Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экто и эндо АТФазы плазмалеммы корневых клеток и действие на них синтетических аналогов фитогормонов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Экто и эндо АТФазы плазмалеммы корневых клеток и действие на них синтетических аналогов фитогормонов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

^ ^ д Па правах рукопасп

3 ; * ТИХАЯ Наталия Иосифовна

УДК 581.12

ЭКТО II ЭНДО АТФазы ПЛЛЗМАЛЕММЫ КОРНЕВЫХ КЛЕТОК II ДЕЙСТВИЕ ИЛ НИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ФНТОГОРМОПОВ

Специальность 03.00.12 — физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории корневого питания Института Физиологии растений РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ПОЛЕВОЙ В. В., доктор биологических наук 'КОРАБЛЕВА II. П., доктор биологических наук ГЛЕБОВ Р. Н.

Ведущая организация — Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, г. Москва.

Здщита диссертации состоится «....."^........» нюня 1994 г.

в часов на заседании специализированного совета

Д 002.45.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора паук при Институте Физиологии растении имени К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии растении РАН.

Автореферат разослан «..<#..'..» апреля 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук II. В. ЗАГОСКИНА

В познании биохимической адаптации растительных организмов к изме нению ионного состава окружающей среды важное значение имеет изучение. ферментов, в частности АТФаз, локализованных на внешней и на внутренней поверхностях плазмалеммы, поскольку эти ферменты, на наш взгляд, могут принимать участие в поддержании гомеостаза апопласта и внутрик- ' леточного пространства.

Анализ литературных данных показал, что большое число публикаций посвящено изучению в растительных клетках эндо АТФаз, тогда как функционирование зкто АТФаз до сих пор вообще не затронуто изучением, если 'не считать работ по внеклеточной фосфатазной активности корней (Купре-вич, 1954, Ратнер, 1955, Выскребенцева, Семенов, 1976, Shoeler at al.,

1979, DuPont, Hurknan, IS34, Lee, 1988).

Мо:;зю допустить, что на внешней поверхности плазмалеммы корневых клеток функционирует зкто АТФаза, которая принимает участие в регуляции уровня внеклеточной АТФ, используемой, с одной стороны, в -качестве субстрата для экто ПКаз, а, с другой стороны, для образования аденози-на, участвующего в регуляции ряда процессов, протекающих в апопласте и цитозоле. ■

В зтсЯ связи вахно подчеркнуть, что в отличие от растительных клеток, на внесшей поверхности плазмалеклы клеток большого числа гсивотных объектов были обнаружены зкто АТФаза;(líagy, IS86), пуринорецепторы (Бернсток, IS33) и зкто ПКазы (Dnssnbsry et al,, 1988).

Поэтому пре:;сде всего следовало было заполнить тот пробел, который имеется в изучении зкто АТФаз поверхностной цитоплазматической мембраны растительных клеток.

Поскольку регуляция ферментов находится под строгим гормональны» контролем и по современны?! представлениям ножет осуществляться на уровне генома растительной клетки и/или на уровне мембран, то одним из важных аспектов в изучении иембраносвязанкых АТФаз является исследование путей их гормональной регуляции.

Среди зндо ферментов плазмалеьзм растительных клеток была выбрана Н-АТФаза , которая играет важную роль в гомеостазе внутриклеточной концентрации ионов водорода, кальция и натрия (Полевой, Саламатова,

1980, Serrano, 1938, 1989),

Следует отметить, что ни в одной работе не было проведено сравнительного анализа действия на АТФэзну» активность таких фитогормонов,

которые имели бы как сходство, так и различие при воздействии на ряд физиологических процессов, что позволило бы представить себе картину путей регуляции мембраносвязанных АТФаз. К таким соединениям можно отнести синтетические аналоги фитогормонов - 2,4-Д и БАЛ, которые обладают высокой биологической активностью и устойчивы к разрушению, а -также фузикокцин (ФК), способный имитировать действие ауксина и цитоки-нина (Karre, 1977, 1979, 1982, Полевой, 1986).

Важно подчеркнуть, что данные по In vitro действию этих регуляторов роста носили разноречивый характер. В одних работах был показан стиму-лирущий эффект ауксина (Thompson et al., 1983, Scherer, 1984) и ФК (Harre, 1982) на активность Н-АТФазы, тогда как в других - не удалось воспроизвести эти результаты (Gleland, Lonax, 1977, Bowman et al., 1978, Perlln, Spanswlck, 1981, Максимов, 1985, Полевой, 1986). Действие БАП на К.Ме-АТФазную активность было рассмотрено только в одной работе (Максимов, 1986).

На основании вышеизложенного основное внимание в работе было уделе-,но выяснению возможности функционирования экто АТФазы на внешней поверхности плазмалеммы корневых клеток и сравнительного изучения действия синтетических аналогов фитогормонов на мембранносйязанные АТФазы. Конкретными задачами работы являлись:

1. Выяснить, функционирует ли экто АТФаза на поверхности интактных корней ячменя и в выделенной из них микросомальной фракции.

2. Изучить биохимические свойства экто АТФазы и ее возможность находиться в двух формах растворимой и мембраносвязанной.

3. Выяснить, возможна ли общепринятая техника для измерения эндо E,Hg-АТФазной активности в микросомальной фракции, обогащенной фрагментами плазмалеммы. из корневых клеток ячменя, пшеницы и кукурузы.

4. Изучить действие синтетических аналогов фитогормонов (2,4-Д, БАП) на экто м эндо АТФазы плазмалеммы корневых клеток.

Научная новизна работы. Установлено наличие На поверхности интактных корней и в выделенной из них микросомальной фракции, обогащенной фра!*-

ментами плазмалеммы, экто Са-АТФазы, аналогичной по свойствам экто Са-АТФазе (экто-нуклеотидазе) животных клеток. Характерные свойства этого фермента : широкий диапазон рН и температур, активация миллимолярными концентрациями двухвалентных катионов (с наиболее высоким сродством к ионам кальция), широкая субстратная специфичность с наиболее высоким • сродством к АТФ (гидролиз нуклеозидтрифосфатов и АДФ, но не АМФ, р-глицерофосфата и п-нитрофенилфосфата) и нечувствительность к ингибиторам "транспортных" АТФаз - ДЦКД, ДЭС и ортованадату натрия.

Показано существование двух форм зкго Са-АТФазы: мембраносвязанной и растворимой. Выяснены условия перехода фермента из одной формы в другую и обратно.

На основании аналогии свойств и факта совыделения Са- и Mg-АТФаз сделан вывод о наличии в корневых клетках одной АТФазы, способной активироваться как Са, так и Ug.

Разработан методический подход для оценки ориентации везикуд микросомальной фракции и локализации активных центров мембраносвязан-ных ферментов с помощью каналогенного антибиотика аламетицина,'который делает плазмалемму проницаемой для АТФ.

Установлено, что в in vivo системе циклогексимид (ЦГИ) снижал стимулирующее действие 2,4-Д, ЕАП и ФК на активность экто и эндо АТфаз, что предполагает возможную регуляцию АТФаз через геном клетки,

Значимость работ«. Исследования АТФаз, локализованных как на внутренней, так и на внешней поверхностях плазмалеммы, расширяют наш представления о важной роли поверхностной цитоллазматической мембраны, как первого барьера клетки, в поддержании как внутри-, так и околоклеточного гомеостаэа у растений. Установление связи между действием синтетических аналогов фитогормонов на активность мембранных АТФаз и уровнем минерального питания углубляют физиологическое обоснование проблемы применения удобрений и повыиения продуктивности с/х культур, Методы, разработанные в данной работе, опубликованы в учебном пособш) " Методы изучения мембран растительных клеток" (ЛГУ, IDOS) и используются в учебной работе студентов, специализирущихся по физиологии и биохимии растений.

Апробация работ. Материалы диссертации были долояены на 7 псесовзних

и 10 международных научных конференциях: на 2-ом Всесоюзном симпозиуме по ионному транспорту в растениях (Черкассы, 1977), на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на Сабининских семинарах в ИФРе АН СССР (Москва, 1983, 1984, 1985, 1987, 1989), на Международном симпозиуме молодых ученых по регуляции метаболизма растений (Варна, 1986), на 3-ем Международном симпозиуме по структуре и функции корней (Нитра, 1987), на 4-ом Международном симпозиуме по регуляторам роста растений (София. 1987), на 6-ом Международном конгрессе по физиологии растений (Сплит, 1988), на 8-ом Международном совещании по мембранному транспорту растений (Венеция, 1989), на 11-ом Международном коллоквиуме по питанию растений (Вагенинген, 1989), на 4-ом Международном коллоквиуме по мембранному транспорту растений (Эдинбург, 1990), на 1гом Международном конгрессе европейских обществ по агрономии (Париж, 1990), на 3-ем Международном симпозиуме по экологии корневых систем (Вена, 1991), на 3-ем съезде физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 20 научных статьях и в 12 тезисах.

I. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Выраоивание растений. В работе использовали корни 4-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea nays I.),7-15-дневных проростков ячменя (Hordeum Yulgare Ь.)(и озимой пшеницы (Trltlcua aeetivuo I.), выращенных на 0,25 мМ CaS04, при температуре 23/16°С (день/ночь), 16-часовом дне (освещение люминесцентными лампами интенсивностью 45 Вт/м2), 75%-ной влажности воздуха и непрерывной аэрации. Средой выращивания служил модифицированный нами питательный раствор Хогланда и Снайдера (Hoagland. Snyder. 1933), разбавленный э 8 раз и содержавший (мМ): Са(Н03)2 - 0.7; HgS04 - 0.8; КН2Р04 - 0,07; НаН2Р04 - 0,07; . KROg - 0.7; HaCI - 0,04; и микроэлементы (мкМ): Fe - 14; В - 0,35; Кп - 0,035; Zn -0.014; Са - 0,018; Мо - 0,0035; Со - 0,0035; Al -0.0035. Раствор меняли I раз в 2 дня (Тихая и др., 1985). , .

1.2. Выделение клеточных фракций. Обогащенную фрагментами плазмалеммы, михросомальную фракцию получали с помощью дифференциального центри- •

фугирования с очисткой В; ступенчатом градиенте сахарозы по модифицированному нами методу Леонарда и Хотчкисса (Тихая, и др., 1984, Тихая,. Максимов, 198Б). Для оценки ориентации везикул микросомальную фракцию обрабатывали антибиотиком аламетицином в течение 30 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация аламетицина в среде инкубации составляла 12 мкг/мл, бежа от 20 до 100 мкг/мл (Тихая и др., 1984). Использовали спиртовые растворы аламетицина , в которых он находился в мономерной форме (Овчинников и др.,1974). Суспензии использовали в опытах сразу после выделения или после хранения при -20 в 40%-ном растворе сахарозы не более 2 месяцев. В течение этого времени АТФазная активность микросомальной фракции снижалась не более, чем на 10 %.

