Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепция и трансдукция цитокнининового сигнала в листьях арабидопсиса и ячменя

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Рецепция и трансдукция цитокнининового сигнала в листьях арабидопсиса и ячменя"

На правах рукописи

ргб ОД

МАСЛОВА ГАЛИНА ГЕННАДЬЕВНА

РЕЦЕПЦИЯ И ТРАНСДУКЦИЯ ЦИТОКИНИНОВОГО СИГНАЛА В ЛИСТЬЯХ АРАБИДОПСИСА И ЯЧМЕНЯ

Специальность 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Института физиологии растений им К.А.Тимирязева РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор Кулаева О.Н. кандидат биологических наук Селиванкина С.Ю. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущее учреждение: Пущинский филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится тэ декабря 2000 г. в часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 053.05.14 при Биологическом факультете Московского университета им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан /3 ноября 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

профессор Кораблева Н.П. доктор биологических наук Клячко Н.Л.

кандидат биологических наук

Полесская О.Г.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Изучение рецепции и трансдукции цитокининового сигнала представляет значительный интерес ввиду ключевой роли цитокининов в развитии растений (Skoog, Miller, 1956; Mothes, 1962; Кулаева, 1973, 1982, 1995). Эти гормоны вовлечены в регуляцию таких важных физиологических процессов, как деление клеток, рост клеток листа, биогенез хлоропластов, индукция стеблевого морфогенеза, старение листьев, а также в реакции растений на внешние воздействия. Физиологические эффекты цитокининов хорошо охарактеризованы, однако этот класс растительных гормонов изучен недостаточно и механизм их действия до конца не раскрыт. За последние годы достигнуты значительные успехи в изучении этой проблемы. Получены данные о реализации цитокининового сигнала в клетках листьев ячменя и проростков кукурузы через ядерный белок-рецептор, который в комплексе с цитокинином регулирует транскрипцию (Kulaeva et al., 1995, 1998; Каравайко и др., 1995; Бровко и др., 1996). Показано участие протеинкиназ, связанных с хроматином, в ответе листьев на цитокинин (Селиванкина и др., 1988). Установлено, что протеинкиназы бикомпонентной регуляторной системы вовлечены в передачу цитокининового сигнала (Kakimoto, 1995; Brandstatter andKieber, 1998; Imamura et.al., 1998, 1999). Продемонстрировано возможное участие G-белков в ответе растительных клеток на цитокинин (Novikova et.al., 1999). Получены доводы в пользу присутствия в клетках наряду с ядерными мембранных рецепторов цитокининов (Plakidou-Dymock et.al., 1998).

Поскольку изученные до сих пор рецепторы природного цитокинина -/иракс-зеатина, участвующие в регуляции транскрипции, выделены из однодольных растений (Kulaeva et al., 1995, 1998; Бровко и др., 1996), актуальным было исследовать возможное вовлечение подобных белков в регуляцию транскрипции у двудольных растений, в частности, у Arabidopsis thaliana. Представлялось существенным изучить ответ транскрипционной

системы на цитокинин и участие в нем цитокинин-связывающих белков у Arabidopsis thaliana в возрастном аспекте.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей ответа на цитокинин транскрипционной системы из листьев Arabidopsis thaliana. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) изучить систему элонгации транскрипции in vitro, содержащую хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из розеточных листьев Arabidopsis thaliana в онтогенезе растений;

2) изучить действие цитокинина (6-БАП) на активность связанных с хроматином РНК-полимеразы I и протеинкиназ в листьях растений Arabidopsis thaliana разного возраста;

3) исследовать активность цитокинин-связывающих белков из листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста в гомологичной и гетерологичной транскрипционных системах с использованием хроматина из' листьев арабидопсиса и ячменя;

4) изучить влияние цитокинина на транскрипционную систему, содержащую хроматин из этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis thaliana (eti5 и etrl).

Научная новизна. С помощью транскрипционной системы, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из розеточных листьев Arabidopsis thaliana показано, что листья арабидопсиса отвечают на цитокинин в течение всего изученного периода онтогенеза (от 14 до 63 дней). При этом обнаружены существенные возрастные особенности транскрипционной системы, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из молодых растущих, закончивших рост и стареющих розеточных листьев Arabidopsis thaliana. Установлены возрастные различия в ответе системы на цитокинин. Обнаружено участие ЦСБ 67 кД, выделенного из розеточных листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста, в регуляции элонгации транскрипции. Впервые показано изменение функциональной активности ЦСБ из листьев арабидопсиса в ходе онтогенеза.

