АТФ - зависимый мембранный транспорт катионов и роль цитокининов в его регуляции у растений

Максимов, Гемир Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АТФ - зависимый мембранный транспорт катионов и роль цитокининов в его регуляции у растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "АТФ - зависимый мембранный транспорт катионов и роль цитокининов в его регуляции у растений"

у злы

г 6 //)7

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ Л

ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им.К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 581.192.7 + 577.3

МАКСИМОВ Гемир Борисович

АТ'5- ЗАВИСИМЫЙ МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ И РОЛЬ ЦИТОКИНИНОВ В ЕГО РЕГУЛЯЦИИ У РАСТЕНИЙ

( 03.00.12 - физиология растений )

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в формэ научного доклада

МОСКВА 1989

работа выполнена в лаборатории биофизики растений Биологического научно-исследовательского института Ленинградского ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственного университета.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.А.Опритов

доктор биологических наук,

профессор 0.0. Лялин

доктор биологических наук, Н.П.Кораблева

Ведущее учреждение:

Институт ботаники им. Н.Г.Холодного АН УССР

Защита состоится "....."............1389г. в.....

на заседании специализированного совета Д 002.45.01 по ващите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР (127106, Москва, Ботаническая ул., 35)

Научный доклад разослан ..............1989г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд.биол.наук

Ю.В.Балнокин

- 3 -

.,: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО ГЛКА РАБОТЫ

Актуальность проблем-.:. Разработка сиотеш минерального питания, обеспечивающей высокую продуктивность растений, ;юг.й1сл;г.;а без знания механизмов регуляции поступления ионов в метку. Бак-нейпкгл звеном в общей регуляторной системе у растений являются фитогорконн (Полевой, 1982). 'Л.'.естса достаточно больиоэ колкчест-во работ, в которых показано активирующее действие фитогорконов на поглощение минеральных олег.еитоз к секреции протонов кнтактны-мл шпi отделенными корнями и другжи органа-,л (Абуталкбов и др., I9G9, 1975; Аламгир, ÍS79; Медведев, ¡¿ixcmoB, 1979; ;.!акс:а:ов и др., 1979; Полевой, 1932; Ладыт.енская, Кораблева, 19Ь5; Пап , I9S2; Daviea , 1973; Pitaan et al ., 1975). Однако, ряд авторов не обнаружил стимулирующего действия фптогорконов на поглотительную деятельность растении (Абуталыбов и др., I9S9; ызрданоБ и др., 1975; Waioel et al . , 1065;Keirincks , 1368; Hishko, Prikho-dko , 1934; Zsoldos at al,I9S4), то есть результаты, полученные на разных объектах разными авторами часто противоречивц.- Причины неоднозначной реакции неизвестны, хотя априори очевидно, что на такой сложной системе, какой язля-з-гсл целое растение и даае орган, зашить их не удастся. Практически невозможно з этом случае ответить на вопрос, действует ли гор.мон непосредственно на плаз-калеьлду или его действие на транспорт поноз осуществляется через реакции внутриклеточного :.:етаболиз.\';а. Анализ литературных данных погавкает, что факт первичного взаимодействия фитогор.мопов с плазмалег-ыой при регуляции ее функциональной активности остается в большинстве случаев недоказанно:.:.

Лая изучения г.:еханизг,-д действия фитогоргдонсв на г,к,'.бранном уровне необходимо е.,'.оть чкетуа однородную фракции плаз.'.лла.ыы, которая сохраняла би способность проявлять все основные трапепор-тние функции. Крайне з&'.акчиво для этой цели использовать заг.'.кну-тне фрагменты плазматической мыбраки, для. которих известны функциональные характерхстккя активных лонных насосов.

В настоящее зреггл накоплен значительней зкелоргслентальнкй материал, подтвэрздакщкй функционирование з плазг.'.але:.з,:е растительных клеток протонного насоса АТФазной природа (Зоробьсв, 1980; Палладии, 1983; Тихая, ;¿r-:cn:.;cE и др., ID£4; Vara, Serrano , 1983; Serrano , 198-1; Sze , 1934). Возникает вопрос: ыскст ли ЬГ^-АТФаза осуществлять транспорт ерлозаркдшх катионов в клетку? По швкяи Пгшашшой (1987) баи.ьжетво иоолодоватяоН ечнгает.

что К^-пасос создает электрохимический градиент, по которому через специальные К^-канаяы поступают коны калия. Нэпосредствен-ноо же участно Н^-АТФазы в транспорте калия, аналогично апикальным мембранам слизистой оболочки желудка аивотных, не доказано.

Практически отсутствуют данные и о способах или принципах регуляции активности транспортных А'ГОаз у растений.

Действие фитогормонов на изолированных мембранах было показано в нескольких работах конца 70-х годов, однако, эти результаты в дальнейшей но были подтверждены и, пожалуй, только Корер ( Schorer , I9SX, ISÖ4) продолжает публиковать статьи, в которых приводятся данные о спыулирукще.ч действии ауксина на гидролиз АТФ. Сведения о роли цятокинпнов в регуляции мембранного транспорта ионов мы не нашли.

Неоднозначность экспериментальных результатов при изучения механизма гормональной регуляции функциональной активности мембран у растений связана, возможно, с отсутствием надекной модельной системы, адекватно отражающей пространственную ориентацию плазматической мембраны в клетке, ее трансмомбрашши потенциал СП,'Л), поскольку до настоящего времени в абсолютном большинстве случаев исследования ведутся на инвертированных везикулах, где и взаиморасположение структурных компонентов мембран, и электрофизиологические характеристики плазмогамии не соответствуют их состоянии в растительной клетке.

Другая причина мо;?.ат являться следствием недостаточного внимания к исходному физиологическому состоянию системы, ее компетентности к данному фитогормону. Последняя определяется, в коночном счете, интенсивностью к направленностью метаболических к,в частности, катаболичоеккх процессов. Прекрасным подтверждением тому являются олова из книги Ф.Коэна ( Ph. Cohen , 1263) -"Глазная задача при изучении регуляции активности ферментов в клетках или тканях заключается в том, чтобы понять механизмы, которые связывают процессы метаболизма с функциональной активностью ферментов".

Работа обобщает результаты исследований, выполненных в лаборатории биофизики растений Биологического научно-исследовательского института Ленгосукиверсптета за период с 1971 по 1988 гг. 3 выполнении работы помимо автора принимали участие С.С.Медведев, А.Н.М.Алаыгир, А.Ю.Батов, Л.М.Крангауз, Н.В.Голубева, Н.А.Разумо-ва, К. J1. Иванова и Т.В.Семенова. Часть исследований выполнена сов-

кестяо с сотрудниками КОР АН СССР Е.Г.Романко, С.Ю.Селшанки-ной и И'.Е.Моикозкм (руководитель - проф. О.К.Куласва) и Н.И. Тихой (руководитель - проф. Д.Б.Вахмистров), с Д.Н.Зоробьевкм (МГУ), Л.О.Синютиной (лаборатория функциональной активности мембран Л1У, руководитель - проф. 3.В.Полевой), Ю.В.Даргиназиче-ке (институт ботаники АН Лит.ССР, руководитель - акадокик АН ХитСС? А.И.Меркис).

Исследования велись в рачках координационного плана НИ? АН СССР по проблеме "Оизиология и биохимия растений", 2.28.5. № гос.регистрации - .01.8в.0081970, шифр заказ-наряда - Б.07.31.

Цель и основчк'о задачи работ». 3 соответствии с вышесказанным основной целью настоящего исследования являлось выяснение роли фитогоркокоэ цктокинкновог природы в регуляции актизного мембранного транспорта хатионов в растительных метках.

Автор поставил парод собой в ходе выполнения работы следующие конкретике задачи:

1. Изучить основные характеристзки катионст1:мул1фуе:.'ои AÏCa-за, локализованной во фракции .таиЗран растительных клеток, обогащенной фрагментами плазшлеид».

2. Оценить проницаемость плазмалетзлы в системе in vitro.

3. Исследовать транспортные фушщии кег.-.браносвязанной АТОа-зы растительных клеток.

4. Изучать действие цглткглков на транскекбраккый потенциал и сопротивление цитоплазу.атической ксмбраиц.

5. Изучить влияние цитокининов на дыхательный катаболизм, АКазную активность и поглотительную деятельность корней пророст-коз кукурузы.

6. Исследовать механизм гормональной регуляции АТО-зависшо-го транспорта катионов через плазмалекыу растительных клеток.

Нр.учнач новизна т>аботы. Проведенная работа позволила выявить .татаболическш процессы и факторы, через которые осуществляется регудяторное действие цитокиншоз на по'глотительнуи деятельность корневой систеглы растении.

Показано, что плаз;.:але:?.'л растительных клзтол обладает слабой пассивной проницаемость® для катионов.

Экспериментально доказал^, что каяалогонный полшалтид ала-

петиции делает плазмалекму проницаемой для 8- ^С-АТО и кофакторов АТОазкой реакции. Эти результаты свидетельствуют в пользу возможности использования аламетицина для оценки ориентации везикул цитоплазматической мембраны в системе in vitro.

Результаты, получешшс на нормально ориентированных везикулах, имитирующих пространственную ориентация цитоплазматической мембраны in situ , свидетельствует о возможности транспорта конов калия (натрия) через глагкалешу растительных клеток при непосредственном участии катионстид;улкруемок АТОазы пли с помощью тесно сопряженной с ней системы по принц.шу электрогенного H"Vi«e± насоса.

Показано, что стимулирующее действие фктогормонов цитокини-новой природы ка поглотительную деятельность корней растений специфично и сопровождается увеличением интенсивности дыхания, активности К+-АТОазы к секреции протонов.

Показано отсутствие прямого действия цитокининоз на АТФаз-нуэ активность в бесклеточной системе, состоящей из фракции мембран, оЗагаченной фрагментами плазмале^мц.

Получены довода в пользу того, что регуляторное действие цк-токининов на АТФ-зависклсыл транспорт катионов может осуществляться через изменение концентрации истинного субстрата АТйазной реакции. Показано, что транспортная функция АТФазк может регулироваться как посредством изменения скорости гидролиза АТФ, так, возможно, и через изменение стехиометрии антипорта катионов через мембрану.

Показано, что хара2:тер специфической электрофизиологической реакции ¡меток пресноводной водоросли Hiteiia fi . на кинеткн определяется исход ним состоянием клетки в момент, предиествугзд'Л обработке. Это связано, по-видимому, с тем, что популяция ¡слеток нктеллы характеризуется наличием нескольких дискретных стационарах уровней траязмембранного потенциала.

Еыдаянуто к частично обосновано предположение о то:.:, что роль цктокининов в регуляции функциональной активности шгазмалем-ии состоит в оптимизации системы. Характер действия фитогормона определяется физиологическим состоянием растения (клетки), а вектор реакции направлен в сторону модальных значений исследуемого параметра.

Практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе новые данные вносят определенный вклад з современные представлена о роли а механизме действия фитогормонов цитохсии-новоЛ природ»- в регуляции трансмембранного переноса конов. Понимание механизма действия цитсхнштоз на функциональную активность мембран растительных меток является необходимым условием целенаправленной регуляции роста к продуктивности растительного организма. Претенсняип з работе метод статистического анализа позволм понять причину разнонаправленной реакции отдельных меток нктеллы на обработку фитогормзнами, которая состояла в наличии нескольких дкекретннх стационарных уровней физиологического состояния клеток популяции.

разработанный в ходе выполнения данной работы потенциомст-рический углекислоткый датчик (авторское свидетельство ;.;39021?) позволяет осуществлять контроль и автоматизации углеродного газообмена как в воздуашой, так и в водкеи фазах.

"етс;пяеские разработки работы используются в учебном процессе на кафедре физиологи:; и слюх::ми:; растений Ленинградского государственного университета к везли в учебное пособие "Методы изучения мембран растительных меток", одним из редактороз-сос-тазптелей которого является соискатель.

