Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторная роль фосфолипидов в функционировании Hf-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляторная роль фосфолипидов в функционировании Hf-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНУ ИНСТИТУТ СИЗИ0Л0ГИИ РАСТЕНИЙ Я ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

НАСЦРОВА Рузель 4ургатовна

РЕГУЛЯГОРНАЯ РОЛЬ «ЮвОЛИПИДОВ В ФШЩЖШРОВАННИ Н+-АТФааы ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ КЕШРАН КЛЕТОК КОРНЕЙ КУКУРУЗЫ.

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени каадилатё биологических наук

Клей - 1992

Работа выполнена в Институте физиологии растений и генетики ÁÍi Украины

Научный руководитель: доктор биологических наук Т. А. ПАЛЛАДИНА

Официальные оппоненты; доктор биологических наук 0. А. КОСТЕРЮ!

кандидат биологических наук А. А. ОКАНЕНКО

Йейутее учреждение: Институт биохимии им. А. Н. laxa Ák rcdcf

"-'/ л "i

Зашита состоится " ч'.■" ^ «.-у- ' г- /\- íggs г.

fi "" часов На заседании специализированного совета

Д 016. Ы. Di при институте физиологии растений и генетики АН

Укракйь! йо адресу: 262iЁ? Киев, 127, ул. бзсильковская, 3Í/17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Института физиологии растений и генетики АН Украины.

Автореферат разослан ^ № '- /'■ <■ . {' ÁÍ992 г.

Ученый секретарь спеииалиаярованного совета

Актуальность проблем. Протонная ATîtiae» С Н+ - AJîaaa), функционирушэя и плазматических мембранах растительных клеток в 1шчестве алектрогенного протонного насосу, энергетически обеспечивает активный транспорт иоНов Й молекул, поддерживает определенное значение рН цитоплазмы, участвует в регуляции активности ряда ферментов клетки С Болдырев, 19B5¡ Serrar>o( 1990; GofTeau, 1990). Обусловливая жизнедеятельность и рост отдельной клетки, на уровне Целого организма Н+ -АТФоза контролирует такие важнейшие процессы, как минеральное питание растении, транспорт ассимилятов, а также, посредством участия П работе успичного аппарата листьев, - фотосинтез И транспирацню (Воробьев, 1988; Bush, 1989; Serrano, 1Q89, 1990). Таким образом, H* - ATЗала плазматических мембран является одним из ключевых ферментов растения, в свяан с чем она интенсивно изучается во всем мире. В последние годы были установлены в обиих чертах структура И свойства H+-AT4cau, которая относится к транспортным АНааам Ег Ёг-ТиНа (Serrano, 1984, 1990; Sussinan, Surowy, 1907).

В настоящее время и исследовании фермента на первый план надвигается регуляторный аспект. Для мембраносйяаанных фермгптоп, к числу которых относятся транспортные АТФеаы, большую роль играют изменения в ЛИпЯДНом окружении. Регуляция активности этих ферментов липиднЬми компонентами мембраны усиленно исследуется на клетках бактерий, грибов И животных органйамов (Болдырев, 1985; Островский, 1965; GofTeau, 1989). Еиясяемие принципов липидИой регуляции активности И*- ЛТЗсшн представляет НесомнеННый интерес для физиологов, изучающих попроси поглощения и транспорта элементов минерального питания, влияния физиологически - активных вевдастй И устойчивости растений.

Цель и аадачи исследования, Основная цель работы заклиналась ti установлении участия фосфолипидов в регуляции активности R* -AT Фаз и плазматических мембрай й выяснений основных закономерностей этого регуляторнаго процесса Для достижения поставленных целей решались следукдие задач«: 1. Получить фракцию очии^нных плазматических мелбран из корней кукуруз^, a ra¡ж солибилизирсваяные препараты ÍJ*-АГ4чаы, охарачтирНаоиать их фтссфолипидний состав и Н* -АТйаануо аКТКПНОСТЬ.

2. Определить значение отдельных классов фосфолйпидов для функционирования И -АТФааы (шимаТИчесКИх Мембран корней Кукуруза

3. ИоЛольвуя <йосфолипазЫ в качестве модификаторов липид -белковым ¿еаимодейстййй, изучить Ьтруктурйо-функционольные изменений лйййдйоГо Ьйслоя й Их влияние на активность II*

4. ЙссЛедойатЬ Ьлйяние Некоторых физиологически активных веществ На фосфолИйЙДНий состай и Н*-ЛИаэМую активность плазМйТЙЧесЫ* Мембран КЛеТок корней кукурузы.