Растворимую фракцию (супернатант 150 ООО g) получали после центрифугирования в течение 60 мин. супернатанта 80 ООО g (Федоровская, Тихая и др., 1993).

1.3. Получение частично-очишениого препарата экто Са-АТФазы. (Тихая и др., 1993):

1.3.1. Получение KCI-экстракта. Микросомальную фракцию обрабатывали 0,25 М или 0,5 М KCI на холоду в течение 30 мин при постоянном перемешивании. После центрифугирования I ч при 150 ООО g осадок отбрасывали, а супернатант.использовали для определения ферментной активности (Tik-haya et al., 1990).

1.3.2. Высаливание фермента. KCI-экстракт подвергали дробному высаливанию при рН 6,0 или 7,2 сульфатом аммония; Последний добавляли небольшими порциями при"постоянном перемешивании, контролируя при этом рН раствора. Растворы (0-50%, 50-60% и 60-80% от насыщения сульфатом аммония) центрифугировали 30 мин при 150 ООО g.

1.3.3. Получение диалнзовавного ферментного препарата. Ферментный препарат, высаленный в диапазоне 60-80% от насыщения сульфатом аммония (2 мл), подвергали диализу при комнатной температуре в течение 3 часов против 0,5 л I мМ трис-МЭС, рН 6. В течение этой процедуры буфер меняли три раза. После центрифугирования 10 мин при 8 ООО g осадок подвергали дальнейшей обрвботке, а полученный супернатант представлял собой диализованный ферментный препарат.

1.3.4. Получение ферментного препарата, солюбилизированного 0,5 М KCI я 0,1-яом % тритоном Х-100. В результате диализа ферментного препарата при рН 6 наблюдалось образование осадке, который обрабатывали 0,5 И

KCI в течение 30 мин на Холоду при перемешивании. После центрифугирования 10 мин при 8 ООО g осадок промывали несколько раз I мМ трис-МЭС, рН 6, обрабатывали 0,1%-ным тритоном Х-100 в течение I ч на холоду и повторно центрифугировали 10 мин при 8 ООО g. Сударнатанты (после обработки 0,5 М KCI и 0,1% тритоном Х-100) использовали для определения ферментной активности.

1.3.5. Ион-обменная хроматография на ШВ-ТоуореаП-650 М. 3 мл :диа-лизованного Ферментного препарата элюировали через колонку (0,5 х 13,5 см), уравновешенную 20 мМ трис-HCI (рН 8), со скоростью 0,4 мл/мин при комнатной температуре. Несвязанный белок был элшрован буфером, а связанный 0,1 н ; 0,3 н КС1 растворами, приготовленными на 20 мМ трис-HCI (рН 8) буфере.. Фракции буферного, ОЛ н и 0,3 н КС1 пиков были использованы в опытах.

1.3.6. Очистка фермента на градиенте глицерина. По I мл ферментных препаратов буферного и 0,1 н KCI пиков наслаивали на линейный градиент глицерина ( 15 - 45 % ). После центрифугирования 24 ч при 120 ООО g.

.отбирали пробы по 0,5 мл для определения активности фермента и'элект-рофоретического анализа.

1.4. Электрофорез препаратов в ПААГ в неденатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (ЬаеипИ ,1970) в 5-ном % или 7.5-ном % ПААГ,но без додецилсульфата натрия, а в присутствии 0,1 % тритона Х-100, который вносили как в гель, так и электродный буфер. После окончания электрофореза одну часть геля окрашивали Кумасси R-250, а другую отмывали в 10 мМ трис-нгп (рН 6) в течение 30 мин, затем трек нарезали на I см кусочки и помещали в инкубационную среду. Через 30 мин инкубации отбирали пробы по 0,5 мл для определения АТФазной активности (Тихая и др., 1993).

1.5. Электрофорез препаратов в ПААГ в денатурирувцих условиях проводили по методу Лэммли с некоторыми модификациями в линейном градиенте концентрации акриламида (5/15 %) или 12-ном % геле. Электрофорез проводили в режиме стабилизации по току: при вхождении образцов в гель -35 мА. а затем - 20 мА. Белки были денатурированы путем кипячения в 23C-HOM додецилсудьфате натрия с 5% р-меркаптоэтанолом в1 течение 5 мин непосредственно до электрофореза. Гели окрашивали Кумасси голубым , R 250 (Тихая и др.,1993).

1.6. Сорбция растворимой форш фермента ва мембранах нлкросоыальной '

фракция. Для этой цели использовали микросомальную фракцию, освобож денную от экто Са-АТФазы путем ее предварительной обработки раствором. хлористого калия (0.5 мМ KCI, I мМ трис-МЭС. рН б). Микросомальную фракцию, промытую I мМ трис-МЭС, рН б, обрабатывали растворимой фракцией, центрифугировали 50 мин при 150 ООО g и осадок гомогенизировали ' в I мМ трис-МЭС, рН 6 (Федоровская, Тихая и др., 1993).

1.7. Обработка 2,4-Д, ВАЛ и ФК. Опыты ставили в двух модификациях: In vivo и In vitro. В первом случае,обрабатывали интактную корневую -систему, внося регуляторы роста в питательный раствор в последние 1-3 суток выращивания проростков. Затем из корней контрольных и опытных растений выделяли микросомальную фракцию и определяли АТФазную активность. В опытах in vitro выделенную микросомальную фракцию предварительно обрабатывали 2,4-Д, БАП или ФК (экспозиция - 15 мин при 5 или 22 °С), после чего определяли АТФазную активность (Тихая и др., 1988).

1.8. Определение АТФазной активности. АТФазную активность в микросо-мальной фракции определяли по методу Линдемана (Llnderoan, 1985) и выражали ее в микромолях Рн на миллиграмм белка в мин или час. Белок определяли по методу Бредфорд (Шоно, 1989), Реакцию начинали добавлением АТФ и останавливали через 15 мин холодной ТХУ, конечная концентрация 3%. Са-АТФазную активность определяли при 20 С как прирост скорости гидролиза АТФ при добавлении в основную среду инкубации 3 мМ СаС12. X.ltg-АТФазную активность определяли при 37°С как прирост скорости гидролиза АТФ при добавлении в основную среду инкубации 50 мМ K^SO^

или 100 мМ Ш.

Основная инкубационная среда (I мл) для Са-АТФазы состояла из ферментного препарата (от 0,01 до 4 мкг белка), I мМ АТФ, I мМ ЭДТА, 100 мМ KCI и 33 мМ трис-МЭС ({Л 6), а для K.Kg-АТФазы - кроме того, 3 мМ HgCI2 и аламетицин (весовое отношение аламетицин : белок - 0,5).

АТФазную активность интактных корней выражали в микромолях Рн на Грамм сырого веса корней в час. Непосредственно перед оццтом корни отрезали на расстоянии I см от основания. Отделенные корни ( сырой вес 0,1 г) помещали в 5,5 мл раствора, содержавшего трис-МЭС рН 6 и молиб-дат аммония, в присутствии СаС12 или без него. Реакцию начинали добавлением 0,5'мл раствора АТФ ( конечная концентрация компонентов среда после добавления АТФ, мМ: трис-МЭС - 33, нрлибдат аммония - I, CaC.Ig-3, АТФ - 3). Инкубацию проводили при 28 °С. Через 10.мин из каждой проб отбирали по 0.5 мл инкубационного раствора и для остановки реакции его

вносили в холодный раствор молибдата аммония ( I мл 1,04 %-ного раствора {ЯН^Но^О^ 4 Нг0 в 3,84. н Н2Б04), который является одним из компонентов для определения Рн. Корни осушали фильтровальной бумагой и взвешивали. Выделение Рн интактными корнями было линейным во времени (Тихая и др.. 1985). -

1.3- Определение протеинкиназной (ПКазной) активности. ПКазную активность определяли в среде инкубации, содержащей 50 мМ трис-НС1, рН 8, 15 мМ МеС1у. 0,1% тритон-Х-100, 10 мМ НаР, 20 нМ ( т32] Р АТФ и 10-20 мкг белка микросомального препарата. Реакцию проводили при 37°С в тече ние 30 мин, останавливали холодным раствором, содержащим 50 мМ АТФ и 0.25 М ЭДТА (рН 7,5). Включение 32 Р в белки учитывали, как описано в работе Селиванкиной и др.(1988) и выражали в имп мин-1 на 10 мкг белка микросомального препарата (Селиванхина и др., 1989, Тихая и др.,1989). 1.10. Расчет концентраций свободных ионов кальция и магния выполнен на компьютере по методу Сторера и Корниш-Боудера (Бгогег. СогпШ-Вояаег, 1976). Константы ассоциации комплексов взяты из.справочной литературы. .1.13. Репрезентативность. Как правило, опыты проводили не менее трех раз в 3-х кратной ловторности. В таблицах приведены средние арифметические и их стандартные ошибки.

'г. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ФИТОГОРМОНОВ НА АТФазную АКТИВНОСТЬ

Предварительные эксперименты показали, что отзывчивость на действие БАП и 2,4-Д, добавленных непосредственно в среду выращивания проростков, наблюдалась в больоей степени у корней ячменя, чем у куку--рузы и гсеницы. Это проявлялось в усилении как длины корней (2,4-Д), так и их утолщения (БАП), а также АТФазной активности плазмалеммы корневых клеток.

Стимуляция АТФазной активности этими регуляторами роста могла быть следствием их действия на генетическом и/или мембранном уровнях. Чтобы разделить пряные и опосредованные эффекты регуляторов роста следовало параллельно изучить их 1п тИго и 1п т17о действия на активность мембранных АТФаз.

Однако прежде чем перейти к изучению гормонального действия на АТФ азнУю активность плазмалеммы корневых клеток ячменя, важно было выяс-. нить, какими именно АТФазами обусловлена обнаруженная нами активность.