Апробация тботы. Материалы диссертации докладывались и демонстрировались на ХП ботаническом конгрессе (Ленинград, 1375), на 2-ом Всесоюзном симпозиуме по ионному транспорту в растениях (Черкассы, 1977), на Всесоюзном ботаническом обществе (Ленинград, 1977), на Второй Всесоюзной конференции по биохимическим и биофизическим механизмам транспорта веществ у растений и его регуляция (Горьки:, 1978), на Всесоюзно:: конференции по ионному транспорту в растениях (Киев, 1979), на 4-ом и 5-ом Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979; Киев, 1986), на Всесоюзной конференции по метаболизму и механизму действия фи-тогормодав (Иркутск, 1979) на семинаре Всесоюзного химического общества км. Д.И.Кевделеега и Научного совета АН СССР по проблеме "Биологические мембраны и использование принципов функционирования в практике" (Ленинград, 1579), на Сабилпнских семинарах з Ж'Ре АН СССР (Москва, 198С, 1985, 1986, 1987), на I-ой и 2-ой Бсесоюзнцх конференциях по регулятора:,! роста и разви-

тия растений (Москва, 1981; Киев, 1988), на Всесоюзно;,] биофизическом съезде (¡.1осква, 1982), на Международных симпозиумах по минеральному питанию (Варна, 1983; София, 1984), на симпозиуме по структуре к функциям биологических мембран растений (Иркутск, 1983), на 1-ой Республиканской конференции по биофизике (Кишинев, 1984), на методическом совещании "Научные основы применения регуляторов роста растении" (Ялта, 1384), на школе-семинаре по минеральному питанию и продукционному процессу (Чернигов, 1984, 1988), на 2-ой Всесоюзной конференции по электрохлжческюд методам анализа (Томск, 1985), на Международном симпозиуме "Свет и взаимодействие гормонов в растениях" (Берлин, 1985), на 4-ом Международном симпозиум по регулятора!,', роста растений (Пампоро-во, Болгария, 1985), на Республиканской научной конференции "Реализация генетической программы в ответе организмов на фитогор-моны и витамины и в мутагенезе" (Вильнюс, 1986), на Всесоюзной конференции, посвященной памяти И.И.Гунара (Москва, 1987), на 12-ом Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 49 научных статьях и одном авторском свидетельстве В 890217. Кроме того материалы диссертации представлены в 30 тезисах перечисленных выае конференции и симпозиумов.

ОБЪЕКТЫ И ¡.ЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта использовали корни и колеоптили 4-10-дн. проростков кукурузы ( zea maye L . ) гибридов Буковинский-3 и ОдесскиЙ-80, пшеницы ( Triticum aeetivua L. ) И риса ( Oryza sativa L. ). Проростки выращивали на питательном растворе В.А.Чеснокова, разбавленном в 10 раз с добавленном 0,25 мМ CaSO^ (иакс!ыов, и др., 1974; Максимов, Медведев, 1985).

Ряд экспериментов проводили на тротьем - пятом междоузлии пресноводной водоросли Niteila «exilia (измерение ВД клеток проводили в стандартной сродо следующего состава: К*" - С,1 ь-J«, Ка+ - 1,0 tól, CI" - 0,1 mí.0.

Динамику поглощения минеральных элементов определяли потен-циомотрическш методом с помощью ионоселективных олектродов ла-

бораторного изготовления в фитостате нашей конструкции (Максимов и др., 1979) и на плаченном фотометре фирмы Цейс (Осмоловская и др., 1984). Дыхание оценивали по поглощению О2 и выделению 002 манометрически на аппарате Варбурга и потенциометрически с помощью С02-датчика лаией конструкции (авторское свидетельство ¡í 8S02I7, IS8I), описанного Разумовой и др. (1982).

Влияние кинетияа на синтез белка оценивали па включению -*4С-лейцина в суммарную белковую фракцию в лаборатории функциональной активности мембран ЛГУ, Транспорт АЮ через нлазмалешу изучали с помощью B-^C-ATS на сцянтилляционном радиометре в институте ботаники АН ЛитССР. Содержание фосфолилпдов было определено Н.Ф.Синютиной (Смшткиа, 1983, 1986).

Мембранную фракцию, обогащенную фрагментами плазмалеммы, получали дифференциальным центрифугированием о очисткой в градиенте плотности сахарозы по модифицированному нами методу Леонарда и Хотчкисса (Тихая, Максимов и др., 1984).

Ориентацию везикул оценивали с помощью каналогенного препарата алаыетицина (Вахмистров и др., 1984). В литературе имеются указания на каналогенное действие аламеткцина (Ритов и др., XS82; Болдырев, 1985), однако прямых экспериментальных данных по индукция проницаемости мембраны для АТ-5 под влиянием аламетицшм нет. В связи с этим нами была предпринята специальная работа по изучению влияния аламеткцина на проницаемость везикул плазмалеммы из растительных тканс15 для 8-14С-АТФ. Как видно из приведенных на рис. 1-Б результатов аламетиция в ко;щентрации 30 мкг/мл значительно ускоряет накопление меченой ATO в о

та

везикулах,что gj сопровождает- -о ся увеличением ^ активности Ш катионстлму- ¿3 лирусмой АТФа- § ® зы (рис.1-А) § за счет вклю- р* чения в рабо- О-ту фермента нормально ориентированных везикул,у которых АТФ-дефос-

Б Рис.1. Влияние аламе-5 -t тицина ( Q ), 30 мкг/

—. мл на АТ£азнуа активность (А) и на проницаемость плазмалеммы (Б) из клеток колеопти-лей пшеницы для 8-^С-АТ$: р ¿0,05.

формирующий центр находится на внутренней поверхности мембраны. Зто действие алакетицина не является следствием модификации мембраны, поскольку на предварительно дезинтегрированных кеио-ногешшм детергентом Тритон Х-100 везикулах аламетицкн не изменял активность фермента.

АТСазну» активность определяли по количеству неорганического фосфата, отщепляемого от АТФ в ходе реакции в среде, содержащей в конечной концентрации 3 ММ АТФ, 3 мМ MjCIg, 50 MM KCI, 30 мМ грис-мэс (рН 6,0) а мембраянуи фракцию (18-70 мкг белка/ мл). Инкубацию проводили в течение 30 минут при 37°С и останав-л:шалк холодной трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 3ft по метода Лоури с соавт. ( Lcwry ot al . , 1951), АТйаз-кую активность выралали в микромолях неорганического фосфата на I мг белка в час.

Проницаемость мембран везикул плагмалеммы и возмоаность генерации трансмембранного потенциала изучали спектрофлуориметри-ческим методом с помочью потенциалчувствительного положительно заряженного кзрбоцианинового зонда dis -Cg-(5) - 3,3' -дипро-пил-2,2' -тиодккарбоцнания иодид ( \БОЗ{з = 570 нм, ^фд^сббвнм) и отрицательно заряженного зонда di ВА-С^-СЗ) - бис - 1,3-дибу-тилбарбитуровая кислота-триметиноксонол ( XB03(3 =420 да, Л^.» 521 нм);дрН на мембране везикул оценивали с помощью 9-аминб-6-хлоро-2-метоксиакрпдина (АСМА, ЛВОЗ(3. = 365 нм, Х&ц. = 480 нм) по метода, описанному Владимировым и Добрецовнм (1980); и Печатниковым (1986). В этих экспериментах везикулы плазмаяеммы (плотность 1,13-1,17 г/см3) нагружали 150 мМ раствором KgSO^, приготовленном на 150 мМ растворе сахарозы в I мМ трис-мэо (рН 6,0 и 8,0), с помощью осмотического сока для создания градиентов концентрации ионов и экранирования поверхностных зарядов мембраны. Использование сульфата калия связано с тем, что анион S04~- слабо проникает через меточные мембраны. Везикулы ресус-пендировали в растворе такого же состава, из расчета коночной концентрации белка 0,5-2,0 мг.сьГ3.

Метод основан на измерении интенсивности флуоресценции зондов с помощью спектрофлуоричетра, собранного на базе ".йомам-И-З" (рис.2). Лдя исключения влияния светорассеивания, возникающего в любых суспензиях и взвесях, использовали эпиобъектив 21x0,40 и конденсор темного поля, т.е. сигнал снимался непосредственно

с поверхности анализируемой взвеси. О проницаемости мембран судили по 'генерации (или изменению) 'Ш на везикулах пдазмаяеммы в ответ на изменения интенсивности и (или) направления транспорта ионов под влиянием специфических ионофороз или других факторов. Инкубационная среда состояла из 150 мМ растворов я agSO^ (На -среда) или Kjs04 (К-среда), приготовленных на 150 мМ растзоре сахарозы и I м.\! трис-мзс (рН 6,0). Конечная концентрация dis -Cg-(5) и di ВА-С^-О) - 0,8 - 1,2 ккМ, этилового спирта - не более 1%. В ка-кдом опыте определяли оптимальное соотношение количества зонда и везикул, для чего проводами флуорнметрическое титрование

растворов зондов суспензией везикул.

Электронно-микроскоп ич ее кий контроль осуществляли в лаборатории корневого питания Института физиологии растеши АН СССР с помощью фиксации фракции З^-ым глу-таровнм альдегидом с последующей дофиксацисй в 1#-ой четырехокиси осмия и контрастирозан'.и 1%~ым уранилацетатом. Окраска - цитратом евгпгца и смесью фосфорноволь-фрамовой, йодной и хромовой кислот (РАСР) на паллацированных сетках (Тихая и др., 198*1). Трансмембранный потенциал и электрическое сопротивление мембраны (Я ) измеряли по методу Хогга-Волкова (Hogg et al. , I969; Volkov , 1972) с помощью одного измерительного микроэлектрода, введенного в вакуоль на расстоя-матор(фильтр), 7 - светоприем- нии 0,41 от токового электрода ник. (1 -половина длины клетки). Че-

рез токовый электрод пропускали прямоугольные импульсы постоянного тока продолжительностью 1,50,5 с (Воробьев, Мусаев, 1979; Голубева, Воробьев и др., IS86). В расчетах использовали значения Т.М и электротонического потенциала (дополнительное падение напряжения на мембране, создавав-

-а

6—с

2Т~\ ^А !

Рис.2. Принципиальная схема

спектрофлуорпметра. I-кювета, 2-эпиобьекткв, 3-ко.'гденсор темного поля, 4 -монохроматор(фильтр), 5 -источник света, 6 - монохро-

мое тестирующими импульсами тока, по которым рассчитывали суммарное сопротивление R), полученные в ходе эксперимента за 7,5 мин., не более чем на i I мВ. Работа выполнена на установке лаборатории биофизики Звенигородской биологической станции МГУ.

Все опыты проводили не менее 3-х раз в 3 - 15-кратной пов-торностк. Обсуэдаются различия, достоверные при 95^-ном уровне значимости. Оценка соответствияголученных результатов нулевой гипотезе проводилась по критерию Стьюдента для случаев сравнения совокупностей с попарно связанными вариантами (Урбах, 1975). Статистический анализ популяции клеток нителлы состоял в сравнении полученных величин распределений "Ш с нормальным Гауссовским распределением по критерию У?.

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КАТГОСТКШИРУЕЖЙ АВДазы ПЛАКШЕШ

РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК В АТОг-ЗАВИСИУШ ТРАНСПОРТЕ КАТИОНОВ

Исследования АТФаз, локализованных в плазмалемме раститель-шх клеток, ведутся уже почти два десятилетия (Палладина, 1977, 1979). За это время мембраносвязанные АТОазы достаточно полно охарактеризованы и в настоящее время ведутся интенсивные исследования по изучению их роли в трансмембранном переносе ионов. Первой и, пожалуй, важнейшей задачей нашей работы, начатой в 1971 году, было изучение характеристик АЮазы, локализованной в плазмалемме клеток корней проростков кукурузы с целью выяснения возможности участия ее в мембранном транспорте катионов.