Научйая Новизна рабо^У, В результате Проведенной работы Доказано ОЙЕШеИие фос^ю^йпнйоВ Ь обеспечении функционирования Н+ -АТ4ааУ ИЛазматИЧесйЙх МеМбраН клеток Корней кукурузы. Показана участие СтДеЛьйых кйассоб фосфоЛйЯидов 6 регуляции активности ферМеЙта. Ёпервь1е устайойлено Наличие Пограничных ЛЙНЙДЬй ЬойруГ Н+ -А'ГйааЫ Е плазматических мембранах ^йМйтеЛкНЫ* клеток И определена, что стеПейь жйдкостйости йоьраййчйия ЛйИйДов ИМееТ йеМаловажПое значение для функЦоНйраЫйия Этого фермента. Сказано, что фосфолипааа Аг вовлечейа в ^е^УлйЦйю активности Н4 -АТ&иы плазмалеммн й Установлено значение к этом Продуктов гидролиза фосфолипидов. ССНаружейо, что Модификация лиНйдного состава под воздействием фивиологй^ескй активных соединений, гербицида трйфлуралИна й стимулятора роста ивина, приводит к изменению Н* -АТвозНоЙ активности плазматических Мембран клеток корней кукурузы.

Теоретическое Й практическое значение работы. Ё Теоретическом отНошейИй ЬолуЧеянме результату расширяют имеющиеся представления о роли фосфоЛйпйдоВ в функционировании 11* -АТФваУ плазматических МенбраЙ растительных клеток. бделшШЫе б работе выводы И обобсрнйй позволяют оцеиить роль фосфо-липидного окружения Н * - АТйазы как фактора, регулирующего активность этого фермента и, соответственно, приближают к волее полному пониманию закономерностей осуществления физиологических функций в растительном организме. Полученные результаты позволяют уточнить механизм действия некоторых физиологически активных вешретв, что мотет явиться одним из

подходов к направленной регуляции активности Н+ -насоса плгшматических мембран.

В синаи со значением Н* - АТФвэн и протекании основных физиологических процессов в растительном Организме, в практическом отношении установленные закономерности могут явиться основой ддп разработки рациональных систем минерального питаний ргютений, а также уЧитыВсПЬся при использовании новых регуляторов роста И создании способов зашиты растений.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались Ha IV Украинском биохимической съезде (Днепропетровск, 1982); 2-ом Всесоюзном совец^шии по физиологии и биохимий кукурузы (Днепропетровск, 1984); 16~ой конференции ФЕЮ (Москва, 1084); IV Всесоюзной межуниверситетской конференции ho биологии клетки (Тбилиси, 1987); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1089); 8-ой международном рабочем совешднии "Мембранный транспорт В растениях" (Венеция, 1989); 19-ой конференции ш» (Рим,1989)! 12-ом ЛоНг-Эштонеком международном сйШюзИуМе 'транспортные и ренепторные белки растительных мембран" (Бристоль, 1991). Публикации. По Материалам диссертации опубликовано 16 работ, отражающих основные положения диссертаций. Объем И структура работы. Диссерта1^й состоит из введения, обзора литературы, описания материалов й методов, Излоиэния собственных Исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитй|»ванИоЙ литературы. Диссертация Иалоиена на 146 страницах Машинописного текста и содержит 25 рисунков и 16 таблиц. Список литературы включает 211 работ отечественных й зарубежных авторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и метод» исследований. Объектов для получения плазматических мембран слуяили корни 8-дневных этиолированных проростков кукурузы сорго-линейного гибрида Днепровский 147 MB. вырапкнннх при 2С*С на 1.0 ММ растЕоре CaS04.

Препараты плазматических • мембран выделяли кз микросоМ'.шьноя фракции центрифугированием ее в ступенчатом

Градиенте плотности Сахарозы (Leonard, Van Der Woude,1976) в ЦаНюй модификации (ЙасЫрова И др. ,1991). Солшбилинацию Hf -ATtastí проводили с Помощью Цвиттерйойных детергентов -11виттергеИта 3-14 й диэофосфптйдилхолина (Set-r-ano, 1984).

ЛипидЫ ЙлаэмйтйЧесКйх Мембран Ьыделялй модифицированным методой ЁЛУЯй И ftiflepä в нашей Модификации (Палладина, ItäclJpcma, 1ÖB4). Суммарный липйдЫ разделяли на Классы путем ДВуМерЙой ТСХ (vaskovsky¡ T&rekhova, ig79) и идентифицировали С ttoMoiitblo каЧеОт^ейнЫХ реаКЦЙЙ (Vaskovsky, Latysliev, 19V£j; Йей+с* 197С), КоЛИЧеСТЙо фосфолИнйдоВ определяли По Рн , обраэойавШеМусй После йх сжйганйя (Vari Veldhoven, 1987). ЖИрЙИе ЙИсЛотЫ аналШзйроВаЛй В вйде меТИлоВЫХ яфйрои методом raao - кйДкосФйой хроматоВрафйИ (СИняк й др., 1970). ДинаМИчеЬкйе сйййства ЛМЙЙДОй йлазмалемми йсследопалй методом ейейтро^уорйметрйй ilö йодВйжности ^уоресцеитног-о аонда üiipeHá Дай OÖHfipjteMUri структурной йеоднородйостй ЛинИдного бЙСдОЯ ЬрйМейЯЛМ Метод Ийдунтйвйо-резойайсного переноса эйергйи fc хроМофороЙ возбужденных белков йа Молекулы йирейа \$ер)^Йой И Др. i 1902). Н4-АТФвзйую активность рассЧитыяалй по приросту содержаний в йробах Рн, который определяли по (Rathbu,4 Betiach,19S9) В нашей Модификации (Pedchehko et al.» Í99ü). Содержание белка в препаратах плазматических Мембран определяли Во Методу Ерэдфорд (Bradford, 1975).

