Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование вектора для галофильных архебактерий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование вектора для галофильных архебактерий"

ГР

3 г

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИЙ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТ1ШШИ УНИВЕРСИТЕТ Ш. И.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи Деркачвва Надевда Игоревна

УД1{ 577.113:575

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРА ДЛЯ ГАЛОШЫШХ АРХЕБАКТЕРИП

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте физико-химической биологии ш. ¿.К. Белозерского МГУ им. Ы.В.Ломоносова

Научные руководители: -доктор химических наук

И.Н. Шатский,

-доктор биологических наук A.C. Манькин

Официальные оппоненты: -доктор биологических наук, профессор

П.М.Рубцов

-доктор биологических наук Ю.Л.Дорохов

Ведущая организация: Новосибирский институт биооргашчаской химии СО АН РСФСР

Защита состоится "_" _ 1992 г. в _ час. на

заседании Специализированного Ученого совета Д 053.05.07 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова пс адресу: ГСП I19899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, корпус -А-, к.536.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологическог факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" _ 19Э2 г.

Учения секретарь Совета кандидат химических наук

i

i

:.r ■'■ ^'í I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

. Ч л'л . j ."V riL'hñ ;

~ ' "Актуальность теш. Архебактерий представляют собой обособленную группу кивых. организмов, равную по статусу эубактериям и эука-риотам. Общие принципы организации и экспрессии генетического материала у этих организмов сходны с представителями двух других групп, однако архебактерии обладают и уникальными молекуляряо-биологическкш особенностями. В то время как молекулярная биология эубактерий и эукариот исследованы достаточно подробно, принципы сгрунтурной организация и функционирования генома архебактерий практически неизвестны. Без выяснения этих принципов, невозможно составить полную и объективную картину становления и эволюции генома, фундаментальных законов его экспрессии, работы аппаратов репликации, транскрипции и трансляции в клетках живых'организмов.

Изучение архебактерий представляет особый интерес еще и потому, что подавляющее большинство представителей этой гругаш обитают в экстремальных условиях: при высоких температурах, при низких значениях pH, в насыщенных солевых растворах. Изучение механизмов адаптации как клеточных молекул, так и надмолекулярных комплексов к экстремальным условиям окружающей среда может пролить свет на фундаментальные принципы, лежащие в основе формирования структур биомолекул.

Галофильныэ архебактерии являются одной из наиболее интересных архебактериалышх групп, так как обитают в высокосолевых растворах (до 4,5 М Nací) я яри этом имеют столь же высокую внутриклеточную концентрацию KCl, что определяет уникальную структуру биомолекул в клетках этих организмов. Кроме того, клетки ряда га-лобактерий содержат уникальный хроматофор бактериородопсин, представляющий собой светочувствительный протонный насос, за счет работы которого возникает мембранный потенциал, используемый для синтеза АТФ.

Однако на настоящий момент информация о молекулярно-биологяческих особенностях галобактерий, как и других представителей архебактерий, крайне фрагментарна. Одной из основных причин этого до самого последнего времени было отсутствие векторных систем для архебактерий.

*

^ Цельа дашюй работы было конструирование вектора для экстремально галйфильной архебактвряи Иа.гаЬасгег1ит На1оЫшл на основе мутантного ояэрона рРНК этого организма, кодирумаего устойчивость к ьнгибиторам белкового синтеза аниэомицину 'и тиострептону. Одной из основных задач настоящей работы была проверка выдвинутого нами предположения о присутствии й районе уникального в геноме aa.ba.io-ыйт оперона рРНН автономно реплицирующейся последовательности. В связи с тем, что это предположение") в значительной степени подтвер-. далось, существенная часть работ посвящена картирована» нуклео-тидной последовательности, способной стабилизировать наследование содержавши ее плазмид в галобактериакыюй клетке.

Научная новизна и практическая цешость работы: Б работе впервые получен челночный вектор для клеток кь.нагаыит и е.сои, содержащий в качестве селективного маркера мутантный олерон рРНК яь.па1аЫит. Впервые ь геноме архебактерий локализованы хромосомные последовательности, стабилизирующие наследование содержащих их шшмвд. Показано, что этим свойством обладают различные неперекрывающиеся между собой районы промоторной области уникального ОПерОНа рРИК КЪ.каЮЫит.

Сконструирован ряд челночных векторных систем для галобакте-рии иь.па1оЫит, представляющих собой удобные модели для исследования регуляции экспрессии генов рРНК этого организма. Созданные векторные системы могут быть использованы в качестве основы при конструировании более совершенных векторных систем для галофилъных архебактерий.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен особенностям структуры и организации генетического материала галофильных архебактерий), экспериментальная часть (материалы и метода), результаты и их обсуждение, выводы и список цитированной литературы (2Ю ссылок). Работу иллюстрируют 23 рисунка и 2 таблицы. Общий объем диссертации 156 страниц.

