Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L.

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L."

На правах рукописи

005051953

Селиванова Наталия Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦ А И В ИЗОФЕРМЕНТОВ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В РАСТЕНИЯХ ZEA MAYS L. И ARABIDOPSIS THALIANA L.

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 АПР ¿013

Воронеж - 2013

005051953

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бпринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Ершова Антонина Николаевна,

доетор биологических наук, профессор, Воронежский государственный педагогический университет, зав. кафедрой биологии растений и животных

Башарина Ольга Владимировна,

кандидат биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет,

доцент кафедры биофизики и биотехнологии

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАН

им. КА. Тимизярева

Защита состоится «26» апреля 2013 года вШйасов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте ФГБОУ ВПО «ВГУ»: www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Актуальность проблемы. Одним из главных направлений развития биохимии является изучение механизмов регуляции метаболических процессов, осуществляемых в живых организмах. Среди множества проблем данной области науки важное место занимает изучение ферментативных систем, их роли и механизмов действия при передаче и реализации генетической информации организма (Пинейру де Корвалью и др., 1991).

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) - фермент, имеющий практически универсальное распространение среди живых организмов. СДГ занимает ключевое положение в регуляции аэробного дыхания. Несмотря на то, что сукцинатдегидрогеназа из объектов различного происхождения хорошо изучена, исследование функционирования данного фермента из растений представляет особую значимость.

В последнее время усилился интерес к выявлению роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии генов. Данные о влиянии метилирования промоторов на инактивацию активности сукцинатдегидрогеназы человека и животных весьма многочисленны (АвШ^ й а1., 2004; Сегуега с1 а1., 2009). Также в последнее время произошел значительный прорыв в понимании процесса метилирования ДНК у растений, особенно у Лгабгс/о/ш.5 ЛаПапа (Ванюшин, 2006), однако работ, посвященных выяснению механизмов эпигенетической регуляции функционирования генов, обеспечивающих энергетический метаболизм (в том числе и сукцинатдегидрогеназных генов) в растительных организмах, нами обнаружено не было.

Не до конца изученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение регуляции экспрессии генов субъединиц А и В изоферментов СДГ в растениях Arabidopsis thaliana и Zea mays.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ активности и изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в разных органах исследуемых растений;

2. Определить уровень транскрипции генов субъединиц А и В СДГ в онтогенезе арабидопсиса и кукурузы методом ПЦР в реальном времени, на основании результатов исследования установить генетическую детерминацию форм фермента;

3. Проанализировать нуклеотидный состав промоторов генов, кодирующих субъединицы А и В СДГ на наличие CpG-островков и разработать праймеры для метил-специфичной ПЦР;

4. Изучить роль метилирования промоторов генов sdhl-1 и sdhl-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы на уровень экспрессии этих генов при прорастании семян кукурузы и смене типов питания;

5. Определить действие красной (X = 640-680 нм и X =710-750 нм) и синей (X = 465-470 нм) части спектра на функционирование исследуемого фермента в листьях растений;

6. Выявить роль катионов кальция в трансдукции рецепторного сигнала фитохромной и криптохромной систем.

Научная новизна и значимость работы. Анализ нуклеотидного состава промоторов показал, что гены sdhl-1 и sdhl-2 кукурузы и гены sdhl-2, sdh2-l и sdh2-2 арабидопсиса имеют в составе промоторов CpG-островки, что обуславливает регуляцию работы данных генов за счет изменения степени их метилирования. Впервые обнаружена корреляция между уровнем транскрипции генов sdhl-1 и sdhl-2 и степенью метилирования их промоторов. При прорастании семян повышался уровень метилирования

промоторов генов $с1М-1 и $с1М-2, что играет важную роль в регуляции экспрессии исследуемых генов в тканях растений.

Показано, что экспрессия гена в зеленых листьях 2.тау$ и

АлЬаНапа находится под контролем фитохромной системы, при этом выявлена важная роль кальция как мессенджера фитохромного сигнала.

Полученные результаты расширяют и углубляют знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности.

Практическая значимость.

Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов сукцинатдегидрогеназных генов, впервые проведенный в работе, позволил синтезировать метил-специфичные праймеры, что открывает новые перспективы для их использования в научно-исследовательских лабораториях при изучении эпигенетического контроля за функциональным состоянием ферментных систем.

Полученные результаты по механизмам трансдукции фитохромного и криптохромного сигналов при различных условиях освещения открывают возможности для создания светильников на основе светодиодов, которые обладают оптимальными спектральными характеристиками и могут быть внедрены в практику выращивания растений в светокультуре.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. В щитках и листьях кукурузы присутствуют конститутивные и индуцибельные формы сукцинатдегидрогеназы, что связано с ее

полифункциональностью (помимо участия фермента в функционировании ЦТК и комплекса II в ЭТЦ, СДГ осуществляет утилизацию сукцината в глюконеогенезе и обеспечивает каталитическое превращение сукцината в оксалоацетат -предшественник аспартата).

2. В геномах кукурузы и арабидопсиса субъединицы А и В сукцинатдегидрогеназы кодируются несколькими генами, характеризующимися дифференциальной экспрессией в разные периоды развития растения, то есть имеет место чёткая регуляция экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы при прорастании растений и их физиологическом переходе от органотрофного к автотрофному типу питания.

3. Метилирование СС-динуклеотидов промоторов генов сукцинатдегидрогеназного ферментного комплекса является механизмом регуляции экспрессии исследуемого фермента в прорастающих семенах кукурузы.