В экейеримейтах йсйольёоВали Препараты фэсфолипааы d Из редьки Черйой И фосфоДиНазЫ Аг Из яда кобры. Препараты плазматических мембран экспонировали с фосфолйпааами А2и D (0.01 Мкг/Мг й 0. 05 МкГ/мг Мембранного белка соответственно) В Б0 WÜ кэс-трис буфере» содержавшем 20 Mkí СаС1г, После чего мембраны, осаждали-Центрифугированием При 14Ь. ОТО g 6 ТеЧенйе 30 мин,. Осадок ресусПендиропали В МЭС-трис буфере, алИКвоты отбирали для экст{агировайЙя лиПидоВ, и также дли определения Н^-АТСааной активности.

Для реактиваций ¡tf-АКоаы фосфолипидЫ Исполъаовали в виде липосом, KoTopiie получали путем диспергирования ультразвуком.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3. Фосфолинидный состав и АТФааная активность плазматических мембран клеток корней кукурузы.

В препаратах плазматических мембран, наделенных из корней проростков кукурузы установлено присутствие фосфолипидов, принадлежащих к б классам. В наибольших количествах были представлены цвиттерионные фосфолиПИды - фосфатидилхолин (ФХ) - 4!5. II н фос^тидилзтаноламйн (СКЭА) - 23.42, в меньших -фосфатидилглицерин (1>Г) - 10. ЗХ, фосфатидилиноаит (ФИ) - 8.9Х и фос^тидилсерин (<tC) - 2.2%, Таким образом, на долй фосфолипидов, лесу|цих отрицательно заряженные полярные группы, приходилось немногим более 20%. Было отмечена значительное содержание фосфатидной кислоты (ФК) в нативннх препаратах плазматических мембран - 9.2%, что объясняется присутствием в них пысокоактивной фосфолилааы D. В препаратах обнаружено также небольшое количество лизофосфатидилхолинг! (лИзоФХ) - 0.9%.

Анализ яирнокислотного состава как общей лйпидной фракций плазматических Мембран, так и отдельны* фосфолйПИдоЬ, показов доминирование Пальмитиноной (С15:0) И лийолейой (С18.-2) КИСЛОТ.

Фосфэгйдролазная активность в препаратах Плазматически* мембран клеток корней кукурузы была Представлена преимущественно Н'-АТЗнаой, которая обладала характерными для этого фермента свойствами; субстратом реакции являлся комплекс Msj-АТФ, pll-оПтимум работы фермента соответствовал 6.6, присутствие в среде реакций 0.1 мМ ванадата, ингибитора транспортных АТСоз Е1.Ег-тйпа, снижало скорость гидролиза АТ# препаратами плазматических мембран на 50%. 2. Влияние солрбилйзации на АТДпзнуп активность и фосфолипидный состав препаратов.

Для солтбилизации Н* -АТЗезы использовали два цвитте-рионных детергента - синтетический ПвИттергент 3-14 и природный - лизсФХ.

Предварительная обработка препаратов плазматических

мембран Тритоном Х-100 вызывала удаление примерно 1/3 белков, в основном, периферических. Это сопрововдадосЬ усилением Н+-ЛТФааноЙ вктйННости ва счет повышения доступности каталитических Центров Молекул фермента для субстрата . После солюбилйза^й фермейта с помощью цвиттерионных детергентов терялосЬ ДО 90Х белка, присутствовавшего в Исходном Препарате, в to время как М+ - АТ5«аная активность солюОИДИзата резко возрастала. Солюбилиаация лйзоФХ приводила К получению Солее актинйых Препаратов, Чем при использовании Цвиттергента 3-14.

Солюбилиаация Hf -АТввды сопровождалась потерей фосфо-липидов И изменением Их состава (табл. 1).

Таблица 1.

Фосфолипидиый состав препаратов Н+-АТФазы ПрМ солюбИлиэации.

