и рада дащчосках агентов, твкаа делать более воспрзщчкшта к кутагеиезу клетки В. coli S. typhiiiiuriuni, Некоторые нэ шх несут аналоги генов muD и ira Е. coli ( Репу K.L,, Walker С.С., iS82j Upton С,, Pinney R.J, 1984).' , .

Несмотря на достаточно результативные исследования, настоящее вреьш нельзя сказать, что все . возможные цлазмидш гены, -модифицирующие радиорезистентность бактериальных клетец уже открыты и изучены. До сйх пор четко не показано присутстю на природных плазшдах, в частности, R-факторах, гено! кодирующих ферменты репарации и репликации ДНК.

6 делом ' се, - для установления • молекулярных механизмоЕ ответствентх за повышение радаоустойчивости клеток как за сче рекоибинантных, так и природных'плазыид требуются расширен» круга изучаемых объектов и продолжение исследований.

Цель и 'задачи исследования. Природная плазмида pR69 « штамма Salmonella derby KB?, выделенного из клиническох материала в связи с проблемой множественной лекарственно устойчивости ' привлекла . наше внимание ввиду предварительнь указаний на .то, что излеченный от пваэмид вариант S. derby боле устойчив к воздействию УФ-света по . сравнению с родительски штаммом фгтонян Р.Г., Саркисян H.H., 1983), о активносч полнмеразы I в плазмидном штамме выше, чем вбесплазмиднс (Саркисян Н.Н» и др., I985)« Целью этой работы стало выделена плазмида pR89 из S. derby К89, перенос ее на генетический фс Escherichia coli и изучение последствий трансформации дл .радаочувствительности некоторых штаммов В. coli с цель выявления роли, изучаемой плазмида в. модификации обцег репаратавного потенциала клеток как штаммов Salmonella derby, та и заведомо известных мутантных штаммов Escherichia coli. Дл осуществления . поставленной целипотреОовалось разрешена следующих задач: : .

I . Исследование радиочувствительности штамма S, darby диког типа и. его бесалазмвдного производного S, derby К82.

2, Электрофоретаческое исследование плазмидной ДНК из S derby К89 с целью определения приблизительных молекулярных весо фрагментов плазмида pR89 и выделения их для последующего перенос на генетический фон В. coli.

3. Модификация ДНК плазмида pR89 с целью изменения сайто рестрикции-модификации во избежание ее рестрикционной деградаци

- - s -

>и трансформация клеток S, coli,

i. Исследование язконошй з ргсг'.очузстшяелмюста втсш'ов В. )l:i, TDSHC'iioprapcaajsüü . «рагоенмми ice^^crrrîMi с раз-гашг-нг: :л ...T-.'jhi';;- ро::: -¡vc.ieдгс-,::~ср«альных клеток яя во?»^

лсыгзнг., ;;яс?о;;пй1д работе икр'?«'"; г,"".-jäGS от", вндолвяпг*» » "—гг; IT-Ъ« ffDr> "tn.-î.-vii -гр'лрсп ■ г, : - .

юр :: .яоиетепяо

.^icivriirivuTM Оесплазмадкого вгеша S. derby £Ш2. а «■««»» ¡ведомо хивестны* и™»——— ..<,ш1«< ^ - er:.«.. ш w««""!"

.-».о м» г-.. „ яикавнрущеЗ pa.».'""':. В работе

сказано, что белковые продукты, Ьбеспе-зизЕкспз zzr.'irj ov обоях нов облучения, ©аернруэт во сходноау aysa рвпгреаяа»

Путей ypsîtcjcpjsî^ûsrioro nspececa- шагкчда pSB33 Саг в ро1А12 3. coli с т&ьаерэт^ро^эсгвзтельпса •• иутацкеа з рлимеразиоа лояусе пслуташ. допояштвяьшо, доказательства [ВЗШ1ДН0Й экспрессии ДЕС-полшеразноЯ 'якгивностя, кетшексиругцвй >1-«утаци» в тгишз- роШ2. 8.. «oli, Поязггаго гак»«-¡азыялк f>«69 Crrr*- хгисЛИ, Z,. coli.

"ГС"; нтгаод"-;' т: >;■ у^г^г^^гд

;;;uoyc'j о-'^гоос™;, ас зосс*э!йает&:д, iff" etc.:, зго

О;-' 0 t ï П: и „СЙ " KT : ГЛ"- : О С'?: ;.

Пра псрежсе гоплнчасккй сок uwuCD я uvrA В, coli пэ ¡дс збедюильнсго cfju*«i«a плас.шя рК89 Слп.

¡км озрозоч, било устш>0леко, что зссладуеыая плазыидз по сет изсестках ллаэгадгах аналогов «anaCD л шгд S. coli, ¡астаррда и процессах озкбочной.. рвпарзди» осуществляемой Б-систсмой - генов mue AB, оперируя " по каксау-то ггчегу, иссяедовакио"? panes пута защиты бзктеркалышх клеток от >здействия радиации.

Впервые п настоящей работе из дикого типа S. derby К89 была делена природная плазыида pSD89 Sm5*, детерминирующая тойчивость к стрептомицину, которая определяет противополсяпкЯ нотип радиорезистентности штаммов S.-aorby и Е, coll. Показано, ■о вое полученнш трансформанты S, derby и В. ooli/рбРЭЭ 5гаг, :зэались значительно чувствительнее к воздействию УФ-света и гучеЯ пс сравнению со штаммаш-рецитшент8ми.

Установленные в настоящей , работе различия. в

радиочувствительности плазмидного и бесплазмидного 'штаммов S derby, отличающимся по морфологии, ультраструктуре физико-химической организации, интенсивности процесса перекисного окисления липидов {ПОЛ), а также количественным ] качественным сдвигам в липид-белковом составе мембран позволяй говорить . как о прямом, на уровне ДНК, защитном эффект« исследуемой плазмиды, так и об, опосредованном воздействии pSD8< на антирадикальную систему защиты мембран клеток S, derby в ответ на воздействие радиации.