■2.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АТФазы, АКТИВИРУЕМОМ ИОНАМИ КАЛИЯ И МАГНИЯ

Впервые Ходжесом и Леонардом (Hodgae, Leonard, 1972), а в дальнейшем и большим'числом исследователей (см. обзор■Serrano, 1989) на плазмалемме корневых клеток в диапазоне рН от 5,5 до 6,5 было показано наличие Hg-зависимой АТФазы, активируемой одновалентными катионами с наиболее высоким сродством к ионам калия. Обнаруженный фермент был чувствителен к "действию таких ингибиторов, как дициклогексилкарбодаи-мид (ДЦКД), диэтилстилбестрол (ДЭС) и ортованадат натрия, которые подавляли также активное выведение ионов водорода из клеток rHodg.ee. 1972), На основании этих данных было сделано заключение об участии K.Hg-АТФазы в работе Н-насоса. Фермент с аналогичными свойствами

был обнаружен также нами в микро-сомальных фракциях, из корней ячменя, пшеницы и кукурузы, обогащенных фрагментами плазмалеммы (рис. I, 2) (Вахмистров, Тихая и др.,1984, Тихая и др., 1984).

Рис Л. Зависимость K,Ug АТФазной активности микросомальшх фракций из корней пшеницы (I), ячменя (2) и кукурузы (3) от рН среды инкубации. 7 - АТФазная активность,

6 в 9 МКМ0ЛЬ рн /"мг белка час. Среднее

рН из 4-х опытов. (Тихая и др.,1984) .

Однако- возникает вопрос, дает ли общепринятая техника измерения АТФазной активности мембранных препаратов адекватное представление о ее полной активности, если известно, что а) активный центр K.Mg-АТФазы In situ локализован на внутренней стороне плазмалеммы (Sze, 1980), б) последняя мяло пронипчема для АТФ (Van Thlenen, Postlna, 1973) и в) ме

100 г

50

& Л

дцнд

АЭС

ОрТОВЛНАЦА1 на 1 Рая

УА6АИН 10~4М

I а з

алигамицин мо.шбдлт

\АНПО ИМЯ

5мкг/мл '

Рис.2. Влияние ингибиторов на К,^ АТФазную активность микросомальных фракций из корней пшеницы (I). ячменя (2) и кукурузы (3). 1 - АТФаз-ная активность, в %, (Тихая и др., 1984).

мбранный препарат представляет собой суспензию по-разному ориентированных везикул (как вывернутых, так и невывернутых). Очевидно, что при этих условиях гидролиз АТФ будет осуществляться только частью АТФаз, а именно теми,активные центры которых обращены наружу и непосредственно контактируют с инкубационной средой. Активные центры фермента, локализованные на внутренней поверхности правильно ориентированных невывернутых везикул?оказываются недоступными для субстратов и не будут участвовать в гидролизе АТФ.

Для того, чтобы включить в работу эти АТФазы. нужно сделать мембрану проницаемой для АТФ и кофакторов реакции. Одним из таких подходов для определения полной К.Кб-АТФазной вктивностии могло быть использование каналогенного антибиотика аламетицина, который делает плазмалем-му проницаемой для АТФ и кофакторов реакции и не влияет при этом на активность самого фермента (Бутылин, Ритов, 1980). Под полной активностью мы подразумеваем скорость катализируемой реакции, достигаемую при участии активных центров фермента, локализованных как на внешней, так и на внутренней поверхностях замкнутых везикул, ориентация которых, как правило, не контролируется.

Данные, приведенные в табл.1. показывают» что в присутствии аламетицина активность К.Кк-АТФазы была почти в 3-4 раза выше, чем в его-

1

. " II

отсутствии. Следовательно, мембранные препараты, полученные нами, состояли главным образом из нормально ориентированных замкнутых везикул, полная К.Мй-АТФазная активность которых не может быть учтена без использования аламетицина.

Таблица I. Стимуляция К.Мб-АТФазной активности микросомальних фракций из корней растений аламетицином. Весовое отношение аламетицин : белок в среде.преинкубации было равно 0,5 для пшеницы и ячменя, а для кукурузы - 0,3. Среднее из 4-х опытов. (Тихая и др., 1984).

Объект Рн, мкмоль/мг белка ч Степень активации

- аламетицин + аламетицин раз

Пшеница 7,50 + 0,51 27,52 + 0,71 3.7 .

Ячмень 4,97 0,06 18,18 + 0,04 3,8

Кукуруза 2,46 ± 0,18 6,90 *0,17 2,8

Вместе с тем не исключена вероятность, что увеличение К,^-АТФазной активности происходит за счет сбрасывания протонного градиента. Однако результаты опытов, в которых везикулы были заполнены АТФ и кофакторами реакции с помощью осмотического пока, показали, что величина активности К,Мб-АТФазы была практически соизмерима с величиной активности фермента микросомальной фракции, обработанной аламетицином.

В отличие от аламетицина, тритон Х-100 (0,1%) в большей степени стимулировал К.Нй-АТФазную активность, что свидетельствует о его влиянии непосредственно на активность фермента,

Таким образом, нами впервые удалось определить полную Я.Нй-АТФаз-ную активность мембранных препаратов из корневых клеток растений с помощью каналогенного антибиотика аламетицина. Величины же АТФазной активности,.получаемые различными авторами по общепринятой методике, при которой не обеспечивется доступность субстратов и кофакторов реакции к обеим поверхностям везикулярных Фрагментов мембран, могут, как правило, не соответствовать действительном значениям ее активности.

Кроме того, использование аламетицина в области мембранологии растительной клетки открывает путь к решению такого.важного вопроса как определение ориентации активных центров ферментов in vivo путем сопоставления действия аламетицина на активность изучаемого и маркерного фермента с известной локализацией субстратсвязываадего центра.

Полученные данные подтверждают наличие в плазмалемме корневых клеток ячменя, пшеницы и кукурузы K.Hg-АТФазы (Н-АТФазы) и характеризуют очищенную микросомальную фракцию как препарат, состоящий главным образом из правильно ориентированных (невывернутых) замкнутых везикул.

2.3, ИДЕНТИФИКАЦИЯ АТФазы, АКТИВИРУЕМОМ ИОНАМИ КАЛЬЦИЯ

2.3.1. Характеристика фермента

В ряде работ было показано наличие в плазмалемме растительных клеток фермента (De 1 ter, Harre, 1981, Bvano et al ,.t 1989), аналогичного по ряду характерных свойств "транспортной" эндо Ca.Hg-АТФазе животных клеток (Lin, Fain. 1984), которая принимает участие в выведении ионов кальция из клеток. Фермент активировался микромолярными концентрациями кальция в присутствии ионов магния и кальмодулина (Deiter, Иагпе.,1981, Evans et al.; 1989). Миллимолярные концентрации кальция ингибировали активность фермента. В наших опытах проявлялась относительно высокая базалытя АТФазная активность, которая достоверно снижалась уже при минимальной из использованных концентраций ЭДТА (0,1 мМ), а при при 10-20 мМ ЭДТА - полностью исчезала. Добавление ионов кальция на фоне хелата приводило к заметному повышению АТФазной активности, достигая максимума при концентрации ЭДТА равной I иМ (Тихая и др.', 1985). Результаты других экспериментов с применением трифторперазина (ТФП), блокатора кальмодулинзависимых реакций (Cheung, I960) показали, что добавление его в среду инкубации снижало как базальную, так и Са-АТФ-азную активность на 34 и 30 %, соответственно (рис.З). Поэтому нами было высказано предположение о возможном функционировании в плазмалемме корневых клеток ячменя эндо Са,Kg-АТФазы за счет эндогенных концентрация ионов кальция и магния. Однако данные. • полученные Лутрой с сотр. (lutra et al,, 1985) ставят под сомнейие специфичность действия ТФП, который подавлял также и активность кальмодулин-независимых ферментов.

V

70 г

50

30

(О

1 г

Рис.3. Влияние ТФП на базальнус (А) и Са-АТФазную (Б) активности микросомаль-ной фракции из корней ячменя. I - контроль, 2 - в присутствии ТФП. V -АТФазная активность, мкмоль Рн/мг белка ч. (Тихая и др., 1985).

Далее из рис.4 видно, что АТФазная активность регистрировалась-во всем

0,001 а,01 0,1

• о.б -Г

0,4 о, 8 */с

Рис.4 Зависимость АТФвзной активности микросомальной фракции из корней ячменя от концентрации ионов кальция (I) и магния (2) в среде инкубации в прямых (А) и двойных обратных координатах (Б). 7 - АТФазная активность, мкмоль Рн/мг белка мин. (Стеханова и др., 1989).

1

испытанном диапазоне концентраций кальция и не снижалась в области мил лимолярных концентраций. Уместно отметить, что Ca.Mg-АТФаза стимулировалась только микромолярными концентрациями ионов кальция. Аналогичная картина наблюдалась для ионов магния, а расчет величин констант Михаэлиса по Лайнуверу-Бзрку показал, что для кальция - К^ была равна 7 мкМ, а для магния Кв - 17 мкМ.

В последующих опытах наблюдалась стимуляция фермента другими двухвалентными катионами (Ca>Ug= Itn > Со vBa). Однако его сродство к ионам кальция было наибольшим.

Результаты ингибиторного анализа ставят под сомнение предположение о том, что обнаруженный нами фермент может выполнять функции "транспортной" Ca.Kg-АТФазы, так как ортоеанадат натрия не подавлял его активность, как это имело место в случае Ca.lig АТФазы (Chan, Junger, 1983) (Табл.2).

Таблица 2. Влияние ингибиторов на Са-АТФазную активность микросомаль-ной фракции из корней ячменя. Сроднее из 3-х опытов. (Тихая и др., 1985, Tlkhaya, Vakhnletrov, 1989).

мкмоль Рн / мг белка ч %

Ингибитор к контролю

56.10 ± 0,51 100

Фторид натрия, I0"2 М 11,22 * 0,76 20

Молибдат аммония,Ю~3 М , 56,10 + 1,38 100

ДЭС, 5 Ю~5 М 43.28 I 1,26 78

ДЩД. 5 Ю"5 Н 44,89 j 1,31 80 ортованадат натрия,

5 I0"5 Н ■ 55,95 fc 1,07 100

Дополнительные характеристики фермента приведены на рис.5. Из него видно, что как базальная, так и Са- или Мй-АТФазные активности проявлялись во всем испытанном диапазоне рН от 4,5 до 9,0 с максимумом прЛ рН 6. Температурный диапазон их проявления был довольно широким - от 10°до 60'с с максимумом при 40.° Фермент в большей степени гидролизоваЛ АТФ по сравнению с другими нуклеозидтрифосфатами и АДФ. В присутствии

го 40 60 /смаерс/тураг, "с

АТЯ> ГТФ УГФ ЦТФ А&Ф АМФ ЫРФ <РЧ> ГФ

ал 0,9 3 9 20 капьмодулин, мкг/нл

Рис.5. Влияние рН (А), Т (Б), субстратов (В) и кальмодулина (Г) на АТФазную активность микросомальной фракции. I и светлые столбики -Са-АТФазная активность, 2 и заштрихованные столбики - ^-АТФазная активность. V

иг белка мин. (Тихая и др., 1985).