Практическая значимость. Обнаруженные в работе возрастные особенности в ответе листьев ЛгаЫЛорьчх th.alia.na на цитокинин, которые включают в себя как функциональную активность предполагаемых рецепторов цитокинина, так и реакцию на фитогормон транскрипционной системы, важны для разработки теоретических основ практического применения соединений с цитокининовой активностью.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации были представлены на IV съезде ВОФР (Москва, 1999 г.) и на 12-м конгрессе РЕ5РР (Будапешт, 2000 г.)

Публикации. Материал диссертации изложен в 10 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на/т^.страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы, который включает

.наименований. Экспериментальные данные представлены в виде 26 рисунков и 9 таблиц.

Объект исследований. В качестве объекта исследования были выбраны растения арабидопсиса {Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, экотип Columbia), срезанные листья которых чувствительны к экзогенным цитокининам, задерживающим их старение.

Растения Arabidopsis thaliana выращивали в ящиках с почвой в факторостатных условиях: длина светового дня составляла 16 ч., освещенность - 50 Вт/м2, температура 22-23°С днем и 18°С ночью, влажность воздуха - 70 %.

Розеточные листья, срезанные с растейНЙ- разного возраста (2-9 недель) помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой (контроль) или раствором б-БАП (10°М) и экспонировали в течение различного времени (от 1 часа до 48 час.) на свету при 22-23°С для изучения

Содержание работы. Объект и методы исследований.

действия цитокинина in vivo. После этого из листьев выделяли хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I и исследовали изменения в активности синтеза РНК in vitro, вызванные инкубацией листьев на растворе цитокинина. В отдельных опытах 6-БАП добавляли в буфер для гомогенизации листьев в ходе выделения хроматина до конечной концентрации 10"6М или 10'7М с последующим изучением влияния фитогормона на интенсивность транскрипции in vitro.

Выделение хроматина из розеточных листьев Arabidopsis ¡Italiana проводили при 4°С в соответствии с методикой, описанной ранее (Селиванкина и др., 1978). Навеску листьев гомогенизировали в буфере (100 -мМ трис-HCl, рН 8.0, 250 мМ сахароза, 100 мМ MgCb, 20 мМ (3-меркаптоэтанол). Гомогенат фильтровали и центрифугировали (10 мин., 1000g ). Осадок 6 раз отмывали в буфере (100 мМ трис-HCl, рН 8.0, 350 мМ сахароза, ЮмМ Р-меркаптоэтанол, 2% тритон Х-100) с последующим центрифугированием (5 мин, 7,500 g). Затем осадок был дважды промыт в том же буфере, но без тритона Х-100. Хроматин ресуспендировали в буфере следующего состава: 50 мМ трис-HCl, рН 8.0 , 20 мМ MgCb , 1 мМ ¡3-меркаптоэтанол, 10 % глицерин.

Содержание ДНК в препаратах хроматина определяли по Бартону (Burton, 1956). Определение белка проводили по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Определение активности связаной с хроматином РНК-полимеразы I

проводили, как описано ранее (Селиванкина и др., 1981). Использовали реакционную смесь (100 мкл) следующего состава : хроматин ( 5-10 мкг ДНК), 50 мМ трис-HCl буфер (рН 7,9), 10 мМ MgCl2 , 10 мМ (3-меркаптоэтанол, и по 0,2 мкМ каждого из 4-х нуклеозидтрифосфатов. В качестве меченого предшественника использовали [3Н]УТФ. Реакцию проводили при 30°С в течение 15 мин., останавливали добавлением равного объема холодной 10%-ной ТХУ с 0,9%-ным пирофосфатом натрия. Пробы

выдерживали во льду и через 1,5 часа нерастворимый в ТХУ осадок переносили на фильтры GF/C, трижды промывали холодной 5%-ной ТХУ и 2 раза 96%-ным этанолом. Фильтры высушивали и помещали в сцинтилляционную жидкость, после чего определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике (модель 6892 Tracor Europe, Нидерланды). Интенсивность синтеза РНК выражали в имп/мин на единицу ДНК за вычетом контроля на неэнзиматическое связывание метки.