ПВ§ктическая_ценность.- Проведенные исследования показали, что плазмида pSD89 (Cmr) из S. derby К89, модифицируюсь радиоустойчивость бактериальных клеток, вероятно, несет ген, продукт которого может участвовать в репарации, но не являете; аналогом известных плазмидных белков ИисА И МисВ, Таким образом, настоящая . плазмида . может найти широкое применение как i исследовательских, для выяснения, возможно, еще неизвестнш механизмов радиоустойчивости и репарации ДНК. бактериальны? клеток, так и в прикладных работах по рекомбинантным ДНК, для повыпения репаративного потенциала клеток как самостоятельно, тан и в сочетании с известными плазмидами. По-видимому, описанная плазмида может модифицировать также чувствительность к мутагенам тех штаммов,' которые традиционно используются для тестирования мутагенной яктивности тератогенных веществ.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Научной школе ''Молекулярная биология: конец XX века" в Г. Черноголовка,, в 1995 г., на семинарах и ученых советах отделения мопекулярной и/радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН И i-рупаы репарационных систем клетки Института молекулярной биологии HAH РА.

Работа апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной биологии HAH РА от И ииля 1996 года.

Основные.результаты исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в четырех статьях и тезисах.

Стр^ктц1а_и_дбТ:ем_£иссеЕтауии. Диссертация состоит им /ине^ния, обзора 'литературы, - -описания материалов и мртодоь, результатов собственных исспедовакий и их. обсуждения ( 3 главы >, закл»'Ч(?ния^ выводов и списка литературы. ' '

F.i'-ота изложена нй ТОО страницах машинописного тексту, содержит 14 ринунгог. и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛ!.! fi ?'UfO£J! '¡ССЛ!»ЛОВАНЙИ

■ i'cOot-.j ггро-

•" ис» пркролао, ^cjioBiio-iiyioreta^H! лиьсг-здао^ iua.i-n,-• • •• • • ГГ7. изолкрс-в«и«!о,< t>;> »\г<;ц«-ачес«оМ5 материала

'Вартанш. '.••,..• • .". m.iT. T970i, его &еочл*с»««у>м;м

¡к~«"»одноц К82, (Кцолл • - >]■-■ «pv'/i, .! r'vve ш> psrwnmx

федстэвлены <_, г*

Для выращивания 6aKTepu««~:*"v .С--" "^пользовали, и (авнсиности от целей опыта максишяьду«, л,.*- '.i—ГС о штибиотикаыи, Антибиотики попользовали в следующих конц«н.р-,"чнА мкг/ил): тетрациклина гидрохлорид (Тс) - 20, стрептошщшта ;ульфат (Sm) - 200, 8000, пенициллина натриевая соль (Рп) -20, лораифеникол (Cm) -20. Максимальный агар содержал 2% агара и 25% ниионаптяда.

Лл>т раоведзнзя ~ «бдучения клеток использовался буфер М9, р. подергал 13,7 к»! ГЩ.01, 43,Т НагНРО«, 23,2 Ш ИН»Р0», тгч i-igscu,. 0,i irt* GaCl « 3 irM Had, рН 7,6, ТЯтроваше бактерий разводили ;-:а максжальном агаре.

Культур« тяжоп шфагзвзгш* при 30°С в бульоне LB с дсбав-emteu хлоракЕмгиг.ода (25 икг/ил) в сличая пдэзтщшх вариантов.

Селекция рядиорезистеиттох и радаотувствительпшс рансформантов, Для идентификации трапс^тНянтов, ~!snr.r~tr. боле* ысокув радиорезистентность, чен рецвдшентнкэ клетки, применял!' пот-тост: отдельные колонии переносили в 2 ил ЛПнЗульоня, ыразогеадк в течепя* ночи без аэрацзл. наносили капли ночной ультур« (0,0! мл) стерильной ттлей на поверхность АП-агарз, и осле высыхания капель облучал!! чаша? Петр« дозой 130 крад яя идентификации свойств траноформантов S. derby и ЮЗ крзд для рапоформантоз Е, coll.

Определение радиочувствительности штаммов бактерий, эреслер • г,.к,, Вёрбенко 8.Н., ХЭ80).Бактериальные культуры аращивались в течение 24 ч в яидкой среде, без аэрации, злее, клетки подранивались в АЛ-бульоне до середины <спокенциальной фазы (концентрация клеток 3-Ю8 мл), осаждали знтрифугированием и ресуспендировали буфером М9, рН 7,6 и '■лучали либо на установке РХ-7-ЗО -лучами "°0о при 4"С, либо &-стетом бокт^рицидной лампы БУВ-15 (мощность дозы 2 дя/и сек) в эшке Петри диаметром 10 си (толщина слоя ' суспензии клеток

\

\

\

Характеристика штаммов 5, derby и Е. coli Таблица I

Штвмм

Генотип

Источник или метод получения

1

3

Salmonella .

derby К89 S. derby KB2

fc l^2/psim (Caf) * K82/pSD89 fSnf) E. coli K-12:

ABl1ST

AB115T/pSD89 fCmr> AB1157/pSD89 (SnF); E805

Z805/pSD69 (Cга1") P108

P108/pSD89 (Cmr) AB2463

AB2463/pSD69 (Cmri TK603

TK603/pSD89 (Cnf)

IK610

TK610/pSB89 (Cm1) BL61T

BI61T/pBR322 KS134 . S134/PSD83 (Cmr) KS134/pSD89 (Car)

/ртз?г

KS55 КШ996

KD1996/pBR322

r~m+recA13 polA6 . recA13 uvrA mnuC* uvrA6 шлиСЗб

poU12 рошг.