Сопоставление активности К^-АТФазц и скорости накопления ионов калия корнями проростков кукурузы (табл.1) показывает, что между этими двумя показателями обнаруживается при изменении концентрации калия в питательном растворе положительная корреляция. При повышении концентрации калия до 8,3 мМ активность К4"-АКазы гомогената корней и поступление калия усиливаются на 25-2&%, хотя концентрация калия изменяется в 10 раз. Повышение уровня калия в питательном растворе до 33 мМ активи^-рует АТйа-ау на 65Í и в 2 раза увеличивает поглощение калия. Аналогичную зависимость между скоростью поглощения калия и уровнем АТ£азяой активности обнаружили Фишер и Ходжес ( Fiaher, Hodges.1969 ) и 0;мер и др. ( Pieher et al., 1970 ). В литературе имеются данные о том, что мембраносвязанная катионстиыулируемая АТОаза растительных клеток может выполнять функции протонной помпы (обзоры:

Таблица I

Влияние концентрации калия в питательном растворе на К+-АТФазную активность гомогената и скорость накопления калия корнями восьмидневных интактшяс проростков кукурузы

Концентрация калия в питательном растворе, т АТФазная активность Накопления калия в копьях

Фн, мкмоль-г~х сырой массы.час" Ч! /' К4", мкмольт-* сцрой массы'Час"1 %

0,83 17,0 ± 5,4 ICO 0,81 ± 0,1 100

8,3 21,4 ± 3,6 126 1,01 ± 0.0S 125

33,2 28,1 i 5,1 1С 5 1,89 ± 0,39 233

Г-,-.* Ща-*^ • •'• • • ••XfcVvV-g^sW С!

ЭлГ

«ижг

■se г>

Шс^тШ

Клетки коровой паренхи-и мембранная фракция, обогащенная фрагмента^! плаз-алеммы (б, в); а,б - окраска специфическим красителем плаз-мал еммц, РАСР; в - окраска тотальным красителем, цитратом свинца; п - плазмалемма, т -тонопласт, эр - эндоплазма-тический ретикулум, м -митохондрия, ко - меточная оболочка, пл - пластида

-é

VDf

i AD^SZ Sr^í__

Палладила, 197?, 1979, 1983; Воробьев, 1980). В настоящее врем следует, по-видимому, считать общепризнанным участие АТОаз в транспорте протонов (Тихая, Максимов, 1984; Vara, Serrano, 1983;

Sze, 1984 ). Что касается других катионов, то кроме (Ца+- 1С4") -АТФазы гатофктов или близких к ним типов растений (Боулинг и Др., 1972; Тихая и др., 1976; Vakhmistrov et al, 1932; Karlason, Kylín, 1974; Sallivan, Valcani, 1974) считается, что ОНИ поступают в клетку по градиенту электрохимического потенциала ДН^ в ходе вторичного активного транспорта. Однако существуют данные, позволяющие предполагать наличие транспорта ионов, сопряженного с АТФазной рзавдией. Дяя выяснения этой возможности нами была освоена методика выделения и идентификации мембранной фракции, обогащенной, по данным электронной микроскопии (Тихая, Максимов и др., 1984), плазмалеммой на 70 - 8052 (рис.3), свободной от загрязнения фрагментами митохондрий и тонопласта (рис.4, Г). Фермент относительно специфичен к ATO (рис.4. А), магний - зависим и активируется одновалентными катионами (К*-, Rb+, NH,+,Na, Li +) практически в равной степени (рис.4, Б). Концентрационный оптимум калия находится в пределах 50 - 100 ы.'Л (рис.4,В). К+-АТОаза обнаруживает максимальную активность при рН инкубационной среда 5,5 - 6,0 (рис.4, Д). Необходимо отметить, что это значение рН со стороны АТФ-гидрэлизующих центров фермента, которые контактируют с АТФ и кофакторами АТФазной реакции, находящимися в инкубационной среде. Активные центры фермента, локализованные на внутренней поверхности нормально ориентированных везикул, недоступны для субстрата реакции, если мембранная фракция состоит из замкнутых фрагментов плаэмалекмы. рН Енутр'/ везикул со стороны, противоположной активному центру фермента, будет около 7,5, что, как видно из рис. 4,Е, является оптимальным для проявления гидролитической функции АТФазы. Перезаполнение внутреннего пространства везикул буфером с более щелочным рН практически не влияло на активность фермента, тогда как слабокислая среда (рН 6,0) вдвое снижала скорость гидролиза ATO. При рН у стороны мембраны, противоположной активному центру АТОазы, 5,0 и ниже гидролиз AT© практически прекращался.

Возникает вопрос, чем определяется активность АТФазы - градиентом рН на мембране или абсолютными значениями рН? Снятие градиентов рН с помощью прстонофоров [карбонилцианид-хлорфенил-гидразон (КЦХФГ), 50 мкМ и карбоншщигнид-п-трифторфенилгидразон (КЦЗгОГ), 1-5 мк!Л не влияли в кратковременных экспериментах на линейном участке работы фермента на его активность ] позволяет считать, что для АТО-гидролизующей функции АТФазы более важны в

ЙЛ

АТ5> АДФ УТФ Г® ЦТФ (1-гл-5 В

12,5 50 86 120 Д

'4,5 5,5 5,5 7,4 8,0 Э.О^Р- 5 6 7 8 9 внутри Рис.4. Характерно тажа АЮазы, локализованной на везикулах плазмалег.с.ш, выделенных из клеток корней 4-дневных проростков кукурузы (рН инкубационной среди в А,Б,3,Г и Е - 5,5), А -субстратная специфичность (С=3 Ы); Б - влияние одновалентных ионов (С=50 !••„;); В - действие разных концентраций калия; Г -действие ингибиторов: оуабапн, 100 мкМ, дицгасяогексилкарбодии-кид (ДШО, дпзтклстпяьбестрол (ДЭС) и ортованадат натрия в кощектрации 50 1.жм1; Д - влияние рН инкубациошюй сроды (со стороны АТ.-гкдролизующего центра); Б - влияние рИ со стороны, про-тивополохсной АТЗ - гидролпзующеглу центру; р<0,С5.

10 > 50 4

3 2 -

I •

г—

"1 - - - - -

'У >

У /

-. 1 йГ

1 С-л+Ы1) О

Г±1

К оуаб. ДЦКДиа;3У04ДЭС

Ордината - А^азпая активность, Р , мкмоль-мг~*(болка)* ч'

„-1

пределах физиологических условий абсолютные значения рН по обе стороны мембраны, а не градиент рН. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что функционирование катионстимули-руемой Mg-АТЙазы зависит от реакции среды у обеих поверхностей мембраны. Локальные изменения концентрации водородных ионов в зоне АТО-гидролизузощего центра и у противоположной поверхности плазмалеммы могут быть одним из способов регуляции активности фермента.

Таким образом, в цитоплазматической мембране клеток корней типичного гликофита кукурузы имеется катионстимулкруемая магний-завксимая .АТОаза с оптимумом рН в зоне АТФ-гидролизующего центра 5,5-6,0, а у противоположной поверхности мембраны 7,0 - 8,0, которая предположительно может участвовать в активном транспорте ионов,::, в частности, протонов.

Для прямой экспериментальной проверки этого предположения была предпринята работа по измерению трансмембранного потенциала, который должен возникать на везикулах плазмалеммы при работе фермента. Естественно, что необходимым условием генерации

II4" является замкнутость везикул и невысокая пассивная проницаемость мембраны.

При добавлении везикул плазмалеммы, нагруаенних ионами калия, в Ка-среду (рис.5,А) происходит тушение флуоресценции по-тенциалзависимого зонда die -С3-(5), отражающее вход зонда в липидную фазу мембрана. В случае замкнутых везикул при индукции калиевой проводимости с помощью валиномицина, обладающего большей селективностью к калию, должна генерироваться разность потенциалов ("-"-внутри), за счет выхода ионов калия по концентрационному градиенту. В этом случае следует ожидать входа положительно заряженного зонда в мембрану и тушение его флуоресценции. Добавление валиномицина (0,2 х I0~° М) к мембранной фракции в присутствии зонда вызывало тушение флуоресценции, которое можно интерпретировать, как генераций диффузионного калиевого потенциала с минусом внутри. Однако практически не исключено взаимодействие валиномицина и зонда, так как краситель может связываться не только с мембранными структурами, но и с другими компонентами среды (Орлов и др., IS94). Наличие взаимодействия мо-кно проверить, если использовать систему, в которой содержатся все изучаемые компоненты, но потенциал не образуется. Это может быть достигнуто с помощью замены натриевого наружного раствора на ка-

Рис.5. Характерные кривые флуоресцентных ответов: А,Б,В-потенщтчувствительнэго зонда dis -Со-(5), (0,4 мкЫ) и Г-рН-чувствктелького зонда АС»1А (2 мкМ) при АТФ-завпс ишм мембранном транспорте иокоз. А - генерация валиномицинэм (0,02 мкШ калиевого диффузионного потенциала в натриевой наружной среде и снятие его моненсиногл (I мкМ); Б - отсутствие генерации потенциала при одинаковом составе внутренней и внешней сред (калиевая среда); В - АТФаавясимый транспорт протонов через мембрану, измеренный с помощью dis-Cg-(5) и Г - с помощью ACJvîA. В -Щ-ATS давался во внешнюю среду, в варианте Г - во внутреннюю, КЩ'ЪТ - 0,15 мкМ; КЦМГи A-23I87 - 1,4 нМ, - 2,5 - 3 мМ. Среды: 150 «i-.î сахароза, 150 Mil KgSO^, I мМ трисгмэс - калиевая среда; 150 Ш сахароза, Г50 мМ E^SO^, I цМ трис-мэс - натриевая среда. рН в зоне активного центра - 6,0-6,2, с противоположной стороны мембраны рН 7,2. Вез. - везикулы; I - валшома-щм; 2 - мококсга; 3 - Ь^44"; 4 - AÏS; 5 - К ДОГ; 6 - A-23I87; 7 - КЦХФГ,

лиевнй. При добавко валиномицина в данном случае должна происходить индукция проводимости без генерации потенциала и, соответственно без изменения флуоресценции зонда, так как нет концентрационного градиента ионов калия. Действительно, как видно из рис.5,Б, при добавлении валиномицина к везикулам в К-среде изменения флуоресценции на наблюдалось.

Таким образом, тушение флуоресценции die ~Cg~(5) в натриевой среда в присутствии валиномицина отражает индукцию калиевого мембранного потенциала, а не прямое взаимодействие зонда с вали-номициком. Такой вывод согласуется с данными, полученными на ли-посомах и мембранах саркоплазматкческого ретикулума (Ивкова и др., 1983). Поскольку генерация калиевого диффузионного потенциала возможна только в случае замкнутых везикул, не обладающих заметкой проводимостью к ионам калия, то очевидно, что мембранная фракция из корней проростков кукурузы содержит замкнутые везикулы, но обладающие существенной проводимостью к ионам калия. Естественно, что индукция калиевого диффузионного потенциала возможна только при отсутствии проводимости к ионам натрия. Следовательно, если наблюдается генерация калиевого потенциала, то везикулы не обладают высокой собственной проводимостью к конам натрия. Доказательство:.; этого положения кокет слуетть также снкыонке потенциала, то есть увеличение флуоресценции зонда, с помощью веаоств, .индуцирующих проводи,юсть к другим ионам. Добавление монаиста (I.I0-® М), индуцирующего Ка^/Н* обмен в натриевой среде (рис.5,А, ),

полностью снимает калиевый диффузиогшкй потенциал. Аналогичные результаты получены и на везикулах из клеток колеоптилей кукурузы (рис.5,А, ). Получаемый в описанной системе калиевый диф-

фузионный потенциал составлял на основании расчетов (при титровании повышающейся концентрацией калия во внешней натриевой среде) около - 100 мВ.

Таким образом, относительно высокая стабильность флуоресценции зонда в присутствии валииомищша и генерация калиевого диффузионного потенциала позволяют считать, что везикулы плазмалеммы из клеток корней кукурузы замкнуты и не обладают существенной пассивной проводимостью для катионов калия, натрия и аниона сульфата.