Содержание фосфолипйдов (% к сумме) ФэсфолипйдЫ Плааматич. Тритон Цвиттергент ЛизоФХ

МеМбргШЫ Х-100 3-14

ФХ 46.2*1.2 24. 2±1. 4 8. 3*1.0 2В. 9*1. 5

«ЗА 22. 711.1 1В. 1*0. В 5.1*0. 6 15. 5+1.2

ФИ 9. 0*0. 5 14. 7*0. 3 77. 8*1.8* 25. 510. 7

ФГ 10. 4*0. 8 14. 8*1. 3 4.1*0. 5 12. 2*0. 8

ОС 3.1*0.4 8. 6*0. 9 * 21.Oil. 8

ФК 8. 4*1.0 16.5*1.2 4. 6t0. 7 -

ЛизоФХ 1.2*0. В 3.1*0. 4 - **

* Хроматографические зоны ФИ и ОС совмещены.

**Количост1ю лизоФХ 22.6 мкг на мл препарата (содержание по отношению к другим фосфолшшдам не"определялось).

(Госфол'ипидныЯ состав препаратов, солюбилизировантк Цвиттергентом 3-14, был представлен преимущественно ФИ и <ЗС. В препаратах Н* -АТФозы, солюбилизиротанннх лизоФХ, такжп отмечалось резкое увеличение этих фосфолипидов, однако, п них В значительной мере сохранились и другие фосфолипидн. Б обоих

случаях нами впервые было отмечено снижение доли ФХ, причем доминирующими становились отрицательно впряженные ''кислые" фосфолипидн - ФИ и ТС.

0. Реактивация солюбилизированной Н*-АТфцаы.

С целью выяснения значения определенных классов фосфолинидов для функционирования Н'-АТЗшы исследовалась их способность реактивировать препараты, солюбилиаиронанные с помощью Цвиттергента Я-14, так как препараты, солюби-лиаированные лиэоС'Х, не нуждались в добавке фосфолипидов для достижения максимальной активности. А

60

40

.ПО -

¡SS0

о

10

Контр. * ** ЗС ФХ 1-й ЛизоФХ Гис. 1 Реактивация солюбилиэированной Н'-АПазн фосфолипидами.

* - липосомы из азолектина.

** - липосомы из фосфолипидов плазматических мембран

Сравнение реактивирующего действия отдельных фосфолилидов и их смесей на Н+-АТ1взную активность показало, что наибольшим эффектом обладали азолектнн (суммарные фосфолипиди сои) и Фракция эндогенных фосфолипидов, выделенных из плазматических Мембран корней кукурузы (рис.1). Средй отдельных адассов фосфолипидов наиболее сильный реактивирупццм действием отличался ФХ, что согласуется с результатами других авторов (Kasara, Houchl, 1987; Serrano et al., 1933). ЛизоФХ вызывал Оол?ч сильную активацию, чей фгс^шипидн, что mowt объясняться его специфическим эффекте«

На Н*- АТФозу.

4. Влияние фосфодипаз А^ и Р на фосфоличидный состав и Н^-АТДазную активность плазматических мембранГ Экзогенные фосфолипазы, модифицирующие фосфолипидный ростав мембран, использовались нами в первую очередь как Инструмент для Изучения влияния физико-химического состояния Оислоя на активность Н+-АТФоаы. Одновременно ато позволяло выяснить,Каким образом эндогенные фосфолипазы, которым в настойшре время уделяется большое внимание н связи с их участием Ь трансдукциИ сигналов Через плазматические мембраны, Могут регулировать активность Й'*-АТ1оаы.

Препараты плазматических мембран экспонировали с фосфолипазамИ Аг и П в течение 30 мин. при 1:0" С. Анализ фосфолипйдноГо состава препаратов после воздействия фосфолипазы ¿¿показал, что гидролизу в рапной мере подверглись Все классы фосфолйпйдоВ, тогда Как фосфолиназа 1) вызывала расщепление Преимущественно ФХ и, в меньшей мере, ЗОЛ, что сопровождалось Накоплением ФК

Экспозиция препаратов плазматических мембран с фосфолипазой 0 в течение 30 мин. приводила к ингибиропамш их Н+ -АТФазной активности. При исследовании влияния длительности экспозиций фосфолипазы Аг на Н+-АТ&юную активность было показано, что в течение первых 15 мин. экспозиции 'активность фермента возрастала, тогда как более длительное воздействие фосфолипазы приводило к

прогрессирующему ингибиршзанию Н+-АТФазы.

Ми реактивировали потерявшую активность Н+ -АТЗезу при помощи экзогенных фосфшшпидсш. В случае экспозиции плазматических мембран с фосфолипазой Г), их АТФозная актив-кость после репссоциащго с ФХ составила 3/4 исходной, тогда как в случае обработки фосфолипазой Аг 11+-АТ1шную активность восстановить не удалось. По нашему мнению, это может быть обусловлено либо значительными нарушениями физико-химической структуры мембраны, затрагивающими гидрофобную часть бислоя, либо накоплением свободных жирных кислот, способных тормозит) активность Н+-АТ1озы.