музей микроорганизмов группы репарационных систем клетки ЙМБ HAH РАШ .эта работа (21 (2) коллекция лаборатории индуцибельных систем (тетки ПИЯФ FAH (3)

(2)

'. (2)

¡3) (2) ГЗ) (21 (3) (?) (3) (?) <31 (21 . (3). (2) Ш . (2) /?> (2) -(31 (31 <2) . •

г

- 9 -

3,1-0,2 uu) при непрерывной перемешивании.

Облученные бактерии после соответствующего разбавления суспензии высевали на максимальный АП-агар, инкубировали при ЗТ°С i черзз 18 ч подсчитывали число колоний. Рассев заканчивали но юзднее» чем через 30 мин поело окончания облучения.

Молекулярно-генетические метода. Дяя введения плазнид» pSD89 ipi-шеняли стандартные метода по* обработке и трансформации ЩК компетентных клеток 5. derby К82 и Е. coli/tjurtjert, Shriloh

1979). Компетентность бактериалыта глоток достигалась путей а обработки 100 лП СаСЬ , В 100 нкл клеточной суспензии (о ;оличестве 10* кя/мл) вносила препарат ДНК (ЯК40 нг) и гнкубировали при ЗТ°С. После инкубации кп="ггг ¿цсемяпя --;елективные чашки с »чт^с.и«»»« " чрзааря*«! hp устойчивость к

't ¿1 «ОНи-atrp-——- ~ ий/<»°!т"Н.

Плазмидную ДНК из бактериальных клеток взделяли при юмовд предварительного осаздения высокомолекулярной хроио-омной ДНК в присутствии высокой концентраци ИаИ {(juerry et al^

1973J, Депротеигазащш проводила, используя метод щелочного изнса. Плазмидную ДНК осаадзли добавлением 70%-го этанола, одержвщего ацетат. Осадок -шшзмидная ДШС - растворяли в , НК-буфере (10 ЯМ трис, рН 3,0, 1 lil ЗЛТА)'."

Электрофорез плпгг-чдпоч ДНК проводил '5 в трис-боратиоп буфера яскользоззшгви 0,5%~их огаропш: гелей {¡лашштпе X, к др-. 934J, Электрофорез зроводали 2 ч при 0 в/cu, поело чего гели крапгавая! з водкой растворе ершистого этндая (1 иг/ил) а омещзлк под источник УФ-сзета (ВИ0-Х, длина волны 254 юл), ля элюцип ДНК пз агарозных гелей использовали метод извлечения ЯК из легкоплавкой sraposa.

В работе также проводная коныогацноннне скрещивания по'методу Дэтта (Dalta et а

Матеыатическая обработка результатов. Для экспоненциальных ривых, описываемых в полулогарифмической масштабе уравнением =А+ЕХ, рассчитывали параметр! А и В по методу наименьших задратов. В ряде опытов ' определяли заченив редне-квадратичного отклонения по .формуле! <з - <

це _ К - количество опытов, Ml - значение в каждой опыте. В стальных случаях рассчитывали среднее значение 3-7 независимых «шериментов.

- 10 -

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Радиочувствительность штампов Salmonella derby

Штаьт S. derby К89, несущий R-плазшду, с которой ассоциирована активность ДНК-полимеразы I, не гомологичной ДНК-полкыеразе I Е. coli ( Саркисян H.H., 1985; Саркисян H.H., 'Антонян Р.Г. и др., TS85 } был тэкне охарактеризован как штамм, отличающийся по чувствительности к. инактивирующему действию УФ-света по сравнению с бесплазмидным дериватом S, derby К82. После.Ецшй был получен в процессе генетического исследования R-Плазмиды S, derby КБЭ (Кцоян Ж.А. и др., 1977),

Исходя из литературных данных, { Walker et а!., 1583 } свидетельствующих о способности некоторых бактериальных плазиид влиять на выживаемость бактериальных клеток, облученных УФ-сВетом или лучами, было необходимо выявить связь между чувствительностью клеток S, derb;, к УФ-свету и ионизиующей радиации и наличием в них Е-пиазмиды.

Внехромосомную ДНК, выделенную чз клеток S, derby К8Э, ми анализировали электрофорезом в агарочном геле. Было показано, что валовая плазмиднан ДНК содержит нисколько нлазмид с молекулярными весами от 2 до 60 Мд, что хорошо коррелирует результатами ранних • р*бот < ,•« : ., к.,.«». «.,

1989). Чувствительность к УФ-сьету двух штаммов S, derb;y представлена на рис. I,' а. Эти штаммы не отличиютсн друг от друга (D37 = 280 дж/мг) и несколько более чувствительны, ч«м Е. cull (D37 = 670 дж/м2), Неожиданным оказался тот факт, что пс чувствительности к 7-лучам штамм К89 был значительно более чувствителен, чем бесплазмидкый вариант KB? (рис. I, б ). ФЩ1 оказался равным 0,55 при S - 0,37. Можно было предположить, чтс повышенная чувствительность к 7-лучаи обусловлена резидентными плазмидами.

Плазмидная фракция,охарактеризованная ранее каь ассоциированная с маркером Стяг, а также с активностью ДНК-полимеразы, была элюирована иЗ геля И использована для трансформационного переноса в рецшшентные клетки беспла^мидногс штамма S. derby К82. После трансформации штамма KB? с отбором пс признаку устойчивости к хлорамфениколу, ассоциированному с ДНК-полимеразной активностью, как показали результата электрофоретических опытов, обнаруживается толко одна ллазмида.

Сравнение с маркерными плазмидными ДНК позволяет оценить молекулярный вес плазмиды pR89 CnF как равный 13,2 Мд.