Аналогия использованной модельной системы с живой клеткой, состоящая в сходстве перечисленных электрических характеристик и

в наличии в них транспортных катионстикулируешх АТеаз, позволяет осуществить демонстрацию АТФ-зависимого транспорта катиона водорода. Добавление Мс?-А® к везикулам, на мембране которых создан калиевый диффузионный потенциал (рис.5,В, ), вызывает частотное снятие его, по-видимому, за счет транспорта протонов внутрь везикул. Этот процесс сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции din -С3-(5). Транспорт протонов внутрь везикул объясняется работой катионстимулируемой Mg-зависимоИ РГ^-АТФазы, активные центры которой расположены на внешней поверхности мембраны везикул, что соответствует нормальному положении их на внутренней поверхности цитоплазкатических мембран интактных зеле ток. Протоно-фор КЦФФГ вызывает тушенке флуоресценции до уровня калиевого диффузионного потенциала, что подтверждает высказанное предположение о протонной природе индуцированного с помощью Мс^-АТФ-трансмсмбран-ного потенциала. Действие IJg-АТФ на ТИ.Щ в модельной системе специфично, хотя необходило отметить, что и к А® вызывают некоторое изменение флуоресценции dis -Cg-(5) в данных условиях, однако изменение интенсивности флуоресценции под влиянием ди- и монофосфатов значительно слабее, чем с АТ5. Это изменение флуоресценции зондов цианинового ряда в результате нзспецифического действия куклеотядов, на связанного с транспортом ионов и генерацией ТАШ, необходимо учитывать. Такое заключение подтверждается увеличением флуоресценции dis -Cg-(5) под влиянием АДФ и ATî в калиевой среде, где генерация калиевого потенциала в присутствии валиномицина, как указывалось выше, не может происходить.

полученные розультаты согласуются с данными других авторов об участии катионстимулируемой Мд-зависимой АТФазн плазмалеммы в секреции протонов из клетки во внешнюю среду.

Другим подтвержденном участия катионстимулируемой АТСазы в трансмембранном переносе протонов являются опыты по измерению д рН на везикулах плазмалеммы с помощью ДрН-чувствительного зонда ACiviA. На рис. 5,Г видно, что индукция калиевой проницаемости с помощью валиномицина не влияла на флуоресценцию АСМА. Добавление в конечной концентрации 2,5 мМ также Hé изменяло свечение зонда. Введение в инкубационную среду в качестве i.iç^VH* об-менника А-23Г87 приводило к усилению свечения везикул с зондом, что по данным калибровки с кислотой и щелочью соответствует выходу ионов водорода. Протонофор КЦХФГ снимал это изменение флуорес-цошии АСМА. При замене магния на воду (рис.5,Г, пунктирная ллг.Ы

величина дрН не изменялась. То есть возможность участия АТФазы в секреции протонов в настоящее время представляется доказанной. Сопряженный же с гидролизом АТФ трансыембранный перенос ионов калия или натрия пока не ю.юет экспериментального подтверждения. Большинство исследователей (Воробьев, 1980; Далладина, 1987) склоняются к мнению, что поступление калия к клетку осуществляет-ояз ходе вторично акт:щного транспорта, например, за счет электрохимического градиента, генерируемого АТ5азой. Описанная выше модель не позволяет ответить на вопрос об участии К*"-АТЗазы шиз-малекмы в актншам транспорте катионов в клетку. Причин этшу, по нашему мнению, несколько. Во-порвых, у инвертированных фрагкон-тов шазкалемш активный, АТФ-гидролизуюодш участок фермента находится на внешней поверхности везикул, лоэтазу в инкубационной среде оказываются относительно высокие концентрации АТФ, АДО, не- , органического фосфата и, главное, водородных ионов, появление которых является следствием гидролиза ATi. Во-вторых, антипорт катионов из везикул крайне трудно измерить из-за того, что оОъвм внешней среды на несколько порядков превышает сугаарный внутри-вазикуляркый объем. В третьих, К*-диффузионкый потенциал, созда-ваегдый с помощью валиноыицина, иг,:еет "+" в зоне активного центра А'йазы и "-" внутри везикул, на нативных мембранах ситуация обратная. И, наконец, в четвертых, пространственное расположение плазмалекаы инвертированных возикул не соответствует ее исходному состояния в клетке.

Тем не менее, в пользу участия АТФазы в транспорте катионов говорит ряд полученных ранее результатов. Так, из данных, приведенных в таблице 2, видно, что ДЦКД, который принято считать ин-

Таблица 2

Действие ДЦКД на ЕГ^-АТФазную активность и антипорт KViï4" у корней 10-дневннх проростков кукурузы (мюлоль-г"^ сыр.массы • ч""1)

Вариант

к*-

н*

К -АТФаза в % от контроля_

Контроль ШД'1-Ш

0,61 ± 0,00 0,44 ± 0,07

0,51 ± 0,09 0,31 t 0,03 (4о?;)й/

1.2

1,44

«/ н скобках - 7' Ю1гибирукщего действия ДЦкД

100 85,7

гибитором Н^-АМаз, на 40/5 уменьшал подкисление среды, что сопровождалось одновременны}.! ослаблением поглощения калил (на 28$* При этом повышалось отношение kvlí* и снижалась АТФазная активность. Максимальная скорость поглощения калия IO-дновныыи проростками кукурузы была в области нейтральных значений рН питательного раствора (рис.в), что совпадает с рН-зависшостью А'Юазной

реакции (рис. 4,Д).

Всё ото побуждало думать, что АКазная реакция тесно сопряжена с трансмембранным переносом ионов. Необходимо было создать модельную систему, которая бы более адекватно отражала положение плазыалеиды в на-тивной клетке. Имеется ввиду ориентация ее поверхностей и изгиба и направление тока через мембрану.

Для решения поставленной задачи были использованы нормально ориентированные зсзикулы плазыалемму из клеток корней кукурузы, внутреннее пространство которых заполнено с поыоцыа осмотического шока раствором 150 Mad сульфата калия и 3 ыа АТФ, приготовленного на 150 мМ растворе сахарозы в трис-ыэс буфере с рН, близким к оптимальному значению для АТОазной роакцшт (6,0 í 0,2). Нагруженные таким образом везикулы помещали в Ка-среду (см. раздел Объекты и основные метода ). Бзнеращгм калиевого диффузиошюго потенциала, аналогичного потенциалу нативной растительной клетки, осуществляли па комбраяе везикул, не обладающих заметной пассивной ионной проницаемостью (рис. 7,А) с помощью валиношщшга (рис.7,Б). При этом происходит выход ионоз калия в наружную среду до установления подвжшого равновесия, при котором согласно уравнению Нврнста и калибровочной кривой ( Hari-küraar, Deeveu , 1983; Кнго-Вечтоыова И др., 1987) генерировался

Ук+, отн.ед. о, озо

0,015.

JÍL

3,5

8 рН

Рис.6. Влияние рН питательного раствора на скорость поглощения ионов калия 10-дневныки проросткам;- кукурузы ("0десская-80").

Ма300 . Ка300 На300

Рис. 7. Индукция проницаемости мембран везикул плазкалем-мы из клеток корней кукуруза и кривые изменения флуоресценции зонда йз-а -С3-(5) (0,4 ыкМ) при АТЭ-зависимом транспорте катионов.

а - исходное состояние, б - генерация калиевого диффузионного. потенциала с помощью валикомицика (Вал.) в концентрации 8 т,1, в - отсутствие действия ионов магния (3 кМ), без добавки А-23187, г - запуск АИааной реакции с помощью А-23187 (0,8 мкМ). Кривив: I - Изменение интенсивности флуоресценции зонда при АТу-зависи-ыом транспорте ионов; 2 - отсутствие изменения флуоресценции зонда при добавлении во внутреннюю среду А.У<5 (3 мМ) шесто АТф или Н^О шесто Мд 3 , 3 - влияние ДЭС (1-10-5М) на АТЗзавпсишЙ транспорт катионов, 4 - влияние ДИМ (5.1О-5&0 на АТФ-зависишй транспорт катионов. Концентрации ионов и АТФ (мЛ) приведены в ивде индексов, стрелками обозначены моменты добавления реагентов в наружную среду, знаки "+" и "-" обозначают изменения потенциала в положительную и отрицательную стороны, соответственно. Составы внутренней а наружной сред приведены в тексте.

мембранный потенциал около 100 мВ (знак минус внутри везикул). Таким образом, получена модельная система, в которой транспортные АТФазы и АТФ расположены аналогично катшзным клеткам. Зта система имеет все основные условия для прохождения АТФазнэй реакции и связанного с ней транспорта ионов. Запуск АТЬазной реакции может быть осуществлен ионами магния, поскольку истинным субстратом для АТФазной реакции является Мо^-АТО. Однако добавление их в инкубационную среду (рис.7,В) не приводит к изменен™ интенсивности флуоресценции зонда, так как мембрана везикул слабо проницаема для ионов магния. Поступление его внутрь везикул к активному центру фермента можно обеспечить индукцией проницаемости мембран везикул с помощью препарата А-23187, которцй в отсутствии ионов.кальция способен переносить другие двухвалентные кати-• ош, в том числе и магний. Действительно, как видно из рис.7,Г, кривая I, в присутствии А-23187 £0,4 - 0,8 мкМ) наблюдалось увеличение интенсивности флуоресценции -Сд-(5). Возникает вопрос: связано ли ото изменение свечения потенциалчувствителыгаго зонда с АТФазнэй реакцией или оно обусловлено физико-химическим действием двухвалентного катиона магния? '¿ожяо, по-видимому, утверждать, что увеличение интенсивности флуоресценции зонда при добавлении А-23187 является следствием АТй-зависииого транспорта ионов натрия, поскольку при исключении АТФ (или замене ео на ЛЗ) из внутренней с^еды везикул изменения флуоресценции не наблюдалось (рис.7, кривая 2). Добавление вместо ионов магния ионов меди в такой же концентрации вызывало некоторое увеличение интенсивности флуоресценции зонда, но действие А-23187 в этом случае не проявлялось. При внесении в наружную среду ингибитора кембра-¡¡освязанных АКаз дизтистильбестрола (ДЗС) изменения интенсивности свечения -Сд-(5) после добавки конов магния и А-23187 не наблюдалось (рис.7, кривая 3), что подтверждает участие мем-браносвязанной АТФазы в изменении флуоресценции красителя и, соответственно, в электрогенном транспорте ионов, по-видимому, водорода и натрия. Другой ингибитор -дициклогексилкарбодиианд (ДЦКД) приводил к. увеличению интенсивности флуоресценция зонда (рис.7, кривая 4), что можно объяснить следующим образом: ДЦКД препятствует выходу протонов из везикул, а транспорт ионов натрия из наружной среды приводит к накоплению его и, соответственно, положительных зарядов внутри везикул, что и сопровождается усилением свечения зонда. Эти результаты свидетельствуют о тга,

что изменение флуоресценции die -С3—(5) связано с АТФазной реакцией и Л№-эависимш транспортом катионов через плазмаяемму. Если эта генерация Ml обусловлена работой А'К-гидролязующей системы, то следовало ожидать, что активный транспорт ионов должен зависеть от рН внешней <реды и от концентрации ионов магния аналогично АТ5-гидролизуадей реакции. Действительно, подкисление наружной инкубационной среды, то есть со стороны, противоположной АТ5-гидролизувдему центру фермента, приводило к резкому подавлению транспортных процессов (рис.8,А), что согласуется с

А Б

Рис.8. Влияние рН и магния на А№-зависимый транспорт катионов (везикулы гиазмалеммц из меток корней кукурузы)

данными по влиянию абсолютных значений рН с функционально той же стороны мембраны на активность АТЙазы (рис.4,Е). Влияние разных концентраций магния (от 1,5 до 12 мМ) на транспорт ионов натрия в модельной системе (рис.8,Б) также аналогично их действии на АТйазную реакцию (Максимов и др., 1280).