для А, Б, и Г - АТФазйая активность, мкмоль Ри на

Н

АМФ, р -глицерофосфата и п-нитрофенилфосфата активность фермента не проявлялась. Добавление в среду инкубации кальмодулина от 0,3 до 30 мкг/мл не влияло на Са-АТФазную активность.

Фермент с аналогичными свойствами был обнаружен в микросомальной фракции, выделенной из корней пзеницы и из суспензионной культуры корневых клеток пяеницы (данные не показаны).

Тот Факт, что обнаруженная нами АТФаза, активировалась миллимоляр-ными концентрациями кальция, убеждал нас в том, что гидролитический

центр фермента скорее всего приурочен к внешней, а не к внутренней стороне плазмалеммы, поскольку концентрация кальция в цитозоле, равная Ю~6 М, уже является летальной для растительных клеток (Нагие, 1983).

Таким образом, требовалось детальное изучение, касающееся оценки ориентации каталитического центра исследуемого фермента.

2.3.2. Ориентация фермента.

Если исходить из того, что, найденная нами, АТФаза относится к экто ферментам, то она должна проявиться на поверхности интактных корней.

Данные о сходстве между свойствами АТФаз микросомальной фракции и поверхности интактных корней ячменя, а также подавление Са-АТФазы интактных корней малолроникаодим агентом - азотнокислым свинцом свидетельствует в пользу того, что исследуемая АТФаза относится к экто ферментам (сравни рис.5 и 6).

Из табл. 3 видно, что добавление аламотицина в среду инкубации приводило к повышению эндо 1,И£-АТФазной активности, тогда как Са-АТФазная активность оставалась без изменений (Тихая и др., 1985). Эти результаты указывают также на локализацию активного центра Са-АТФазы Ш «Ни на внесшей стороне плазмалеммы.

Таблица 3. Влияние аламетицина на К,^ (рН 5,5) и Са-АТФазну» (рН 6,0) активности микросомальной фракции из корней ячменя. Основная срода инкубации - рз мМ трис-МЭС, 3 мМ АТФ, аламетицин 12 мкг/мл, весовое отнесение аламетицин/белок - 0,5). Среднее из 3-х опытов. (Тихая и др., 1985).

Рн.мкмоль/мг белка ч

----------------------.-------------. Отношение в/а

аламетицин ♦ аламетицин (а) (в)

К.Й5 АТФаза 4,97 ± 0.10 18,18 ± 0.07 3,66

Са-АТФаза 71.77 ♦ 0.17 72.10 * 0,16 1,00

Тип актив ностн

Рис.6. Влияние рН (А), ионов кальция (Б), субстратов (В) и ингибиторов (Г) на АТФазную активность интактиых корней ячменя. ДЦКД, ДЭС - 5 х Ю-5?/, молибдат аммония -10~3 М, РЬ(П03)2~ З'Ю"3^- фторид натрия -10"%. 7 - АТФ—азная активность, мкмоль Рн (г сыр .веса)"1 ч . (Тихая и др,, 1985, ТШауа, 7althníвtroт, 1989-).

Поскольку эти данные были получены не на стерильных корнях, то моя но было бы допустить возможность приуроченности АТФазы плазмалеммы га-крооргпниэмоз, имеющихся на поверхности корней. Однако обнаружение

АТФазы с аналогичными свойствами на поверхности стерильных трансформи рованных корней клевера снимает это сомнение и указывает на функционирование фермента на внешней стороне ллазмалеммы корневых клеток, а не микроорганизмов.

Можно предполагать, что экто Са-АТФаза, обнаруженная нами на внешней поверхности плазмалеммы корневых клеток ячменя» играет какую-то физиологическуцю роль в апопластическом компартменте клетки, поскольку внешняя поверхность плазмалеммы вовлечена в такие физиологические процессы, как транспорт веществ, межклеточное узнавание, рост клетки И ее гормональная регуляция и т.д. Это предположение будет более подробно рассмотрено в раздело 3.

2.3.3. Две .формы фермента

Тот Факт, что Са-АТФазная активность была обнаружена во всех зонах ступенчатого градиента сахарозы, используемого для очистки микросо-мальной фракции, то было высказано предположение о возможности' связывания фермента с плазмалеммой лабильной связью.

В пользу этого предположения могли бы служить данные о солюбилиза-ции фермента хлористым калием, который способен снимать с мембран не-прочносвязанные белки (Фридрих, 1986).

Данные о солюбилизации Са-АТФазы 0,5 М раствором ЕС1 указывали на 60-ньйХ выход фермента (Табл. 4), который мог быть существенно увеличен вплоть до 100% при снижении концентрации мембранного белка (Стеха-нова и др., 1989). ,

Таблица 4. Сравнение кембраносвязанных и солюбилизировапнных 0,5 М . раствором КС1 Са- и АТФаз из микросомальной фракции корней ячменя. Среднее из 4-х опытов. (Стеханова и др., 1939. ТШауа ег а!.* 1989).

Препарат

Йкросомальный Солюбилиэирсванный

Выход, АТФазная

% активности активность

степень очистки, раз '

Са Са И6 Са /

100 100 3,75 2,74 I 'I

60 56 18.20 12,25 5 5

В дальнейших опытах удалось обнаружить сходство между биохимически ми свойствами АТФаз растворимой Фракции (супернатант 150 ООО g) и мик-росомальной фракции (осадок 80 ООО g), а именно: диапазон р!1 работы Фермента, широкая субстратная специфичность, сродство к Са и Hg (рис 7). Между тем наблюдалось также отличие в свойствах этих ферментов' ' ■ ТТ?п-5„?°Лев ВЫ°ОКОе Ср0ЛСТВ0 ^Р"ента к АТФ микросомальной фраюш

действию рН (Дйнные не приведены). ^ Фракции к

J0

SO

10

%

J_1.-4 I. .1

врн *

SO

to ■

________1........ ..........1.

ЙТ<? ГГф УГ9 AQO АМРНФ? Гф

Vv

го

г

/ to ¿0

f/cd

ftc.7. Влияние т Ш, субстратов (Б), ненов кальция (В) и магния (Г)

У- АТФазная активность мтиъ гн'мг шт. (Сюровская, Тих ал а др., 1993).

Далее важно было выяснить, какая часть фермента - находится в растворимой форме, и влияет ли изменение состава среды при растирании корней на его переход в ту или иную форму. Результаты опытов показали, что перераспределение Са-АТФазной активности между растворимой и микросо-мальной Фракциями наблюдалось в случае изменения рН среды гомогенизации или внесения в нее СаС12. При этом подщелачивание среды до рН 8 или внесение СаС12 приводило к десорбции фермента и (в растворе оказывалось 75? общей активности), в то время как подкисленио среды до р!1 6 или исключение СаС12 из среды - к его сорбции (в растворе 33-38$ общей активности) (Табл. 5).

Таблица 5. Влияние {Л! сроды гомогенизации и присутствие ионов кальция (3 мМ) в среде инкубации на распределение Са-АТФазной активности между растворимой и микросомальной фракциями. Среднее из.3-х опытов. (Федоровская, Тихая и др., 1993).

рН среды Растворимая фракция Микросоыальная фракции

гомогени- Белок, Удельная х Общая** Белок, Удельная Общая зации мг активности . , мг активности

6.0х** 7,2х** 7,2

15,72 17.04 17,08

0.36 0,48 0,90

О П Ы Т I 5,66 (34) 8,18 (45) 15,37 (75)

. О П и Т 2

5,45 5,32 3,76

2,06 1,85 1,40

11,22 (66) 9,83 (55) 5,26 (25)

6.0 9.92 0.85 8,43 (38) 2.95 4,61 13.60(62)

7.2 14.68 0.82 12,04 (55) 3.35 2.96 9,92(45)

8.0 18.60 0.82 15,25 (76) 3,41 1.42 4,84(24)

X

XX -

ххж -

ыкмоль Р,/ыг белка мин

ыкмоль ?ц/ иин. в скобках - % за 100 % принимали суилу общих активностей растворимой й микросомальной фракций). Боз конов кальция в среде инкубации

Зависимость сорбции фермента на мембрана от ионнсй силы и рН позволяет считать, что его связывание происходит скорее всего с помощь» электростатических сил.

Другим аргументом в пользу лабильной связи фермента с мембраной является данные о ресорбции фермента растворимой фракции ячменя на мембранах микросомальиой Фракции как ячменя, так и кукурузы (Табл. 6).

Таблица 6. Десорбция и ресорбция Са-АТФазы на микросомальиой фракции из корней ячменя и кукурузы. Среднее из 2-х отитов. (Федоровская, Тихая и др., 1993).

Удельная активность,

Общая активность,

Объект Препарат

мкмоль Рн/иг мин

мкмоль Рн/мин %

ячмень ' микросомальная

фракция 4,11

0,5 М ЕС! экстракт 18,30

4,77 4,25

100 89

фракция после обработки 0,5 И Ш

0,24

0,09

2

фракция после обработки суперна-тантом ячменя • 2,84 кукуруза микросомальная

фракция 0,07

2,53 0,29

53 100

Фракция - после обработки суперна-тпн'юм ячменя

0,78

3,81

950

конечная концентра-

Физиологический смысл сорбции фермента на внешней поверхности плаз-малеммы может заключаться в его пространственной ассоциации с другими ферментами в комплексы для выполнения той или иной функции.

Таким образом, результаты этой серии опытов служат доказательством того, что Са-АТФаза относится к непрочно связанным с плазмалеммой ферментам и может существовать в двух формах: мембраносвязанной и растворимой .

2.3.4. Активация АТФазы кальцием или магнием - проявление работы одного фермента.

Выве было показано (см. раздел 2,3.1) что подобно экто АТФазам животных клеток АТФазы корней ячменя активировались не только Са, но и Mg (Тихая и др..1905). В связи с этим возникает вопрос, обусловлена ли эта активность функционированием двух разных экто АТФаз (Са- и Bg-АТФазы) или одного фермента (Стеханова и др.. 1989).

