Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солодилова, Мария Андреевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО - ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

УДК 575:5??.112:611.018.51

СОЛОДИЛОВА Мария Андреевна

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И СРЕДОВЫХ ФАКТОРОВ В ДЕТЕРМИНАЦИИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ОСНОВНЫХ БЕЛКОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научный руководитель: член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.П.Иванов.

МОСКВА - 1999 г.

На правах рукописи

03.00.15 - генетика

СОДЕРЖАНИЕ.

Стр.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ .............................. 4

ВВЕДЕНИЕ................................................. 5-10

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Некоторые проблемы функционирования эритрона

и экспрессии генов в эритроцитах человека ...... 11-17

1.2. Характеристика структурно-функциональной организации основных мембранных белков эритроцитов ... 18-34

Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Материал исследования ...................... 35-36

1.2. Методы исследования ........................... 37-51

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава III. Количественное содержание основных белков мембран эритроцитов человека и многомерный анализ их взаимного варьирования II 1.1. Количественная характеристика белкового спектра мембран эритроцитов человека и ее сравнительный анализ среди родственников I степени родства .. 52-58 II 1.2. Основные закономерности взаимного варьирования количественного содержания белков мембран эритроцитов человека и сравнительный анализ матриц множественных корреляций среди родственников

I степени родства ............................. 59-70

II 1.3. Обсуждение .................................. 71-76

Глава IV. Роль генетических и средовых факторов в формировании фенотипических дисперсий количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека.

IVЛ. Анализ коэффициентов внутрисемейных корреляций по количественному содержанию основных белков

мембран эритроцитов человека .................. 77-84

IV.2. Компонентное разложение фенотипических дисперсий количественного содержания основных мембранных

белков эритроцитов человека ................... 85-89

IV.3. Обсуждение .................................... 90-93

Глава V. Вклад генетических и средовых факторов в детерминацию количественного содержания белкового спектра мембран эритроцитов человека V.l. Вклад генетических факторов в детерминацию коли-

чественного содержания основных мембранных белков

эритроцитов человека....................................................94-101

У.2. Роль средовых факторов в обеспечении контроля за количественным содержанием отдельных белков

мембран эритроцитов человека ....................................102-108

У.З. Обсуждение .......................................109-112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................113-121

ВЫВОДЫ .............................................................122-124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..............................................................................125-151

ПРИЛОЖЕНИЕ ............................................................................................152-160

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ.

АТБ - анионтранспортный белок АТФ - аденозинтрифосфат

ВСМЭЧ - белковый спектр мембран эритроцитов человека

В - вольт

ГАФД - глицерапьдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ГБТ - глютатион-Б-трансфераза

ДЗБ - дизиготные близнецы

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дсн - додецилсульфат натрия

ДДФ - линейно-дискриминантная функция

м - молярность

ШБ - монозиготные близнецы

мА - миллиампер

мг - миллиграмм

мкг - микрограмм

мкл - микролитр

мм - миллиметр

ПААГ - полиакриламидный гель

РНК - рибонуклеиновая кислота

см - сантиметр

ТГ - транспортер глюкозы

ЭП - эритропоэтин

ЭФ - электрофорез

кБ - килодальтон

Мг - молекулярная масса

г - коэффициент корреляции

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

В последние годы интенсивное развитие мембранологии способствовало решению ряда важнейших проблем биологии и медицины, связанных с изучением физиологической активности клеток. При этом своими успехами она в значительной степени обязана прежде всего исследованиям мембран эритроцитов [8,13,49,76].

Цитоплазматические мембраны эритроцитов человека играют ключевую роль в обеспечении и регуляции физиологической активности этих клеток [11,30,761. Выполнение ими своих важнейших для организма функций обеспечивается довольно сложной структурной организацией, важнейшим компонентом которой являются белки [33,34,199,200]. Использование современных биохимических методов позволило к настоящему времени выделить практически все основные мембранные белки эритроцитов и описать множество минорных белков [31,190,207,2161. Известно, что белковые компоненты эритроцитарных мембран тесно взаимосвязаны друг с другом и изменение количественного или качественного состава одного или группы из них могут приводить к различным функциональным нарушениям мембран и клеток в целом, сказывающихся на благополучии всего организма. Об этом свидетельствуют данные о вовлеченности клеточных мембран и, в частности, их белкового спектра в патогенез целого ряда наследственных заболеваний ['1,7,20,47,50,52,53,1521. Причинами, обусловливающими возникновение дефектов структуры мембран эритроцитов могут быть не только мутации генов, детерминирую-

щих отдельные мембранные белки [63,121], но и нарушения их экспрессии на различных этапах потока информации, включая и посттрансляционные модификации [2,45].