В случае у-облучетя радиоустойчивость ' трансфораантв K82/pR89 (Cmr) оказалась выше, чей у реципиента ££ЙД = 3,83 при S = 0,37) и еще более высокой по сравнению с донором К89 (рис1,$ При-облучении УФ-светом ФЙД был равен 5,0. Кривая выживаемости после -/-облучения была S-образной (рис.1 ).

Таким образом, итоги KB2/pR89 CirF, полученный путем трансформации плазмиды pR89 из S. derby К89 в бесплазгшдаый вт&ш К82, оказался значительно более устойчивый к детальному дейстаяю ионияиругщей радиации в сравнении со птаьшои-реципиентои S» ¿аг'эу К82, и, соответственно, намного более устойчивей дикого типа S. derby К89, из чего следует, что фенотип пя.чг сцаалзь « детерминантой ултеЛтявссти к хлорвн^яппколу.

Тот факт, что исходные штаммы 5. derby К89 и К82 почти ка отличаются друг от друга по чувствительности к УФ, а полученная путем переноса плазмиды в бесплазыидный штамм S,' derby К82 трансформант оказался гораздо более устойчивым к летальному действии данного вида облучения, свидетельствует о сложной . механизме действия валовой плазмиды в диком типе S. derby К89. По. всей видимости, плазыядкые продукты, обеспечивающие защиту от обоих типов облучения, оперируют по сходному пути, с чем коррелируют некоторые литературные данные (Francia et al», 1987). Защитный эффект изучаемой плазмиды, экспрессируеиый на генетическом фоке S. derby интересен упе сам по себе, по для выявления общих черт в поведении такого рода плазннд, необходим было пронаблпдать действие плазмиды pR89 на заведомо известных мутантах Е. coli К-12,

2. Изменение радиочувствительности штаммов В, coli, трансформированных плазыидой pSD89 Ста1" из S. derby К89.

По "пути выявления эффекта плазмиды pR89 в бактериальных клетках был осуществлен перенос исследуемой плазмидной ДНК не генетический фон Е. coll.. Ставилась задача выявить, в какой из мутантных штаммов- данного -вида бактерий, эффект радиоустойчивости плазмиды pR89 Cm1- наиболее очевиден. Штамм К. r.oli ?,805 (r~m+recA~) был использоввн для трансформации плазмидой pK8J Cmrc цепью изменения сайтов рестрикции-модификации как пронижуточный хозяин плазмиды pR89 Cm3", чтобы в дальнейшем

рйс. X. Летальное действие УФ-светв/я/ г Г-оолучения /б/ на штаммы с/* г и I -«^¿/•^Кф, 2 К82, 3 -¿-еЦгЬу К82/рИ89 См\ 4 - К-]

По оси абсцисс - а: доза УФ-света /дж/ц2/, б: доза ¿'-лучей /кГр/; по оси ординат - логарифм выживаемости /.

I -Ze05 /г-yftech-/, 2 -Z605 /г-m +recA~//pR69 См", 3 - PI08 /po¿A6/, 4 PI08 /poÍA6//pR89 Cu', 5 - AB2463 /гесА13/, 6 AB2463 /recAI3//pB89 Смг, ? - TK603 /üvrA umuCV, 8 - 1X603 /íivrx wn.uC+//pH89 Смг, 9 - ТС6Ю А» г A6 uirwC36/, 10 - IK603 /«УглбитиСЭб//рЯ8У Сл^. II- ABI15? /дикий тип/, 12 - ABII57/PR69 Смг.

збежать ее рестрикционной деградации при трансформации клеток •coll.. После трансформации к хлорамфениколустойчивости этот гамм проверялся на присутствие яесалектируемого марг.зрг, -адиоустойчивости и оказался более устойчивым к 7-яучам (0ИД = ,5 при 5 ~ 0,37) по сравнению со штаммом-реципиентом ípac.2,á,

Зрог-теет, проведенный на селективной среде о Cm, с отбором О колоний полученных трансформантов Z805/pR89 Слт по стойчивости к УФ показал, что колонии траксформантов гораздо изнеспособнее штамма-хозяина 2805 Escherichia coli» После I шш. Ф-облутения, в пятнах бесплззмидного реципиеаткого siraiaifi Z605 е было замечено ни одной колонии, в т'о время как в стерильных ятнах трансформантов их насчитывалось г>»о»л ICO.

После jí'.uüou^mphtí; по траьдеогзмацпв раашчвнх штаммов

. "Ol1 осуществлялась посредством плазмвды pSD89 Сшг, выделенной з трансформантов Z805/pR89 Cmr. Результаты' электрофореза оказали, что из трансформированного штамма 2805 S, coli ыделяется плазмида с тем se молекулярным весом, что и из B2/pSD89 Сшг, приблизительно равным 13,2 Мд (рис. 3).

Таким образом, можно утверждать, что все обнаруженный зменения в выживаемости трансформантов K82/pSD89 Cnr v¡ 805/pSD89 Сшг обусловлены этим "конкретным участком валовой .лазмидиой ДНК , размером 22 т.п.н.

Как. уже упоминалось, штат 2805, как следует из его ниотяпического описания, является гесА-ыутан.'ом К, coli, К ■дному из ранних наблюдений за плазмидными системами •ящитк-мутагенезв у бактерий относится то, что .для их работа ¡еооходима функционирующая рекомбинационная система .четки-хозяина í Upton С,, 1979). Значительный защитный эффект :л«змиды pS089 Cmrna данном бактериальном объекте указывает на о. что, возможно, наша плазмида, в отличие от других, подобных, поминаемых в литературе природных плазмид бактерий (pKMIOl, >R46)( Upton П., Pinney K.J., 1979) не нуждается в гесА-подобном ■нянином продукте хозяина, вероятно, потому что плазмида pSJ3ß9 ,W -Ж(пр^ссирует зтот, необходимый для репаративного процесса летки продукт. Эта возможность. былз проверена на более iyверительном к радиации гесА~-штямме, в которой эффект данной (утации был лолее очевиден - штамме recA13 Е. coli AlfMf.3;. 0ки >;,Л1,1:ь, чть плазмида рБКЗУ н значительной мере (ФЙД = '."«4 при компенсирует длфокт, вызванный мутацией гесД13 .