4. Функционирование сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях растений контролируется фитохромной системой, при этом катионы кальция, выступая в качестве вторичного мессенджера, обеспечивают трансдукцию фитохромного сигнала.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 12-ой, 13-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология -наука 21-ого века» (Пущино, 2008, 2009, 2010); Международной научной конференции «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва, 2010, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011); Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных»

(Махачкала, 2010г.); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва 2010); МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010г.); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011г.); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2009, 2010, 2011, 2012).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях- 7 статьях и 10 тезисах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (195 источников). Иллюстрационный материал включает 43 рисунка и 3 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве объектов исследования в работе использовали листья и щитки семян кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76 и проростки арабидопсиса, выращенные гидропонным способом. В работе использовали семена четырех линий растений A. thaliana: растения дикого типа (Со1-0), мутанты по гену фитохрома A (phya-201), мутанты по гену фитохрома В (phyb-1) и мутанты по гену криптохрома (сгу-7), полученные из Института Макса Планка (Гольм, Германия).

Постановка эксперимента по созданню светового режима. Белый свет получали от ламп дневного света в установке «Флора-1». Красный и дальний красный свет получали с помощью светодиодов с областью испускания 640680 нм (ОАО «Протон», Россия) и 710-750нм (ОАО «Протон», Россия).

Синий свет получали с помощью светодиодов с областью испускания 465470 нм (ОАО «Протон», Россия).

Определение активности сукцинатдегидрогеназы. Активность СДГ определяли методом, основанным на применении искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенциалом (Епринцев и др., 2010). Общее количество белка определяли по методу Лоури с совт. (Lowry, 1951). Определение изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы. Для определения изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы использовали метод неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по Девису (Davis, Ornstein, 1959). Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы осуществляли модифицированным тетразолиевым методом (Климова, Епринцев, 2008).

Выделение ядер из листьев кукурузы. Выделение фракции ядер из растительного материала производилось по методике, предложенной Ли и Лин (Lee, Lin, 2005).

Определение содержания катионов кальция. Измерение свободного кальция проводилось спектрофотометрическим методом по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина (Меньшиков, 1987). Выделение суммарной клеточной РНК. Для выделения суммарной клеточной РНК использовался метод фенол-хлороформной экстракции с использованием в качестве осадителя LiCl (Herrington, 1992). Проведение ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ проводили на приборе BioRad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I.

Выделение геномной ДНК. ДНК выделяли из.щитков кукурузы с помощью набора ДНК-сорб-С (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Модификация ДНК бисульфитом натрия. Модификацию ДНК бисульфитом натрия согласно ранее опубликованному протоколу (Warnecke

et al, 2002) с некоторыми изменениями.

Анализ промоторов сукцинатдегидрогеназных генов и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР. Для анализа промотора генов sdhl-1 и sdhl-2 СДГ на наличие CpG-островков использовали программу MethPrimer - Li Lab, UCSF

Проведение метил-спецнфичной полимеразной цепной реакции. ПЦР с

метил-специфичными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpIiSence ("Хеликон", Россия). Реакцию ПЦР проводили на приборе Терцик ("ДНК-Технология", Россия).

Секвенирование ПЦР-продукта. Очищенный и экстрагированный ампликон секвенировали в отделе «ВНТК генной активности» Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 8-10 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

Анализ активности СДГ в различных органах растений Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в процессе прорастания семян кукурузы и арабидопсиса представлена на рисунках 1а и 16 соответственно. Видно, что в сухих семенах не наблюдается ферментативной активности СДГ. В последующие дни прорастания семян происходило постепенное увеличение активности СДГ, которое достигло максимального значения на 4 день (для арабидопсиса, 3,840 Е/мг белка) и 5 день (для кукурузы, 0.633 Е/мг белка в щитках и 0.267 Е/мг белка в проростках). Интенсивность работы сукцинатдегидрогеназы в щитках прорастающих семян кукурузы после 7-го дня прорастания стабилизируется на уровне 4345% от максимального значения, тогда как в проростках и кукурузы и арабидопсиса сохраняется около 30% активности исследуемого фермента.

Интенсификация функционирования СДГ на начальных этапах прорастания семян, по-видимому, связана с увеличивающейся ролью цикла Кребса как поставщика восстановленных коферментов (НАДН) и субстратов для биосинтетических процессов, активно протекающих в развивающемся проростке.

I

| I | ]

I I 1

Пп^Ь

I I • { I

I * I Г. ' с к •». ш

I • I * « $ 8 * Л

23456739 10 Экспозиция, день

(б)

Рис. 1. Динамика активности сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы (а) и арабидопсиса (б).

Исследование изоферментного состава СДГ Электрофоретический анализ изоферментного спектра в полиакриламидном геле при прорастании семян и переходе проростков на новый тип питания выявил, что на пятый день прорастания в щитках кукурузы появлялись четыре формы СДГ с = 0.19, 0.29, 0.39 и 0.44 (рис. 2). В дальнейшем изоферментный состав СДГ в щитках кукурузы значительно менялся, и к девятому дню прорастания обнаруживали только две формы СДГ с К{= 0.29 и 0.39, а изоформы с = 0.19 и 0.44 отсутствовали.