Идентичные результаты получены и с другим потенциалзависи-мым зондом ¿1 -ВА-С^-(З). Транспорт ионов натрия в описанной система, по-видимому, не связан с натриевыми каналами в мембране, поскольку ыдшюрид в концентрации 0,9-2,7 мкМ не влиял на

АТО-зависимую генерацию потенциала в модельной системе. Амило-рид (5*10~%) не сказывал существенного влияния и на катионсти-мулируемуга АТФазную реакцию.

Совокупность изложенных результатов и их анализ позволяют считать, что в плазматической мембране локализовала транспортная катионстимулируемая, магкийзависимая АТОаза, которая может осуществлять мембранный транспорт протонов и однозарядных катионов. В этом антипорте может участвовать или сама АТФаза и (или) какая-то неидентифицированная система, тесно сопряженная с ней функционально.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ШТОКЙНИЮВ НА АТ&-ЗШСШЙ ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ ЧЕРЕЗ ПЛАЗШЕММУ У РАСТЕНИЙ. РОЛЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В РЕГУЛЯЦИИ ГОРМОНАКТИВИРУЕМОГО ПОГЛОЩЕНИЯ КАТИОНОВ

Поглощение минеральных элементов растительной клеткой,

тр&чсмембранный перенос ионов имеют ключевое значение для жизнедеятельности целого растения. Поэтому понятен интерес, проявляемый физиологами, к изучению роли фитогормонов в регуляции транспорта ионов. В наших более ранних работах било показано, что кинетин может усиливать поглощение минеральных элементов растениями кукурузы. Обработка 10-ти дневных проростков кукурузы кинетшом в концентрации 1,25 мкМ усиливает поглощение калия, вызывает подкисление внешней среди и одновременно активирует катионстимулпруемую АТФазу (рис.9). При более высоких концентрациях фитогормона все три параметра снижаются. Естественно,

+20

□-АТФаза

ИЗ -поглощение К4" выделение К4"

-20 -

-40

Рис.9. Влияние кияетпяа на К+- АТФ-аз-ную актганость, поглощение калия и на выделение протонов корнями 10-дн. проростков кукурузы в % к контролю; р<0,05.

возникает вопрос: может ли кинетин действовать непосредствешю на АТФазу, или его действие опосредовано какими-то метаболическими процессами? Как видно из рис. 10, кинетин в микромолярной

концентрации достоверно усиливает каяийсч'имули-руемую АТОазную активность частично очищенного гомо-гената из корней проростков кукурузы. Физиологически неактивный аналог цитокининов - аденик ни в одной из испытанных концентраций такого действия не оказывал. Таким образом, очищенный от клеточных стенок, ядер и неразрушенных 'клеток гомогенат содержит систему, в которой активность катионсткмулируе-мой АТОазы монет повышаться в присутствии фи-тогормона цктокиниковой природы. Однако при дальнейшей очистке гомогената (центрифугирование при 18000 д) реакция на кинетин исчезает (рис.11). Реакцию можно восстановить, добавляя в инкубационную среду для определения АТФазы следовые количества исходного частично очищенного гомогената (Р) или обрабатывая гомогенат кияетином до центрифугирования при 18000 д. Б млкросомальной. фракции (82500^) активирующее действие кинетика не обнаружено. Эти данные свидетельствуют в пользу вывода о том, что уже в надмитохокдриальнзм супернатанте отсутствует какой-то фактор (или факторы), необходимый для проявления компетентности к фитэгормону. Наши попытки выделения такого рецептора для АТОазяой реакции, проведенные в лаборатории О.Н.Кулаевой (ШГ АН СССР), не увенчались успеха!;. Полученные результаты были неубедительны л варьировали от опыта к опыту. В связи с этим возникает альтернативное предполокепие-дейехзие гормона на А№азы опосредовано каким-то другим метабо-

20-

□ -аденик Q -гашеткн

0,012 0,12 1,25 12,5 125 Концентрации кинотнна к аденяна.мкМ

Рис.10. Влияние Кинетика и аденина на К+-А"Шазную активность гомогената корней проростков кукурузы в опытах in vitro С д1С+ в % к общей АТС-азной активности).

IOCM О

IOO -1 О

100 о

дк

<■—I

ПК

ЦК

500s I

18000g !

ч=гг2рг1"'

ДК

32 500 а

ЦК+р

Д 100

цк+р

100 л

100 -j

^ZZZZZZ^

ISOOOg -JjJJHt^*

Ц- контроль Й" кинетин

Pec.II Действие кинетина (ЦК) на-АТОазную активность го-могената корней проростков кукурузы, р - очищенный гомогенат ("рецептор"), ординаты - % к контролю (без дх).

лическш процессом, реакцией. Прямое действие кинетина на АТЗ-зависимый транспорт катионов на везикулах плазмалеммы (табл.3)

Таблица 3

Влияние кинетина на ТШ-плазмалеммы из клеток корней кукурузы при AÎS-зависимом транспорте катионов в модельной системе, оцениваемом по изменению флуоресценции потевдналзависимого зонда dis - Сд-(5), относительные единицы

Вариант Усиление флуоресценции зонда

Контроль 7,2 i 0,36

Ккнетия, 2.10_7М 8,8 ± 0,66

обнаружить не удалось. Некоторое увеличение ТШ, обусловленное АМ-зависимим транспортом натрия, статистически недостоверно.

Таким образом, поскольку прямая активация фитогормоном АТОазы и транспорта катионов в модельной системе не проявляется, естественно предположить, что действие кинетика на поглощение ионов и на ЛТФазную реакцию опосредовано каким-то метаболическим процессом. Элементарный анализ возможного места действия гормона, приведенный на схеме Срис.12), показывает, что оно может быть реализовано, во-первых, через изменение интенсивности дыхания,

Рис.12. Схема действия килетина на метаболические процессы клетки и трансмембранный перенос ионов.

которое влияет на уровень ATO, во-вторых, через изменение рН в зоне активного центра фермента и, в-третьих, через изменение электрических характеристик системы. Регуляция на уровне генетического аппарата, синтеза - распада белков выходит га рамки поставленных задач и в настоящей работе не рассматривается, хотя она,без сомнения, имеет место.

Стимулирующее действие ккнетинд на дихание показано во многих работах (Карданов и др., 1976; Kiicuta et el . ■ 1977). В наших опытах кинетин оказывал достоверное активирующее действие на дыхание отделенных корней четырехдневных проростков кукурузы, оцениваемое по поглощению кислорода. Физиологически неактивный аналог килетина - аденин скорость поглощения кислорода отделенными корнями в аналогичных условиях не изменил. Вето ва™:о вжснлть, с каким этаго'.' днхг.тельного катаболпзка согаано действие фитогор-

мона. Для этого действие кинетика на поглощение О2 анализировали на фоне метаболических ингибиторов (табл.4). Активирующее действие кинетика на дыхание сохранялось на фоне дыхания, подавлешю-

Таблица 4

Влияние кинетина (РКГ^М) на дыхание отдатангнюс корней четырехдневных проростков кукурузы па фойе метаболических ингибиторов (Дыхание рассчитывали в миллилитрах на I г в час; Р 4 0.С5)

Вариант ' Без ингибиторов Фторид - Ка I-ID-3M Малоновая кислота з-ю-% 2,4-ДНО 1-Ю~4М

'V % °2 /V °2 % °2 %

Контроль Кинетин 0,40 0,52 100 130 0,32 0,41 100 128 0,32 0,41 100 128 0,60 0,61 100 102

го фторидом натрия, который используется в качестве ингибитора гликолиза, и малоновой кислоты, конкурентного ингибитора сукци-натдегвдрогеназы. Специфичность малоновой кислоты в ее действии на цикл Кребса контролировалась с помощью яблочной кислоты. Аналогичные результата получены и с парахлормеркурийбензоаток, который ияактизирует фермента пентозэфосфатнаго пути, образуя мер-калтидч с тиоловыми группами белков. И только на фоне 2,4-ДНФ, применяемого в разобщающей концентрации, действие кинетика практически полностью снималось. Эти данные свидетельствуют о том, что действие кинетина на дыхание осуществляется, по-видимому, на уровне электронтранспортной цепи и связано с образованием ATO. Синтезируемая AT<ií в простейшем случае используется в качестве субстрата или идет на фосфорилирование мембранных белков с участием протеинкииаз. Если транспортше мембраносвязанные АТФа-зы модулируются протеинкиназами, то вещества, специфически влияющие на активность протеинкиназ, долхчы при идентичных условиях изменять скорость гидролиза АТФ и, как следствие, - влиять на трансмоибраяный перенос ионов. Дяя проверки этого предпологеяия было изучено действие наиболее специфичного из известных в настоящее время активаторов протешшиназы С - фэрбол-12-мористат-

- 30 -

-13-ацетата (РМА) и его неактивного аналога

Ал.- форбол, 12,13-

100

50-

-а

+а

-дидеканаата (РДД) на хатион-стимулируемую АТФазную реакцию в модельной системе на везикулах плазмалеммы из корней проростков кукурузы и на транспорт конов в аналогичных условиях. Никакого стимулирующего действия активного фзрболо-вого эфира на транспорт катионов и гидролиз АТФ не установлено (рис.13). Эти данные позволяют допустить, что действие кинетика на АТФазвую реакцию связано, возможно, с регуляцией на уровне концентрации субстрата. Однако необходимо иметь ввиду, что истинным субстратом АТФазной реакции является Mg-АТФ, а не свободная АТФ. Между тем известно, (Кометиани, 1983), что реальная концентрация Mg-АТФ определяется реакцией среды (табл. 5) и может варьировать в зависимости от значения внутриклеточного рН в пределах от 0,?3 до 2,48 иМ (при исходных концентрациях магния и АТФ - 3 мМ).

Действие кинетина на концентрацию истинного субстрата -Mg-ATS может осуществляться не только через интенсивность дыхания (фосфэрилирования), ко и посредством локального изменения концентрации водородных ионов в зоне, прилегающей к активному центру АТйазн. Этот сдвиг рН определяет соотношение свободной ATO и tó<j-ATfi и, в конечном счете, меняет активность транспортной АТЙааы.

0,8 8 80 нМ

Рис.13. Влияние активного форбо-лового эфира (ЕЛА, О , I нМ) и неактивного (РДД, £2» I нМ) на АТФазную активность везикул плазмалеммы из клеток корней кукурузы (А) и действие РМА В разных концентрациях на АТФ-зависимый транспорт катионов через плаз-малемму в модельной системе (Б); "а" - аламетицкн, 40 ккг/мл.

Действие кинетина на электройиакологичеоиие параметры (Tffl.R)

Добавление^ инкубационную среду кинетина в конечной концентрации 5-IO-0?,! вызывало быстрое падение потенциала клетки

Nitella fl. с последующим переходом нителлы в гипер-, деполяри-

Таблица 5

Зависимость концентрация Мд-АТ$, АТФСВ0(3 и от рН

среды (исходные концентрации магния и А® - 3 ыМ)

.рН ЧЙоб.' ^ °А®своб.' глМ

5,0 2,27 2,27 0,73

5,5 1,80 1,80 1,20

6,0 1,29 1,29 1,71

• 7,0 0,66 0.66 2,34

8,0 0,52 0,52 2,48

9,0 0,50 0,50 2,50

Расчет по уравнению:

<fATWl " [М3-Атф3 > ФЗобшЗ - [М9~АТО] > _

I +

[Mq

I0pH-6,S5"

A®]

,-1.49

I + ЮрН-4,44

зовагаюе или исходное состояние ( Kaximov et al,I985; Голубева

и др., IS85) (рис.14). Возникает вопрос - чем определяется разная реакция клеток на обработку фитогормоном?