риг .i также повышает устойчивость клеток этого штамма к

воздействию У® (рис. 26)

Дальнейшие усилия по выявлению побочных (помимо увеличен» резистентности) аффектов плазииды в данном мутантнс бактериальной штамме не привели к какому-либо качественной результату. Вероятность того, что плазмида pSD89 Cnf несе recA-поДобный ген кажется минимальной, поскольку в штамме АВ246 не было замечено никаких изменений в рекомбинационной активное! в связи с присутствием плазииды pSD89, что было проверено скрещиваниях с пяты> различными штаммами Hfr. Возможно экспрессируеиый с плазииды белок оперирует по" какому-то ином пути защиты, тем самым увеличивая общий репаративный потенциа клетки, не участвуя, при этом, в рекобинационных процессах осуществляемых ею.

Указание на повышение полимеразной активности в S. derb К89 по сравнению с К82 ( Саркисян H.H. и др.) определило выбо мутанта Е. coli по полиыеразв I как объекта для трансфорыаци плазиидой pR89 (Cmr),

Трансформированные клетки polAl приобретают дополнительну устойчивость к Y-лучам (рис/!, а), но компенсация дефекта являете неполной. Диалогичная зависимость наблюдается и в отношена устойчивости к УФ-свету штамма роШ, трансформирован®» плазиидой pSD89 Crair.

Неполная компенсация дефекта мутации в данном штамме обусловленная плазиидой, на жжет быть строгим доказательство наличия полимерезного гена на плазмиде pSD89 СшГ В то же время этот факт не исключает ранее сделанного предположения ( Сарккся H.H., 1985) об ассоциации ДНК- щшшеразы I с плазмидне фракцией; ассоциированной с маркером устойчивости хлорамфениколу, в силу того, что значительные аффект плазииды настоящей работе наблюдался именно в polА мутантком итамме.

Различные предположения относительно функций, выполняемы плазмиДными генами, не исключают, как уже было сказано возможности обнаружения полимеразной активности, экспрессируемс с некоторых плазмид (MacPhee D.G., 1974). Однако, следует указат на тот. факт, что работ с предположениями подобной активност имеется в литературе крайне мало, и, в большинстве своем, ои г.отречаются на самых ранних этапах изучения закодированных н плазмиде генов. Более поздние данные либо не подтверждают яаличи полимеразной активности, обусловленной плазмидами, либ свидетельствуют о взаимодействии плазмидных продуктов

-IS -

юлимеразами клетки-хозяина { Potter et al,, 1994),

Относительно нлазниды pSD89 С;пгнеобходвио было получить «шолштрлыша доказательств» тону, что - повняепие >адиоустойчявостл атамков S. derby г? coli доело введения п них u»»f»wf«j» г>5Г.85 Obi' обусловлено экспрессной по.шмерязного преду «ад» ■ ;>7уч:'и!пс.Г> !1лаз»тд>; или егч; аналога.

¿ксмериыенты с, »«утаптом й, coli но волинераэе 1, проведошпю • ¡!«:тоя|ке>5 рзоотк, указали чь приобретение дополнительной рядчо-л^чдаоетн, не ц- аолкой кошенетттг" дсфист^ трэнефоршфовйшт мазыипг» роЛГ5с о,,-- /лртоп роЗАб. что но ».о где дать точного » .-.b-v.,:-'« . г>;:сл,,те »coro ^ejjueur* " репаративных процессах в

яспольэуешх итаныов, обусловлен'- „..„о-* >"■." гатературнш. haw»'» о »очной ргбет; ;,олимеразы I

, я,"--- , iuuc^ ,, ;jju00e нарушеше этой точности могло бы фивести к необратимым нарушениям репвративного процесса. Неполная яе компенсация дефекта в данном случае говорит как раз о гон факте, что большак часть репаративных нроцесов все ^ще точна, и речь монет идти либо о каком-нибудь другой ферменте, либо о какой-то другой, измененной форме ДНК-полимеразы I {Lackey D, et al., 1977; LacKey D,, Krause S.W., 1982; lackey et al., 1985).

Все выпоекззанное и определило выбор мутанта Е, coli по чувствительности к температуре,Т5-мутацич в которой сцеплене с генетическим локусом полимеразы I. Ранее было обнаружено, что штаммы Е. coli, несущие либо мутацию polAI, либо ро1А12, приводящие к дефектной полимеразной активности, не способны расти при 42"С. В этих условиях ингибировакие синтеза ДНК приводит к ее полной деградации и, соответственно, к потере клеточной выживаемости. После проверки нескольких штаммов, несущих указанную мутации ро1А12 был отобран самый жизнеспособный (KD 1996).

Этот штамм после трансформации к хлорамфениколоустойчивости

проверялся на присутствие неселектируемого маркера - устойчивости

к температуре (42'С). Как следовало из Spot-теста, проведенного • г

для штамма-реципиента (ро1А12) и трансформанта polA12/pSD89 Cm

при 42"С выживали только колонии получены« трэнсформантов, что

говорило о компенсации дефекта чувствительности к температуре

штамма хозяин,"1 и, соответственно, предполагало нормальную работ?

полимеразы I при данной температуре,

В то время, важным шагом в понимании плазмидных систем

защиты н репаративного мутагенеза явилось демонстрация того факта, что плазыиды, подобные нашей, могут восстанавливать мутабильность в нестабильных umuC, umuD и uvrA штаммах, что впервые было показано для рВ4б и рКШ01, и, позднее, для рТРПО п некоторых других плазмид ( Elleflge S.J., Walker G.G., 1S83J Elledge ei al., 1983). Эти данные свидетельствуют о том, ■что такие плазмида продуцируют аналоги генов шиШ ,В. coli ¡[Bridges В,A., ffoodgate R.,"1935). .