Апробация работа к публикации: Материалы диссертации докладывались на Двустороннем Симпозиуме ССЙР-ФРГ "АгоЬавЬаогег1а", Тбилиси 1990; на теоретическом семинаре лаборатории нуклоопроте-вдов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.БбЛозерского МГУ еы. Ы.В.Ломоносова. (Москва, 1991). По теме диссертации опубликовано 4 " работы.

IX. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИВ.

I. Конструирование плазмида pHR2.

В ходе работ по созданию вектора в нашей лаборатории И.М. Змряновой была сконструирована плазмида pHRZ (рис.1). Эта плазмвда была использована в настоящем исследовании, в связи с чем здесь необходимо кратко описать схему ее получения.

Плазмвда piffiZ была создана на основе оперона рРНК мутанта яъ.ЬлгоЫьп, устойчивого одновременно к двум ингибиторам белкового синтеза анизомицину и тиостреп-тону. Было показано, что устойчивость обусловлена точечными заменами в гене 23S рРНК. Замена ОТ в положении 2471 обеспечивает устойчивость организма к анизскдаци- Рис.1 Физическая карта нлазмиды ршк ну, а замена A+G в положении 1159 - к тиострептону [Uankin.1990]. HindiII- Bglll <}рагмент хромосомной ДНК этого мутанта длиной около 10,5 т.п.о., содержащий оперон рРНК и фланкирующие его области, был клонирован в плазкиду рВЮ22 по рестрикционным сайтам эндону-клеаз Hindlll и BamHi. В результате была получена плазмида pHRZ (рис.1). Кроме генов рРНК и промоторной области оперона рРНК, включающей семь промоторов и открытую рамку трансляции гор, в клонированном в плазмпде pHRZ фрагменте ДНК нь.нагоьыт содеркатся также фланкирущие оперон участки ДНК длиной около 3 т.п.о. перед первым промотором и около I т.п.о. за сигналом термилации транскрипции оперона (рис.2).

Ранее было показано, что клонированный в плазмида pHRZ му-тантный оперон рРШ къ.на1оыи.п может быть использован в качество селективного маркера в клетках этого организма [tiankin and el, 1991]. При этом исключительно важной представляется возможность проводить селекция трансформантов одновременно по двум антибиотикам. Дело в том, что вь.на1оыит обладает довольно высокой час,го-той возникновения спонтаяых мутантов, резистентных к кадкой' из этих антибиотиков (lCf'-ICf8). 8 то время как вероятность спонтан-

гср

)ба

гая А'

А 1а

233

I-

Н1п(Л11

ьз ъми

а!

Хуа

-1

ваш

Ааи1 |

ТГЕГГ ~БаГГ

ТчзоЕТ

ЛЬ

"НраТ~

ДарВТ?

ТПиТ

ИЗ

ТТнаёГ

N00 ШП

ТутТТГ

БаоТ"

ГГТТ5аНГГ

ПС

И

Эта!

—I-1-]—

6000 8ооо

Т-|-

10000

гсюо

1

4000

Рис. а Сима и ре стрикционная ■ карта Н1пй1И-Бе111 фрагмент ДЯК еъ.ьагоЫит, содержащегося в плазмиде р1Ш. О - открытая рамк трансляции гор, $ - гены рРНК, - промоторы,! - гены тРНК.

ного возникновения "двойного" мутанта настолько мала (<10 ) не может помешать отбору истинных, трансфзрмантов.

Благодаря присутствию последовательности плазмндо рВЮ22 плаэмвда рНМ может реплицироваться в клетках в.сои, а соответ ствуюцш трансформанты могут быть отобраны благодаря способност расти на селективных средах, содержащих ампициллин.

К моменту конструирования плазмиды рнкг в литературе ш был описано ни одного реплююна галобактерий. Тем не менее, на осшж нии анализа литературных данных, касающихся локализации хромосои ных участков инициации репликации у других организмов, возмоги было предполокить, что участок инициации репликации хромосоь нь.но1оыи»г мокэт находиться на фрагменте, предшествующем уникал1 ному оперону рРНК.

Такш образом, на основании совокупности изложенных выше да! ных, мы предположили, что плазмида рШг может быть использована качестве челночного вектора, способного реплицироваться как клетках uъ.haloъ^w^, так и в клетках, г.сои.

чт

1

2. Трансформация нъ.haiobtun плазмидой pHRZ.