Таким образом, изоферменты с = 0.29 и 0.39 являются конститутивными формами, поскольку они выявлялись в течение всего периода прорастания семян кукурузы, а изоферменты с Кг = 0.19 и 0.44 проявляются только в щитках с пятого по седьмой день прорастания и представляют собой индуцибельные формы.

5 7 9

ЖИР ¡ши ......: :

Рис. 2. Изоферментный состав СДГ в щитках

|| л -_ р

_ кукурузы при прорастании семян. Р — белковая полоса, Б - фронт красителя, 5, 7, 9 — дни прорастания семян кукурузы.

Изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу А сукцинатдегидрогеназы

Для оценки количественных показателей интенсивности работы генов, кодирующих субъединицу А СДГ использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green I.

Расчетные значения относительной концентрации транскрипта гена sdhl-1 и гена sdhl-2 в разных образцах кДНК из щитков кукурузы представлены на рисунках ЗА и ЗБ, из которых видно, что в растениях с первого по четвертый день активно транскрибируются оба гена, достигая максимума на пятый день прорастания. Начиная с шестого дня, уровень экспрессии гена sdhl-1 уменьшается по сравнению с уровнем экспрессии гена sdhl-2 и практически прекращает транскрибироваться к восьмому дню. При этом относительная концентрация транскрипта гена sdhl-2 остается высокой на протяжении всего времени эксперимента.

Аналогичная картина наблюдается и при анализе экспрессии генов sdhl-1 и sdhl-2 при прорастании семян арабидопсиса.

I I, I I '! I

1 I 5 I"

. III. IT .Jlliilj

0 12 3) 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Экспозиция, день ЭКСПОЗИЦИЯ, ДвНЬ

(a) (6)

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии генов sdhl-1 (а) и sdhl-2 (б) в щитках кукурузы в ходе онтогенеза.

Изменение степени метилирования промоторов генов субъединицы А СДГ при прорастании семян кукурузы и смене типов питания

Показана зависимость изменения содержания мРНК для исследуемых генов при прорастании семян и зеленении проростков кукурузы от уровня метилирования промоторов данных генов. Расчетные величины относительной концентрации транскрипта гена sdhl-1 и гена sdhl-2 в разных образцах кДНК представлены на рис. 4а и 46, из которых видно, что в растениях в первые дни прорастания, когда промоторы практически не метилированы, активно транскрибировались оба гена. Максимальное содержание мРНК для гена sdhl-1 было обнаружено на пятый день прорастания, а для гена sdhl-2 - на четвертый. К пятому дню метилирование генов sdhl-1 и sdhl-2 достигало 75 и 50% соответственно. Начиная с шестого дня, CG-динуклеотиды, входящие в состав промотора гена sdhl-1, были полностью метилированы, что привело к резкому снижению уровня экспрессии гена sdhl-1 и полному выключению его к десятому дню, что может быть связано с регуляцией за счет изменения степени метилирования его промотора, т.к. оба исследованных гена имели в составе промотора по два CpG-островка. В то же время, метилирование CG-динуклеотидов,

входящих в состав промотора гена зс1к1-2, не вызывало его полной инактивации. Уровень экспрессии данного гена на десятый день прорастания составлял 30% от максимального значения.

Экспозиция, день

1 - экспрессия &ЛМ-1 , Экспозиция, день

? - степень мепинрованга дайЫ J -экспрессия$ЛП 1-2

степень ыетпировашя Л1-2

(а) (б)

Рис. 4. Динамика метилирования промотора генов зс!к1-1 (а) и (б) и

его экспрессии в щитках при прорастании семян кукурузы.

Трансдукция фитохромного сигнала при светорегуляции сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы

На рисунке 5 изображена зависимость изменения активности СДГ от уровня экспрессии гена 3(1111-2 под действием света разных длин волн,

Показано, что на свету и под влиянием КС (660 нм) происходило снижение активности фермента относительно контрольного уровня (24 часа в темноте) в 2,2 и 2,6 раз, соответственно. Полученные данные четко коррелируют с изменением скорости экспрессии гена, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы. Прямая зависимость активности сукцинатдегидрогеназы от уровня экспрессии гена яс1И1-2 свидетельствует, что изменение каталитической активности исследуемого фермента связано с

регуляцией синтеза пептидных компонентов для каталитического димера

СДГ.

Рис.5. Активность и уровень транскрипции гена Бс11г1-2

сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы под действием света разной длины волны. Свет - растения, освещенные белым светом; Темнота -растения, выдержанные в темноте; КС -растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; ДКС - растения, освещенные светом с длиной волны 730 нм; КС+ДКС - растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 нм и 730 нм.

Динамика экспрессии гена в листьях АгаЫс1ор515 ШаНапа,

дефицитных по генам фитохрома А и В

Ранее было показано, что красный свет ингибирует функционирование сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях арабидопсиса дикого типа (Попов и др., 2007). Для выяснения роли и механизма действия разных типов фитохромов в регуляции экспрессии СДГ нами был проведен анализ содержания мРНК гена в листьях мутантных форм арабидопсиса,

дефицитных по гену фитохрома А и В (рис.6 А и В). В опытах по влиянию красного и дальнего красного света на уровень экспрессии гена ¡с1Ъ1-2, было показано, что красный свет вызывает изменения в работе генетического аппарата клетки, приводящие к уменьшению количества мРНК СДГ в клетке растений, содержащих в геноме ген фитохрома А. Противоположный эффект вызывает действие дальнего красного света. Его влияние на растения

сзет темнота КС ДКС КС#С Условия опыта

1 ■ ЖШ8Н0Я1 СДГ - ■ зкспркспя М-2

арабидопсиса приводит к более интенсивному экспрессированию гена «Ш-2, что проявляется в увеличении числа копий мРНК в образце суммарной РНК, выделенной из растений, облученных дальним красным светом.