Здесь же следует сослаться на некоторые литературные данные относительно роли хозяйских uvrA генов в сепаративных процессах клетки, обусловленных природными плазмидами. Несмотря на то, что ни в каких Других генах хозяина, кроме гесА и 1ехА нет никакой необходимости для проявления эффекта плазмид, достаточно слояная картина наблвдаетсд.в ЮТА нутантшх штаммах ( Согв А., 1979). В Е. coli Е-12 плззвдды эффективно защищают от У£>-об лучения мутанты uvrA, vmraC, umuD, отгВ и др. ( T»eats D.J. et al,, 19Гб).

Все вышесказанное определило интерес к выявлению эффекта исследуемой шшзьшда pSD89 сЛ указанных мутантных штаммах В. coli. Чувствительность двух. нутантшх штаммов В. . coli - одного одиночного и другого, , двойного представлена на рисунке 2,6. Незначительная роль • плазмяды в выживаемости этих мутантных итамыов после воздействия ультрафиолета, наглядно демонстрирует то, что в о&ьясшний шханизыз защиты, обусловленном pSD89, речь не идет об UrauDC-подобшх плазмидных белковых продуктах - ЫысАВ.

В диком ишз В. coli ABI 157' также было замечено некоторое увеличение радиорезистентности при введении в пего плазмида pSD89 (рис.2 )

Таким образом,' плазшда pSD39 представляет еще больвий в плане изучения и моделирования систем заадеты - мутаций интерес, т.к. обуславливаемые ев зффекты, в «большинстве своем, не имеют аналогии с аффектами известных плазмид (рКШ01, pTPUO, pR46).

3. Изменение радиорезистентности ютаммов S, derby и В. coli, трансформированных плвзмидой р5Ю9 Smr из S, derby К89

Исходя из электрофоретических результатов, показавших, что валовая, плазмидная дик содержит несколько плазмид, а также из предварительных указаний на устойчивость дикого типа S. derby К89 к Cm, Sm и Рп было высказано предположение-о тон, что, по-видимому, именно с плазмидами, несущими другую, отличную от Cm

P:rc. .3. ЭлектрО(Торегрв>шя распределения пдазмидноЛ ДЖ из штаммов а-К в9, c-Kd2/pS83 С m , С -рВВ322,

и -рЖ'Ю-и^.

L а б i<-

Рис. 4. Ллеутроиореградаа распределения плазмидноД 43 штаммов

a-K82/pRd9 (V, 6-ABII57/pRÛ9 Cri ,

в-:;«, глви^язэ smr, i-rBPJ22, li -p£C4042.

'a б в г tt

лекарстввнную резистентность, связана повышенная радиочувстви тельность дикого типа S, derby К89 (рисЛ ) по сравнению с S derby К82. В литературе имеется много данных о распространен» таких чувствительных плазнид среди бактериальных иташов. Само, распространенной из них является плазиида pR391 и другие родственные ей плазниды группы несовместимости ( Upton et al, 1979).

Эксперимента на селективной среде с Рп на выявили никаки. видимых различий в выживаемости бактериальных шташов S. derby j зависимости о-т присутствии или отсутствия плазиида. Однако, i отношении Sra подтвердились предыдзтцие данные относительно рост! ПЛ331ИДНОГО -штамма на. среде, содержащей высокую концентрация этого антибиотика (8000 мкг/нл) ( Кцояк Ж,Л., Таисова А.С 1988). Колонии S, derby К82 полностью погибали в присутствии столь высоких концентраций Szn.

Необходимо было получить однородную .бактериальную культуру, несущую именно данный участок плазмида, сцепленный с ыаркерм Sm-yстойчивости.

Для э^ого была проведена трансформация бесплазыидного штаммг К82 S, derby к дикого типа К, coll по признаку устойчивости к Sm, После трансформации штаммов К82 и АВ115г> с отбором пс устойчивости к Sm обнаруживается только одна плазмида (рис, 4 "г"). Сравнение с маркерными плазшдаши ДНК позволяет оценит! размер плазмиды pSD89 5гаг как равный 6 т.п.н.

Чувствительность к 7-лучаы двух трансформированных штаммов v их бесплэзнидных реципиентов представлена на рисунке 5 . Трансформанты оказались значительно более чувствительны f 7-лучам, чем их бесплазмидные варианты. ФИД оказался равным 1,6 при 3 = 0,37 и =1,9 при S = Ю"7 в случае K82/pR89 Sm i Радиочувствительность трансформанта AB/pR89 Sm1, оказалась такяе почти вдвое выше, чем у реципиента (ФИД = 2,02 при S =0,37 и ФИЛ =1,5 при S = 10~').В совокупности, эти данные позволили предположить, что повышенная чувствительность к у-лучам у дикого типа S. derby КВ9 обусловлена плазмидой рК89 Smr.

Для проверки' полученных путем трансформации бактериальных штаммов на устойчивость ' к УФ, был проведен Spot-тест с 10-тм колониями трансформантов от каждого вида бактерий и двух штаммоь-реципиентов в качестве контроля. Эксперимент убедительно продемонстрировал значительное снижение выживаемости штаммов S, derby и Е, coll в сравнении с хозяйскими штаммами уже при первой

О, - 0,7 F,Oí) I,

0,35 0,7 1.05 1,4

Fiío. 5. Л<?гп.тьао-ч дч.Чствив У- лучел на штамм/

/V .с йг/pR .-JSU,r и /с/ ab ш?, Aa.iiüy/pR ß9imr.

i-3.rlerbj . 2-, К ¿>/pA 8ílStT)r '

' ' ' ■ i ;■!/'', :-Aj ¡„///pH Л/V

дозе УФ-облучения (I шш.).