Трансформация клеток нь.нагоЫит плазмидой pHRZ проводилась в соответствии с описанной в литературе методикой [01ine and Doolittle, 1939]. В результате трансформации были получены клоны Sb.haiabium, устойчивые к анизомицину и тиострептону. Контрольные эксперименты показали, что клопы с двойной антибиотической устойчивостью не возникают, если клетки проводить чорез процедуру трансформации, не добавляя ДНК плазмиды pHRZ. Учитывая это, мокно было полагать, что полученные колонии, являются Истинными трансформантами. Проведенные ранее в нашей лаборатории эксперименты показали, что при трансформации галобактеряи яъ.нсЧоЫип плазмида-ми, содержащими мутантный оперон рРНК, двойные мутанты могут возникать в результате гомологичной рекомбинации между плазмидным и хромосомным оперонами рРНК, сопровождавшейся потерей плазмиды. В связи с этим, для проверки присутствия ДНК плазмиды pHRZ в трансформированных клетках проводилась гибридизация полученных колоний с Р-меченной ДНК плазмиды pBR322. Результаты этого эксперимента показали, что все эти колонии нъ.ка1аыит действительно содержат чузкеродную для галобактерий последовательность плазмиды pBR322, то есть являются трансформантача.

Поскольку представители вида Hb.haiobiun богаты различными гиазмидами, выделение из галобактериальных клеток плазмиды pHRZ в индивидуальном виде затруднено. Кроме того, не исключено, что при попадании в галобактериальную клетку плазмида pHRZ мокет претерпевать изменения, вероятность которых достаточно велика, принимая во внимание исключительно высокую нестабильность генетического материала Bb.haiobium. Для того, чтобы определить что происходит с плазмидой pHRZ в галобактериальной клетке, препараты суммарной клеточной ДНК трансформантов гидролизовали рестриктазой EooRl и тест1фовали гибридизацией по Саузерну. В качестве контроля проводили гибридизацию гидролизованной EooRl суммарной ДНК реципиент-ного штамма вь.haiobtun RI. Зондам для гибридизации служила замеченная ДНК плазмиды pHRZ. Результаты одного из подобных экспериментов представлены на рис.3. Видно, что в ДНК трансформированного клона, помимо зон, присутствующих в гидролизате ДНК решши-ентного шгаша и соответствующих хромосомному оперону рРНК, имеются также зоны, в точности соответствуют зонам гидролизата плазми-

да pHEZ, использованной для трансформации. При этом интенсивность зон, соответствующих pHRZ, приблизительно равна интенсивности хромосомных зон. Данные результаты позволяют предположить, что в клетках трансформантов содержится полноразмерная последовательность плазмида 1 2 ) 4M * pHRZ в количестве близком к одной копии

| . на геном.

i Одним из наиболее существенных вопро-

сов связанных с судьбой плазмида pHRZ в у '* трансформированных клетках, является во-

w & -*—ш лрос о ее способности к автономному су-

4 'ZZtj шествованию в галобактериальной клетке, са»^^ «_».* Рис.з Радиоавтограф фильтра, получен-

I' ¿3 —s.r кого в результате гибридизации по Сау-! зерну ДНК клонов кь.ыоыв«, трансфор-

^ мированных нлазмидой pHRZ. I - ДНК штам-

ма R1; 2 и 3 - ДНК трансформантов; 4 -ДНК плазмида pHRZ, М - продукт гидролиза ДНК фага \ рестриктазой Bat Eli. (Отмечены длины фрагментов ДНК). Результаты гибридизации по Саузерну, хоти и являлись веским аргументом в пользу автономной репликации плазмида pHRZ в галобактери-альных клетках, но могли сыть объяснены и интеграцией pHRZ в хромосому в результата гомологичной рекомбинации. Таким образом, на следующей стадии исследования была предпринята попытка определить существует .да pHRZ в клетке в автономно реплицирующейся форме или реплицируется в составе хромосомы.

Для решения этой задачи мы воспользовались способностью плазмида pHRZ реплицироваться в клетках е.оои. Суммарной ДНК из клэ-.ток Hb.haiobium, трансформированных плазмидой pHRZ, использовали для трансформации компетентных клеток е. сои В результате такой трансформации бнли получены колонии трансформантов г.оон, устойчивых к ампициллину. Ресгрикциошый анализ плазмидной ДНК из этиа клонов не выявил никаких ее отличий от исходной плазмида pHRZ, использованной для трансформации галобактерий. Полученный результат позволил сделать вывод, что плазмида pHRZ присутствует в клет-

ках яъ.МоЫшл в виде экстрахромосомной кольцевой ДНК, и следовательно, вероятно, содержит автономно реплицируюцуюся последовательность.