Б. Влияние жирных кислот И диаофосфатидилхолина Hà свойства

!I*-AÎ<fe3U.

Изменение Н -АТСазной актйвности ПОД воздействием фосфолипаа можот битв обусловлено Модификаций фиайко -химических спойств плазматических мембран, вйзЫВаИНой Появлением продуктов гидролитического расщепления фОпЗшйпйдов. Поэтому мы исследовгиш влияние продуктов катализируемого фосфолипааой Ае гидролиаа <t>X, основного фосфолйпида плазматических мембран клеток корйей кукурузы, Йа айТйпйость ^АТФнзы и ряд ее свойств. В опытах Ш йейользовалй ЛйзоФХ, а также ненасыщенные С18 - жирных кйелотЫ.

Присутствие жирных кислот в среде реакций сдвигало рН- оптимум И1' -АТ<£аэы в нейт^ад^йую область, вызывая сглаживание его лика, так что При рН В. В ужа отмечалось ингибирование. При возрастании концентраций лйнЬДевой кислоты ее ингибирущий аффект на Н4" - Atisay а препаратах

25

20-

15

10-

Рис, 2. Измейение ак-тйвййс1'й Н+-АТФазы под воздействиём лиэо®Х(» ), ллнолевой кислоты (+) и их сМесй (»).

-|--1-г~

0 10 20

30

~40 50 «ГмкМ

плазматических мембран прогрессирующе усиливался. Напротив, лизоФХ стимулировал Н+- АТЮау (рйс. 2).

Нами изучалось совместное возДейстйие йа Н4- АТФазнус активность лизоФХ й линолевой кйсйотУ в аКвимолйрных количествах, rai; это имеет Моею при гидролизе ФХ фэсфолипазой в плазматических Уембрайах. НрИ низких

концентрациях атих соединений наблюдалась активация Н+ -АТФешы, то есть аффект лизоФХ. При повышенных концентрациях превалировала ингибирукхцее влияние «ирной кислоты.

Изучение воздействия дивоФХ на свойства Н+ - АТФазы в Препаратах плазматических мембран показало, что он не сдвигал рН-оптимума фермента й не Влиял на чувствительность Н*-АТ1вэы к ее специфическому Ингибитору ванадату, однако усиливал сродство Н+- АТ1еаы к своему субстрату - К^-АТФ.

6, Динамические свойства липидоэ плазматических мембран Клеток корней кукурузы.

Для функционирования транспортной Н+- АТФавы плазматических мембраМ, являющейся интегральным белком, большое вначение должна иметь микровязкость ее липидного окружения. Поэтому мЫ попытались выяснить вависимость функционирования этого фермента от динамических свойств липидов бислоя.

О микровявкости липидного бислоя судили по степени образования аксимеров флуоресцентного зонда пирена (Добре-цов, 1989). Возбуждение триптофанилов белков светом с X = £85ны Приводило к переносу энергии на молекулы зонда, расположенных на расстоянии З-б слоев фосфолипидннх молекул вокруг белка, тогда как при длине волны 338 нм возбуждалась вся поПуляцйя НйреНа в Мембранах. Па основании аналива спектров флуоресЦеНЦии пиреНа в мембранах нами показана Ьниженная подвижность И менее полярное окружение Молекул бонда в непосредственной близости от белка по сравнению с Ьбицм липйдным бислоем. Найденные различия в динамических характеристиках для двух популяций аонда адекватно отражают существование отлйчной Но своим физическим свойствам от оОодзго Сйслоя липидной области, примыкающей к интегральным белкам плазматических меМбран.

Испольвуя специфический субстрат - АТФ , а также ингибитор ванвдаг, было показано, что конфирмационные перестройки и молекуле - АТФааы Приводят, вегоятно, к изменению количества трипто^ановых остатков, участвующих в переносе энергии На пирсн (табл. 2).

Таким образом, нам впервые удалось обнаружить на

Таблица 2.

Влияние АТФ и АДФ на флуоресценции пиреиа в препаратах плазматических мембран из корйей Кукуруз Н.

Варианты Интенсивность флуореоЦенЦММ (X К Контр.)

опыта 333 нм &В5 нМ

АТФ 92. 9 i 2. 4 67. Ü 1 Э. t)

АТФ + ванадат - i&L 2 ± ё. ё

АДФ 96. A i 2.3 71. 0 í 1.9

АДФ + нгшздат - 127. б i 3.1

растительном объекте наличие пограничного фосфоЛИпмдного слоя вокруг молекулы Н*- ЛМозы.

7. Изменение динамических свойстб лйпидноГо Ьисдоя под действием фосфолипйа Аа И Ь. Мы изучали изменения динамического Состояния липидов мембран в общем бислэе мембраны й В области пограничных липидов, возникающие в результате йоздайствйй фосфолипаз. Экспозиция препаратов плазматически* с фосфолипалой

оС

и 0.26

0. 24

0. 20-

t

У.