Туана и Дхадла (Tuana, Dh&Ua. 1988). работая с очищенным фермен-Т)шм препаратом из сарколеммы сердечной мышцы крысы, прими к выводу о существовании одного ферыснта, активируемого как Са. тах и Kg. Такой же вывод сделали Хэмлин и Сеньор (H&ialyn, Senior, 1983) на основании близкой аналогии свойств Са- и Bg-АТФэзных активностей микросомальиой фракции и интактных клеток поджелудочной железы крисы.

Однако другие авторы (Bagjr, 1ЭВ6. Clanflrl, Боев, 1988) предполагают наличие двух разных ферментов - Са- и Ig-АТФаз. поскольку наряду со сходством свойств между ними были обнаружены различия (отновеиме к ингибиторам).

Важно было выяснить степень сходства свойств Са- и Mg- АТФазных активностей ммсросомального (связанных с мембраной) и солюбихизирован-ного (свободных) препаратов из корней ячменя.

Доказательством наличия в плазмажшс корневых клеток одной АТФазы. способной активироваться как Са-. так и Kg-, могло бы Сыть, с одной стороны, совпадение параметров солюбилзгзации Са- и Kg АТФазы (процент выхода 5срмгктов. степень юс очистки), в с другой. - сходство основных биохимических свойств кк?с{осаыального и сслиби1и;ирсвзн;$ого препаратов этих АТФаз. " .

Обработка иик{юсс*"игпной фракшя на холоду хдаристым кадвем приао-

дала к союбилизации как Са-, так и М|>-АТФаз. Выход этцх ферментов и степень их очистки были одинаковыми (см. табл. 4), что подтверждает предположение о том, что активация АТФазы кальцием или магнием обусловлена работой одного фермента.

Это предположение подтверждается также одинаковым характером зависимости Са- и Не АТФазных активностей микросомального и солюбилизиро-ванного препаратов от температуры'и рН, величинами сродства АТФазы к Са (К^ 7 мкМ) и Ч (Кд =17 мкМ), широкой субстратной специфичностью (данные но приведены), а также одинаковым подавлением их одними и теми же ингибиторами (Табл. 7), ,

Таблица 7. Влияние ингибиторов на Са- и ¡^-АТФазные активности микросомального И солюбилизиропанного препаратов из корней ячменя. Среднее из 3-х опытов (% к контролю), (Стеханова и др., 1989, ТШауа вt а!., 1990).

Препараты

Ингибитор Микросомальный Солюбрлизировяшшй

Са йg Са ' ' ' Не

ШЛ. 5 х КГ5 М 92 86 99. • 96

Ванадат натрия.

5 х Ю~5 М 99 95 94 96

ДЭС, 5 X Ю"5 М 85 81 84 88

Фторид натрия,

5 х Ю"3 М 71 .77 77 75

ЮТЕ, I х 10~4 И 100 95 92 '' 95

Молибдэт натрия.

I * И •91 97 . 90 83

Таким образом, сравнительный биохимический анализ микросомального и сслюбилизированного препаратов обнаружил аналогичные свойства Са- и

Kg АТФазных активностей, .что, по всей вероятности, свидетельствует о наличии в корневых клетках ячменя одного фермента - АТФазы, активируемой двухвалентными катионами и обладающей несколько более высоким сродством к ионам кальция.

2.315. Очистка фермента ■

Поскольку экто Са-АТФаза была впервые обнаружена в корневых клетках важно было оценить ее полипептидный состав и молекулярную массу (Тихая и др., 1993)'.

Первый этап солюбилизации-фермента заключался в обработке микросо-мальной фракции хлористым калием, который, как было показано выше, был эффективным солюбилизирующим агентом, для этого фермента. Дальнейшие стадии очистки.были следующими:'высаливание фермента сульфатом аммония, диализ и элюция через DEAB-Toyopearl-650 1! и разделение на линейном градиенте глицерина, 1

В результате элщии ферментного препарата через БЕАЕ-Тоуороаг1-650 H обнаруживалась высокая Са- или Hg-АТФазная активность в буферном пи; ке и очень низкая в.0,1 M KCI (рис.8). При этом в препарате буферного пйка обнаруживались более четко полипептидо с и.и. 25, 46 и 50 кДа, в то время как в препарате Ш пика - 25, 33 и 36 кДа полипептиды -(рис.9). Можно допустить, что столь высокая АТФазная активность буферного пика скорее всего объясняется отсутствием в этой фракции каких-то белков или ферментов, участвующих в регуляции активности этого фермента, а не очисткой ферментного препарат?. '

Дальнейфая очистка двух препаратов на линейном градиенте глицерина не цривела к увеличению степени очистки исследуемого фермента и не изменила его полипептидный состав. Гель-фильтрацию и нативный электрофо-' рез для оценки молекулярной массы фермента провести не удалось из-за высок/ой сорбционной способности экто Са-АТФазы. Па это свойство фермента указывали в своей работе, выполненной на животных клетках, Лин и тФэйн (Lin; Fain, 1984).

-i 4 80

ч

к .1 J

320

- i60

1

го ^о бо

Ы* фракций

Рис.8. Профиль элвдю! белка (сплоаная линия) и Са-АТФазной активности (пункт!фная линия с ОЕАВ-ТоуорваП-бБО Ц.

.Диализованный .препарат (0.56 мт белка) помещали на колонку '(0,9 . х,13.5 см) и злюировали со скоростью 0,4 |1Л/мин по I мл в каждую пробирку. Ферментный препарат был элюирован буфером и ступенчатым градиентом хлористого калия. (Тихая и др.,1993).

2.3.6. Сравнение экто Са-АТФазы растительных и животных клеток и ее' предполагаемая функция.

История открытия зкто АТФазы в кивотных клетках- началась с работы Акса (Асз et all, 1954), в которой было показано наличие на поверхности клеток опухоли АТФ-гидролазной активности. Трэмс и Лутер (Тгапз7 lanter, 1974), а затеи ряд исследователей (см.обзор Иа£у., 1986) наэли на внепней поверхности зукариотических .клеток АТФазную активность. Ее-ским доказательством фушавкрвфованяя на ллазмалемме «штатных клеток ' экто АТФазы, обладащей пирокой субстратной специфичностью (с наивыс-сим сродством к АТФ) я стимулируемой двухвалентными катионами (с наивысшим ..сродством к кальцию), а именно экто Са-АТФазы, являются ре-

0.4

94 6? « SO • 20.114.4 кДа

. 1.6

t.l

0.8

Ö.4

U___А—.J

НАЛ! „AI

94 et 43 io ТОЛ \4,4siu

Рис.9. Электрофорез В ПЛАТ с ДДС-На ферментных препаратов, полученных в результате диализа (в), элшии чв рез DEAI-Töyopiarl 650 £ буфером (б), 0J н KCl (в) и .солвзилизаиии 0,12 тритоном Х-100 (я). Донсито-метрическое сканирование гелей, наг руженных 10-15 мхг белка и охраеен-кых Кумассй голубым R-250.г,е-.стандартные белки, слева направо, (кЮ: фосфорилаза Б (94), ВСА (6?). оваль Сумин (43), карбоангидраза (30), соевый ингибитор трипсина (?.0,П и ' х-лактальбумин (14,4). (Тихая и Яр.,1993),

зультаты более поздних работ (Ып, Fanson, 1988, Qhyacfylkl et al'.v 1988, Нас Donald. Seeks, 1988, Birch-Hachin, Dawson, 1988, Zhao et -al"., 1989, Tafíorel et al., 1989). Такой продолжительный период от от крытая экто АТФазной активности до идентификации фермента обуслов-. лен тем, что многие исследователи подвергали сомнению наличие внеклеточного АТФ, а. следовательно, и существование экто Са-АТФазы, кото- ■ рая использует для своей работы этот субстрат. Однако с привлечением новейпей техники было убедительно доказано наличие не только внеклеточной АТФ (Chaundry. 1984) и экто Са-АТФазы (îlagy. 1986),. но и экто-ПКаз (Kubler, Xinzel. 1986).

В растительных клетках была обнаружена Ca- или tig АТФазная актив-' . ность (Kylin, Kahr, 1973, Ponlnan-Яертви et al., 1978, .Erdel et^.al',, 1979, Tognolli, Harra, I98I), но ни в одной работе не изучалась ориентация активного центра фермента и не была описана подробная его-характеристика. . • • Нам удалось обнаружить активность экто Са-АТФазы не только на по- • верхности правильно ориентированных замкнутых везикул плазмалеммы микросомальных фракций, выделенных из корней ячменя и пшеницы, но и на * поверхности интактных корней. При этом было выявлено поразительное т сходство между свойствами зкто Са-АТФазы ¡тавотных и. растительных кле- ! ток-(Табл.8), которое свидетельствует о единстве, животных и растительных организмов в отношении их АТФазных систем, если учесть it тому re функционирование на плгзмалекме их клеток К,Mg и Ca.ïïg-АТФаз (Serrano. IS89, Evans et all, 1989).

Функция экто Са-АТФазы как в животных, так и в растительных клетках до сих пор нз раскрыта. Предположение об участии этого фермента в регуляции поступления ионов кальция, высказанное Туана и Дхалла (luana,, Dhalla., 1982), на наш взгляд, маловероятно, поскольку вход кальция как. в животные, так и в растительные клетки осуществляется пассивно через ■ кальциевые каналы, функционирований которых-не зависит от. наличия:в среде АТФ. Если допустить, что Са-АТФаза не участвует непосредственно . в транспорте кальция, но ответственна за открывание и закрывание каналов, то она должна проявлять свойства миозиновой АТФазы (узкая субст- • ратная специфичность, резкая'стимуляция в присутствии акйша, проявление К-ЭДГА активности);, однако, как показали результаты наших- экспериментов, Са-АТФаза корневых клеток такими свойствами не обладала -

(данные не приведены). Поскольку в растительных клетках, так же как и в животных, нуклеозидтрифосфаты и АДФ могут оказывать эффекторное влияние на функционирование ряда ферментных белков, то не исключена возможность участия экто Са-АТФазы в регуляции уровня этих соединений в апопластй растительных клеток.

Итак, на поверхности плазмалеммы корневых клеток ячменя в широком диапазоне температур и pH был обнаружен фермент, который обладал широкой субстратной специфичностью с наивысшим сродством к АТФ, активировался микро- и миллимолярными концентрациями двухвалетных катионов (Ca, Kg и Ял ) с наивысшим сродством к ионам кальция, на проявлял чувствительности к ингибиторам ''транспортных" АТФаз. Все это послужило , основанием называть его экто Са-АТФазой или экто Са-нуклеотидазой.