Из статистического анализа большого числа значений ТЫЛ клеток Ni-teUa fl. (ll=II65) ВИДНО (рис.15), что в интервале рН стандартной среды от 6,5 до 8,5 величины ТШ варьировали от -65 до -250 мВ и их распределение не подчинялось нормальному распределению Гаусса. .Математический анализ (Шевцов и др., 1982) показат наличие, по крайней мера, трех дискретных уровней потенциала, ха-

3 мВ I

5мин

Рис.14. Характер изменения трансмембранного потенциала клеток Nitella fl. в присутствии кинетина (5-10~®М). Стрелка - добавление кинетина.

рактеризующихся определенной частотой встречаемости. Аналогичные

результаты были получены радой других авторов (Воробьева, Горю-%

ГО-

-У/

гЛ

ЫГЬпП,

100

150

200

250

ТШ,мВ

Рис. 15. Гистограмма частот встречаемости значений ТМИ клеток ШЛеИа п. в диапазона рН 6,5 - 8,45. л&теьатическая обработка на соответствие нормальному йуссовскому распределению проводилась при величине классового интервала 5 мВ.Границы уровней показаны стрелками.

нова, 1974; Воробьев и др., 1976; Мельников и др., 1976; Пятыгш, Опритов, 1980). Считается, что наличие таких уровней обусловлено

Таблица 6

Коэффициенты уравнения линейной корреляции для трех дискретных уровней Ец меток кие11а п . , приведенных на рис. 15.

Уровни МП, мВ Коэффициенты

а в

60-140 0,50 42,6

120-200 0,80 104,5

180-230 0,93 168,0

энергетическим состоянием мембраны и дкскреткостью работы транспортних систем. Исходя из этого следует допустить возмолсность существования зависимости биоэлектрической реакции клетки на обработку кинеганом от ее исходного функционального состояния. Анализ действия Литогормона в рамках вычлененных уровней ТмП (К,,) показа.'., что кглетяи-отулируемоэ изменение (Л К,) оягсыпч-

ется уравнением линейной корреляции вида: aEj, = -а /Ем/ + в (коэффициенты "а" и "в" приведены в таблице 6).

Расчеты показывают, что

кинетин

150 4 I

100

<3 M

50-

30 80 90

Рис. 16. Характерные кине тининдуци-руомые (50 ыкМ) изменения сопротивления мембраны клетки щдеца {1. при различных исходных значениях сопротивления.

при значениях Ti.ffl около 90, 130 и 185 мВ изменение потенциала под влиянием кинетика не наблюдается. Эти величины ТШ соответствуют модальным значениям вычлененных уровней потенциала (рис.15). Соответственно, реакция на фитогормон определяется исходным значением потенциала и направлена в сторону его модального значения. На стыке двух соседних уровней направление реакции ысает меняться в сторону мода соседнего дискретного уровня ТМП, то есть клетка может переходить как в гипер-, так и в деполяризованное состояние.

Электрическое сопротивление

мембраны клоток Н1*е11а п. (Ю может варьщювать в пределах от 5 до 130 кОм • см"2 и под влиянием кинетина увеличивалось (рис.16). Физиологически неактивный аналог кине тина - аденин такого активирую^ го действия не проявлял. Ыэнду исходными значениями потенциала (В^,) и сопротивлением мембраны (К) установлена корреляционная зависимость вида: й = 0,41 Ем - 17,8, согласно которой более высоким значениям потенциала соответствуют большие величины сопротивления, Аналогичные результаты были получены на клетках ]Ше11орэ1а оЪ1ияа (Цусаев, Воробьев, 1983). По г/леки» этих авторов увеличение сопротивления при более высоких значениях ТЛ1 свидетельствует о том, что оптимальным условием работы активных протонных насосов является режим с более низкой пассивной К^-проницаемостьы, что в конечном счете, повышает сопротивление мембраны. Ь'оыю допустить, что кинетин является факторси, обеспечивающим поддерта-ние растительной метки в наиболее энергетически выгодном состоянии, и, таким образом, оптимизирующим работу активных К^-насо-

сов.

Таким образом, регулярнее действие кинетина мсжот осуществляться через измените электрических или точнее, электрофизио-логяческих характеристик цитоплазматической иембраны, что может быть способом регуляции активных контранспортирукцих систем, обеспечивающим наиболее эффективный ражим их работы, а возможно, и их элзктрогенность. Реакция клетки на кино тин определяется ее электрофизиологичаским состоянием в момент, предшествующий обработке.

Кинетин специфически усиливает поглотительную и сокреторную деятельность корней проростков кукурузы. Одновременно у них увеличивается интенсивность дыхания, оцениваемая по поглощение кислорода, к повышается активность катионе табулируемой АТФазы.

Прямое действиз цптокининов на АКазную реакцию и мембранный транспорт ионов в бесклегочной системе (мембранная фракция, обо-гащо!иая фрагментами плазмаломмы) яе обнаружено.

функциональная активность АТФазы можэт рэхулщзоватъся фитого-р:,:онами цитокшпшовой природы через изменение концентрации истинного субстрата реакции - açj-АТг. Действие цитокшшгов на уровень Mg-АТФ осуществляется или через дыхательный катаболизм (синтез А1\г), или чороз локальные изменения концентрации ионов водорода по обе стороны мембраны.

Следующий вопрос - как коордшифуются, или можэт быть точнее, сопрягаются транспортная и гидролитическая функции АТФазы? Какие принципы могут быть использованы при гормональной регуляция работы транспортных АТйаз, локализованных в плазмалзже растительных клеток?

ПРИНЦИПЫ, ЛЕШИЕ В ОСНОВЕ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ АТЗ-ЗАВЖЖ0Г0 ТРАНСПОРТА КАТИОНОВ У РАСТЕНИЙ

Вышо было показано, что фитогормоны цитокининовой природа могут усиливать поглощение корнями растений конов калия и, что это сопровождается увеличением АТФазной активности.

С другой стороны, доказательство участия катионстимулируе-мой АТбазы в транспорте катионов позволяет думать, что основной путь гормональной регуляции мембранного транспорта связан с изменением АТЗ-гкдролизуыцзй системы. Отсутствие работ, в которых било бы продемонстрировано целенаправленное, прогнозируемое из-

'менение АТФазной активности, несмотря на исключительное внимание в этой проблеме, говорит, по-видимому, о том, что пока не будут изучены и реконструированы в модельной системе все звенья гормональной реакции, включая выделение к идентификацию рецептора или нескольких рецепторов, обеспечивающих компетентность фрагментов цитоплазматической мембраны к фитогормону, выяснить детали механизма гормональной регуляции ионного транспорта не представляется возможным. В настоящее время мы находимся еще только в начале трудоемкого неизведанного пути. На приведешюй ниже схеме видно, что для действия фитогормона необходим кагсой-то фактор (или факторы), который мы обозначили как фактор компетентности.

АТФаза

Исследование этого этапа действия кинетина выходит за рамки настоящей работы.

Следующий этап рогуляторной цепочки достаточно слокен, хотя и детально изучается. Скорость гидролиза АТ5, определяющая количество использованной метаболической энергии, без сомнения важна, ко представляется крайне грубим и "расточительным" способом регуляции. По-видимому, контроль на этом уровне связан с изменением количества АТО, количества истинного субстрата реакции - -АТ$ и рН среды у обеих поверхностей мембраны в зоне локализации транспортной А№азы. Действие кинетина на дыхание (терминальные участки дыхательного катаболизма, сопряженные с образованием мах-роэргической фосфатной связи) и взаимосвязь АТФазной реакции и АТФ-зависимого транспорта катионов в модельной системе на везикулах плазмалеммы были рассмотрены в предыдущем разделе. Было показано, что такой принцип регуляции транспорта вполне возможен, и он детально изучается в различных лабораториях (см.обзоры: Полевой, 1982; Ладыженская, Кораблева, 1985), хотя следует отметить, что большинству авторов, как правило, на удается продемонстрировать прямое действие фитогормона 1г>

Достоверное изменение сродства ионтранспортирующай систомч к

субстрату АТФаэной реакции показано в работе Бабатулера и Кли-ланда ( СаЬа№ц1ег, С1е1апй, 1905 ). В присутствии ИУК (10 мкШ активного транспорта протонов снижалась с 0,75 мМ до 0,35 мМ. Интересные данные приведены в статье Вениса (Уеп1в , 1983). по увеличению АТФ-зависимого потенциала в присутствии нафтил-уксусной кислоты в модельной системе при микромолярных концентрациях АТ», что соответствует условиям экспериментов Шерера (гсиогег , Х984) - максимальное усиление АТФазной реакции под влиянием ИУК при концентрации АТФ 10 мкМ. Хотя эти результаты и качсутся неубедительными, а может быть, даже и сомнительными (нам, да л некоторым другим лабораториям не удалось их повторить), тем не менее они свидетельствуют косвенно об изменен™ под вл:шнием гормона сродства фермента к субстрату реакции. То есть литературные данные говорят в пользу возможности использования такого способа регуляции в условиях обедненности ткани АТФ.

В нашей работе была рассмотрена возможность регуляции через изменение эффективности, режима работы ионтранспортирующей сис-теш. Исходя из анализа литературы по животным объектам (Кометиа-ни, Вокуа, 1983), разрозненных сведений по растительны.! объектам (Воробьев, 1980) и из элементарной логики такой подход представ-ляотся перспективным, ибо изменение режима работы системы, соотношения антипортируемых ионов и сопряжение транспортной и гидролитической функций позволяет цри минимальных затратах энергии регулировать эффективность работы А'ГФазы, степень ее электроген-носта.

Известно, что соотношение М^-АТФ / АТФ может влиять на количество катионсвязывающих центров Ка, К-АТФазы животных объектов. При этом меняется электрогенность- натрий-калиевого насоса. Модификатором фермента считается свободная АТФ. В связи с этим были' рассчитаны коэффициенты линейной корреляции (КК), которые могут служить (наряду с графическим решением) критериями для определения показателей степенной линеаризации. Последние позволяют судить о числе катионсвязывающих центров фермента.

Из табл.7 видно, что в вариантах с эквимолярныки соотношениями А5®/Ыд (2,1/2,1; 3,0/3,0; 3,9/3,9) коэффициент линейной корреляции имеет максимальные значения при параметре степенного преобразования около I, независимо от абсолютных значений концентрации комплекса Мд-А1Ф (в пределах 0,84-1,56 »'.!). К,, по калию имела величину около 50 мМ'при исходных концентрации Мд и

АТО 3 мМ. Изменение соотношения А!№/Щ как в пользу М^, так я

Таблица 7

Коэффициенты линейной корреляции между АТЗазной активностью и концентрацией ионоз калия (в двойных обратных величинах) при варьировании соотношения магния и АТФ и- параметра степенного преобразования (п)

п Соотношение АТФ/üg (мМ)

2,1 : 2,1 3,0 : 3,0 3,9 : 3,9 2,1:4,78 3,9 : 2,39

. 0,8 . 0,99362 0,99937 0,98525 0,98267 0,98360

I 0,99464 0,99938 0,98188 0,98377 0,93494

2 0,99322 0,99964 0,97491 0,98519 0,98652

3 0,99217 0,99924 0,97281 0,98514 0,98639

4 0,99118 0,99880 0,97030 0,98528 0,98708

5 0,99055 0,99847 0,97056 0,98457 0,93677

6 0,98944 0,99870 0,97084 0,98572 0,98684

1,2 1,56 1,2 1,2

Км(мМ) 91,3 51,7 20,2 60,4 71,6 ■

ATO увеличиваю "п" до 4 и более, при одновременном снижении К^-специфичности (60-70 мМ). То есть и растительные АТОазы могут, по-видимому, модифицироваться нуклеотидтрифзсфатом или другими (например, факторами внутриклеточной среды.

Следовательно, регуляция активности транспортной АТФазы растительных клеток может осуществляться как через изменение скорости гидролиза АТэ, так и за счет изменения степени сопряжения транспортной и гидролитической функций фермента.