Поэтому изучение проблем функционирования и генетического контроля за формированием функционально-активных белковых структур мембран эритроцитов человека представляет особую ценность. Ее значимость возрастает в связи с вовлеченностью этих процессов в патогенез целого ряда наследственных и муль-тифакториальных заболеваний и необходимостью поиска способов их лечебной коррекции на клеточном уровне [23,79].

Современные данные свидетельствуют, что мембранные белки эритроцитов человека являются продуктами экспрессии генов, выраженность которых определяется биохимическими и молекуляр-но-генетическими процессами регуляции их биосинтеза от пре-транскрипционных до посттрансляционных этапов. Для большинства мембранных белков эритроцитов установлены их аминокислотные последовательности, выяснены места локализации генов, детерминирующих эти белки [17,31,190,222,225]. В то же время, в научной литературе не получили должного освещения проблемы, связанные с соотносительной ролью наследственных и средовых факторов в этом многостадийном процессе. Остаются открытыми вопросы генетической детерминации самой экспрессии генов белков, проявляющиеся в их количественной представительности в мембранах эритроцитов. Это, а также объективная потребность дальнейшего углубления и развития представлений о регуляции функционирования единиц транскрипции генома человека определило проведение настоящего исследования.

Цель исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение роли генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов у человека.

Задачи исследования:

1. Изучить количественное содержание основных белков мембран эритроцитов у человека и оценить особенности их взаимосвязей между собой.

2. Оценить соотносительную роль генетических и средовых факторов в формировании фенотипического разнообразия количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов у человека.

3. Установить выраженность генетической детерминации количественного содержания каждого из исследуемых белков мембран эритроцитов.

4. Определить степень общности в генетической детерминации количественного содержания различных белков исследуемого спектра мембран эритроцитов.

5. Изучить особенности проявления влияния средовых факторов в формировании количественной представительности основных белков мембран эритроцитов.

Научная новизна работы.

Впервые проведена оценка соотносительной роли генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека. Оценена роль отдельных генетических и средовых компонент в формирова-

нии фенотипической дисперсии количественной представительности 15 основных белковых фракций эритроцитарных мембран. Показана роль генетических факторов в детерминации количественного содержания отдельных белковых продуктов, входящих в состав мембран эритроцитов, и выраженность взаимосвязей между ними. Установлен вклад средовых факторов.

Практическая значимость.

Полученные результаты углубляют представления о соотносительной роли наследственности и среды в формировании количественной представительности основных белков мембран эритроцитов человека. Они создают методологическую основу и открывают перспективы для более глубокого изучения механизмов регуляции экспрессии генов, вовлеченных в детерминацию формирования отдельных белков мембран эритроцитов.

Полученные данные могут быть использованы при изучении курсов цитологии, мембранологии, биохимической, медицинской и клинической генетики, нормальной физиологии и биохимии в высших медицинской и биологической школах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Содержание основных белков мембран эритроцитов у человека характеризуется различной степенью выраженности и гетерогенности, не зависит от пола и возраста, и стойко сохраняется в последующих поколениях.

2. Количественное содержание отдельных белковых фракций, входящих в состав клеточных мембран, статистически достоверно взаимосвязано между собой. Фенотипическая структура этих вза-

имосвязей сохраняется в поколениях и не различается среди родственников I степени генетического родства.

3. В формировании фенотипических дисперсий количественного содержания основных мембранных белков у человека принимают участие генетическая и средовая детерминанты. По каждому из исследуемых мембранных белков качественная структура и количественный вклад основных компонент ((За, (Зс1, Ее, Ем, Ме) имеют свои особенности.

4. Генетическая детерминированность количественной представительности отдельных белковых фракций мембран эритроцитов различна и варьирует в широких пределах (от 0.21 до 0.63). Установлена генетическая общность в детерминации количественного содержания отдельных белков.

5. Количественное содержание основных белковых продуктов в мембранах эритроцитов в существенной мере испытывает влияние среды. При этом средовые воздействия по отдельным белковым фракциям имеют как общий, так и локальный характер.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы доложены на I Всероссийской конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике ин-валидизирующей наследственной патологии" (Москва, 1997), международном симпозиуме "Артериальные гипертензии" (Москва, 1997), конференциях молодых ученых КГМУ (Курск, 1997, 1998), заседании Курского регионального научного общества медицинских генетиков (Курск, 1998), межкафедральном заседании сотрудников КГПУ и КГМУ (Курск, 1998), межлабораторном семинаре

МГНЦ РАМН (Москва, 1998). По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 5 рисунками, 8 приложениями. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, приложения. Список использованной литературы включает 231 источник, из них 79 отечественных и 152 иностранных.

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Некоторые вопросы функционирования эритрона и экспрессии генов в эритроцитах человека.

В настоящее время проблемы функционирования генома человека приобретают особую актуальность. С одной стороны это связано с успехами расшифровки самого генома человека, а с другой - с установлением множества различных патологических состояний, связанных с изменениями в строении и функционировании генетического аппарата [6,7,28,45,50,86].