Определение активности связаных с хроматином протеинкиназ. Активность протеинкиназ хроматина определяли как описано ранее (Селиванкина и др., 1987). Реакционная среда объемом в 100 мкл. содержала хроматин (10-20 мкг белка), 20 нм [у-33Р]-АТФ (148 ПБК/мМ), 50 мМ трис-HCI рН 8,0, 0,1%-ный тритон Х-100 , 10 мМ MgCb , 10 мМ NaF. Реакцию проводили 15 мин. при 37°С и останавливали добавлением 25 мкл холодного раствора 50 мМ АТФ и 250 мМ ЭДТА, рН _7*&.>Проб№'"выдерживали на холоде, осадок собирали на фильтрах (Whatman ЗММ) и промывали холодной 5%-ной ТХУ и этанолом. Фильтры высушивали и переносили в сцинтилляционную жидкость для определения радиоактивности. Во всех опытах присутствовал контроль на неэнзиматическое связывание метки. Включение фосфора в белок выражали в имп/мин на 20 мкг. белка хроматина.

Определение функциональной активности цитокинин-связывающих белков из листьев растений Arabidopsis thaliana проводили в системе синтеза РНК in vitro. Система содержала связанную с хроматином РНК-полимеразу I из листьев арабидопсиса или ячменя, транс-зеатин и ЦСБ из листьев арабидопсиса. В качестве меченого предшественника использовали [3Н]УТФ. Выделение хроматина из листьев ячменя и определение активности связанной с хроматином РНК-полимеразы I проводили в соответствии с методикой, описанной выше.

Опыты поводили в трех или четырех биологических повторностях. В таблицах приведены средние арифметические из трех аналитических повторностей типичного опыта и их стандартные отклонения.

Результаты и их обсуждение Действие цитокинина на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I. Первая задача нашей работы состояла в получении активной в синтезе РНК in vitro системы элонгации транскрипции, содержащей хроматин и ассоциированную с ним РНК-полимеразу I из розеточных листьев Arabidopsis thaliana. Это было необходимо для изучения действия цитокинина на транскрипционную систему листьев Arabidopsis thaliana, о котором мы судили по изменению синтеза РНК in vitro в препаратах хроматина, выделенных из срезанных розеточных листьев, предварительно обработанных 6-БАП. Ранее на ячмене было показано, что реакция на цитокинин активацией синтеза РНК в опытах in vitro была характерна только для закончивших рост зрелых листьев в возрасте 9-12 дней. У молодых растущих и стареющих листьев эта реакция отсутствовала (Селиванкина и др., 1979). Поэтому прежде всего необходимо было проверить, существует ли возрастная специфика ответа транскрипционной системы листьев Arabidopsis thaliana на цитокинин.

Для этого срезанные листья Arabidopsis thaliana выдерживали 24 часа на воде (контроль) или растворе 6-БАП (1(Г5М), затем из листьев выделяли препараты хроматина, содержащие РНК-полимеразу I и использовали их для анализа синтеза РНК in vitro. При этом обнаружили, что листья Arabidopsis thaliana отвечали на цитокинин активацией транскрипционной системы в течение всего изученного периода онтогенеза, от 2 до 9 недель (рис 1). Это полностью согласуется с полученными в лаборатории экспрессии генома растений ИФР данными о задержке цитокинином старения срезанных листьев Arabidopsis thaliana в течение всего онтогенеза растений. Наибольшей активацией транскрипции в ответ на цитокинин отличались

листья 3-х-недельных растений. Данные нашей лаборатории показывают, что в этот период листья АгаЫёорз1з ЖаНапа содержат наименьшее количество цитокининов, что, очевидно, определяет их наибольшую отзывчивость на экзогенный цигокннин.

1 о 450 ш ¡=

£ о 400

2 о.

§ 5 350

Ш о

§ 2 300 | ^ 250 | 200

1 « 150

2 са

Н" е юо

§• > 50 га .—.

|пх о <

Рис.1 Влияние 6-БАП (10"5VI) на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I при обработке гормоном в течение 24 час. розеточных листьев АгаЫсЬрз(з ¡ИаИапа разного возраста. Представлен % активации синтеза РНК под действием инкубации листьев на растворе 6-БАП по сравнению с синтезом РНК в системе, содержащей хроматин из контрольных листьев, инкубированных на воде (К).

Реакция транскрипционной системы на экзогенный цитокинин обнаруживалась уже через 1 час действия 6-БАП на срезанные листья (рис 2 а, б), т.е. она относилась к достаточно быстрым ответам клеток листа на цитокинин. Активность транскрипционной системы срезанных листьев 3-х-недельных растений сохранялась на высоком уровне в течение 12 часов после срезания, а затем снижалась (рис За). В присутствии 6-БАП транскрипция была существенно выше во все изученные сроки (1,3, 6, 12 и "'14 ч).

II

2 3 5 7

Возраст растений (недели)

К

о.

2 п;

х о

ш

X

О)

■у

9.

т

250 200 150 100 50 0

Возраст растений (недели )

ЕЕ

3 5 7 9

Возраст растений (недели)

Рис.2. Влияние 6-БАП (10"5М) на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I при обработке гормоном розеточных листьев АгаЫс1ор$1з ЛаНапа разного возраста в течение 1 часа, а - включение меченого предшественника в РНК, имп/мин на 10 мкг. ДНК б - активация цитокинином включения метки в РНК, % к контролю. За контроль (100%) принято включение метки в РНК в препаратах хроматина, выделенных из листьев, инкубированных на воде.

X <г> 2500

о. X

ш 2000

е > X сг 1500

г

X о т—

ш СП 1000

I X

Ф X

т 2 5 500

5 ш "с г 3 0

■1 2

3 6 12 24

Инкубация, час

^ <гэ х т~

О. X со

> к

х|

^ т-

Ш Л х X

1 0) :г

2 5

со

3 6 12 24

Инкубация, час

Рис.3. Влияние инкубации листьев 3-х-недельных (а) и 5-недельных (б) растений АгаЫс1ор.113 ЛаНапа на растворе 6-БАП (10'5М) на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I.

1 - листья на воде

2 - листья на растворе 6-БАЛ

Транскрипционная система из листьев растений других возрастов отличалась меньшей стабильностью, о чем можно судить по быстрому снижению активности синтеза РНК in vitro в препаратах хроматина, выделенных после инкубации срезанных листьев на воде в течение 6 часов и более (рис. 3 б). Это снижение активности слабо задерживалось цитокинином. Особенно резко активность РНК-полимеразы I хроматина снижалась у листьев растений в возрасте 9-недель, что отражало старение листьев на растении (рис Т&). Срезание, как известно, в свою очередь индуцирует процессы старения, которые отличаются от старения листьев на растении. Этот вторичный процесс хорошо выражен через 24 ч после срезания листьев растений всех изученных возрастов. Он особенно чувствителен к цитокинину, который максимально активирует синтез РНК in vitro в системе, полученной после инкубации срезанных листьев на растворе 6-БАП в течение 24 ч.

Поскольку повышение активности РНК-полимеразы I в составе хроматина может происходить за счет увеличения активности фермента или усиления его синтеза, были проведены опыты с добавлением 6-БАП в буфер для гомогенизации листьев растений арабидопсиса разного возраста в ходе выделения хроматина, когда целостность клетки нарушена и новообразование фермента не происходит. В результате активация синтеза РНК под действием цитокинина в системе, содержащей хроматин, обнаружена в листьях растений всех изученных возрастов, от 3-х до 9 недель, максимальной она была у 3-х-недельных растений (рис 4 а,б), что согласуется с данными по действию цитокинина на листья этого возраста (рис. 1, 2, За). Активация связанной с хроматином РНК-полимеразы I из листьев 3-х-недельных растений под действием 6-БАП, добавленного при гомогенизации листьев, была выше, чем в опытах in vivo (рис. 1 и 2), следовательно, в изученных условиях гормон увеличивал активность фермента, не влияя на его синтез.

ьс. х о.

ш

е

я

0 ^ о н > о.

X „ 13" X ас

§'1 *

1 §

5 Л

О X О.

ш

X ^ е- 2 т о

О ь > о.

1 |

гг X со X о

к

СС

ГГ 5:

га X

ш <о

т

Ё 2

< со

500 400 300 200 100 0

600 500 400 300 20 0 100 0

3 5 7

Возраст растений(недели)

3 5 7 9

Возраст растений (недели)

Е

а

К

9

Рис.4. Влияние 6-БАП на активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I при добавлении гормона в буфер для гомогенизации листьев ЛгаЫс!ор$15 гкаИапа в ходе выделения хроматина. За контроль (100%) принято включение метки в РНК в препаратах хроматина, выделенных в отсутствие 6-БАП.

а - концентрация 6-БАП в буфере - 10"7М б - концентрация 6-БАП в буфере - 10"6М

Действие цитокинина на активность связанных с хроматином протеинкиназ. Из литературы известно, что протеинкиназы хроматина участвуют в ответе листьев ячменя на цитокинин, причем одна из протеинкиназ ассоциирована с РНК-полимеразой I и фосфорилирует ее субъединицы (Селиванкина и др., 1987, 1988). Поэтому мы изучили активность связанных с хроматином протеинкиназ в листьях АгаЫйорзи IИаНапа и ее изменение под действием цитокинина.

Как видно из рис. 5, хроматин из листьев АгаЫ<к>р$1з tha.lia.na содержит протеинкиназы, активность которых резко падает с увеличением возраста растений. При этом только листья 9-недельных растений отвечали на гормон значительной активацией протеинкиназ (рис 5). Этот эффект постепенно уменьшался с увеличением экспозиции листьев на растворе 6-БАП (рис.6).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

1

3 7 9

Возраст растений (недели)

Рис.5. Влияние 6-БАП (10"5М) на активность протеинкиназ хроматина при обработке гормоном листьев АгаЫ(1оряЫ ЛаИапа разного возраста в течение 3-х часов.

£ 0) д

I И я § 300

о -Г г о.

£ а°- ? % 250

< ш 50

0

К 3 6 12 24 48

Обработка 6-БАП, час

Рис.6. Влияние 6-БАП (10"5М) на активность связанных с хроматином протеинкиназ при обработке гормоном листьев 9-недельных растений АгаЫсЬорз'я ¡ИаНапа. За контроль (100%) принято включение метки в белок хроматина, выделенного из листьев, инкубированных на воде. Рис 7 (а,б) позволяет сравнить динамику изменения активности РНК-полимеразы I и протеинкиназ хроматина под действием 6-БАП у листьев старых 9-недельных растений. Как видно, активация гормоном протеинкиназ предшествует активации РНК-полимеразы I. Это позволяет думать, что фосфорилирование белка (белков) может участвовать в активации цитокинином РНК-полимеразы I. Нужно отметить, что корелляция в действии цитокинина на протеинкиназы и РНК-полимеразу I не отмечалась в листьях растений в возрасте 5 и 7 недель. Однако, учитывая то, что активность чувствительных к цитокинину протеинкиназ может составлять лишь небольшую часть от суммарной активности протеинкиназ хроматина и их доля может меняться как в зависимости от возраста растений, так и от продолжительности инкубации срезанных листьев на растворе 6-БАП, ожидать полную корелляцию изменения активности протеинкиназ хроматина и РНК-полимеразы I невозможно.

со 2500

12 24

Инкубация, час.

х

± х

ш

И

* I •Е?

<Ц

з: х а> т 2

ш

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

—-1

-я- 2

6 12 24

Инкубация, час.

48

Рис.7. Влияние инкубации листьев 9-недельных растений Лгай/г/орти скаНапа на растворе 6-БАП (Ю'5М) на активность связанных с хроматином протеинкиназ (а) и РНК-полимеразы I (б)

1 - листья на воде

2 - листья на растворе 6-БАП

Небольшое увеличение активности связанных с хроматином протеинкиназ в листьях 3-9-недельных растений арабидопсиса обнаружено и в опытах с добавлением 6-БАП на стадии гомогенизации листьев в ходе выделения их них хроматина, что говорит о прямом влиянии цитокинина на чувствительные к нему протеинкиназы хроматина (рис 8).

Возраст растений(недели)

Рис.8. Влияние 6-БАП (10" М) на активность протеинкиназ хроматина при добавлении гормона в буфер для гомогенизации листьев растений Лгаб/фртм ¿/гаИапа разного возраста в ходе выделения хроматина. За контроль (100%) принято включение метки в белок хроматина в отсутствие 6-БАП.

Изучение функциональной активности ЦСБ 67 кД из листьев растений арабидопсиса разного возраста. Ранее в нашей лаборатории из закончивших рост листьев ячменя был выделен цитокинин-связывающий белок со свойствами рецептора, который в комплексе с гормоном активировал синтез РНК в гомологичной системе элонгации транскрипции in vitro, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев

ячменя (Kulaeva et.al., 1995; Каравайко и др., 1996). Аналогичными свойствами обладал ЦСБ 70 кД из этиолированных проростков кукурузы (Бровко и др., 1996; Kulaeva et.al., 1998). Полученные результаты указывали на существование у злаков семейства рецепторов цитокининов с общими функциями и иммунологическими характеристиками (Kulaeva et.al., 1998). Следовало проверить наличие подобных рецепторов цитокининов также у двудольных растений.

Сотрудником нашей лаборатории Н.Н.Каравайко были выделены зеатин-связывающие белки 67 кД из розеточных листьев растений Arabidopsis thaliana в возрасте 3, 7 и 9 недель и была доказана их высокая аффинность к транс-зеатину. В нашу задачу входило изучение функциональной активности выделенных белков в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин из листьев арабидопсиса (гомологичная система) или ячменя (гетерологичная система).

67 кДа ЦСБ, выделенный из листьев 9-недельных растений, в присутствии транс-зеатина активировал элонгацию транскрипции в гетерологичной транскрипционной системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I из листьев ячменя (табл.1). Транскрипционная система из листьев ячменя отвечала на белок из 9-недельных растений арабидопсиса таким же образом, как на 67 кД белок из 10-дневных листьев ячменя. Активация белком синтеза РНК in vitro была продемонстрирована также в гомологичной транскрипционной системе, содержащей связанную с хроматином PHK-полимеразу I из листьев арабидопсиса (табл.2). Следовательно, 67 кД ЦСБ из листьев 9-недельных растений арабидопсиса функционально активен - участвует в комплексе с цитокинином в активации транскрипции как у ячменя, так и арабидопсиса и может рассматриваться как рецептор цитокинина со свойствами трансфактора.

Таблица 1

Влияние ЦСБ из листьев 9-недельных растений Arabidopsis thaliana и w/ш/с-зеатина на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полнмеразу I из листьев ячменя.

ЦСБ, нг Транс-зеаткн 10"7М Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 109181 ±1612 100

15 - 81431 ±896 75

30 - 121282 ±1580 111

15 + 225236 ±3153 206

30 + 509686 ±6167 467

Таблица 2

Влияние ЦСБ из листьев 9-недельных растений Arabidopsis thaliana и трапе-зеатина на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев 9-недельных растений арабидопсиса.

ЦСБ, нг Тракс-зеатин ю-7м Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 4106 ±182 100

17,5 - 4242 ± 376 103

35 - 3910 ±107 95

17,5 + 6326 ±291 154

35 + 6159 ±302 150

Таблица 3

Влияние ЦСБ из листьев 3-недельных растений Arabidopsis thallana и транс-зеатииа на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев 3-недельных растений арабидопсиса.

ЦСБ, нг Транс-зеатин 10"7М Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 41475 ±552 100

4,5 - 51952 ±717 125

11 - 72423 ±913 175

22 - 60623 ±818 146

4,5 + 71209 ±911 172

11 + 74202 ±994 179

22 + 183729 ±2021 443

Таблица 4

Влияние ЦСБ из листьев 3-недельных растений Arabidopsis thaliana и транс-зеатина на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя.

ЦСБ, нг Транс-зеатин 10"7М Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 63403 ±951 100

11 - 66411±1328 105

22 - 123840 ±1362 197

11 + 96131±1249 152

22 + 153245 ± 1991 242

Таблица 5

Влияние ЦСБ из листьев 7-недельных растений Arabidopsis thaliana и транс-зеатина на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев 7-недельных растений арабидопсиса.

ЦСБ, нг 7ранс-зеатин 10"7М Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 110731±1329 100

4,5 - 310855 ±4342 280

11 - 332868 ±4194 301

4,5 + 330741 ±4267 299

11 + 303250 ±4275 274

Таблица 6

Влияние ЦСБ из листьев 7-недельных растений Arabidopsis thaliana и /ярянс-зеатина на синтез РНК in vitro в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя.

ЦСБ, нг 7роис-зеатин 10"7М Включение [JH] УМФ в РНК

имп/мин на 20 мкг ДНК %

- - 133885 ±2677 100

4,5 - 228838 ± 2746 171

11 - 342526 ±4624 256

4,5 -ь 246691 ± 3947 184

11 4- 217956 ±2812 163

ЦСБ из листьев 3-х-недельных растений активировал синтез РНК in vitro в гомологичной транскрипционной системе и для этого не требовалось присутствие транс-зеатиа. Однако его добавление в реакционную среду усиливало активацию РНК-полимеразы I (табл.3). В гетерологичной транскрипционной системе этот белок был также активен один, без гормона, но добавление транс-зеатина увеличивало его активность (табл.4). Следовательно, ЦСБ из листьев молодых растений арабидопсиса отличается от ЦСБ из старых растений, т.к. обладает активностью в отсутствие цитокинина в среде, но эта активность существенно повышается в присутствии цитокинина.

ЦСБ 67 кД из листьев 7-недельных растений был активен как в гомологичной, так и в гетерологичной транскрипционных системах. Добавление транс-зеатина ъ реакционную среду не увеличивало его активность (табл.5-6).

Полученные данные позволяют предположить, что в ходе развития растений арабидопсиса от 3 до 9 недель происходят изменения в свойствах рецептора цитокинина. В листьях молодых 3-х-недельных растений белок активен один, но цитокинин вызывает увеличение его активности. В листьях 7-недельных растений белок становится гормон-независимым, тогда как в листьях 9-недельных растений белок активен только в присутствии цитокинина.

Исследование транскрипционной системы, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из розеточных листьев этилен-нечувствительных мутантов eti5 и etrl, позволило продемонстрировать ее реакцию на цитокинин как при обработке гормоном срезанных листьев, так и при добавлении 6-БАП к буферу для гомогенизации листьев с последующим выделением хроматина. Полученные результаты показали, что у этилен-нечувствительных мутантов ответ на цитокинин сохраняется и не претерпевает принципиальных изменений.

Заключение

Изучены системы элонгации транскрипции, содержащие хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I, выделенные из розеточных листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста. Обнаружены изменения в активности РНК-полимеразы I и протеинкиназ хроматина в ходе старения листьев на растении и в срезанном состоянии. Изучена реакция транскрипционной системы на экзогенный цитокинин и цитокинин-связывающий белок 67 кД, выделенные из листьев Arabidopsis thaliana разного возраста.

Проделанная работа показала, что активность связанной с хроматином РНК-полимеразы I из молодых растущих листьев 3-х-недельных растений Arabidopsis thaliana существенно не изменяется в ходе инкубации срезанных листьев на воде и сохраняет в течение изученного периода (24 часа) высокий уровень ответа на экзогенный цитокинин, что согласуется с низким содержанием эндогенного гормона в этих листьях. Молодые листья содержат 67 кД белок, способный активировать синтез РНК in vitro в гомологичной (хроматин и РНК-полимераза из тех же листьев) и гетерологичной системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя. Действие белка усиливается в присутствии цитокинина.

Листья 7-недельных растений отличались высоким содержанием эндогенных цитокининов и слабой реакцией транскрипционной системы на экзогенный цитокинин. Они содержали активный в стимуляции транскрипции in vitro 67 кД белок, способный активировать элонгацию транскрипции как в гомологичной, так и в гетерологичной системе. В обеих системах он не нуждался в экзогенном цитокинине для активации транскрипции. Можно предположить, что его насыщение гормоном или вызванная гормоном модификация белка происходили в клетках под действием эндогенных цитокининов.

В старых листьях 9-недельных растений экзогенный цитокинин вызывал существенные изменения. При его действии на срезанные листья

происходило транзиторное повышение активности протеинкиназ хроматина, за которым следовала активация РНК-полимеразы I, что позволяет предполагать участие фосфорилирования белков в активации этого фермента. Рассмотренному действию цитокинина in vivo соответствовало присутствие в листьях 67 кД рецепторного белка, который активировал транскрипцию in vitro только в присутствии экзогенного цитокинина как в гомологичной, так и в гетерологичной системе транскрипции.

Суммируя рассмотренные материалы, приходим к заключению, что в старых листьях двудольного растения Arabidopsis thaliana, как и в старых листьях однодольного растения (ячмень), присутствует 67 кД белок -рецептор цитокинина со свойствами фактора транскрипции, участвующего в активации транскрипции цитокинином. Проделанная работа позволила установить изменение свойств этого белка в онтогенезе растений, что открывает перспективу дальнейших исследований его возрастных особенностей.

Выводы

1. Обнаружены возрастные различия в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев растений Arabidopsis thaliana в онтогенезе растений.

2. Показано, что обработка срезанных листьев цитокинином приводит к активации в них связанной с хроматином РНК-полимеразы I в течение всего изученного периода жизни растений ( от 2 до 9 недель).

3. Наибольшая чувствительность транскрипционной системы к цитокинину при обработке им срезанных листьев обнаружена в молодых растущих листьях 3-х-недельных растений.

4. Обработка цитокинином листьев 5 и 7-недельных растений слабо влияла на активность РНК-полимеразы I и протеинкиназ хроматина, выделенного из листьев, что может быть результатом высокого содержания эндогенных цитокининов в листьях растений этого возраста.

5. Обработка листьев 9-недельных растений Arabidopsis thaliana цитокинином с последующим выделением хроматина показала, что цитокинин вызывает в листьях транзиторную активацию связанных с хроматином протеинкиназ, за которой следует активация РНК-полимеразы I.

6. Активация протеинкиназ и РНК-полимеразы I наблюдалась как при обработке гормоном срезанных листьев, так и при добавлении гормона в буфер для гомогенизации листьев в ходе выделения хроматина.

7. Установлено, что ЦСБ 67 кД, выделенные из листьев растений Arabidopsis thaliana разного возраста (3, 7 и 9 недель), различались по способности активировать элонгацию транскрипции in vitro в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I из листьев арабидопсиса (гомологичная система) и ячменя (гетерологичная система):

а) белок 67 кД из листьев 9-недельных растений в комплексе с цитокинином активировал транскрипцию в гомологичной и гетерологичной системах и это свойство строго зависело от присутствия цитокинина в реакционной среде;

б) белок 67 кД из листьев 3-х-недельных растений арабидопсиса активировал синтез РНК in vitro в гомологичной и гетерологичной транскрипционных системах и эта активация существенно усиливалась цитокинином;

в) белок 67 кД из листьев 7-недельных растений активировал элонгацию транскрипции in vitro в отсутствие цитокинина в реакционной среде и был цитокинин-независимым. Листья растений этого возраста отличались максимальным содержанием эндогенных цитокининов, что позволяет обсуждать возможные изменения свойств 67 кД белка в клетках листа под их влиянием.

8. В опытах с обработкой срезанных листьев цитокинином показана активация гормоном связанных с хроматином РНК-полимеразы I и протеинкиназ у этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis thaliana (eti5 и etrl).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Земляченко Я.В., Каравайко Н.Н., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Изучение взаимодействия цитокининов с ЦСБ из листьев ячменя в зависимости от их структуры. // Тезисы докладов III съезда ВОФР «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология». Москва, 1997, с.6.

2. Земляченко Я.В., Каравайко Н.Н., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Новый подход к изучению зависимости между структурой и функцией цитокининов //Доклады Академии Наук, 1997, т.353, №2, с.261-263.

3. Бурханова Э.А., Каравайко Н.Н., Порфирова С.А., Селиванкина С.Ю., Маслова Г.Г., Земляченко Я.В. Ответ на цитокинин листьев белых и зеленых мутантов ячменя // Тезисы докладов III съезда ВОФР «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология».Москва, 1997, с.З.

4. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Maslova G.G. Nuclear receptor of trans-zeatin involved in transcription activation by cytokinin // Abstracts of International Conference " Molecular, Biochemical & Physiological Aspects of Plant Science, Moscow, 1997, p. 13.

5. Каравайко H.H., Селиванкина С.Ю., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Сравнительный анализ взаимодействия с рецептором транс-зеатина цитокининов - производных пурина и производного фенилмочевины // Тезисы IV съезда ВОФР, Москва, 1999, с.764-765.

6. Маслова Г.Г., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Действие цитокинина на синтез РНК in vitro в транскрипционной системе из листьев Arabidopsis thaliana И Тезисы IV съезда ВОФР, Москва, 1999, с.774-775.

7.0.Kulaeva, N.Karavaiko, S.Selivankina, V.Kusnetsov, G.Maslova, G.Cherepneva. Cytokinin-binding proteins mediating cytokinin-dependent regulation of transcription // Biologia plantarum, 1999, p 30. 8. Maslova G.G., Selivankina S.Yu., Karavaiko N.N. and Kulaeva O.N. Cytokinin-binding protein from Arabidopsis thaliana leaves mediates cytokinin-dependent activation of transcription elongation // Plant Physiology and Biochemistry, 2000,

vol.38-Supplement. Abstracts 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, 21-25 August 2000, Budapest, p.76.

Zemlyachenko Ya.V., Cherepneva G.N., Maslova G.G., LukevichT.V., Smith A.R., Hall M.A. Nuclear and chloroplast cytokinin-binding proteins from barley leaves participating in transcription regulation// Plant Growth Regulation, 2000, v.32, p.1-8.

10. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., ЗемляченкоЯ.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro II Физиология

9Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Kusnetsov V.V.,

растений, 2001, т.48, №3.