РОЛЬ ЦИТОКШМЮВ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬЮЯ АКТИВНОСТИ IUiAaiATíHfiCKOá МЕМБРАНЫ

Широкий спектр реакций, активируемых флтогормонами цитоккни-новой природы, с одной стороны, и неоднозначное, а иногда и разнонаправленное действие цитокининов в практически идентичных ус-

ловлях, с другой,- инициировали поиск причин этой разнокачествен-ности гор;.;опальной реакции. Б связи с этил была предпринята попытка анализа действия фитогормонов на мембранном уровне. На рис.17 приведены данные по влиянию цитокининов (и ИУК) на ряд функциональных характеристик плазматической мембраны иативной клетки и в модельной системе на везикулах пяазмалокмы. Каждая диаграмма состоит из двух частей: левая (I) - действие гормона в условиях ослабленного процесса, правая половина (2) - влияние фитогормона на систему, которая находится в оптимальной или сворхопта;ально:.; состоянии, то есть работает в усиленном (ускоренное) режиме.

Рассмотри/, характер цитокин'.мин.к^тиц.уемых изменений систем различной степени нативностн и слояностя, находящиеся з условиях гипо- ¡ми гипер— состояния исследуемых функций;. Изменение трансмембранного потенциала клеток нителлы (рис.17,Л) в пределах одного дискретного стационарного уровня (см.рис.14 и 15) при деполяризованных величинах ТьШ (I) под влиянием кинетина происходит в сторону гиперполяризации, а при более высоких исходных значениях ТУ.П - в сторону снижения потенциала, то есть в направлении модальных значений ТАШ. В моде (в оптимуме) действие гормона вообще не проявляется. Сопротивление мембраны нителлы (рис.17,Б) при высоких исходных значениях при добавлении кинетина меняется мало

(со 134 до 254 кСгл/см ), тогда как обработка клеток с сопротивлением около 60 кОм/см^ вызывает увеличение его на 67^, поднимая до уровня клеток, которые практически не реагируют на фитогормон. •дозшо думать, что сопротивление мембраны клетки нктеллк в пределах 100-150 к0м/смй является наиболее оптимальным и кинетин выступает здесь, как и в случае с ЪШ, в качестве фактора оптимизации.

Возникает вопрос, как зависит характер гормональной реакции от исходного физиологического состояния у высших растений? На рис. 17 В и Г показано действие кинетина на секрецию протона и поглощение калия, соответственно, корнями 10-даевных проростков кукурузы. Очевидно, что оба процесса усиливаются в присутствии флтогорыона только в том случае, когда исходная секреция протона И поглощение калия было относительно слабым, замедленным (I). Экспериментально этот эффект достигался с помощью использования растений кукурузы с более высоким исходным солевым статусом. Прединкубацкя растений кукурузы на чистом кальциевом растворе

Е.мЗ

сч ( .

150

а м

ей

V-

200-

& 100 а

м о сл

в й

/ У §

А к

о и

Й о

2 И

300

150-

20-

£3

1 п

& ю

о • и

с) р.

П— контроль

й £

■I

30-1

кинатин.ГмкД

КУК,0,02 мкМ

Рис.17. Действие фитогормонов на транскенбрангл?, потенциал (А) и электрическое сопротивление (Б) клеток нителлы; на секреции протонов (В) и поглощение калия (Г) отделенными корнями проростков кукурузы; на АЮ-зависимый мембранный транспорт натрия (Д) и на натриевую проницаемость (Е) у везгс'.уд плазмалем.и; из клеток корней проростков кукурузы в зависимости от исходных характеристик системы: I - параметры системы ниже оптимума, 2 -параметры в области мода (или в области супероптклуиа).

(0,5 Ш) обеспечивала высокую Н*-секреторную и К^-поглотительную способности корневой системы и у контрольных растений (2). В результате скорость поглощения калия в этом случае при обработке кинеткном не изменялась, а секреция протонов даже ослаблялась. Полученные на отделенных корнях кукурузы данные также свидетельствуют в пользу предположения о том, что цитокинины могут выступать в качестве факторов оптимизации функций.

Известно, что на изолированных мембранах растительных клеток стабильный гормональный эффект получить практически не удается. В связи с зткм экспериментальные результаты по действию цитокинина и ауксина (ИУК) на АТО-завкскмый транспорт натрия и пассивную натриевую проницаемость мембраны везикул плазмалеммы были проанализированы с позиции взаимосвязи изменений транспорта натрия с исходным уровнем назриевой проницаемости мембраны в каждом конкретном опыте. Оказалось (рис.17, Д), что кинетин не влияет на АТС-зависимый транспорт натрия в модельной системе при исходно высокой натриевой проницаемости мембраны (2). Если же натриевая проницаемость везикул относительно невелика (I) - кинетин может достоверно усиливать АТФ-зависимый мембранный 1ранспорт (на 35/»).

Аналогичная ситуация и с ИУК-(рис.17, Е), хотя оценка производилась по другому параметру - по пассивной натриевой проницаемости.

В целом результаты, полученные на разных объектах (клетки пресноводной водоросли нителлы, отделенные корни проростков кукурузы и Фрагменты цитоплазматической мембраны, выделенные из корней кукурузы) по различным показателям (параметрам), позволяют выдвинуть и в определенной мере обосновать гипотезу, согласно которой роль цитокининов в гормональной регуляции трансыембран-ного переноса катионов состоит в оптимизации системы. Характер действия фитогормона определяется физиологическим состоянием растения или клетки в момент, предшествующий обработке, а вектор реакции направлен в сторону модальных значений исследуемых параметров.

ВЫВОДЫ

I. Катионетимулируекая магнийзависимая АТ£аза, локализованная в плазмалемке клеток корней и колеоптклей кукурузы и пшеницы, млеет разные оптимумы рН у морфологически и функционально

различных поверхностей плазматической мембраны: в зона активного центра - 5,5 - 6,0; а у противоположной поверхности плазма-леммы - 7,0 - 8,0. Локальные изменения абсолютной концентрация водородных ионов у обета поверхностей мембраны могут быть одним из способов регуляции гидролитической сТункции фермента.

2. Зэзикулы ллазмалскмн обладают слабой пассивной проницаемостью для кеорганическихшнов. Каналогепный полипептид аламети-ци! делает плазмаломму проницаемой для 8-^С-АТ© и кофакторов АТФазной реакции, не влияя непосредственно на сам фермент. Полученные данные доказывают возможность использования адаметицика для оценки ориентации везикул цитоплазм,лтической мембраны в модельной системе.

3. С помощью флуоресцентных потенциал- и рН-чувстзптельных зондов показано, что мембраносвязанная катионе табулируемая ilig-АКаза может осуществлять транспорт протонов и однозарядных катионов через плазмалемму растительных клеток. В антипорте IiV;.!e+ может участвовать или сама АЮаза и (или) какак-то ноидентифшщ-рованная система, тесно сопряженная с ней функционально.

4. Основные характеристики гидролитической и транспортной функций АТФазы (рН оптимум. у обеих поверхностей плазмалеммы, стимулирующее действие одно- и двухзарпдных катионов, зависимость от концентрации Мд-АТ5) практически одинаковы. По ряду некоторых других параметров (например, потенциалчувотэителъность, чувствительность к некоторым ингибиторам) они существенно различаются. То есть возможно изменение степени сопряжения гидролитической и транспортной функций АТОазы и на этой основе может осуществляться регуляция эффективности работы иошюго насоса, его олектро-ге'нность.

5. Ккпотпи специфически усиливает поглотительную к секреторную деятельность корней проростков кукурузы. Одновременно уве-личиваэтея интенсивность дыхатш, оцениваемого по поглощению кислорода, повышается активность катионе табулируемой АТМзы и меняется соотношение liVFC1". Характер изменения И+/К+ соотношение.зависит от условии выращивания и инкубации растений.. Рогуля-торное действие кинетика определяется компетентностью растения

•к фитогормону. Транспортная функция АТОазы мажет регулироваться как посредством изменения скорости гидролиза АТ5, так и через "переключение" режима работы фермента.

6. Прямое действие цитокининов на АТФазнуи активность и

мембранный транспорт ионов в бесклеточной системе (мембранная фракция, обогащенная фрагментами плазиалемиы) не обнаружено.

7. Кинетика изменения транскэмбрапного потенциала меток ни-теллы под влиянием цитокивпна имела двухфазный характер. После быстрой деполяризации травсмембранш-.й потенциал выходил на гипер-полярпзованный, исходный иди деполяризованный уровень. Характер реакции нителлы на кипатин определяется исходньгл элег.трофизполо-гичоским состоянием клетки в момент, предшествующий обработке.

8. Роль цптог.шинов в регуляции функциональной активности плазмало;ллм состоит в оптимизации систола. Характер действия (Твиогормопа определяется физиологически.! состоянием растения (плоткн), а вектор реакции направлен в сторону модальных значений исследуемого параметра.

СПИСОК РАБОТ,

ОПЛ^ДОЗАННЫХ ПО ;.1АТЕРйАЛАЫ ДКССЕРТЛЦ/М

1. Рождественский В.И., Зкльямс. U.B., Максимов Г. Б., Алохина Г.П., Осмоловская И.Г. Автадаткческсй ¿к.моронж и регистрация концентрации калия в питательных растворах для растений с помощью ноноселоктивнкх электродов. - Физиология растений, IS73, т.20, вип.5, C.I083-I0S8.

2. „"аксимоз Г.Е., Осмоловская Н.Г., Разуыова H.A., Хрекозич А.Л., Белюоткн A.A. Применение ионоселэктизных электродов для изучения поглотительной деятельности корневой системы растений.-йизиология рпстений, IS74, т.21, вып.1, с.211-218.

3. Ыахлина A.if., {«аксимоз Г.Б. Определение концентрации хлоридных ионов с помощью коноселективяого электрода. - Лабораторное дело, 1975, !í 5, с.295-297.

4. ¡'.йдводев С.С., ¡-¡акекмов Г.Б. Действие хинетипа,• ауксина и гиббереллина на рост и поглотительную деятельность корней проростков кукурузы. - Вестник ЛГУ. 1975, й 9, вып.2, с.124-126.

5. i.iiKCiiMOB Г.Б., Разу;,юза H.A., Греков;« А.Л., ¡Ледведез С.С., Осмоловская Н.Г. Ириаэпспга хопосолехтивних электродов для определения концентрации конов а-ялония в питательных растзорах

в присутствии кал;:«. - Агрохп,:ия, 1975, ü II, с.120-125.

6. Разут.юза H.A., ¿5акспг>:ов Г.Б., Батов А.Ю. Определение активной концентрации ионов лотенциометркчеекпм методом. - В: Методы бпогл.нгчоского анализа растешй, JI., кзд-зо ЛГУ, 1978, с. 140-

Tt-To

7. Максимов Г.Б., Разут,соа К.А., Батов А.Ю. Изучение динамики поглощения минеральных элементов потоншюметртеским методом. - В: йокний транспорт в растениях, Киев, изд-во Наукоза Думка, 1979, с.228-236.

8. Максимов Г.Б., Медведев С.С., Алакпф А.НМЛ. Влияние ки-кетина на поглощение калия и Ю^-АТЗазнуп активность у корне;: проростксз кукурузы.- ДАН СССР, 1979, т.245, Г? О, c.I5II-I5I3.

9. Максимов Г.Б., Аламгир А.K.M., Медведев С. С., Кренгауз .U.M. Взаимосвязь между транспортом ионов и К^-стиглулкруокоп АТФазлол активностью у корней проростков кукурузы. - 3: Биохимия и биофизика транспорта веществ у растенп:!, Горький, изд-во ГГ/, 1979, с.81-88.

Ю.Максимов Г.Б., Аламгкр А.ü.M., Медведев С.С., Батов А.Ю., Кренгауз Jl.i/I. О транспортных функциях растительных А'Даз. - Тезисы 4 Всесоюзного биохимического съезда, ¡.I., Наука, 1979, с.109.