л 8 ' А

сае* темнот .НС ДНС «ода: Условия опыта

Условия опыта

Рис. 6. Относительный уровень транскрипции гена зс1к1-2 в листьях арабидопсиса, мутантного по гену фитохрома А (А) и фитохрома В (Б), при разных световых режимах.

Картина изменения уровня транскрипции гена 8<Н11-2 в растениях, мутантных по гену фитохрома В, аналогична картине в растениях дикого типа (Попов и др., 2007). Это свидетельствует о пассивности фитохрома В в регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы.

Изучение роли кальция в трансдукции рецепторного сигнала Анализ содержания кальция в ядрах клеток растений в условиях разного светового режима показал, что данная характеристика имеет четкую корреляцию с функциональным состоянием фитохромной системы. Так установлено, что в условиях облучения растений красным светом происходит увеличение содержания кальция в ядре по сравнению с 24-часовой инкубацией в темноте. При этом максимальное увеличение концентрации кальция в ядре наблюдается в первые 30 мин после облучения (рис. 7). Из рисунка видно, что по истечении 30 минут после облучения растений КС концентрация кальция возрастала в 1,4 раза. В дальнейшем происходит

уменьшение содержания кальция в ядрах растений и к 24 часам после облучения данный показатель стабилизируется на уровне контроля (темнота).

л 1,2 5 >1

о 0.8 а • л

и 0,4

Рис. 7. Изменение содержание кальция в ядрах растений после облучения красным светом.

30 ми*

Условия эксперимента

По-видимому, изменение концентрации кальция свидетельствует о его роли в регуляции функционального состояния генома клетки, являясь переносчиком в трансдукции фитохромного сигнала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные по динамике активности сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы позволяют оценить изменение скорости функционирования данного фермента и выдвинуть предположение о его физиологической роли в метаболизме прорастающих семян при изменении типа их питания.

Исследование изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе кукурузы позволило выявить индуцибельные и конститутивные формы СДГ в щитках и листьях кукурузы.

Выявленное изменение интенсивности экспрессии генов и з<1Ы-2

сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян арабидопсиса и кукурузы может свидетельствовать о переключении энергетического метаболизма растительной клетки при переходе к фотосинтетической активности.

Исследование экспрессии генов субъединицы В сукцинатдегидрогеназы позволило выявить неоднородность их экспрессии в разные периоды развития семян кукурузы.

В процессе развития растения происходит выключение интенсивности транскрипции генов $с1М-1, $с1Ь2~2 и л//г2-/, вероятно, обусловленное снижением количества сукцината, образующегося в глиоксилатном цикле. Однако, небольшой уровень активности генов яс1к1-2 и СДГ

сохраняется, свидетельствуя о функционировании ЦТК в зеленых проростках для обеспечения протекания биосинтетических реакций (Епринцев и др., 1999).

Анализ промоторов показал, что гены .усй/-/ и хйМ~2 кукурузы и гены •уа%/-2, $с1И2-1 и «ЙЙ2-2 арабидопсиса имеют в составе промоторов СрО-островки, что обуславливает их регуляцию за счет изменения степени метилирования. Обнаружена корреляция между уровнем транскрипции генов л/А/-/ и и степенью метилирования их промоторов. При прорастании

семян наблюдалось повышение уровня метилирования промоторов генов, кодирующих субъединицу А СДГ, что приводило к снижению их транскрипции. Предполагается, что этот механизм может играть важную роль в регуляции экспрессии генов ясНг1-1 и зйМ-2 в тканях растений.

На основании анализа данных изменения экспрессии гена сукцинатдегидрогеназы и динамики концентрации катионов кальция в ядрах растений в условиях освещения светом разного спектрального состава, можно предположить, что экспрессия гена яс11г1-2 находится под контролем фитохромной системы и, вероятно, катионы кальция выступают в качестве мессенджера фитохромного сигнала, запуская каскадные механизмы регуляции экспрессии генетического материала клетки. Поскольку выявлена прямая корреляция между экспрессией генов СДГ и ее ферментативной активностью, перераспределение внутриклеточного кальция между

органоидами, осуществляемое фитохромной системой, является тонким механизмом контроля функционирования сукцинатдегидрогеназы.

Таким образом, на основе полученных данных можно представить гипотетическую схему регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений (рис. 8).

Известно, что на начальных этапах прорастания семена осуществляют гетеротрофный тип питания, используя в качестве субстратов запасные вещества (вио е1 а1., 1998). В том числе, функционирует процесс превращения запасных жиров в углеводы через глиоксилатный цикл, являющийся звеном глюконеогенеза. В данном случае сукцинатдегидрогеназа выполняет биосинтетическую роль, осуществляя метаболизацию сукцината, образующегося в результате работы глиоксилатного цикла (\Vestenberg е1 а1., 1993). Вероятно, в метаболизации образующегося сукцината принимает участие одна из индуцибельных форм исследуемого фермента. Интересно отметить, что степень метилирования промоторов и за1И1-2 обуславливает редукцию количества

изоферментов СДГ. Максимальный уровень метилирования генов наблюдается на 5 и 7 (яс!Ы-2), что сопряжено с исчезновением двух

дополнительных форм фермента.

По мере развития проростка происходит смена основного типа питания с гетеротрофного на автотрофный. Основную долю углеводов растение начинает получать за счет фотосинтетических процессов, в связи с чем необходимость мобилизации запасных липидов отпадает. Перестройка

гетеротрофный тип питания

липиды

\

аслартат интермедиа™

Рис.8. Гипотетическая схема световой регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений.

Фббо - неактивная форма фито хрома; Ф730 - активная форма фитохрома; ГЦ - гли оке штатный цикл; АлАТ- аланинаминотрансфераза; РП7 - фактор транскрипции.

метаболизма в растении при физиологическом переходе (смене типа питания) сопровождается изменением состава энзимов сукцинатдегидрогеназной системы. Регуляция функционирования СДГ при помощи фитохромной системы может являться одним из важнейших механизмов контроля за энергетическими процессами в клетке.

Известно, что фитохром А и фитохром В, после их индукции светом, способны активно транспортироваться в клеточное ядро (Harry, 2000). Регулирование экспрессии гена sdhl-2 фитохромом возможно осуществляется путем перемещения Фк в ядро, где индуцируется изменение концентрации Са2+, являющегося вторичным мессенджером, регулирующим функционирование экспрессии светозависимого гена

сукцинатдегидрогеназы.

ВЫВОДЫ

1. Установленная вариабельность активности и изоферментного состава (выявлены иидуцибельные и конститутивные формы) сукцинатдегидрогеназы может быть связана с ее полифункциональностью: помимо традиционного участия фермента в функционировании ЦТК и комплекса II ЭТЦ, СДГ осуществляет каталитическое превращение сукцината в глюконеогенезе и закисление запасных веществ путем синтеза органических кислот. Максимальная активность СДГ наблюдалась на 4-5-е дни, что сопровождалось появлением наибольшего числа изоформ (4 изоформы).

2. Анализ экспрессии генов, кодирующих субъединицы А и В сукцинатдегидрогеназы, показал, что гены sdhl-2 и sdh2-3 транскрибируются во все периоды прорастания семян, и, вероятно, принимают участие в формировании конститутивных форм СДГ. Транскрипции генов sdhl-1, sdh2-l и sdh2-2 четко совпадают с активацией

процессов метаболизации запасных жиров, и предположительно кодируют соответствующие изоферменты.

3. В результате анализа структуры промоторов показано, что гены ясНг!-! и .уя%/-2 кукурузы и гены яс!Ь1-2, зсШ-] и ЛЙ2-2 арабидопсиса имеют в составе промоторов Срв-островки, что может обуславливать их регуляцию за счет изменения степени их метилирования. Впервые проведена амплификация промоторной области геномной ДНК кукурузы и ее сиквенс, на основе которого разработаны специфические праймеры для метил-специфичной ПЦР.

4. Впервые показана важная роль метилирования СО-динуклеотидов промоторов генов СДГ-комплекса в регуляции экспрессии фермента, на что указывает прямая корреляция между степенью метилирования промоторов и активностью и изоферментным составом СДГ при прорастании семян кукурузы.

5. Выявлена зависимость скорости функционирования СДГ от состояния рецепторных систем кукурузы и арабидопсиса. Показано, что активная форма фитохрома А участвует в регуляции экспрессии гена £¿//77-2, вызывая уменьшение скорости синтеза мРНК. Криптохромная система не оказывает влияния на работу генетического аппарата клетки.

6. Выявлена прямая корреляция между экспрессией гена в(Нг1-2 СДГ и изменением содержания катионов кальция в ядрах клеток листьев кукурузы в условиях различного светового режима. Перераспределение внутриклеточного кальция между органоидами, осуществляемое фитохромной системой, является тонким механизмом контроля функционирования сукцинатдегидрогеназы.

7. На основе полученных данных представлена гипотетическая схема регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений, в которой рассматривается роль рецепторных систем, влияющих на

функционирование СДГ при физиологическом переходе и смене типа питания с гетеротрофного на автотрофный.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП№ 14.740.11.1199 и грантом РФФИ № 11-04-00812-а.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Гончаренко И.В., Буре И.Н., Мухаммад Навид, Епринцев А.Т. Динамика экспрессии генов sdhl-1 и sdhl-2 при прорастании семян Zea mays L.// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2008. С.266-273.

2. Селиванова Н.В., Гончаренко И.В., Буре И.Н., Федорин Д.Н., Епринцев А.Т. Экспрессия генов субъединицы А сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян Zea mays L. // Биология наука XXI века: 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных (Пущино, 10-14 ноября 2008г., сборник тезисов, с. 59-60.).

3. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Анвар Ахмад Дж., Селиванова Н.В., Гончаренко И.Н. Роли фитохрома А и фитохрома В в световой регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях Arabidopsis thaliana L. // Международная конференция 'Тецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2-4 июня 2009г., Т.2. с. 657-661).

4. Селиванова Н.В., Анвар Ахмад Дж., By Тхи Лоан, Федорин Д.Н., Епринцев А.Т. Роль фитохромной системы в регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях Arabidopsis thaliana L. // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2009. С.184-191.

5. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Анвар Ахмад Дж., Гончаренко И.Н. Экспрессия субъединицы В сукцинатдегидрогеназы в щитках кукурузы // Биология наука XXI века: 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных (Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г., сборник тезисов, с. 48.).

6. Селиванова Н.В., Гончаренко И.Н., Федорин Д.Н. Степень метилирования гена sdhl-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян

кукурузы // Биология наука XXI века: 14-я международная Путинская школа-конференция молодых учёных (Пущино, 19-23 апреля 2010 г., сборник тезисов, с. 179.).

7. Епринцев А. Т., Федорин Д. Н., Селиванова Н. В., Ахмад Дж. А., Попов В. Н. Роль дифференциальной экспрессии генов sdhl-1 и sdhl-2 в изменении изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы // Известия РАН. Серия биологическая, 2010, № 3, с. 324-332.

8. Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Гончаренко И.Н., Буре И.В., Ву Тхи Лоан, Епринцев А.Т. Особенности структуры промоторных областей генов субъединиц а и в сукцинатдегидрогеназы A. thaliana L. И Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2010. С.222-229.

9. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Гончаренко И.Н. Влияние метилирования гена sdh 1-2 сукцинатдегидрогеназы на уровень его экспрессии при прорастании семян Zea mays L. // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010 г., 12 —-15 апреля, с. 208-209).

10. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Ву Тхи Лоан, Епринцев А.Т. Роль синего света в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы в проростках кукурузы II Материалы Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010г. С. 88-91.).

11. Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Ву Тхи Лоан, Гончаренко И.Н., Епринцев А.Т. Фоторегуляция экспрессии гена sdhl-2 в растениях A.thaliana нокаутных по генам фитохрома А и В // Всероссийский симпозиум «Растение и стресс» (Москва 2010, 9-12 ноября, с. 315-316).

12. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Гончаренко И.Н., Дадакина И.В., Ву Тхи Лоан Эпигенетический контроль функционирования гена sdhl-1 сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян Zea mays L. // МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010г., с. 251).

13. Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Ву Л.Т., Махмуд A.C. Экспрессия генов субъединицы В сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы II Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2011" (Москва, 2011г., 11 — 15 апреля, с. 196-197).

U/

l ■

14. Федорин Д.Н., Селиванова Н.В., Селезнева Е.А., Карабутова Л.Ю., Махмуд Али С., Эсмаилпур М., Епринцев А.Т. Экспрессия генов каталитического димера сукцинатдегидрогеназы в щитках и зеленых листьях кукурузы // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2011. С.190-197.

15. Федорин Д.Н., Епринцев А.Т., Селиванова Н.В., Эсмаилпур Махди, Селезнева Е.А. Роль синего света в регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы // VI съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий», 4-10 июля 2011г., Нижний Новгород. - стр. 715-716.

16. Епринцев А. Т., Селиванова Н. В., Федорин Д. Н., Башкин С. С., Селезнева Е. А., Дадакина И. В., Махмуд Али С. Роль катионов кальция в механизме фитохром-зависимой регуляции экспрессии гена sdhl-2 и активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы // Биол. Мембр., 2012, том 29, № 3, с. 165-168.

17. Епринцев А. Т., Федорин Д. Н., Селиванова Н. В., Ву Т. JI., Махмуд А. С., Попов В. Н. Роль метилирования промоторов в регуляции генов сукцинатдегидрогеназы в проростках кукурузы // Физиол. Раст., 2012, том 59, № 3, с. 332-340.

Статьи № 7, 16 и 17 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 21.03.13. Формат 60x84 Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 281.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Селиванова, Наталия Владимировна, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

(ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

ИЗОФЕРМЕНТОВ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В РАСТЕНИЯХ гЕА МАУ8 Ь. И АЮІВЮОРЗт ТНАЬІАИА Ь.

На правах рукописи

Селиванова Наталия Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦ А И В

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04 - биохимия

00

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Епринцев А.Т.

Воронеж - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................................7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................13

I. Характеристики сукцинатдегидрогеназной системы......................................13

1.1. Структурная организация и механизм действия СДГ..................13

1.2. Физиологическая роль комплекса II в растениях............................17

II. Генетическая детерминация сукцинатдегидрогеназы..........................19

2.1. Структурные особенности организации

генетического материала............................................................................................19

2.2. Сравнительная эволюция сукцинатдегидрогеназных генов......................................................................23

III. Регуляторные аспекты функционирования СДГ в

живых организмах................................................................................................................................29

3.1. Экспрессионная регуляция сукцинатдегидрогеназы................................30

3.2. Эпигенетические механизмы регуляции СДГ..................................................32

3.2.1. Метилирование ДНК..................................................................................................33

3.2.2. Регуляция метилирования ДНК в

эукариотических клетках........................................................................................35

3.2.3. Срв островки......................................................................................................................36

3.2.4. Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК..........37

3.3. Регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы факторами среды......................................................................................................................40

3.3.1. Влияние света на СДГ растений........................................................................40

3.3.2. Функционирование СДГ под действием

стрессовых факторов................................................................................................................41

IV. Рецепторные системы растений..........................................................................................42

4.1. Фитохромная система............................................................................................................43

4.1.1. Структура и свойства................................................................................................44

4.1.2. Распространение и локализация..................................................................46

4.2. Криптохромы................................................................................................................................47

4.2.1. Структура и свойства..................................................................................................47

4.2.1. Распространение и локализация........................................................................50

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................................52

2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................52

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................53

2.2.1. Объекты исследования..............................................................................................53

2.2.2 Постановка эксперимента по созданию

светового режима............................................................................................................53

2.2.3. Метод выделения фермента..................................................................................56

2.2.4. Определение активности сукцинатдегидрогеназы..........................56

2.2.5. Определение количества белка..........................................................................57

2.2.6. Определение изоферментного состава

сукцинатдегидрогеназы......................................................................................57

2.2.7. Выделение ядер из листьев кукурузы............................................................59

2.2.8. Определение содержания катионов кальция........................................59

2.2.9. Определение степени загрязнения фракции ядер..............................59

2.2.10. Выделение суммарной клеточной РНК..................................................60

2.2.11. Определение концентрации суммарной клеточной РНК... 60

2.2.12. Получение кДНК методом обратной транскрипции..................60

2.2.13. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле..................................................................................................................61

2.2.14. Проведение ПЦР в реальном времени......................................................61

2.2.15. Выделение геномной ДНК....................................................................................62

2.2.16. Модификация ДНК бисульфитом натрия............................................62

2.2.17. Анализ промоторов сукцинатдегидрогеназных генов и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР..............................................63

-к

и

2.2.18. Проведение метил-специфичной полимеразной

цепной реакции.....!........................................................... 65

2.2.19. Секвенирование ПЦР-продукта.................................. 66

2.2.20. Измерение концентрации хлорофилла.......................... 66

2.2.21. Статистическая обработка данных.............................. 67

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................ 68

2.3.1. Биохимические аспекты функционирования сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений........................ 68

2.3.1.1. Анализ активности СДГ в различных

органах растений............................................ 68

2.3.1.2. Исследование изоферментного состава СДГ........... 72

2.3.2. Молекулярные аспекты функционирования сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений................ 76

2.3.2.1. Экстракция суммарной РНК из щитков кукурузы...... 76

2.3.2.2. Амплификация кДНК.......................................... 77

2.3.2.3. Изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу А сукцинатдегидрогеназы.................. 79

2.3.2.4. Изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу В СДГ........................................... 86

2.3.3. Регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы...... 91

2.3.3.1. Исследование роли метилирования промоторов в

регуляции экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы..... 91

2.3.3.1.1. Анализ промоторов генов, кодирующих каталитический субкомплекс СДГ.................. 91

2.3.3.1.2. Изменение степени метилирования промоторов генов и з(1М-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы и смене типов питания.................... 96

К

2.3.3.2.Механизм регуляции функционирования

СДГ фоторецепторными системами...................... 103

2.3.3.2.1. Трансдукция фитохромного сигнала при светорегуляции сукцинатдегидрогеназы в

листьях кукурузы.......................................... 103

2.3.3.2.2. Динамика экспрессии гена 8(1к1-2 в листьяхАгаЫс1ор818 ЖаНапа дефицитных

по генам фитохрома А и В.............................. 105

2.3.3.2.3.Действие синего света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы....... 109

2.3.3.2.4. Влияние синего света на активность СДГ из

зеленых листьев арабидопсиса.................. 110

2.3.3.2.5. Влияние синего света на экспрессию гена субъединицы А сукцинатдегидрогеназы растений............................................................... 112

2.3.3.3. Изучение роли кальция в трансдукции

рецепторного сигнала.................................... 116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................... 120

ВЫВОДЫ................................................................................ 123

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ....................................... 125

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДГ - алкогольдегидрогеназы; АТР - аденозинтрифосфат; АФК - активные формы кислорода; ДКС - дальний красный свет; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ДХФИФ - дихлорфенолиндофенол; ИЦЛ - изоцитратлиаза; КС - красный свет; ЛДГ - лактатдегидрогеназы; НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РНК - рибонуклеиновая кислота; СДГ - сукцинатдегидрогеназа; СДГА - флавопротеин; СДГВ - железо-серный белок;

СДГС и СДГО - субъединицы С и D сукцинатдегидрогеназы,

соответственно;

СС - синий свет;

СУР - сукцинат-убихинон оксидоредуктаза;

УФ - ультрафиолетовый свет;

ФАД - флавинадениннуклеотид;

Фдк - фитохром дальний красный;

Фк - фитохром красный;

ФМН - флавинмононуклеотид;

ФМС - феназинметасульфат;

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;

ЭТЦ - электронтранспортная цепь;

GTP - гуанозинтрифосфат.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Одним из главных направлений развития биохимии является изучение механизмов регуляции метаболических процессов, осуществляемых в живых организмах. Среди множества проблем данной области науки важное место занимает изучение ферментативных систем, их роли и механизмов действия при передаче и реализации генетической информации организма [29].

Знание структуры и характеристик ферментных комплексов, механизмов регуляции их активности имеет как фундаментальное, так и практическое значение.

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) представляет собой мультифункциональный фермент и по этой причине имеет практически универсальное распространение среди живых организмов. Данный фермент занимает ключевое положение в регуляции аэробного дыхания. Кроме того СДГ является мембрансвязанным ферментом, что обуславливает его полифункциональность - участие в функционировании ЦТК и работе электрон-транспортной цепи (комплекс И) [7]. Несмотря на то, что сукцинатдегидрогеназа из объектов различного происхождения хорошо изучена, исследование этого фермента из растений представляет особую значимость.

В последнее время усилился интерес к выявлению роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии генов. Данные о влиянии метилирования промоторов на инактивацию сукцинатдегидрогеназы человека и животных весьма многочисленны [94; 64]. Также в последнее время произошел значительный прорыв в понимании процесса метилирования ДНК у растений, особенно у АгаЫс^орягя ЖаПапа [2], однако работ, посвященных выяснению механизмов эпигенетической регуляции функционирования генов, обеспечивающих энергетический метаболизм (в

том числе и сукцинатдегидрогеназных генов) в растительных организмах, нами обнаружено не было.

Не до конца изученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось изучение регуляции экспрессии генов субъединиц А и В изоферментов СДГ в растениях Arabidopsis thaliana и Zea mays.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ активности и изоферментного состава сукцинатдегидрогеназы в разных органах исследуемых растений;

2. Определить уровень транскрипции генов субъединиц А и В СДГ в онтогенезе арабидопсиса и кукурузы методом ПЦР в реальном времени, на основании результатов исследования установить генетическую детерминацию форм фермента;

3. Проанализировать нуклеотидный состав промоторов генов, кодирующих субъединицы А и В СДГ на наличие CpG-островков и разработать праймеры для метил-специфичной ПЦР;

4. Изучить роль метилирования промоторов генов sdhl-1 и sdhl-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы на уровень экспрессии этих генов при прорастании семян кукурузы и смене типов питания;

5. Определить действие красной (X = 640-680 нм и X =710-750 нм) и синей (X, = 465-470 нм) части спектра на функционирование исследуемого фермента в листьях растений;

6. Выявить роль катионов кальция в трансдукции рецепторного сигнала фитохромной и криптохромной систем.

Научная новизна и значимость работы.

Анализ нуклеотидного состава промоторов показал, что гены ьйМ-! и кукурузы и гены и зс0г2-2 арабидопсиса имеют в

составе промоторов Срв-островки, что обуславливает регуляцию работы данных генов за счет изменения степени их метилирования. Впервые обнаружена корреляция между уровнем транскрипции генов зс1М-1 и $сНг1-2 и степенью метилирования их промоторов. При прорастании семян повышался уровень метилирования промоторов генов 8(1М-1 и $с1М-2, что играет важную роль в регуляции экспрессии исследуемых генов в тканях растений.

Показано, что экспрессия гена 8с1И1-2 в зеленых листьях 2.тауз и АлкаНапа находится под контролем фитохромной системы, при этом выявлена важная роль кальция как мессенджера фитохромного сигнала.

Полученные результаты расширяют и углубляют знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима при прорастании семян и переходе к фотосинтетической активности.

Практическая значимость.

Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов сукцинатдегидрогеназных генов, впервые проведенный в работе, позволил синтезировать метил-специфичные праймеры, что открывает новые перспективы для их использования в научно-исследовательских лабораториях при изучении эпигенетического контроля за функциональным состоянием ферментных систем.

Полученные результаты по механизмам трансдукции фитохромного и криптохромного сигналов при различных условиях освещения открывают возможности для создания светильников на основе светодиодов, которые обладают оптимальными спектральными характеристиками и могут быть внедрены в практику выращивания растений в светокультуре.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. В щитках и листьях кукурузы присутствуют конститутивные и индуцибельные формы сукцинатдегидрогеназы, что связано с ее полифункциональностью (помимо участия фермента в функционировании ЦТК и комплекса II в ЭТЦ, СДГ осуществляет утилизацию сукцината в глюконеогенезе и обеспечивает каталитическое превращение сукцината в оксалоацетат -предшественник аспартата).

2. В геномах кукурузы и арабидопсиса субъединицы А и В сукцинатдегидрогеназы кодируются несколькими генами, характеризующимися дифференциальной экспрессией в разные периоды развития растения, то есть имеет место чёткая регуляция экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы при прорастании растений и их физиологическом переходе от органотрофного к автотрофному типу питания.

3. Метилирование Св-динуклеотидов промоторов генов сукцинатдегидрогеназного ферментного комплекса является механизмом регуляции экспрессии исследуемого фермента в прорастающих семенах кукурузы.

4. Функционирование сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях растений контролируется фитохромной системой, при этом катионы кальция, выступая в качестве вторичного мессенджера, обеспечивают трансдукцию фитохромного сигнала.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 12-ой, 13-ой, 14-ой и 16-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2008, 2009, 2010, 2012); Международной научной конференции «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва, 2010, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011); Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010г.);

Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва 2010); МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2010г.); XLIX Международной научной студенческой технической конференции «Студент и научно прогресс» (Новосибирск, 2011); 1-ой Международной Интернет-Конференция «Растения и Микроорганизмы» (Казань, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011г.); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2009, 2010, 2011, 2012).

Публикации.

Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях - 7 статьях и 10 тезисах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (195 источников). Иллюстрационный материал включает 43 рисунка и 3 таблицы.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Характеристики сукцинатдегидрогеназной системы 1.1. Структурная организация и механизм действия СДГ

Сукцинатдегидрогеназа (сукцинат: (акцептор)-оксидоредуктаза, сукцинат-убихинон редуктаза, СДГ, КФ 1.3.99.1) - фермент, принадлежащий к классу оксидоредуктаз. СДГ встроена во внутреннюю мембрану митохондрий, являясь одновременно комплексом II электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и функциональной частью цикла Кребса [31]. Комплекс II, охарактеризованный у бактерий, простейших, грибов и животных, имеет консервативное строение и состоит из четырех субъединиц с молекулярной массой ферментативного комплекса ~ 90-110 кДа (рис. 1). Самый большой из этих полипептидов (СДГ А) - ФАД-содержа