На основании плазмида рннг в нашей лаборатории была сконструирована плазмида рннгн. Эта плазмида была получена в результате клонирования природной галобантеркальной плазмида рНББ, линеаризованной рестриктазой Н1пМ11, в уникальный ШайШ-сайт плазмида рняг. Было доказано, что плазмида р1ШН не способна автономно реплицироваться в клетках пъ.ъагоъып и является интеграционным вектором, что вероятнее всего связано с присутствием в ней двух участков инициации репликации.

3.Конструирование и изучение плазмида, не содержащей последовательности рВй322.

Плазмида ргог содержит последовательность вектора е.ооН рВЯ322, поэтому нельзя исключить возможность того, что именно эта последовательность поддерживает репликацию плазмиды р1Шй в клетках

НЪ.ка1аЫит.

Для выяснения этого конструировали плазмиду, содержащую только галобактериальную часть плазмида рНЕ2 и тестировали ее способность к автономной репликации в клетках кь.нагоЫит. При этом плазмиду рниг гидролизовали рестриктазой Кои, для которой в гало-бактериальной части плазмиды рНЯ2 имеется два сайта, один - перед опероном рРНН, в положении 968, а другой-за ним (рис.2), и выделяли больший фрагмент, содержащий лишь галобактериальную последовательность ДНК. В результате лигировашя этого фрагмента была получена плазмида, названная рНягАрВя. Поскольку эта плазмида на мокет поддерживаться в клетках е.оон, для трансформации клеток вь.КагоЫит использовали непосредственно лигазную смесь. В результате были получены колонии, устойчивые к анизомицину и тиострепто-ну. Суммарную ДНИ трансформантов анализировали с помощью гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда 32Р-мэчешгую ДНК плазмида рНВ2. Во всех случаях на автографе видна зона, соответствующая фрагменту, образующемуся при гидролизе плазмида рнвгдрвя рестриктазой ЕсоШ (рис.4). Эта же зона, соответствующая плазмиде рШШрВН обнаруживалась в выделенной щелочным лизисом плазмидной фракции трансформнрованшх клонов пъ.ъа1аыип. Этот результат позволял заключить, что плазмида рНМАрвЯ способна автономно поддерживаться в клетках пь.ьагаъ^т и, следовательно, последовательное--

ти ДНК, обеспечивающие стабильность плаз-мидц pHRZ, находятся в галобактериальной 2 4 ■ части этой плазмиды.

Рис.4 Радиоавтограф фильтра, полученного ' при гибридизации ДНК клона, транс-л 93 формированного лигазной смесью, содериащей

плазмиду pHHZipBR. 1 - ДНК клона ир.ь^го-Ыит, трансформированного плазмидой pHRZ, 2 и 3 - ДНК штамма RI, 4 - ДНК клона, трансформированного лигазной смесью, содериащей плазмиду pHRZApBR. (Отмечены длины фрагментов ДНК).

Целью дальнейшей работы явилось картирование участка, отвечаицвго-за стабильность плазмиды pHRZ в клетках нь.ьагоЫша.

4. Делении участков ДНК, перед промоторным районом плазмидного оперона рРНК.

Решать задачу картирования фрагмента ДНК, отвечающего за стабильность плазмиды pHRZ в галобактериальных клетках, мокно, деле-тируя определьнные районы галобактериальной части плазмиды pHRZ и проверяя, наследуются ли плазмиды, содержащие делеции, в клетках Sb.haiobium. Естественно, что в получаемых при этом плазмидах не должна нарушаться экспрессия оперона рРНК, являющегося селективным маркером. То есть, строго говоря, в плазмидв pHRZ в области предшествующей оперону рРНК можно делетировать только район перед промоторами, чтобы не нарушить экспрессию этого оперона.

Для получения таких делетантов использовали плазмиду рНЪ, ранее сконструированную а нашей лаборатории Й.Г.Левиевым. Эта шшзмида представляет собой клонированный в pUCl9 по сайтам HindIII и ЕооН1 фрагмент HindIII-Ball (4204 и.о.) ДНК нромо-горного района Bb.haicbium (см.рис.2). Сайт EcoRl плазмиды рХЮ19 при этом был предварительно "затуплен" с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I е.coa. Плазмиду рНХ гидролизовали одной из рестрик-таз - Sali, Kot1, Sm1, Nae1 или AsuII. В случае рестриктаз Sail и Notl продукты гидролиза обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, посла чего их лигировали с Hindin-линкерами, гидролизовали рестриктазой HindIII в выделяли электрофорезом в агароз-ном' гела. Наибольший фрагмент, выделенный из каждого гидролизата.

циклизовали с помощью ДИК-лигазы. Таким образом, из плазмида рНЪ были удалены участки ДНК, расположенные между сайтами Н1псИИ и одной из указанных выше рестриктаз. Полученными лигазними смесями трансформировали клетки Б.сои, и плазмида рН1АЗа1, р1ШШо<;, рНЬЛЗта, рКШае и рНХЛАви, названные в соответствии с использованными для их получения рестриктазами, выделяли в препаративных количествах. Далее Н1пйШ-Крп1 фрагмент из соответствующих рньд-клонов, содержащий ту или иную делению, выделяли из агарозы и использовали для замещения Н1лс1111-Крп1 фрагмента в ндазмиде рннг. Полученные- плазмида балл названы соответственно рНН2АБа1, рШШИо!;, рНВгДЗта, рНЕЯДйае и рНЯ2ДАзи (рис.5) и использовались далее в трансформации нь.нагоыип.

й1пс131Т р1 ГгР3Р4Р5Р61>7

Бша) Но<; 1 АзиИ За11 Ыае1 г-»гср->->-> 1 63

1-Н-1--1-11 ') 'Т"7 1—Г1^

3 12 3 А т.п.о.

1 ргагЛиог

г ' рнпгЛлзи

I ■ ' рНКИДЗа1

I , - . рНЕгДЫав

Рис.5 Схема получения делеционных вариантов плазмида р!1Я2. □ - делетированяыв области, [3 - области, присутствующие в соответствующее. планмидых. Отмечены промоторы оперона рРНК, сайты рес-гриктаз, использованных при получении соответствующих делеционных вариантов и начало гена I6б рРНК.

У. Трансформация пъ.па1оЫип плазмидами р1Ш2ДЗа1. ■ ' рннгдмо*. ртагдзта. рндгднае и рнишви.

В результате трансформации клеток аь.кагоыит. плазмидами рНМДЗа!, рнммж. рНЛгДБта. рНН2ДНае и рННгЛАза для кавдой плаз-иида были получены клоны, устойчивые к анизомициау и тиострептону. Зри гибридизации этих клонов с 32Р-меченной ДНК плазмида рВК322 5ило установлено, что все они содержат эту чужеродную для галобак-герий последовательность, то есть являются трансформантами. Из этобранных клонов выделяли суммарную ДНК, гидролизовали ее рес-гриктазой Еаой1 и тестировали гибридизацией по Сауэерну. В качест-зе зонда использовали Р-меченную ДНК плазмида рниг. При этом во зсех исследованных случаях на радиоавтографе были видны зоны, со-этветствупцне фрагментам, получаемым при гидролизе рестриктязой

EooHi плазшщ, испольэованнш для трансформации (рис.6). Этот результат является веским аргументом в пользу того, что все эти плазмида существуют в-клетках Hb.haloblum в тголноразмер-ной форме и, по-видимому, могу; стабильно наследоваться. Дш Рис.6 Радиоавтограф фильтра, полученного при гибридизации п< по Саузерну суммарной ДНК клонов иъ.haiobium, трансформированных делеционными вариантам] плазмида pHRZ. I - ДНК штамм; R1, 2-7 - ДНК клонов, трансфор мированных плазмицами pHRZ pHRZASma, pHRZ&Not, pHRZAAsu pHRZASal И pHRZANae, COOTB0T ственно, 8-13: ДНК этих плазми в том же порядке. (Указаны дли ны фрагментов ДНК), прямого доказательства их автономного наследования из соответству мцга галобактериальных клонов выделяли суммарную ДНК и трансформи ровали ею клетки е.соit. Во всех случаях из устойчивых к ампицил лину клонов были выделены плазмида, идентичные использованным м трансформации клеток Hb.haloblum.

Полученный результат означает, что последовательность фраг мента Hindlll-Nael (см. рис.2), непосредственно предшествующа промоторному району .оперона рРНН вь.кагоыип, не необходима дл стабильного наследования плазмида pHRZ в клетках галобактерий.

VI.Локализация автономно реплицирующейся последовательности в промоторном районе оперона рРНК нъ.нагоъыт.

После того, как было показало, что фрагмент Hindlll-Hael расположенный перед опероном рРНК в плазмиде pHRZ, не важен ¡и обеспечения ее стабильности в клетках нь.ьаюыит, было решен сконцентрировать внимание на промоторном районе оперона рРНК, пс скольку ряд ко светит аргументов позволял предполагать, что имен* в этой области может располагаться хромосомный участок инициащ

1234$.« 78 9 10111213

78

- в • • — — КеНО»****- 7.1

репликации.

Проблема, однако, заключалась в том, что решать эту задачу с аспользованием плазмида рГОй не представлялось возможным. Действительна, внесение делений в промоторную область должно приводить к нарушению экспрессии селективных маркеров, расположенных в плаз-мидном гене 233 РНК. Поэтому на данной стадии исследования возникла необходимость ь ином селективном маркере для отбора трансформированных галобактериальных клеток. Вектор р1ЖР2 (рис.7(А)), несущий такой маркер, ген устойчивости к антибиотику мевинолину, был любезно предоставлен нам Р.РИе11ег (Институт Макса Планка, Германия ).

Для проверки способности промоторного района оперона рРНН нь.ьа1оЫит поддерживать автономную репликацию плазмид в клетках этого организма, было решено заменить последовательность рНН9, выполнившую роль участка инициации репликации в векторе рШЗР2, на фрагмент галобактериальной ДНК, содержащий этот промоторный район.

А

Рис.7 Физические карты плазмид pUBP2 (А) и рОТЖВ). Для этого плазмиду pUBP2 гидролизовали рестриктазой EooRl и выделяли фрагмент, не содержащий последовательности рНН9. Полученный фрагмент циклизовали, трансформировали им клетки е.сои и выделяли плазмиду, названную pUBPAR. Фрагмент, содержащий промоторную область галобактериального оперона рРБН, выделяли из плаз:адщ рНГ. (см. стр.10). Для этого плазмиду pHL гидролизовали .рестриктазой Hindiu, обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лиги-ровали с EooRl-линкером. Полученный продукт гидролизовали рестриктазой EcoRi и содержащий промоторный район фрагмент выделяли из агароэного геля. Далее этот фрагмент лягировали с линеаризованной в результате гидролиза рестриктазой EooRl плазмвдой pUBPÄJR и после

трансформации лигазной смесью клеток е. сои выделяли нлазмиду, названную риш (рис.7(Б)). Эта плазмида использовалась для трансформации нь.haiobiun. В качестве отрицательного контроля параллельно проводили трансформацию нь .пагоЫи.т. плазмидой pUBPAR, а в качестве положительного - плазмидой pUBP2. Полученные устойчивые к

ор

мэвинолину колонии гибридизовали с Р-меченным фрагментом HindiII-EooRI плазмиды pUBP2, содержащим только последовательность вектора р1В131 е.call. Результат этой гибридизации свидетельствовал о том, что в случае трансформации плазмидами pUBP2 и рЮТ во-31шкает много колоний, гибридизующихся с зондом, а в случае трансформации pUBPAR нет ни одной такой колонии.-

Суммарную ДНК одного из клонов, выросших из клеток трансформированных плазмидой pULN и гибридизующихся с последовательность PIBT31. анализировали гибридизацией по Саузерну. Результат этого эксперимента представлен на рис 8, из которого следует, что в ДНК трансформантов присутствуют зоны, соответствующие по размеру фрагментам плазмиды pULN. Это дает основание считать, что плазмида pULN существует в клетках пь.нагоыит в полноразмерной форме. Для

получения прямого доказательства стабильного наследования плазмиды pUIN в галобакте-риях, проводили перетрансформацию клеток E.colt суммарной ДНК ИЗ КЛОНОВ Hb.halobltmi, ... о трансформированных pUIN. После чего и;

1 ■ трансформированных, клеток Е.оон была выде-

: лены плазмиды, имеющая ресгриктну» карту,

! идентичную pULN.

и

u WSt«~ 4.1

„ Рис.8 Радиоавтограф, полученный npi

■ гибридизации суммарной ДНК клона, трансформированного плазмидой ptTLN, с 32Р-меченно1 и ' ДНК этой плазмида. I - ДНК штамма RI, 2 -

ДНК клона, трансформированного плазмидо! pULN, 3 - ДНК плазмиды pULN. Во всех случаях ДНК гидролизована рестриктазой Азр718. Указаны длины фрагментов ДНК. Таким образом, плазмида pULN способна автономно поддерживаться в клетках ыъ .haiobiurr.. Полученный результат означает, что по следовательность, отвечающая за стабильное наследование плазми,

2 J.

pHRZ и pUIN, действительно расположена в промоторном районе огоро-на pPffií.

Глава vil. Детальное картирование участка промоторного района оперопа рРНК, стабилизирующего плазмида в клетках нъ.ИагоЫит.

С целый более детальной локализации участка промоторного района, способного поддерживать автономное наследование содержащих его плазмид, различные фрагменты этого района клонировал? в EooRi-сайт плазмида pUBPAR и полученные плазмида использовали для трансформации клеток нь.haloьtum. Для получения необходимых фрагментов, плазмиду pHLANae (см. стрЛО) гидро.тизовали • рвстриктьзами М1Ш, 'Лоот, Аар?18, Hpai, Naíí л HindIII, а также парами рестриктаз Авр718 и Mlu1, Нра1 И HinoIIÍ, ЫвИ и HindIII ( см. рис.2). Гидро-лизаты обраОатовали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, лигирова-ли с Всом-линкерами и выделяли нужные фрагменты. Плазмиду pUBPAR линеаризовали рестриктазой E00RI и лигировали с каждым из выделенных фрагментов. Полученные в результате плазмида амплифицировали в клетках в.сои и затем использовали для трансформации клеток sb.haiobiun. Названия плазмид и участки промоторного района оперопа рРНК, содержащиеся в них, представлены на рис. 9.

С-

163

Hael

Pi

Mlul Noo1

p2 p3 pA pb p 6 p7 Asr/719 flsilNcol Hpa1Mlu1

Ball

—j-

1000

T

1200

1-Г

1400 1600 П.О.

V

200

■JOO

600

800

'pOHK

ава!ииая8ашЕаа8аве8ааяаяаааа1 POHH

pOHN pOMM

PONSR

pom

pOHR pONCR

Рис.9 Схема промоторного района оперона рРНК нь.на1аЫим. Показаны участки промоторного рйона, которые были тестированы на способность поддерживать автономную репликацию содержащих их плазмид. Рядом приведены названия соотвегствуодих плазмид.

Полученные в результате трансформации устойчивые к мевинолин колонии гибридизовали с ^Р-меченным фрагментом HindlII-EcoR нлазмида рШР2, содержащим только последовательность р1В131, кото рой заведомо нет в нетрансформированных клетках. Результат этог эксперимента оказался довольно неожиданным, поскольку оказалось что для каждой из плазмид были обнаружены клоны, которые давал положительный сигнал при гибридизации с этим зондом.При этом одна ко необходимо отметить, что в случае плазмид, содержащих толък прилегающую к гену I6S РНК область размером около 0,5 т.п.с (pONCR, pONSR, poro и рОШ) (рис.9), образовалось 'значителы меньше трансформантов, чем в остальных случаях. ,

Для того, чтобы определить присутствуют ли все эти плазмид полученных клонах в автономном состоянии, из них выделшм суммам ную ДНК и трансформировали ею клетки в. со а. Во всех случаях, с исключением плазмиды pONSR, были получены клоны, устойчивые к ал пицшшшу. Выделенную из этих клоноы плазмидную ДНК подвергaj рестрихционному анализу. В качестве контроля использовали аналс гичные гидролизаты соответствующих исходных плазмид. В результат было показано, что в продуктах гидролиза плазмидной ДНК всех клс

Рис. 10 Сравнительный peí трикционный анализ плазми. содержащих различные участ; промоторного района оперо рРНК ЕЬ.НаЛоЫит, И ШШЗВД полученных после трансформ ЦИИ В. сои суммарной Д штаммов, трансформированы этими ке плазмидами. Показ ны гидролизаты рестриктаэ E00R1 плазмид: I - pONCR,

- pOHR, 3 - pOÍÍR, 4 - рОЫ 5 - рОАМ, 6 - рОШ, 7 рОММ, 8 - pOAR, 9 - pOHN,

- pOfJR. а - плазмида, выл ленная после перетрансфорг. шш, ъ - исходная плззми;

М - мэркчр. (Указаны длины фрагментов ДКК).

нов, за исключением клонов, полученных при перетрансформации клеток E.caii плазмидами ронн и pONCR, имеются фрагменты, соответствующие фрагментам плазмид, использованных для трансформации клеток НЬ. halobiwn. (рис.10).

Полученный результат позволяет сделать вывод о том, что некие щиэ общих районов участки промоторной области, такие как фрагменты Mlu1-Asp7ia (В ПЛ£ЗШДе pO'iA), Asp718-Mlu1 (В рОАМ) И Mlu1-EooRi (в pOliH) (рис.9), поддерживают автономное наследование плаз-МВД в клетках Hb.haloblum.

Анализ плазмид ронк* и pONCR*, получошшх в результате пере- ■ трансформации л.coi t плазмидами pOHR и pOHCR, показал, что они

отличаются от исходных (рис.Ю). Было показано, что в случае плаз-, $

мида pONCR увеличение длины является результатом замены участка промоторного района в плазмиде pONCR (3657-4204) на другой участок промоторного района (2727-3771). В результате в этой плазмиде, по сравнению с pONCR, появился дополнительный фрагмент промоторного района длиной 920 п.о. от сайта Wool (позиция 3657) .до позиции 2727 (позиции нуклеотидных остатков пронумерованы от сайта Hlndlll в соответствии с рис. 2). При этом соответствующий EcoRi-сайт, по которому был клонирован фрагмент промоторного района в плазмиде, pONCR, отсутствует, а остальная часть плазмиды piBI сохранилась. Фрагмент оперона рРНК, клонированный в плазмиде pONCR, частично делетирован и содержится в pONCR* только,до 3771 остатка, считая от сайта Hindlll. Непосредственно за этим остатком следует последовательность EcoRi-линкера. Таким образом, в плазмиде pONCR* отсутствует последовательность начала гена I6S РНК и промотор Р7, которая была клонирована в pONCR, но имеется область со всеми остальными промоторами, что вероятно, и объясняет способность плазмиды pONCR* стабильно наследоваться в галобактериальной клетке. Такое изменение плазмиды pONCR вероятнее всего является результатом ошибочной гомологичной рекомбинации менду участками оперона рРНК в хромосоме и в этой плазмиде. (Детальный аналиь плазми-ци pOHR нз проводился, и по этому в настоящий момент трудно замычать какие рекомбшациошшв события привели к ее образованию.)