11. Максимов Г.З., Медведев С.С. О механизме действия кинетика на функциональную активность корня. - В: Метаболизм и механизм дсйстзкя фитогор:-.-;онов, Иркутск, изд-во СО АН СССР, 1979,

с.162-165.

12. Максимов Г.Б., Медведев С.С., Алампф А.Н.М., Кренгауз Л.М. Катаонстжулцруемая А'К-азяая активность корней проростков кукуруз;!. - В: Фотосинтез, дыхание и органические кислоты, Воронен, кзд-во ВГУ, ISS0, с.53-57.

13. Медвздов С.С., Максимов Г.Б., Зверева 'Г. Г. Влияние гиб-берэляига. на дыхание к поглоергкю цонэв калия и нитрата отрезками корней кукурузы. - В: Фотосинтез, дыхание и органические кислоты, Воронеж, изд-во ЗГУ, I9BU, с.58-63.

14. Медведев С. С., Максимов Г.Б., Патовой 3.В. Значение разности потенциалов г.'.еяду мезокотплем и корневой системой дда ростковых процессов к накопления минеральных элементов пророст-wr.ffl кукурузы. - Вестнлк ЛГУ, 1380, т.21, вып.4, с.85-90.

13. Осмоловская Н.Г., Батов А.Ю., Разумова H.A., Еорцоз 10.И., Максимов Г.Б. Зависимость скорости поглощения растанг-ями ионов-калия и нитрата от их концентрации в питательной среда.-В: йеркенты, ионы и биозлехтропотенциалы у растений, Горький, изд-во ГГУ. 1980, о.£2-69.

16. Медведев С. С., Максимов Г.Б., Таг.жлон 0.3. Влаяякэ фхтогормоноз на рост ;г поглощение мперальяых г-с.лентсь проростками кукурузы. - 3: Получение и применение регуляторов роста,

Jí, изд-во Лен.технол.института, 1981, с.47-55.

17. :.!одведов С. С., Максимов Г.Б., Федосова H.H. Изменение скорости поглощения ионов отделенными корнямигроросткоз кукурузы в присутствии кинетина в зависимости от состава питательной среды. - В: Получение и применено регуляторов роста, Л, изд-зо Леи. технол. института, 1931, с.95-99.

18. Семенова Т.В., ¡."аксгслоз Г.Б., Алаыгкр А.Н.М. Злияние гнбберелловой кислоты и кшетка на АТФ-дофосфорщнфуюкуй активность ¡сорной проростков кукурузы. - В: Получение и применение рогулятороз рсста, Л., Кзд-во Лен. технол.института, 1981, с.55-60.

19. Семенова Т.В., д!акск.юв Г.Б., Дроевский O.E. Изменение скорости гидролиза ATíi гемогенатом проростков кукурузы и листьев ячменя в присутствии кинетина. - 3: Биохимия и биофизика транспорта вещестз у растений, Горький, кзд-во ГПУ, 1981, с.68-72.

20. Разумова H.A., Лепназ Г.П., Максимов Г.Б., Вильяме М.В. По?енциометр1гческий газовый датчик. - Авт.свнд. на изобрет. :,Щ90217, ¿¡rarerem, '.'5 46, I9SI.

21. Alamgir A.H.M., Haximov G.B. Characterization OX К -ATPase activity of corn roots.- Bangladech J. Agril. Sei., 1981, v.9, 1.

22. Alangir A.:;.", Haxinov G.S. Ion transport a carier Mediated active process. - Bangladesh J.Biol. Sei., 1981, v.10,

1, p. 13-21.

23. Медведев С.С., Каксшов Г.Б., Федосова H.H. Влияние ингибиторов дыхательного метаболизма на поглощение калия и нитрата отделенными корнями проростков кукурузы. -В: Регуляция физиологических процессов растений, Воронеж, изд-во ВГУ, 1982,

с. 68-73.

24. Разумова H.A., Ь'акскмов Г.Б., Лепнев Г.П. Потенциомет-ричееккй С02-датчик для изучения дыхательного и фотосинготнчес-кого газообмена в воздушных и водных средах. - Физиология растений, т.29, вип.1, I9S2, с.183-197.

25. Шевцов Ю.И., Голубеза Н.В., Лукояпова С.А., Максимов Г.Б. Доказательство наличия дискретных уровней трансмембранного потенциала клетки Kitella floxilis . - Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда, т.1, У, 1982, с.250.

26. ¡.'аксЕлов Г.Б., Тихая H.H., Ыикустина Н.Е., Куркова Е.Б., Семенова Т.З., Крснгауз JLai. Ионетамуляфуеше АТбазы цитоплаз-

магических мембран растительных клеток. - Тезисы 1 Всесоюзного биофизического съезда, т.1, М., 1982, с.253-254.

27. Медведев С.С., Максимов Г.Б., Федосова К.Н.Значение дыхательного обмена для проявления сталирующего действия кинотина на поглощение ионов. - Физиология и биохимия культурных растений, 1982, т.14, № 3, с.248-251.

28. Осмоловская Н.Г., Рлакскмов Г.Б., Кронгауз .О. Злияние рН среды и типа азотного питания на содержанка солей органических кислот в листьях свеклы. - 3: Регуляция физиологических процессов растений, Воронеж, изд-во В1У, 1982, с.73-79.

29. Шевцов И.И., Голубева Н.В., Дукшиова С.А., Максимов Г.Б. Зависимость биоэлектрической реакции клеток Miteila fi. от исходного значения трзнсмембранного потенциала. - В: Ферменты, ионы к биозлекрогзпоз у растений, Горький, изд-во ГГУ, 1982, с.ЗЗ-40.

30. Осмоловская Н.Г., Норкин К.Б., Тике И.В., Иванова 13. Л., Максимов Г.Б. Влияние ионного состава среды на динамику накопления минеральных элементов растениями кукурузы.- В: Транспорт веществ и биоэлектрогенез у растений, Горький, изд-во ПУ, IS83, с.39-46.

31. Alaagir А.К.М., Maxinov G.B. Kechanisn of kir.etin action on ion transport. - Bangladesh J. Bot., 1983, v.12,^2, p. 155-165.

32. Тихая Н.И., ¡.'лксикоз Г.Б., ¡Дииусткна Н.Е., Куркоза Е.Б., Батов А.Ю., Семенова Т.В., Тазабаева 1С.А., Вахмпстроз Д.Б. Ка-тионзазисгслая АТФазная активность мембран, изолированных из корней кукурузы. - Физиология растений, 1984, т.31, вып.2, с.221-228.

33. Тихая Н.И., Максимов Г.Б..Коренькова Н.З., Захмкстров Д.Б. Полнзя активность К, .'^-АТФазы и ориентация везикул мемб-рапных препаратов растительных клеток. - Физиология растений, 1934, т.31, вып.5, с.882-888.

34. Вахмистров Д.Б., Тихая H.U., ¡Лахсимов Г.Б., Коренькова Н.В. Полная активность К, Мд-АТОазы изолированных мембран растительных клеток. - ДАН СССР, 1984, т.276, :Ь5, c.I277-I2C0.

35. Osmolovskaja N.O. , Kaxinov G.B. Role of pH in ionic balance regulation of plants grown on aisr.cniura воиасе of nitrogen. - In: Mineral nutrition of plants-. Proceed, of the Second

.international Symposiun on plant Kutrltion, v.3, 1984, Sofia, Publishing House of Central Cooperation Union, p. 2C3 -208.

36. Uedvedev S.S., Kaximov G.B. Proton extrusion and effect of kinetin on the potassium and nitrate uptake by гаауге roots. - Ih: Mineral nutrition of planta; Proceed, of the Second International SynposiuE on Plant Kutrition, v.4, 1204, Sofia, Publishing Houoe of Central Cooperation Union,p.419-421

3?. Осмолозская H.Г., Иванова И.Л., Максимов Г.Б. Зависимость распределения минеральных элементов в надземных органах кукурузы от формы азотного питания. - 3: Ферменты, ионы и био-злохтрогеиоз у растений. Горький, ::зд-зо КУ, 1934, с.89-95.

38. ¡«аксимов Г.Б., ¡.'едводов С.С. Действии цитоккпиноз на конный транспорт в корня;: проростков кукурузы. - Сельскохозяйственная биология, 1935, Л 5, с.121-123.

39. Разугюза H.A., Лепнег» Г.П., Максимов Г.Б. Время отклика нотепцпсметркческого О^-датчиха и концентрационные пределы его функционирования. - Журнал прикладной химии, 1985, R и, с. 944-918.

40. Батов А.Ю., Максимов Г.Б. Оценка катиояной проницаемости везикул цитш^-им^тичееких мембран растительных клеток. - В: Биоэлектрические явления и мембранный транспорт у растений, Горький, изд-зо ПУ, 1985, C.IS-22.

41. Максимов Г.Б., Полевой В.В., Батов А.Ю., Танкелж O.E. Изучение полной актпзкостп АТ5-аз цитоплазматкческих мембран, Еыдоленных из корней и колеоптилей кукурузы. - В: Структура к функции биологических мембран, Иркутск, нзд-во СО АН СССР, 1985, с.81-88.

42. Иш>з-Ввчтомоза Н.И., Батоа А.Ю., Ворзплкн H.H., Салама-тона Т.С., Чиркова Т.В., Бупгова ?Л.П., Максимов Г.Б. Спектрофлу-ор;т.:стр1гческке методы исследования йиологкческих объектов. - В: методы изучения мзкбрач растительных клеток, Л., изд-во ЛГУ, I9SG, с.142-167.

43. Тихая H.H., Максимов Г.Б. Выделение плазмалеммы из растительных клеток. - В: Методы изучения мембран раститзлышх 'слеток, Л., изд-зо ЛГУ, 1986, с.20-29.

44. Разумова H.A., иакекмов Г.Б., Тиле И.В. Потенциалетр::-чопгий пето;; изучения биологических мембран. - В: Методы изучения мембран растительных клеток. Л., изд-во ЛГУ, 1966,. c.III-123.

- 47 -

45. Максимов Г.Б., Тихая Н.И., Батов А.Ю. Определение полной активности 1С*", М^+-АТФазн й ориентация везикул плазмалеммы растительных клеток. - Тезисы У Всесоюзного биохимического съезда, М., Наука, 1986, т.2, с.390.

46. Голубева Н.В., Воробьев Л.Н., Лукоянова С.А., Шевцов Ю.И., Максимов Г.Б. Влияние кинетина на электрофизиологические характеристики клетки. - Вестник ЛГУ, 1986, сер.З, вып.4, с.100-104.

47. Максимов Г.Б., Батов А.Ю., Кренгауз Л.М., Махало» A.B. Влияние градиента pH на АТ&азную активность везикул цитоплазю,-ткческкх мембран растительных клеток. - В; Биоэлектрогенез к транспорт веществ у растений, Горький, изд-во ИУ, I98S, с. 3339.

48. Максимов Г.Б., Батов А.Ю., Кренгауз Л.М. Регуляция ка-тионстимулщ>уемой АТФазы растительных клеток аденозинтрифосфатом.-В: Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки. - Тезисы ХП Всесоюзного совещания по транспортным АТФазам, М., иэд-во М1У, 1987, с,62-63.

49. Maximov G.B., Inge-Vechtomova N.I., Batov k.J., Karpenko M.B. Investigation of passive and active Plasmalemms ion transport of nayze roots and coleoptilee in vitro. - International Symposium on Mineral nutrition and Photosynthesis, Varna, Bulgaria,

1988.

50. Максимов Г.Б., Батов А.Ю., Изучение роли АТФаз в регуляции ионного транспорта. - В: Биоэлектрическая активность и мембранный транспорт у растений, Горький, изд-во Г1У, 1988, с.52-56.

Подписано к печати 13.01,89. M-340I2 Заказ 21. Тираж 200. Объем 3,0 п.л. Бесплатно. ГШ ЛГУ. 199034. Ленинград, наб. Макарова, 6.

Информация о работе

Максимов, Гемир Борисович
доктора биологических наук
Москва, 1989
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы