Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ модулирующего действия ΔΨ на работу некоторых систем активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Ольга Валентиновна, Нижний Новгород

/

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского

ОРЛОВА Ольга Валентиновна

АНАЛИЗ МОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ Ду НА РАБОТУ НЕКОТОРЫХ СИСТЕМ АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА В ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - Физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: засл. деятель науки РФ, д.б.н., проф. Опритов В.А., к.б.н., доцент Калинин В.А.

На правах рукописи

Н.Новгород, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ............................................................................................6

Глава 1. Потенциал покоя клеток высших растений и его

функциональное значение ..................................................II

1.1. Природа потенциала покоя клеток высших растений II

1.1.1. Особенности потенциала покоя плазмалеммы 12

1.1.2. Природа пассивной компоненты потенциала покоя 14

1.1.3. Природа активной компоненты потенциала покоя 16

1.2. Роль потенциала покоя в функциональной активности плазмалеммы ..............................................................19

1.2.1. Потенциал покоя и физико-химическое состояние плазмалеммы ......................................................20

1.2.2. Потенциал покоя как регулятор пассивной проницаемости плазмалеммы ............................22

1.2.3. Потенциал покоя и работа первичных активных транспортных систем ............................................23

1.2.4. Потенциал покоя и вторичный активный транспорт 24

1.2.5. Роль потенциала покоя в работе мембраносвязанных ферментов ............................................................28

Глава 2. Объекты и методы исследования ....................................31

2.1. Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального

ультрацентрифугирования ..........................................32

2.2. Формирование искусственного Д\|/ на мембранах с

помощью К*-диффузионного потенциала ..........37

2.3. Определение Д\|/ и ДрН во фракции изолированных плазматических мембран методом флуоресцентных зондов 38

2.3.1. Измерение Д\|/ с помощью флуоресцентных зондов

АНС", ДСМ и сНз-Сз-(5) ..........................................38

2.3.2. Измерение ДрН с помощью флуоресцентного

зонда 9-аминоакридина........................................40

2.3.3. Определение ЭН-групп с помощью зонда

флуоресцеинмеркутиацетата....................41

2.4. Определение АТФазной активности во фракции изолированных плазматических мембран..........................42

2.4.1. Спектрофотометрический метод определения АТФазной активности с помощью

малахитового зеленого ..............................................42

2.4.2. Определение АТФазной активности методом

Лоури-Лопец ................................................................43

2.4.3. Люциферин-люциферазный метод определения

АТФазной активности ................................................44

2.5. Изучение вторичного активного транспорта сахарозы 45

2.5.1. Метод турбидиметрии ................................................45

2.5.2. Метод миллипоровой фильтрации ............................46

2.5.3. Изучение транспорта Сахаров в частично изолированных проводящих тканях растений по характеру биоэлектрических реакций ....................................................................47

2.6. Определение белка во фракции изолированных плазматических мембран методом Лоури ......................................................47

2.7. Статистическая обработка результатов ..............................48

Глава 3. Стабилизирующая роль АТФ-зависимого Н+-насоса в электрогенезе

плазматических мембран клеток высшего растения ..............49

3.1. Способность везикул генерировать пассивную компоненту потенциала покоя (Дц/о), представленную К*-

диффузионным потенциалом ....................... 50

3.2. Способность везикул генерировать активную (АТФ-зависимую) компоненту потенциала покоя ........................ 53

3.3. Стабилизирующая роль активной компоненты потенциала покоя

в электрогенезе везикул плазматических мембран ..........58

Глава 4. Модулирующее влияние ^-диффузионного потенциала на

гидролитическую активность Н+-АТФазы плазматических мембран

высшего растения в различных условиях ..................................62

4.1. Влияние мембранного потенциала на гидролитическую .... активность Н+-АТФазы при физиологически нормальной температуре (24°С) .................................. 63

4.2. Влияние мембранного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы при пониженной температуре (6°С) 67

4.3. Усиление влияния мембранного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы у растений, подвергнутых холодовому

закаливанию ......................................

Глава 5. Исследование роли мембранного потенциала во вторичном активном транспорте сахарозы в плазматических мембранах клеток высших

растений ............................................ л

5.1. Исследование биоэлектрических реакций клеток проводящих тканей высшего растения при

транспорте сахарозы ................................. 78

5.2. Изучение потенциал-зависимости транспорта сахарозы на везикулах плазматических мембран .................... 80

5.3. Анализ изменений мембранного потенциала, индуцированных транспортом сахарозы в везикулах плазмалеммы.......... 95

5.4. Влияние ^-диффузионного потенциала на конформационное состояние переносчика сахарозы везикул плазматических мембран (по анализу содержания свободных SH-групп)...... 98

Заключение..................................................... 102

Выводы ...................................................... ИЗ

Литература ....................................................115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

9-АА - 9-аминоакридин

АНС" -анилинонафталин-8-сульфонат

ДСМ - п-толуолсульфонат-4(п-диметиламиностирол)

ДЦКД - N, -дициклогексилкарбодиимид

КЦХФГ - карбонилцианид-(т)-хлорфенилгидразон

ПМ- плазматические мембраны

ФМА - флуоресцеинмеркуриацетат

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

сй8-Сз-(5) - 3,3-ди-пропил-2,2-тиодикарбоцианин

Е0 - диффузионная компонента потенциала покоя клетки

Етг - потенциал покоя клетки

Ер - электрогенная (активная) компонента потенциала покоя клетки

1фл - интенсивность флуоресценции

ДрН - разность концентраций ионов водорода

Ац> - мембранный потенциал (разность потенциалов) в везикулах ПМ Ду|/о - К^-диффузионный потенциал Дур - АТФ-зависимый потенциал

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что биоэлектрические потенциалы растений изучаются на протяжении весьма длительного времени и в этой области накоплен значительный экспериментальный материал, их функциональная роль остается очень слабо раскрытой. Имеются лишь отдельные исследования, в которых делаются попытки выяснить возможность участия биоэлектрических потенциалов в физиолого-биохимических и биофизических процессах у растений (Опритов и др., 1991; Gradmann et al., 1993; Медведев, 1996). Вместе с тем, становится все более очевидным, что разности биоэлектрических потенциалов на мембранах растительных клеток не могут быть безразличны для ряда процессов. К их числу следует отнести и процессы мембранного транспорта.

В последнее время появился ряд исследований, посвященных выяснению роли мембранного потенциала (Ау) в регуляции работы мембраносвязанных ферментных систем, в частности, Н+ -АТФазы плазматических мембран, которая способна выполнять функцию электрогенного Н+-насоса (Остроумов, Воробьев, 1976; Тимашев, 1981; Конев, 1987; Slayman, 1987; De Weer et al., 1988; Tsong et al., 1989; Треушников и др., 1994; Briskin et al., 1995). С помощью анализа вольт-амперных кривых активного транспорта Н+ было показано, что работа Н+-АТФазы как Н+-насоса является потенциал-зависимой (Slayman, 1987; Blatt, 1987; Briskin et al., 1995). В то же время остается неясным влияние А у на протекание реакции гидролиза АТФ, катализируемого Н+-АТФазой ПМ, в ходе которой освобождается энергия, используемая для активного транспорта Н+ через мембрану, хотя выяснение данного вопроса является не менее важным, чем доказательство потенциал-зависимости самого транспорта Н+.

Становится все более очевидным, что Лч|/ как универсальная конвертируемая форма энергии в клетке может принимать участие и в процессах вторичного активного транспорта (Опритов и др., 1991), в частности, вторичного активного транспорта сахарозы (Getz et al., 1987; Калинин, Опритов, 1989; Опритов и

др., 1991; Bush, 1993; Shakya, Sturm, 1998). Вместе с тем, данный вопрос исследован пока недостаточно. Так, до сих пор не ясно, какой этап переноса является потенциал-зависимым, как изменяется потенциал-зависимость транспорта сахарозы с изменением величины и знака Ау и т.д.

Для успешного выполнения вышеназванных функций мембранный потенциал должен поддерживаться на относительно высоком стационарном уровне. В клетках большое стабилизационное значение имеет связь электрогенеза ПМ с внутриклеточными системами метаболизма и регуляции (Reid et al., 1985; Hansen et al., 1987; Michelet, Boutry, 1995). Менее известно о значении собственно электрогенных систем, в частности, Н+-насоса (Н+-АТФазы) в стабилизации мембранного потенциала, хотя это представляется важным, поскольку возникающая при работе Н+ -насоса протондвижущая сила имеет значение для транспорта целого ряда потенциалопределяющих ионов (Максимов, 1989; Опритов и др., 1991; Michelet, Boutry, 1995).

Все вышеизложенное обусловило цель и задачи представленной работы.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы было выяснение роли Ац/ в функционировании систем первичного и вторичного активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1- оценка стабилизирующей роли АТФ-зависимого Н+-насоса (Н+-АТФазы) в электрогенезе плазмалеммы растительных клеток;

2- анализ модулирующего влияния Ду различной величины и знака на гидролитическую активность Н+-АТФазы и изменения потенциал-зависимости данной ферментной системы при холодовом закаливании растений;

3- установление роли Av|> разного знака и величины во вторичном активном транспорте сахарозы.

Большая часть исследований была выполнена на изолированной фракции везикул плазматических мембран (ПМ), что позволило наблюдать процессы пер-

вичного и вторичного активного транспорта без вмешательства внутриклеточного содержимого.

Основные элементы научной новизны. В результате проведенных исследований на фракции изолированных везикул ПМ установлено, что мембранный потенциал, возникающий как ^-диффузионный (А\[/0), не проявлял способности к сохранению постоянства своей исходной величины. Появление в составе мембранного потенциала АТФ-зависимой компоненты (А\[/р) приводило к стабилизации электрогенеза ПМ на некотором стационарном уровне.

Впервые показано стимулирующее влияние индуцированного валиноми-цином ^-диффузионного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы. Ограничение конформационной подвижности фермента при 6°С сопровождалось усилением потенциал-зависимости. Такой же эффект наблюдался и при холодовом закаливании растений озимой пшеницы.

На инвертированных везикулах ПМ установлена зависимость вторичного активного транспорта сахарозы от величины и знака К*-диффузионного мембранного потенциала. Основную роль в транспорте сахарозы играет А у со знаком «+» внутри везикул ПМ. При генерации на везикулах А\|/ отрицательного знака выход сахарозы реализуется через АрН. Существует быстрая (начальная) и релаксирующая фазы выхода сахарозы из везикул. Потенциал-зависимой является только начальная фаза. Релаксирующая фаза зависит от концентрации сахарозы во внешней среде. Кажущаяся константа транспорта (-Кт) сахарозы оказывается близкой к 5 мМ. Обе фазы ингибируются флоридзином.

Анализ содержания свободных БН-групп в везикулах ПМ с использованием блокатора транспорта сахарозы флоридзина свидетельствует об участии Ау в структурных перестройках, происходящих при транслокации мембраносвязан-ных переносчиков сахарозы.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты имеют значение для решения вопроса о функциональной роли мембранного потенциала в клетках высших растений. Обнаруженное усиление потенциал-зависимости работы Н+-АТФазы при холодовом закаливании растений вносит определенный вклад в

изучение механизмов регуляции работы данной ферментной системы при нахождении растений в режиме адаптации.

Положения, выносимые на защиту. Работа Н+-насоса (Н+-АТФазы) ПМ является одним из важных факторов стабилизации (автостабилизации) электроге-неза плазмалеммы растительных клеток, обеспечивающих надежность этого процесса в условиях физиологической нормы и при определенном отклонении от нее. Мембранный потенциал может выступать в качестве фактора, модулирующего гидролитическую активность Н+-АТФазы. Его влияние на работу фермента носит, по-видимому, организующий характер и тесно связано с конформацион-ной подвижностью фермента. Процедура холодового закаливания высших растений (на примере проростков озимой пшеницы) усиливает потенциал-зависимость гидролитической активности Н+-АТФазы. Вторичный активный транспорт сахарозы является электрогенным. Выход сахарозы из везикул происходит как при положительном («+» внутри инвертированных везикул), так и отрицательном значении А\|/ (в последнем случае реализация электрического градиента происходит через конверсию в АрН). Существует быстрая (начальная) и ре-лаксирующая фазы выхода из везикул сахарозы, причем потенциал-зависимой является только первая. Использование энергии Д\|/ в качестве движущей силы переноса сахарозы может реализовываться через конформационные изменения мембранных переносчиков.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 3 Всесоюзной конференции «Транспорт ассимилятов в растениях и проблема сахаронакопления» (Фрунзе, 1983), Международной конференции «Мембранный транспорт в растениях» (Прага, 1984), на 3 съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993), 3 ежегодном симпозиуме Российского общества физиологов растений «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), 2 Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998), а также на региональных конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объектов и методов исследования (2 глава), изложения полученных результатов и их обсуждения(3-5 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 7 таблиц, список литературы включает 230 названий, из которых 139 иностранных.

Глава 1. ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ЕГО

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ

1.1. Природа потенциала покоя клеток высших растений

К настоящему времени потенциал покоя исследован в наибольшей степени на животных клетках. Известно, что Emr животных клеток составляет до 100 мВ и может рассматриваться как алгебраическая сумма пассивной и активной составляющих . Пассивная компонента (Е0) формируется за счет диффузии ионов (в основном К1") и составляет более 50% от общей величины Emr. Активная (метаболическая) компонента (ЕР) возникает в основном за счет разделения зарядов при работе Ма+,К*-АТФазы. (Ohki, 1985).

Потенциал покоя клеток высших растений также имеет комплексную природу, связанную как с наличием двух составляющих Emr (ED и ЕР), так и со строением растительной клетки, различные мембранные структуры которой характеризуются собственными электрическими свойствами. К основным по-тенциалобразующим элементам растительной клетки можно отнести клеточную стенку, плазмалемму и тонопласт. Оценка электрических свойств митохондрий и хпоропластов представляет значительные методические трудности. Мало известно об электрических свойствах ядра и ряда других клеточных структур (Опритов и др., 1991).

Потенциал покоя клеточной стенки, измеренный с помощью микроэлектродов, составляет для высших растений величину порядка -20 -г -30 мВ (Chedhomme, Roña, 1988), причем известно, что вклад данного потенциала в общий измеряемый Emr клетки тем больше, чем плотнее контакт клеточной стенки и плазмалеммы (Юрин и др., 1977). Считают, что основной вклад в измеряемый Emr клетки вносит потенциал плазмалеммы. Величина его у высших растений нередко составляет около -130 4- -150 мВ (Etherton, Higinbotham, 1960; Вахмистров и др., 1974; Кларксон, 1978; Chedhomme, Roña, 1988; Опритов и

др., 1S91). Потенциал плазмалеммы, так же, как и клеточной стенки, имеет знак «-» относительно внешней среды. Результаты измерений потенциала то-нопласта показывают, что он имеет знак «+» по отношению к цитоплазме и составляет по данным микроэлектродных измерений 5 -н 20 мВ для изолированных вакуолей или 30 4- 40 мВ для интактных клеток (Bates et al., 1982; Ched-homme, Rona, 1988).

Уравнение для измерения Emr имеет вид :

Emr = Et rs /( rs+ Rt) + Epm ars /( ors + Rpm),

где Et и Epm - потенциалы покоя тонопласта и плазмалеммы соответственно, Rt - сопротивление тонопласта, Rpm - сопротивление плазмалеммы, rs - сопротивление шунта утечки, введенного электродом через мембрану, а - коэффициент, отличающий сопротивление шунта через плазмалемму от сопротивления шунта через тонопласт (Bates et al., 1982). Таким образом, Emr представляет из себя алгебраическую сумму потенциалов плазмалеммы и тонопласта и всегда отрицателен по знаку вследствие меньших величин потенциала тонопласта.

Растительные клетки отличаются высокими �