л

У

о. la-

tí. ia-

0.14-

0 20 40 60 80 0 20 40 СО 80 100

{ , мин. t , мий.

Рис. 3. Влияние фосфолипаз на эксимеризацйю пирейа в йлазма-тических мембранах ( X воаб. - 286 иМ). а - ^офолипаоа , б - фосфолйпаза D. Здесь, и в случае рис. 4, Л. - , ГДе Г,3, - интенсив-

ность флуоресценции мономеров, a F0js - интенсивность флуоресценции эксимероп мирена.

- IE -

A¿ приводила к повышению эксимериэации пнрена В результате увеличения его лодвижносуи. Напротив, фосфолипаза D снижала цодвииюст^ флуоресцентного зонда в мембране (рис. 3 а и б). Это указывает , Ч1Р фосфолипаза Ад уменьшала микровязкость бисло« В Обдаэтй ПоГрайИЧнЫ* ЛМПИДОВ, тогда нак фосфолипааа D Оказывал^ Ms вту область противоположное действие.

Иаменецйе микровийксстй Пограничного слоя под влиянием фоофодкпаа Йорло СцтЬ результатом непосредственного воздействий йродуктов Гидролитического расщепления фосфолипйдой На Дййа^иЧескйе Свойства мембраны. Свободные жирные Кислоты, во мере возрастания их концентраций, вНаЫваДИ прогрессирующее усиление эксимеривации гшрена, которое саЙДетеЛЬствойало об уменьшении микровязкости Сйслой 6 пограничной области (рис. 4). ЛизоФХ не влиял на дйнамичеркие свойства бисЛой. Эти реаультаты, а также данные о его воздейстбйй йа кинетические характеристики Н+- АТФааы, ПоаволИлЛ ЙеЩ предположить, Что лиаоФХ непосредственно Воздействует На белковуй молекулу Н+ - АТФааы. Это Подтверждает предволомэнйе, что лиаоФХ переводит фермент

0.64 О. Б0-0. 4В-

• - лизоФХ

+ - линолевая кислота х - линоленовая кислота

Авовб. - 285 им

0 10 £0 00 40 50 60 мкМ Рис. 4. Влйяние лйаофосфатйдмдхолина и свободных жирных кислот на зксИмериаацию пирепа

в более активную форму (Serrano, 1S90).

Иэлучэнные Дамйые Позволяет говорить о том, что влияние фосфолмпааы Ар на активность Н1" - AT Ian ы осуществляется,

очевидно, как путем прямого воздействия образовавшихся лизоформ фосфолипидов на lt+ -Attoyj Й посредством

изменения динамического состояний Иогранйййон! ЬЛоЙ ЛИйиДов под воздействием свободных кИрнЫх КйсДоТ. в. Нлияпие физиологически АКТИВНЫХ feeciectfe На ЛЙПИД -белковые взаимодействия в плазматйчеЬИй» МеМбреНаХ laíelon корней кукуруз».

В целях выяснения возможной фйзйологй^еейой рОЛЙ ДИПИДНой регуляции Н+-АТ1ипн нлгюматм^еекйх MétJetiail, Ш йссЛеДойалй действие двух фиаиологиЧескИ ElktHBÍilix веЬэстЬ - ГйрбйЦйда трифлурнлина и активатора роста UbHitd.

Иредпсходовнй гербицйд трифЛураййЙ t ДейстйуШре йейвство --JJA-трифТор -2,6- динитро- N,N- ИроНиА- р-тоДуМДйН), ИсНоль-вуклнийся для уничтожения йлакЬВЫХ coplirikbB¡ тор(ио8ЙЛ И'1 -АТФазную активность плазматичесКЙх меМб^ай tWeiok ИорнеП кукуруаы.

Обработка трифлуралином (БлЮ^М) сеМяй кукурузы вызывала также значительную модификацию фосфолИЙИдНоЫ Состава плазматических мембран, которая емТраГЙЬйЛЕ! Все классы фосфолипидов (рис.0, А). На осйовайии харак+ера Измейеййй фосфолипидного состава можно Предположить, Что влййнйе трифлургишна могло в определенной Мере с1су!1(ествляться Путем активации эндогенных фосфолипаз Ла й 0.

Стимулятор роста растений Ивий (2,6-дИметИЛПИрИдйН N-оксид) Повышал Hv- АТФазную активность в препаратах Плазматических мембран клеток корней кукурувУ При Применении как in vivo, так И in vitro (Палладййа й др. , 1991).