В , связи . с результатами' по плазмиде pSD89 Бг/кэстоящей работы, особый интерес, представляет различная устойчивость двух двух родительских штатов S. derby - К89 и К82 к воздействию ионизирующей радиации н УФ-света. Вероятно, здесь ми имеем дело либо с. интерференцией плэзмидной и хромосомной ДНК-полимераз в процессах репарации, квк- stö предполагалось ранее ( Саркисян H.H., Антонян Р.Г., ISS5),' либо, как показали результаты нашей работы, с двумя, автоношо реплицирующимися плазшдаш, одна из которых, p5D89 Сп)г обуславливает звгцитные .фенотийические свойства ■ реципиеигаого' иташга, в то. время как другая, pSD89 Smr, приводит к сеисяСнгазацзи .клеток тех- se рещшиентных юташов в ответ на воздейсгвва' как Н-евета, • так и f-лучей и, вероятно, специфическое взаааодействие этих двух плазшд является причиной столь : значительной разницы в вышваемости плэзыидного' и бесплазмидного штатов S. derby-в процессе облучения.

Наконец,-. .казется, вполне обоснованной альтернатива опосредованного . механизма - защиты , бактериальной клетки, обусловленного отсутствием в ней R-плазкида и связанного с изменениями в структуре гшибраны и биохимическими процессам, . происходящими в ней .( Кцоян S.A. и др., -1989; .Пепоян А.З. и др., 1991). ; - ;

В работах ( Пепоян А.З. и др., 1993) было показано, что отсутствие .- В-плазшда в клетках S, derby приводило к физико-химическим сдвигам компонентов мейбран, их дестабилизации с последующим морфо^изиологическим .изменением клетки, включая интенсификацию процессов . перекисного ' окисления липидов (ПОЛ). Активацией процессов'ПОЛ в мембранах штамма S. derby К82 монет быть обусловлена большая степень гидратированности мембраны, что сопров'оадается увеличением ее- толщины, которая, возможно, обусловлена и большей толщиной лептидоглйкана. -

Особенность ФЛ. состава мембран бесплазмидного штамма S. .derby К82, значительное снижение' их суммарного, содержания,' по-видимоМу, - влияют на градиент гибкости мембраны, связаншй с асимметричным расположением ФЯ и белков.в бислое, что отражается hp повншршш- извилистости мембран бесплазмидного штамма, bWHRii иной при электронном микроскопировании i Кцоян Ж.А.,

- 21 - ■

Саркисян H.H.i I9cJ9). Извилистость мембран, в свою очередь, иояет Сыть причиной устойчивости бесплазмидкых клеток S, derby к воздеЯстш'г< радиации, к т^чу ие, R-плвгмидв, как с^дувт и- ~><-ио ииа*п~у- :r .f'.-tiHv.i V иплч:,1 ни антирадикальиуь активность клеточкой которая, как известно, имеет важное значение в ответе бактери (лышх клиток на воздействие радиации ( Еурлакова Е.Б., Щшйкым Л.Н., I9Q9j. .

Таким обрнзом, можно заключить, что белковые продукты, жщ*чч иругмые с Ц-ппьзмдды р5М9, либо прямо, участвуя в различны* репаратибных процессах клетки, повышающих (pSD8S Сшг) ..... Ami.».««» /г>чгло \ глнпгй г^пяпятипммЯ потенциал клеток как 5. florr»}», тчк я s, coli, лчСю, и случмк Sdbuonblla ■ derby, опосредованно, через антирадикальный , механизм защиты, могут обуславливать ту или иную степень устойчивости бактериальных культур к воздействию облучения.

' ' ' . •' • в у в оды .

К Выделена природная плазмида pSD89 (Сгаг), способная

повышать устойчивость штаммов Bscherlchia coli к летальному действии ионизирующей радиации.

2. Способность плазмида pSD89 (Cmr) частично компенсировать дефекты ь генах recA.polA, но не umuDC позволяет предположить, что она не несет плазмидные аналоги геноь iwiuDCä- гены гписАВ,

3. Плазмида pSDö9 (Стг) является трансмиссивной плэзмидой, ионышншцей радиоустойчивость клеток-хозяев не изученным ранее пут^м,возможно, за счет экспрессии afi.tjjora полимеразы X, исходя из способности ллазмиды p5D89 Cmr в значительной мере восстанавливать устойчивость к температуре Ts-мутанта ро1А12. ■ ".

4. Возможным аналогом ДНК-полимер'азы Т, оперирующей по ррцарагивному пути, оЛу сломанному пчязмидой pSD89 Стгможно иодразумг-нагь форму ДНК-нолимеразы I V . экспреесирующуюся в . штаммах К, coli с конститутивным БОб-ответом. • •*..

5. Плазмида pSD89 •" Стгимеет адаптивное значение для йозяикнов'ения УФ'-устойчивых форм бактериальных штаммов.'

6. Выделена природная плазмида pSD89 Бп)Г, способная ювшать чувствительность ■ штаммов S. .derby и, JS, coli к детальному действию ионизирующей радиации и УФ-света.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

.1. йсаханова К.Г., Вербенко В.Н. Плазыида pR89 из штамь Salmonella derby , К89, повышающая радаоустойчивость шташс Escherichia coli К-12// Тезисы научн. школы "Мол. биол. ; коне XX века", Черноголовка,- 1995,- С, 23-25.

2. IsaKhanova K.G., VerbenKo V.W,, Kalinin V.L., Kuznetso\ I.V, natural plasmid pSD89 (Cror> from Salmonella derby KE enhances repair, in gansna-irradiatert Escherichia coli K-5 strains// Abstracts о i International Congress on Radiatic Protection, Vienna, 3-9 February, 1996, P. 61-64.

3. Isalshonova K,G,, Verbenlo V.H., Kalinin V.l. Hatur: plasmid pSD89 ■(Crar) from Salmonella derby R89 proted Escherichia coli K-12 strains against radiation// PHPI Researt Report, Catchina, 1996, P. 33-40. '

4..Йсаханова К.Г,, Калинин В.Л., Вербенко В.Н., Кцоян S.A. Кузнецову Л.В. Природная плазыида pSD89 (Cmr) из Salmonella derl К89, повышающая радиоустойчивость мутантшх штампов Escherich: coli// Генетика, 1996, ( в .почата ),

5. Исахановв К.Г., Кцоян S.A., Вербенко В.Н., Саркисян Н.Н Вартаресян И.В., Кврагезян К.Г. Изменение радиочувствительное-бактериальных клзток Salmonella derby .и Escherichia col: трансформированных плазмидой pSD89 (Smr) из Salmonella derl K89// ДАН PA, 1996 ( в печати ).

6. Исаханова К.Г., Вербенко В.Н., Кцоян S.A., Саркисян Н.Н Вартаресян И.В., Карагезян K.P. Природная плазмида pSD89 (Cmr) ! Salmonella derby K89, компенсирующая мутацию ро1А7 У Bscherich: coli// ДАН PA, IS96, ( в печати ).

ьоиьиъпча wuaabb

Salmonella derby is Escherichia coli pmipnbptimi pjlistt.pi>

n»irilmy)4ijm\impjni\ip, uj3ipfailiuii|npiluib Salmonella derby KB9 jmuntji рЬш'рпЪ R—m'nqiî|u]ïill

ииФПФиЧ1-Г

S. derby K89 jmœitfi pR89 pbinljuib ujitnqiftin"'1' {binlpnp¡imn[itilihp¡i

Ijlpui.-nfuiifp pniqifiul||i lpiijnitif!i}»jnili uquiji/uilmnlnprni) i/tq hkinmpppphg oijli mnniifni}, np 1iwi}ii1(1iii m ut tii t/p Tj t^i [1 uipQpilùplitpml ицшцЩнцицпр!) pjftjTihpp дпдшрЬрпРГ !,(ili ПЫТ-1ш[иф Ijlpiiimiiuilp u'qnfi 'f*® Ipnpulmippiili ¡>nlj TX0-qn¡fí!jbpu[qm I-|i inlpnJulnipjmJn; u|iuiqit|irçuiqiipl| p^jighbpniti ¡п{ппа gurôp Í.P ï

"nuaqiftirçuiqhpU poh<>lihnh Tit-.íi¡mj!r3S¡in^ uiumUtiïIiiuili

- шшийЬвифр^п^ "П0'"*'!1^!1 íjfcpli praigmhnipnvTuili lnuilmp, pSD89 niiuiqiijiiip inpu!lnl.vipit!09¡iui)¡i iTtigngml uil,Tpmfin]m}bi 1; S, derby K82, fiTijujhn Inuli E, COli Ьифорпр hiDjuiliJ) u]imq<I}ii]Qiqnpl| tlminiuliin pg^iplibp :

t,fcpljui ujpfiujimmbpnnJ шпа/gpb uiltquitl puiguiíiuijini[b[ t, pSD89 Cmr uj["iqiriiii}i ujuijincquiliJi} ijtpg! 8rnjg t шрфиЬ, np pSD89 СП1Г U)[iuq<I|nni iquijtíuilmiilnpnul t S. derby K82 U B. COli nbgtitqfibtnn pjfijlihpli

Ipupiilmipjuili putpÂpuigntiÎQ flhtT-tnijaJi U titiju|bu liuiti )f -/fmnmqoijmlibpfi [hmini uiqijhgmpjuiii liljuimifuiifp : lniiuiuipi}ui6 Ш2^иштшЬрЬЬрр gnijg Ui mijbj, ip п1чпиП[ти(1р|)пц «Iimqittlljp Ipnpili) t oqinuiqnpAi|L[ fllí>rí(Mí ' hhmuiqimiiiHjuifi niirjuiMinjiribim imufuip puilpnl,p|mi| pst<sTil>ph nuii||inl)iiijni1inipjuili Ii T-1.W-¡i Jhir¡innuif]|iriij[i mnuijdií jpingmlir)ipni|uiô ifbtiimlíliqinibp¡i, w¡ liujl.u t.| lf¡ipiuinulpnli tijlmiitnmhplil<pnní pt.ljniíp|iTiuíí(Ui T-t-fï—Ji ht.in, putlpnl,pliiti¡ p?l'?lil.|i|t }bU~lpiipnli ЛЬЦф rnnuigiíiiill qnphnnf :

Uji] ljinjli I'5>|i?Ubp|iq uiliyimnuift t pSD89 Smr i>([iuqi/|iri. tipp

¡тл jií mi lim ilnji niTf ^ Ipnptilimppïlb infipt¡mumií[igli1iji Iilpinnifiiuíp, miilpujli ü, lerby 11 К. со] J nl.t)|iu||il,liin pgliylil.ppb lniiî\niMirmf I, huil¡iíii)iiil| фМшифщ :

llpiu|¡niiii(, S, derby i,pipil ;mim(t,p|i {S. derby K89 Ii K82) тпч.рц. uijmUmpjmliß, pinti. bplimipjili, a|uijifiuti>itilnpi|"ift I, 'p"i' > hyiuupti'ju iiiil,ii{'lpluj|l,,ti nip"ia|4i\ihpli f.pSD89 Сшг и рРГ09 f.iV }

HjHMilHHIIlHlj juufj', Ipuif 1 Pf i, А > 4 i > ИИ; H , , }■■ H t II 11

'piiinuuiup Ь. íAurby »ipugimqnihmiAjuih hiHljumimijilpvii iijiuinbií], ifpiii

ibl.gmh R—»ip"4lFl"ll> *»Ф1ЬдтрршТр :