г Л. IS VITB0 ■ ДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА АТФ-АЗНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЛАЗМАЛЕММЫ КОРНЕВЫХ- КЛЕТОК

. В ряде работ было показано стимулирующее in vitro действие 2,4-Д на АТФазу микросомалъных фракций, активируемую Kg (Каваио, Yanaki, -. 1973, 1974, I97S) , Hg и К (Scherer, líorre, 1978) или Ca и К (Erdei et al., 1979), которое усиливалось после предварительной обработки растений этим синтетическим аналогом ауксина (Кавагао. Yamaki, 1974, Erdei et al., 1979). Сравнение действия ауксина с действием его неактивного аналога на Og-АТФазную активность очищенной микросомальной фракции бщо показано только Шерером с соавторами (Scherer, 1981, 1984, Scherer., Иогге, 1978). Однако гормональный.эффект ауксина, обнаруженный ими, не удалось воспроизвести в опытах с очищенными микросомалышми фракциями из корней гороха (Gabatholer, Cleland,, 1985) и колеоптелей овса (Cleland,, Lomax,, 1977). Что касается цитокшшнов, то их стимулирующее действие на K.Wg-АТФазную активность было показано только на грубой микросомальной Фракции (Максимов, 1979).

Как было сказано выше (см. раздел 2.1), стимулирующее действие гормонов in vivo на АТФазную активность может быть следствием не только синтеза АТФаз, но и прямого действия фитогормонов на их активность.

Важно было выяснить возможность прямого действия фитогормонов на АТФаЪную активность, обнаруженную нами на внутренней и внешней повер-

Таблица 8. Сравнение свойств экто Са-АТФаз животных, и растительных клеток.

(Данные по экто АТФазе плазмалеммы животных клеток взяты из работы Яабу, 1986).

Свойства фермента

Животные кЛетки

Растительное клетки

Ионная

специфичность

рН оптимум

Стимуляция двухвалентными катионами в области их микромолярных и миллимол'ярных концентраций • , . . К,, для Са и Иб 1.4 Ю-4 М К^ для Са ' 7 -Ю"5 М

Кд, для ^lig Г7 М

7,4 - 7,8

5,5 - 6,5

Субстратная специ- | фичность

Чувствительность к ингибиторам

Гидролиз АТФ, ГТФ. УТФ, ДТФ, АДФ. но не АМФ, НФФ, ГФ, с наивысшим сродством к АТФ.

Кд для АТФ 2,5 1СГ5 М ■ К^ для АТФ 3,6 1СГЭ !.:

Не чувствительны к действию ингибиторов .' "транспорт!шх" АТФаз. Подавляются непрони-кавдими агентами и фторидом натрия/

тп~5 и

Ориентация

, Активность проявляется на поверхности правильно ориентированных везикул плазмалеммы микросомальной фракции. ' -На поверхности интактных . На поверхности ин-клеток . такт'йых корней

хностях плазмалеммы. Поэтому, их добавляли непосредственно в среду инкубации, содержащую микросомальную фракцию, выделенную'из корней контрольных и предварительно обработанных 2.4-Д, БАЛ и ФК растений (Ти-

хая и др.,1988, 1989,). Опыты показали (табл.9), что, будучи внесенными в среду инкубации, ни БАЛ, ни 2,4-Д, ни ФК не оказывали никакого влияния на активность обеих исследованных АТФаз и, следовательно, не действовали на них непосредственно (Тихая и др., 1988, Tlkhaya et al., 1987, îazabaevà et al., 1987).

Таблица 9. Влияние БАП (I0-8M), 2,4-Д (I0"IG M) и ФК (IO-8 M) на АТ^азную активность микросомальной фракции из корней ячменя. Обработку корней 15-дневных проростков БАП или 2,4-Д проводили в последние трое-суток, à ФК в последние сутки выращивания. Температура инкубации 22°. Среднее из 5-ти опытов. (Тихая и др., 1988).

Добавки мкмоль Рн / ыг белка ч

в среде инкуба- в среде выра- К, Hg АТФазная С а АТФазна*

ции щивания активность активность

t 52.3 i 2.Т

БАП ■ - 9,0 ± 1,8 53,0 ± 1,9

2,4-Д. 1 .■ - ■ 8,6 t 1,6 54,1 * 1,5

ФК - 8,6 ± 2,0 54,3 ± 1,7

-, БАП 17,2 ± 1,9 112,2 ± 2,3

БАП БАП 17,3 ± 2,1 111,9 + 2,9

- 2,4-Д 15,2 ± 2,2. 99,8 ± 2,4

2,4-Д 2,4-Д 15,1 * 2,0 99,9 i 2,5

- ФК 16,9 ± 2,7 81,3 ± 2,9

ФК ФК 16,7 + 1,3 81,5 + 2,5

Одним из условий стимулирующего действия ауксина на Н-АТФазную ак тивность в In vitro системе, указывал"Шерер (Scherer, 1984), явля&тся добавление в среду гомогенизации нуперкаина и холина.

Однако" добавление ^ами^этих соединений на стадия гомогенизации но

приводило к проявлению стимулирующего действия фитогормонов на АТФаз нуп активность микросомальной фракции (Рис.10).

I/

I/

10 - — 10

о б £

S • Г*- ч V, 5

г < 'О ч- Си < 9-

I/ <Мг

40

го

5; С! . '■О ГЦ

К, Mg - АТФаза

са - дт<рел«

Рис.10, влияние БАЛ (Ю-8 И), 2,4-Д (Ю-10 М) и ФК (Ю-8 М) In vitro на АТФазную активность микросомалышх фракция из корней контрольных проростков ячменя, гомогенизированных в отсутствии (А) или в присутствии 10~3 М нуперкаина и 4-ного % холина (Б).

Фракции из корней 15-дневных проростков, выращенных на 1/8 питательного раствора. 7 - ATФазная активность, мкмоль Рн /мг белка час. (Тихая и др.. 1988).

В последующей работе Шерера (Scherer, 1984) стимулирующее.действие in vitro ауксина на K.lig-АТФазную активность проявлялось только на фоне швсромолярных концентраций АТФ. Однако нам, как и американским исследователям, работавшим на микросомальной фракции из корней гороха (Gabathuler, Cleland, 1985) не удалось воспроизвести его результаты." Использование ряда других условий, оптимальных для связывания 2,4-Д с мембранами : 5°С или 22-25°С pH 5,5, отсутствие shi-агентов, (Ray et al., 1977) и ФК - при pH 6,5-7,0 (Harra И. et al., 1992), широкий диапазон концентраций этого токсина' в наших опытах также не привели к • стимуляции исследованных АТФаз'(Тихая и др., 1988, Tikhaya, 7akhnißt'-rov, 1988). Стимулирующий эффект.ФК на эндо K.Hg-АТФаэу плазмалеммы растительных клеток удалось показать только в лаборатории Mappe

(Bellagna et al., 1977).

Можно предположить.'что одной из причин отсутствия In vitro регуляторов роста на активность экто и эндо АТФаз является то, что исследуемые ферменты находятся в оптимальном режиме своей работе и поэтому при добавлении регуляторов роста в среду инкубации не наблюдалось изменения в активности АТФаз..Тот факт, что ПКаза соочнцалась с экто АТФазой (табл.10) допускает возможность фосфорилированного состояния экто фермента, что безусловно требует специального изучения. Аналогичная ситуация может иметь место для Н-АТФазы, которая, как было показано на микросомальных фракциях из овса и томатов, способна фосфорялироваться в in vitro и in vivo экспериментах ПКазой (Schaller, Sueeman, 1988).

Таблица 10. Очистка ПКазы из микросомальной фракции корней ячненя Результаты одного из характерных опытов.

Стадия

32Р вкл, имп. мин-1 Степень . ■ Полипептидный

на 10.мкг белка

Микросомальная фракция

II544

очистки, раз

I

состав, кДа

Ш-экстракция

50512

ВШ Toyopearl 650 К буферный пик 0,1 н KCl. пик

224257 250I2I

19 5D, 46, 25 21 36, 33, 25

Градиент глицерина буферный пик 0,1 н Ш пик

1244500 I39547I

108 121

5D, 46 25 36, 33, 25

' Не исключено также, что в лрогцессе выделения и очистки микросомальной фракции мембраны могут утрачивать лабильно связанные с ними регуляторные белки и ферменты, участвувдих в регуляции активности АТФаз.: Потеря белков может происходить не. только в процессе выделения, микросомальной фракции, но уже на стадии промывания корней дастиллиро-

4

j

ванной водой. В последнем случае мы имеем дело с гипоосмотическим шоком, который может приводить к освобождению белков с поверхности -плазмалеммы корневых клеток . Действительно, во фракциях, элюированных с НЕАЕ Тоуореаг1 650 М хлористым калием (рис. II) обнаруживались белки с мол.массой от 13 до 60 кДа (данные не показаны).

На основании полученныз результатов .мы пришли к выводу о том, что " микросомальная фракция не может быть использована в изучении in vitro действия регуляторов роста на экто и эндо АТФазы плазмалеммы корневых клеток ячменя.

2.5, IN 7170 ДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА АГФазнун АКТИВНОСТЬ ШШШЕКМН КОРНЕВЫХ КЛЕТОК

В опытах in Tlvo, т.е. при внесении БАЛ в питательный раствор во _ время выращивания проростков ячменя, их стимулирующее действие зависело от возраста проростков и уровня ювдерального питания (Тихая и др., 1988, 1989, Tíkhaya et al., 1987,1989). Из табл.И, видно, что Са-АТФззная активность мембранных препаратов из корней, контрольных • проростков с возрастом снижалась, тогда как ее стимуляция в присутст- ' вин ЕЛП повышалась как в.относительном, так и в абсолютном выражении'.

В контроле (без цитокинина)'наивысшая активность Са-АТФазы наблюдалась у проростков ячменя, выращенных на полной питательной среде,

ÍS 1

ib

20 60 loo 14 О

Ы" <рракиий

Рис.11. Профиль злюции с ДЕАЕ-Toyopearl 650 М материала, полученного после промывания корней. дистиллированной водой. Стрелками .обозначены ' фракции в которые добавляли KCI указанной концентрации. (Тихая и др., 1989, Кузембаева и др., 1989, Tikhaya at al., 1989).