Обработка семян кукурузU HitUÜtítí (io'^il) Также приводила И изменению фосфолипидного состава плазматических мембран, выделенных из корней проростков кукурузы (рйс. В,Ё). При этом отмечено снижение содержаний do( Йрй одйовреМеНЙоМ Возрастаний доли TOA. Повышенное содержайЙе 1>К свидетельствовало, что обработка иВйном ВЫзЫЬалё аКТййЕЩИю эНДогбЙНОЙ ^осфолипаэы D, способной катаЛИзИрова!^ Нэ только ГЙдроДйв, но и взаимопревращение фосфолипидов. ИзМеЙеЙИя фосфолйпидногО состава плазматических мсмбрай GiüiH lileHeé значительными, чем при использовании трифлуралййй и, очевидно,Не Приводили к

150 40-ао-2010

X Й

✓

/

/

✓

/

✓

ФХ «НА <Ы

✓ ✓

- X

д,

гЬ

Д1Ч

¿¿и

ФГ 40 ФК лФХ

ФХ <ЮА ФИ ФГ. 1С ФК ЛФХ

Рис.Б. Влияние гри&луралина (А) и ивина (Б) на фосфолипйдный состав Плазматических Мембран. | I - контроль, - трифлуралин,}/.у.У | - ивин

вначительным Нарушениям бислоя. Полученные результаты Подтверждают участие фосфоЛИпаэ в регуляции Н*- АТФазной активности Плазматических Мембран.

Таким образой, На оснований полученных результатов можно утверждать, ЧТо фосфолипиды имеют исключительно важное вначейие Ь функционирований Н4- АТФазы. Модификация липидного окружения Н+-АТ1ааЫ, осуществляемая эндогенными фосфолипааами путем изменения качественного состава фосфолипидов Бислоя и динамических свойств пограничных липидов, может лежать в оснойе направленной регуляции активности И+ - насоса Плазматических Мембран растительных клеток.

вывода

1, Фосфолипиды плазматических мембран клеток корней кукурузы Представлены 6 классами, среди которых доминировал фосфатидилхолИН. В качестве минорного компонента отмечено присутствие лйзофосфатйдилхолина.

2. ШказаНо, что Дели Лидирование препаратов плазматических момвран И йвменейив Их фосфолипидного состава детергентами и экзогенными фэсфоднпазами А. и О приводило к модификации

фосфогидролатшй активности транспортной Н* - ATtoaü. Это свидетельствовало о лиПйдзаййсйМос^И аТоГО фермента.

3. Установлено, что в хоДе солюбилйзации Н+ - ATtöaU происходило уменьшение соДержШЖя фосфаТЙД(Шо.КИНа И возрастание доли фосфатидилиноэйта И фосфат И дйЛС<5рВДЕ1.

4. На основании исследований СТруктурЙ0-Дй11аМИЧёсМ< свойств бислоя плазматических Мембрай обнаружена fehl HeOftlWiJOflHbctt. И выявлен слой пограничных Лййй^й ЁОНруР ШвнумИ Hf- АТФпзц.

5. Показано, что фосфолипаза ДАактйьйро®айа H^-Attesyi а йрй увеличении времени ЕоздейстпЙЯ MfMöHpöfcäJiä ein teäjläf-идилхолин реактиниропал И'-АТМз? tlpeitapatofcj эИсНоЙЙронаНнйх с фосфолиназой D, но не Aa. .VcTatioBJieliö, ЧТО фьсфО-МЙаза Лц1 в противоположность фосфолипазе Ö, увелйчййао!1 ФейучеЬТЬ фосфолипидов пограничного слоя.

(у. Выяснено, что фосфолиИаза А^модифицирует akTtitiHocib Й*-АТФаэы посредством влияния Продуктов гидролитического разложения фое^слипидон. Лизофосфй+Мдйлхьлйн ¡¡ейосредстйейнс вааимодействует с молекулой Й4 -Aitestij Йё влияя Hs пограничные липидЫ, а жириУе кИсЛоТь!, ЫшяУвавдиэ ингибирующее действие На ферМейт, рЬйуНорйЙЬЧИЫй* слой пограничных фосфолилйдов.

7. Изучение действия ксенобиотиков - ^еЬЭМЦЙДЙ Трйфлуралийа й ростового стимулятора йвИНй Йоказало, Uro первый иа них ингибировал Н+-АТФаау, а второй ак*йвироваЛ ее. Г1рй зтоМ фосфолипидннй состав плазматических мембран йзмейялей я результате стимуляции эндогенных фосфолййаз А^й D.

Список работ, опубликований по теме Диссертаций.

1. Палад1На Т. А., Насирова Г. Ф. ЕИзНачейНя рол1 фосфолпмдного складу плаамалеми рослйннйх кЛ1*Йй у активному транспорт! ioHlB //IV Украшський OioxlM. а' 1йД! тез. ДОН., Днтропетровськ, 1982. - с. 162.

2. Иасырова Г. ф., Палладий» Т. А. 4ЬсфолМЙиД1ЫЙ состав плазматических мембран клеток корней пророегкой кукурузы //Физиология растений. - 1984. - Т. 31, й. 2. - Ö. 351-555.