С плазмидой pONSR в галобактериальной клетне токе, по-зщдамому, произошли какие-то преобразования, поскольку из соответствующего трансфорыанта не удалось выделить плазмиду, способную реплицироваться в s.con, хотя ДНК этого клона гибридизуется с

последовательностью р1В1Э1. Этот результат может быть объяснен либо интеграцией этой плазмиды или ее части в хромосому пь.пахоы-ип, либо тем, что в ней вследствие рекомбинационных событий нарушились области, ответственные за репликацию в клетках е.сои, а в клетках нъ.нагаЫип эта плазмида реплицируется.

В свете результатов, полученных для плазмид ронсн, ронзн, и рот, несколько неожиданным выглядит тот факт, что плазмида рОМЛ способна автономно поддерживаться в клетках нъ.ныоыип, и, как показали результаты рестрикционного анализа и сиквенирования, находится при этом в неизменной форме. Необходимо отметить, что в повторных опытах по трансформации нь.нагоыит ртзмидой рОШ ее никогда не удавалось выделить в неизменном виде, размер плазмид, перегрансформированных в е.соИ был больше, чем размер исходной рОШ.

Можно предположить, что участок промоторного района оперона рРНК Еь.на1оЫи.ш размером 450 п.о., прилегающий к гену 165 РНК и присутствующий в плазмидах роксн, роЬ'ЭЯ, ромн и рони, может обеспечить в лучшем случае нестабильное наследование соответствующих плазмид и что интеграция в эти плазмида дополнительных фрагментов ДНК (из промоторного района, например) необходима в общем случае для их стабилизации в клетках нь.ьагоыит.

XIX.ВЫВОДЫ.

1. Исследована возможность трансформации архебактерии вь.ьагс ыиа векторной плазмидой, содержащей мутантный оперон рРНК это! организма, обеспечивающий трансформированным клетка устойчивость антибиотикам тиострептону и анизомицину.

2. Доказано присутствие векторных плазмид в трансформировали клетках нь .Иаюыип, предполагающее возможность их автономной ре] ликации. ,

3. Показано, что присутствие фрагментов промоторного райо! оперона рРНК къ.ьлХоЫит в векторных плазмидах необходимо и дост точно для обеспечения их стабшгного наследования в галобактераал ии клетках.

4 Сконструирован ряд векторов для галобактерии пъ.на1аыи содержащих различные участки ДНК промоторного района оперона рРНК ген устойчивости к антибиотику мевинолину.

5. В ряде случаев показана возможность рекомбинации между ве торными и хромосомными последовательностями в клетках галобактери

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ ПО ТЕМВ ДИССЕРТАЦИИ

I. Kagrareanova Y.K., Derckaoheva И.I., Hankin A.3. The iomplete nuoleotida eequence of the arohaebaoterial plaemid pHSB trom Halobaoteriun, strain SB3 // Nuol.Aoids Reo. 1988, V. 16, p

И 58.

2 Kagramanova V.K., Derckaoheva H.I., llankin A.S. Unusual luoleotide eequenoe heterogeneity of small multicopy pHSB plasmid from Haiobaoterium strain SB3, an arohaebaoterium. // Can. J liorobiol. 1989, V.35, p.160-163.

3. Leviev 1.0., Derckaoheva N.I., Mankin A.S. Transformation 3f halophilio archaebaoteria. // Bilateral symposium USSR-PRO "Arohaebaoteria": Abstraots. - Tbilisi, 1990, - p.12

4. Каграманова B.K., Деркачева Н.И., Манышн А.С. Трансформация и векторные системы архебактерий. // Успехи современной Зиологии 1992, т.112, в.З, в печати.

ДЕШАЧЕВА НАДЕВДА ИГОРЕВНА КОНСТРУИРОВАН IE ВЕКТОРА ДЛЯ ГМОЭИШШХ АРХЕБАКТЕРИЙ

/Автореферат/

Подписано к печати 07.05.92 Формат 60x90 ГДб п.л. 1,2 Уч.изд.л.I.О Тирад 100 Заказ 236_

ротапринт МАСИЛЗТТЗ-ЗЮГ/,109280„Москва,Автозаводская,!6