Таблица II. Действие in ?ivo I0"8 M ЕАП на Са-АТФазную активность микросомалъной. фракции'в зависимости от возраста проростков ячменя. Проростки выращены на 1/8 нормы питательного раствора, ВАЛ добавляли в питательный раствор в последние трое суток выращивания. Среднее из 4-х опытов. (Тихая'и др., 1988, ïikhaya et al., 1987).

мкмоль Р../мг белка ч Активация в присутствии БАЛ

л

■ Возраст . Активность растений, - БАЛ + БАЛ мкмоль Р^мг ч %

сутки

7 72,3 + 1,06 95.3 + 1,3 23,0 ± 1,6 32

9- 66,3 + 2, СО 105,0 + 2,7 38,7 4 3,1 58

15 , 57,1 4 1,10 102,4 + 3,9 45,2 ± 4,0 79

снижение уровня питания в 8 и 20 раз приводило к ее заметному уменьшению (табл.12). Стимулирующее действие БАЛ на этот фермент наблюдалось только у проростков, выращенных на 1/8 и 1/20 питательной смеси, тогда как добавление этого регулятора роста в полный питательный раствор вызывало небольшое, но достоверное ингибирование активности Са-АТФазы. Это можно объяснить тем, что с возрастом растений, выращенных при недостатке элементов минерального питания, происходит снижение уровня эндогенных циторшинов в растении (liíchnierwlcz ot al"., 1976), в результате чего компетенция корневых -клеток к экзогенным цитокининкм увеличивается.

У растений, выращенных на полной питательной среде, активность Са-АТФазы в ответ на обработку растений БАЛ не только не увеличивалась, но даже снижалась, что, вероятно, связано с увеличением содержания эндогенного цитокинина в корнях ячменя.

Сравнительное действие 2,4-Д, БАЛ и аденина на эндо E.Ug- и зкто Са-АТФазных активностей приведено в табл.13.

Поэтому можно было полагать, что действие регуляторов роста на вк-тивнЬсть исследуемых АТФаз может зависеть от длительности обработки

Таблица 12. Действие 1п т1уо БАЛ на Са-АТФазную активнрсть микросо-мальной фракции в зависимости от уровня минерального питания проростков ячменя.

БАП добавляли в питательный раствор 15-дневных проростков в последние трое суток выращивания. Среднее из 4-х опытов. (Тихая и др.,' 1988, ' ТШауа Ш а1., 1987).

Норма - БАЛ + БАП (Ю-8 М) Активация

Активность мкмоль Рн/мг белка ч мкмоль. Рн/.мг-белка ч %

I 73,7 ± 2,7 61,9+3,5 -11,8 ± 4,4 --8

1/8 57,1 ± 1,1 102,4 £ 3,9 45,2 *4,0 79

1/20 49,3 + 1,0 90,1 А 1,4 40,8 ± 1,7 83

корней ячменя регуляторами роста. Действительно, при относительно ко-.' ротких экспозициях (менее 7 дней) наблюдалось стимулирующее влияние БАП и 2,4-Д на активность обеих АТФаз, а при более длительных (более 7 дней ) - ингибирующее (Тихая и др., 1988).

■ Таким образом, длительная предобработка корней регуляторами роста в течение выращивания проростков (1а т1?о) повышала активность-изученных АТФаз микросомальноя фракции. Можно предполагать, что действие фито-гормонов на АТФазнув активность мембран опосредовано через их синтез.

Действительно, из рис.12 можно видеть, что ЦГИ снижал стимулирующее действие на активность обеих АТФаз, вызванное ФК, 2,4-Д и БАП в боль-' пинстве случаев - более чем вдвое. .

Результаты этой серии опытов предполагают регуляцию' в изменении активности экто и эндо АТФаз синтетическими аналогами фитогормонов и ФК путем синтеза молекул этих ферг-^нтов. ;

Аналогичные да1^ые были получены по действию ЦГИ на ИУК-вызванную стимуляцию Н-АТФазы мшсросомальной фракции. выделенной из колеоптилей

питательного раствора

Таблица 13. Влияние БАЛ, 2,4-Д и аденина на K.lrfg и Са-АТФазные активности микросомальной фракции ln vivo.

Фракция из корней 15-дне'вных проростков ячменя, выращенных на 1/8 питательного раствора. Указанные соединения добавляли в питательный раствор в последние три дня выращивания. Среднее из 3-х опытов, (Тихая и др.,-1988).

K.Mg-АТФаза

Са-АТФаза

Добавки

Контроль (без добавок!

БАЕ, 1СГ8 М

Апенин. ТО-8 М

2,4-Д, Ю"14 М

мкмоль Рн'/мг белка ч % мкмоль Рн/мг белка ч %

TO.fi ± 1.2 ТОО 57.Т ¿ Т.Т ТОО

"" " " » . . ~ *

23,3 ±1,4 219 102,4 ± 3,9 179

26.2 + Т.О 46

20,2'+ 1,9 189 88,1 ± 2,8 154

кукурузы. Кроме того, с помощью иммунохимического анализа было показано увеличение числа молекул Н-АТФазы в ответ на In vivo обработку ко-лооптилей ИУК (Hager et al., 1991).

Таким образом, в этой части работы было обнаружено in vivo действие регуляторов роста на зкто и эндо АТФазы плазмалеммы корневых клеток, которое зависело от возраста проростков и уровня их минерального питания.

3. 3 А К Л D Ч Е II И Е

Один из наиболее существенных результатов - обнаружение ранее не известного для растений фермента - зкто АТФазы. Это позволяет заключить, что. в корневых клетках функционирует два типа АТФаз, гидролитическая активность которых проявляется на разных сторонах поверхностной цитоплазматической мембраны. Представителем первого типа является *

V

30 г

40-

Са - /7 ТФаза

<

ЕЯ

£

У

/

£

1/

20г

10

к,М£-*АТФаза

1 г 1г з 1г г г

-<?Г-<РГ УК -ФГ ВАП 3,4-Ъ

< 2 13 3 12 .С? ' .<рг -ФГ ФК -<РГ ВЦП 2,4-Л

Рис.12. АГФазная активность микросомальшх фракций из корней обработанных Ю"8 М БАЛ. Ю"10 И 2,4-Д или Ю-8 М ФК проростков ячменя; вы--, ращенных в присутствии ЦГИ (5 иг/л) в среде выращивания (2) или без ; него (I). 7 - АТФазная активность, мкмоль Рн,/мг белка ч (Тихая и др., 1988, ТШауа а!.. 1987). ; . _ .

зндо К.Ц^-АТФаза (Н-АТФаза), которая является Интегральным белком, -осуществляющим гидролиз АТФ на внутренней стороне Плазма леши, представителен^ второго - экто Са-АТФаза, которая проявляет свой активность на ее внешней стороне и может находиться в двух формах: пембраносвя-занной я растворимой. Если для зндо АТФаз (К.Нз- и Са,^-АТФазы) характерна узкая субстратная специфичность, то для обнаруженной нага экто АТФазы - пирокая субстратная специфичность.

В отличие от хоропо изученных зндо АТФаз, функция экто Са-АТОазьг не известна. Однако обнаружение фзрмента и связанной с ней ПКазы открывает новую перспективу в изучении гормональной сигнальной системы, • локализованной на внешней стороне плазмалеммы. На наш взгляд, реализация гормонального сигнала должна осуществляться на обоих сторонах плазиалекш, тек как от того, в каком (физиологическом состоянии нахо-

дится мембрана, зависит гомеостаз не только внутриклеточного пространства, но и алоплас'та, В этой связи уместно отметить, что большое внимание в последнее время отводят изучению процессов участвующих в поддержании гомеостаза апопластного компартмента клеток (Саляев, Пузанов, 1993, Touchard et al,, 1987, 1988, 1989, Sentenac et al., "1981, 1989). По всей видимости, биохимические реакции, протекавшие по обе стороны клеточного барьера - плазмалеммы находятся в строгой зависимости друг от друга и подчиняются гормональному контролю. В реализации гормонального сигнала на внешней и внутренней сторонах плазмалеммы, по -видимому, 'принимает участие большое число белков и ферментов, причем ключевая роль отводится в последнее время ПКазам, разнообразие которых было продемонстрировано не только в животных (Ивашкин, 1987), но и в растительных клетках (Ладыженская, Кораблева и др.,1987, Се=-ли-ванкина и др.,1987, 1989, Polya, Daviee, 1983, Polya et al., 1987, Soromarln et al., 1988). В этом аспекте интересны данные Селиванкиной с соавт. (1989), которые нашли, что в ответ на добавление фитогормонов в инкубационную среду происходит,значительная активация ПКазной активности плазмалеммы корневых клеток ячменя и увеличение степени фосфо-рилирования белков микросомалыюй фракции. Тот факт, что ПКаза соочи-щалась с экто АТФазой предполагает, ¡ее локализацию на внешней стороне плазмалеммы. и ее активное участие в регуляции экто фермента в ответ на действие регуляторов роста.

Можно предположить, что в ответ на Гормональный сигнал происходит, с одной стороны, поступление в клетку "сигнал передающих" ионов кальциу. которые запускают различные биохимичесие процесса, протекающие как на внутренней стороне плаз:;алеммы (регуляция активности К,Kg- и Ca.Mg-АТФаз с участием регуляторных белков и ферментов), так и в цитозоле. С другой стороны - быстрое поступление в апопласт "сигнал передающей" молекулы - АТФ, которая может выступать в роли связующего звена между гормон- рецепторным комплексом и эффекторными системамм, ПКазами, локализованными на внешней стороне плазмалеммы. Это обеспечивает включение в действие мгновенного механизма фосфорилирования мембранных -белков посредством активации различного типа ПКаз. Можно допустить, что экто АТФаза принимает косвенное участие в регуляции активности эх-.то ПКаз путем изменения уровня внеклеточного АТФ, а также является г первым компонентом в биохимической реакции образования аденозина, ко-

• торый может оказывать влияние на ряд процессов, протекающих как во внутриклеточном пространстве, так и в апопласте.

Поскольку АТФ обладает зффекторными свойствами, которые проявляются при достаточно низких ее концентрациях, поддержание уровня АТФ в апопласте корневых клеток в определенных пределах необходимо для нормаль- ■ ного функционирования клетки. В противном случае возможно наруоение '' * проницаемости плазмалеммы и гибель1 клеток. Можно предположить, что зк-то Са-АТФаза контролирует уровень нуклеозидтри- и дкфосфатов, начиная работать при достижении определенной пороговой их концентрации.