а Наснрова Г. Ф., Палладийа Т. А. , tfeipoba Й. В Влияние

repOflWRa триФ^Урал^Н^ На активность Н*-АТФазы плазматических (лембраН чувствительных и устойчивых растений //Докл.

АН СССР. - J684. - f, 276, N 2. - С. 511-612. 4. Шлладина Т. А., ¡¡¿»сиропа Г. Ф. , Петрова IL В Специфические Свойству транспортной Н+-АТЗады плазматических мембран растительных клеток //16-я конференция ФЕЮ; тез. докл., Москва, 10В4. - С. 344.

Б. Палладина т. А. , Насирора Г. Ф. , Петрова 1L В. Влияние фосфолипазы fl На активность Н'-АТашы и фосфплипидный состав цлазмалеммы клеток корней кукурузы //Фиаиолого -биохимические основы Повышении продуктивности кукурузы; Tea. докл. 2 Всесоющ!. соцещ. по физиологии кукурузы, Днепропетровск, 1004- - С- Iffi-lOS.

6. Щлладина Т. А., Иасыроаа Г. Ф. Действие фосфолипаз Аги Д на гцазиатйчесцие Мембраны клеток корней кукурузы //Докл. Ail УССР. Сер. Ьиод. - 10В6. - N 7. - С. 71-73.

7. ПедчеНко В. it , 1]алладинз Т. А., Насырова Г. Ф. Некоторые биохимические характеристики Н^АТФааы плазматических мембран Клеток ¡гарней кукурузЫ //V Всесоюэн. межуниверситетская конф. "Биология клетки"; теа.докл. , Тбилиси, 198*?. - 0.347-348.

8. Pall ad ¡па Т. А. , pedcberiko 'V. К. , Nasirova G. F. , Snnchuk Е. Ё. Lipid dependence of plasma membrane H*-ATPase//14 Intern. Biochem. Congress; Reports, Prague, 1S88. - P. 124.

9. Nasirova 0. j\ , PaJladina T. A., Pedchenko V. K. Lipid-protein interactions in plasma mentoranes of" plant cells //(ntern. synp. "Цз1всц1аг organization or biological structures"; abstr., ibscow, 1989. - P. ББ.

10. Paljadina T. A. , Pedchenko V.K. , Nasirova G. F. Lipid dependence of soltibiliEed ll'-ATPase preparations from plant plasm meirbrariss //19-Ui Meeting of FEBS; Abstr. , Rone, 19B9. - TH 349.

11. Palladina T. A. , Nasirova G. F., PedcU:nko V.K. Effects of ptiosphol i pases on plasma immbrane vesicles from coin see.il me roots /Plant m?mbr. tt-ansport: tlx' current posit ion: Elseveir Amsterdam- New York- Oxford, 1889. - P. 115-116.

12. Pall ad I ha t. A. , Nasirova IF., Pedchenko V. K. Effects of

plwspholi pases on plasma membrane vesicles from corn seedling roots /Plant mentor, transport: the current position: Elsevier AjmtrdnirrNew York-Oxrord, ,1989. - P. 115-118.

13. Palladlna Т.Д., Nasirova G.F., Pedchenko V. K. I.ipid-protein interaction in plasma menbrarie of pl&ht cells // III R]ropean Congress оГ Cell Biology; abstr., Florence,

1990. - P. 34

14. Pedchenko V. K., Nasirova Q. F., Palladlna t. A. Lyso-|)ho'~.phat idylclolinc specifically stimulates plasma metnbrane H* ATPa- :>:• f rom oorri roots //FEBS Letters. -1990. - v. 276,

U 1 Г. P. 20П-20Я

15. Hacupona Г. Ф., Капрольянц А. С., Палладина Т. А. Влияние |}юс|{'>линазм Aj на динамические свойства лйпйдиого бйслоя плазматических мембран растительных клеток //fevtoxnwtn. -

1991. - T.tiFi. п. 7. - С. 1264-1271

К'., i'.il ladina Т. A., Nasirova G. F,, Pedchenko V. k. . Simchuk U.K. Participation of plasma membrane lipids in Hf-ATPase i fgulatioti //12-th Long Ashton Intern. Synfc. ''transport and liccoptor Proteins or Plant Ktembranes" ; abstr., Bristol, 1991. - P. 54

Иода, и ш;ч. U4.0¿.92. ¿ормат 60x84/15. Бумага тип. Офс. печать. У'.:л.иоч.л. 1,10. Уоллф.-отт. 1,16. Уч.-изд.л. 0,95. Тираж 100

тез. Oí]-.. 40 . t Ьишшатно.__

стпичзтпно л Институте математики ЛИ Украины; Zb'J¿Ll linen 4, It'll, ул. Репина, 3