В геноме человека по наиболее вероятной оценке истинное число структурных генов составляет около 80 ООО [23]. В различных клетках организма экспрессируются не все, а лишь определенные группы генов [23,46].

Дифференциальная экспрессия генов, конечным результатом которой является синтез функционально активного белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной активности, но и полноценность всех последующих этапов, включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность к посттрансляционным модификациям, правильную локализацию и корректное взаимодействие с другими компонентами клетки [79]. Представления о дифференциальной экспрессии генов позволяют объяснить причину существования специфических "белковых портретов" дифференцированных клеток [23,46,64,74,79].

Одним из примеров высоко специализированных клеток организма человека служат эритроциты, являющиеся конечным и ключевым звеном в процессе эритропоэза.

Эритроциты, а в основном цитоплазматические мембраны

этих клеток, на протяжении нашего века привлекают исследователей относительной простотой своего строения и выделением цитоплазматических мембран [761. В настоящее время проблема структурно-функциональной организации мембран эритроцитов привлекает ученых в связи с установлением различных нарушений в строении и количественном соотношении белковых компонент мембран, приводящих к наследственным заболеваниям. Так, современные данные биохимической генетики указывают на вовлеченность клеточных мембран в патогенез ряда наследственных патологий: гемолитической анемии [52], миодистрофии [29], псориаза [201, гипертонической болезни [60] и других [113].

Эритроциты циркулируют в клеточном русле в течение 120 дней (в среднем), после чего они элюируются из кровотока. Эритропоэз представляет собой постоянный и непрерывный процесс образования и восстановления клеток эритрона, главной функцией которых является снабжение тканей кислородом. Эрит-рон - совокупность всех эритроидных клеток костного мозга и крови. Эта клеточная система выполняет высокоспециализированную функцию переноса 0г из альвеолярного воздуха в ткани и включает в себя 4 категории клеток: 1) ядросодержащие эритро-идные клетки костного мозга; 2) ретикулоциты костного мозга; 3) ретикулоциты крови; 4) зрелые эритроциты [57,58,65,204].

Процесс старения эритроцита - это процесс комплексный и затрагивает практически все компоненты этих клеток. Старение сопровождается изменением активности метаболизма, ионного и водного состава клетки, изменением функциональных и структурных свойств мембраны [30,33,225]. При старении эритроцитов снижается их гемолитическая устойчивость. Многие исследовате-

ли первопричину гибели эритроцитов видят в изменении поверхностной структуры мембраны, что приводит к распознаванию и разрушению таких "старых" клеток макрофагами и лимфоцитами [65,190,1983. В связи с этим отмечается важная роль в мембране сиаловой кислоты, содержание которой уменьшается с возрастом эритроцита. Интересные сведения получены Као о том, что на эритроцитарной мембране появляются в ходе старения клеток рецепторы с Мг=72 кО, которые являются фрагментом ан-кирина. К ним прикрепляются иммуноглобулины класса в, которые способствуют фагоцитозу эритроцитов макрофагами [303. Таким образом "старые" эритроциты постоянно удаляются из крови.

Рассмотрим подробнее вопросы, касающиеся основных этапов эритропоэза и формирования различных клеточных структур эритроцитов человека. Клеточная основа эритропоэза состоит из дифференциации, пролиферации и созревания эритроидных предшественников в костном мозге с последующим выходом эритроцитов в циркуляцию крови. В результате дифференциации клетки приобретают ограниченную способность проявлять фенотип тех частей клеточного генома, которые кодируют информацию для синтеза белков, специфичных для эритрона. В процессе последующего созревания эритроидные клетки становятся полностью дифференцированными. Таким образом, процессы дифференциации и созревания создают уникальную специализацию в структуре и функции эритроидных клеток [57,58,2253.

Продолжающееся на протяжении всей жизни организма обновление клеток эритрона контролируется механизмами регуляции, которые поддерживают динамически устойчивое эритроцитарное равновесие. Центральное место в регуляции эритропоэза занима-

ет эритропоэтин (ЭП) - почечный гормон гликопротеиновой природы С57]. Инициируя синтез всех классов РНК, специфических для эритрона, ЭП действует так же, как и другие "классические" гормоны, приводя к образованию белков, составляющих структурную и функциональную основу эритроидных клеток [581.

Синтез мембранных компонентов эритроцитарных клеток происходит на ранних стадиях зритропоэза [57,2253.

Эритроидная дифференциация, которая индуцируется эритро-поэтином, в молекулярном аспекте означает экспрессию генов, определяющих синтез специфических белков эритрона, главным образом, синтез гемоглобина. В литературе довольно подробно описаны возможные механизмы регуляции генной активности н