По всей вероятности, гормональная регуляция АТФаз на мембранном уровне представляет собой сложный комплекс процессой, b который включено большое число различных белков и ферментов. В таком случае не исключена вероятность того, что отсутствие прямого действия регуляторов роста (In vitro) на исследуемые АТФазы обусловлено потерей в прог цессе выделения микросомальной фракции каких-то компонентов этого ре-гуляторного комплекса, которые относятся к растворимым белкам и лабильно связаны с поверхностной цитоплазматической мембраной. При этом связь этих белков с мембраной осуществляется скорее всего только в момент регуляции того или иного биохимического процесса, протекающего-на; уровне плазмалеммы с участием указанных белков (Eeplnal, 1986). ,

Более длительный-процесс адаптации растений к изменениям ионного состава окружающей среды обеспечивается регуляцией исследуемых' АТФаз плазмалеммы корневых клеток через геном. Результаты наших опытов предполагают, что при дефиците минерального питания происходит более интенсивный синтез эндо и экто АТФаз в ответ на добавление регуляторов роста в среду выращивания. Можно допустить, что гормональный сигнал достигает ядерного аппарата с помощью вторичных посредников, регуляторных белков и/или ферментов, в результате чего происходит синтез мембранных белков, в частности эндо и зкто АТФаз.

Следует отметить, что синтез АТФаа был обнаружен у животных, также испытывающих недостаток питания.

Возможные пути гормональной регуляции эндо и экто АТФаз плазмалеммы.корневых клеток, представленные на схеме рис.13, позволяют предположить, что адаптация растительных'и животных клеток к изменениям ионного состава окружающей среды осуществляется с участием одних и тех же или аналогичных'регуляторных белков и ферментов определенного, типа.

Гормональный , сигнал

К неточная стенка 1 Ж)!

VЬУ. у\Ч.\ 1 цдЦЦ1'п11ПI''Г1 [щН.Н.

Рис .13 Возможные пути действия регуляторов роста на мембранном и генетическом уровнях.

41

4. ВЫВОДЫ

1. На внешней поверхности плазмалеммы корневых клеток ячменя и пшеницы был открыт новый фермент - экто АТФаза аналогичная по основным свойствам экто АТФазе плазмалеммы животных клеток.

>

2. На поверхности интактных корней ячменя и в выделенной из них микро-сомальной фракции, состоящей главным образом из замкнутых правильно ориентированных везикул фрагментов плазмалеммы, описаны основные биохимические свойства фермента: широкая субстратная специфичность (с -наиболее высоким сродством к АТФ), стимуляция двухвалентными катионами (с наиболее высоким сродством к ионам кальция), нечувствительность к действию ингибиторов "транспортных" АТФаз (ДЦВД, ДЭС, ортованадат натрия). . •

3. На основании данных о совпадении параметров солюбилизации Са- и Иг-АТФаз (процент выхода ферментов, степень их очистки), а с другой -

. о сходстве основных биохимических свойств микросомального и солюбили-. зированного препаратов этих АТФаз сделан вывод о функционировании в' плазмалемме корневых клеток ячменя одного фермента способного активироваться как Са, так и Не, но обладающего' более высоким, сродством к ионам кальция.

4. Экто Са-АТФаза не относится к интегральным ферментам мембраны. Она лабильно связана с плазмалеммой ионными связями и может находиться в двух формах - связанной и свободной, * •' ----

5. Сделано предположение, что экто Са-АТФаза может регулировать апоп-ластный уровень АТФ как эффектора функций плазмалеммы..В процессе выделения из нккросомальной фракции экто Са-АТФазы обнаружены ее соовы-деление и соочистка с протеинкиназой. На этом основании высказано - , предположение о существовании в плазмалемме растительных, клеток экто ПКаз, которые могут участвовать в фосфорилировании внеклеточной Са--АТФазы-я белков апопласта. '

6. На плазмалемме корневых клеток ячменя, ше:шцы и кукурузы было по -казано наличие К,Kg-АТФасы аналогичной по основным свойствам Н-АТФазе, обнаруг.изнной в плазмалемме растительных клеток (кислый оптимум pH, подавление ДЦКД, ДЭС и ортованадатом натрия).

7. Оценка полной активности зндо K.Mg-АТФазы микросомальной фракции возможна с помощью каналогенного антибиотика - аламетицина, который делает плазмалемму проницаемой для АТФ и кофакторов реакции. Применение неионного детергента - тритона Х-100 для этих целей невозможно, поскольку он способен непосредственно оказывать действие на активность ферментов.

8. Соединения гормонального типа (БАП, 2,4-Д и фузикокцин) не оказывали прямого действия in vitro (в среде инкубации) на активность экто и эндо АТФаз микросомальной фракции. Предполагается потеря в процессе . выделения фракции каких-то регуляторных белков и/или фермен—тов, участвующих в сложной цепи гормональной регуляции АТФаз на уровне плазма-леммы.

9. На основании данных о стимулирующем действии in vivo (в среде выращивания) БАП, 2,4-Д и фузикокцина на зкто и зндо АТФазы и подавления его циклогексимидом предполагается, что действие этих регуляторов роста опосредовано через усиление синтеза АТФазных белков в плазмалемме корневых клеток.

5. СПИСОК, ОСНОВНЫХ РАБОТ, ■ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TBE ДИССЕРТАЦИИ.

1. Тихая H.H., Максимов Г.Б. и др. Катионзависимая АТФазная активность мембран, изолированных из корней кукурузы // Физиология растений. 1984 Т.31. Выя. 2. С. 221-228.

2. вахмистров .Д.Б., Тихая И.И. и др. Полная активность КД^-АТФазы изолированных мембран растительных клеток // Докл. Акад, Наук СССР 1984. Т-.276. N 5. 1277-1280.

3. Тихая Н.И., Максимов Г.Б. и др. Полная активность К,Мд-АТФазы и ориентация везикул мембранных препаратов растительных клеток // Физиология растений. 1984, Т.31. В.5. С.882-888.

4. Вахмистров Д.Б., Тихая Н.И. и др. Экто-Са-АТФазная активность плазмалеммы корневых клеток // Докл. Акад. Наук СССР 1985. Т.280.В.6 C.I5I0-I5I3. •

5. Тихая Н.И., Тазабаева К.А., Вахмистров Д.Б. Са-АТФаза.плазмалеммы корневых клеток ячменя: свойства и ориентация. // Физиология растений. 1985. Т.32. В.6. C.I079-I089.

6. Тихая Н.И., Максимов Г.Б. Выделение плазмалеммы из растительных клеток. // В кн. Метода изучения мембран растительных клеток. ЛГУ • I98S. 20-29. '•'/'.

7. TiJchaya K.I., Tasabaeva К.A, Vakhnlstrov D.B. Do the phytohornones effect on the plasaalema-bound K.Ifg- and Ca-ATPase activities of • barley root cells? // Proceedings on the 17 Intern. Symposium on plant' gronth regulators,Sofia, Bulgaria, 1987, P. 653-657,

8. Cazabaeva K.A., Tikhaya H.I., Takhmistrov D.B. Sffect of cytokinin and auxin on the plasma nenbrane-bound AlPase activity of barley root, cells. // Proceedings'of the 17 Youth Symposium on plant metabolism, regulation. 7arna, Bulgaria, 1987, P. 187-190, v

9. Тихая Н.И., .Тазабаева К.А., Вахмистров Д.Б. Прямое и опосредован- ■ ное действие фитогормонов на активность мембранных АТФаз корней ячменя // Физиология растений. 1988. Т.35. В.2. С. 276-284.

10. ТШзуа ПЛ. 7akhnistror D.B. Ecto-Ca-ATPase of plasma membrane fraction from barley roots. // In: Structural and functional aspects of transport in roots, Eds. B.C. boughnan at al., Kluser Academic . Publishers, 1989, P.85-87.

11.Tikhaya Я.1., 7akhraIstro7 D.B, The plasma membrane-bound ATPas'es of barlsy root ceels: properties and regulation. // Proceedings of the 6-th Intern. Congress of the Federation societies of plant physiology. Yugoslavia. 1988, P. 58-59. ' •. • . •'.

12.Селяваккгаа C.D., Новтжова Г.В., Тихая Н.И., Романко Е.Г., Кулаева ОЛЬ • Протеинкиназа плазнаяемш корневых клеток ячменя - мишень действия фтгорюнор-е // Докл.Акад.Наук СССР 1989. Т.308. n 2.С.508- 51Г. '

13.Тихая Н.И., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В. Действие фитогормонов на протеинхмназную активность плазматических мембран корневых клеток ячменя. // Физиология растений. 1989. Т.36. В.5. C.I003-I0II.

14'.Стеханова Т.Н., Федоровская М.Д., Тихая II.И., Вахмистров Д.Б. Экто Са++- или Mg+±- АТФазы корневых клеток ячменя: один или два фермента? // Физиология растений. 1989. Т.36. В.5. С.926-932.

15.Кузембаева Н.А., Тихая Н.И. и др. Модулятор Са-АТФазной активности корней ячменя, освобождающийся при осмотическом коке. // Физиология растений. 1989. Т.36. В. 5. 933-938.

16.Tikhaya N.I., Selivankina.SЛ., Hovlkova G.V. Effect oi hornones on ATPase and proteinkinase activities oi microsomal fraction iron) barley roots. // In: Plant membrane transport: the current position. Eds, Dainty J. et al., Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Devi-slon), 1939, P. 427-430.

17.Tikhaya N.I. et al. Properties of ecto-Ca-ATPase isolated iron barley (Hordeura vulgare b.) roots. //In: Plant nutrition - physiology and applications. Ed.. Van Bousicliem И.1., Kluwer Academic Publishers,

«£30 P. | 3:3-1 35-.

IB.Tikhaya H.I., Zagoskina II.7., Fedorovskaya U.D. .Ecto-Ca nucleotidase of barley root cells.//In: Root ecology and its practical application Z. Eds, Kutshera L. et al., Verein fur 'SurzellorBChung A-9020 Klagenfurt, p. 3S7-3S8.

19.Федоровская М.Д., Тихая Н.И. и др. Экто Са-АТФаза (экто-нуклеоти-даза) корневых клеток ячменя, т.Растворимая и менбраносвязашгая формы. // Физиология растений. 1993. Т. 40. В.2. С.133-138.

20.Тихая II.И., Федоровская М.Д., Стеханова Т.Н. Экто Са-АТФаза (зкто-нуклеотидаза) корневых клеток ячменя. 2. Очистка и некоторые свойства фермента. // Физиология растений. 1393. Т.40. В.2.(3.139-145.